Protocol
सभी जानवर काम सिफारिशों की देखभाल और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों की प्रयोगशाला पशु के उपयोग के लिए गाइड में उल्लिखित के अनुसार संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।
1. हिंद अंग लंबी हड्डी विच्छेदन
- संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार माउस euthanize।
- एक लापरवाह स्थिति में माउस की स्थिति और टखने संयुक्त नीचे माउस पंजा पैड के माध्यम से सभी चार पैर लगाए द्वारा प्रत्यय।
- 70% इथेनॉल के साथ माउस स्प्रे, अच्छी तरह से पैर dousing।
- सिर्फ कूल्हे ऊपर पेट के निचले हिस्से में midline के अधिकार के लिए एक छोटा सा चीरा बनाओ।
- पैर नीचे और पिछले टखने संयुक्त चीरा बढ़ाएँ।
- त्वचा वापस खींचो और quadriceps मांसपेशियों फीमर के समीपस्थ अंत करने के लिए लंगर में कटौती फीमर के पूर्वकाल पक्ष बेनकाब और पैर से बाहर पिन, बोर्ड से एक 45 डिग्री के कोण पर पिन रखने के लिए।
- blad के साथफीमर के पीछे पक्ष के खिलाफ कैंची का ई, हैमस्ट्रिंग संयुक्त घुटने से दूर कटौती।
- त्वचा और मांसपेशियों को पंख काटना फीमर की समीपस्थ अंत करने के लिए लंगर फीमर के पीछे की ओर बेनकाब और पैर से बाहर पिन करने के लिए वापस खींच, बोर्ड से एक 45 डिग्री के कोण पर पिन रखकर।
- संदंश के साथ, सिर्फ संयुक्त घुटने से ऊपर, फीमर के बाहर का अंत पकड़ो। कूल्हे की ओर ऊरु शाफ्ट के दोनों तरफ कैंची के ब्लेड गाइड, फीमर ही में कटौती करने के लिए नहीं सावधान किया जा रहा।
- और्विक सिर, कैंची से थोड़ा खोलने के द्वारा संकेत दिया पहुंचने के बाद फीमर भंग करने के लिए, ऊरु सिर के नीचे की हड्डी तस्वीर करने के लिए नहीं सावधान किया जा रहा कैंची और्विक सिर पर सीधे आगे बढ़ के शीर्ष ब्लेड के साथ कैंची मोड़।
- संदंश के साथ ऊरु शाफ्ट के शीर्ष समझ, कोमल ऊतक में कटौती और्विक सिर से दूर ऐसीटैबुलम से इसे जारी करने के लिए।
- पूरे पैर की हड्डी खींचो, सहितफीमर, घुटने, और टिबिया, ऊपर और शरीर से दूर है, ध्यान से संयोजी ऊतक दूर काटने और मांसपेशियों त्वचा के लिए पैर जोड़ने।
- टखने संयुक्त overextend और फिर एक घुमा गति में कैंची का उपयोग टिबिअ भंग करने के लिए।
- , टिबिया के बाहर का अंत लोभी ख्याल रख रही है tendons तोड़ने के लिए नहीं, टिबिया अप और शरीर और पिन बोर्ड से दूर खींच।
- किसी भी शेष संयोजी ऊतक घुटने पर माउस करने के लिए लंबे हड्डी संलग्न कट।
- किसी भी अतिरिक्त मांसपेशियों या संयोजी ऊतक फीमर और टिबिया से जुड़ी निकालें।
- किसी भी आवेदन कि हड्डी की आवश्यकता बरकरार (ऊतक विज्ञान, histomorphometry, बायोमैकेनिकल परीक्षण, आदि।) रहने के लिए के लिए, (4-7) के रूप में मानक के घर में प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ें। अस्थि मज्जा को अलग-थलग करने के लिए, धारा 2 के लिए आगे बढ़ना।
अस्थि मज्जा अलगाव के लिए 2. लंबी हड्डी तैयारी
- संदंश का प्रयोग, पटेला दूर का सामना करना पड़ के साथ फीमर काबूएन डी समीपस्थ अंत (और्विक सिर) नीचे।
- घुटने संयुक्त overextend और एक घुमा गति में कैंची का उपयोग टिबिअ हटाना और फीमर करने के लिए।
- किसी भी संयोजी ऊतक एक साथ फीमर और टिबिया पकड़े कट।
- संदंश का प्रयोग, पूर्वकाल ओर दूर सामना करना पड़ रहा है और समीपस्थ अंत (और्विक सिर अंत) से नीचे के साथ फीमर समझ।
- कैंची condyles को ऊरु शाफ्ट को गाइड।
- धीरे कैंची आगे और पीछे बारी बारी से condyles, पटेला हटाने, और एपिफ़ीसिस रक्ताधान का पर्दाफाश करने के लिए।
- किसी भी अतिरिक्त मांसपेशियों या संयोजी ऊतक का उपयोग संदंश, कैंची, और Kimwipes फीमर से जुड़ी निकालें।
- संदंश का प्रयोग, पूर्वकाल ओर दूर सामना करना पड़ रहा है और बाहर का अंत (टखने अंत) से नीचे के साथ टिबिअ समझ।
- अगर tibial एपिफ़ीसिस बरकरार है, अप करने के लिए condyles टिबिअ शाफ्ट कैंची गाइड।
- धीरे condyles दूर करने के लिए आगे और पीछे कैंची बारी बारी से और एपिफ़ीसिस metaph बेनकाब करने के लिएविश्लेषण।
- किसी भी अतिरिक्त मांसपेशियों या संयोजी ऊतक का उपयोग संदंश, कैंची, और Kimwipes टिबिअ से जुड़ी निकालें।
3. अस्थि मज्जा अलगाव
- एक 0.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब के नीचे के माध्यम से एक 18 जी सुई पुश।
- लंबी हड्डियों की जगह ट्यूब में (2 femurs और tibiae 2 की अधिकतम), घुटने का अंत नीचे नीचे अंत और ढक्कन बंद करें।
- घोंसला एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में 0.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब।
- 15 सेकंड के लिए एक microcentrifuge में ≥10,000 XG पर नेस्ट ट्यूबों अपकेंद्रित्र।
- सत्यापित करें कि अस्थि मज्जा दृश्य निरीक्षण द्वारा हड्डियों से बाहर काता गया है। हड्डियों सफेद दिखाई देनी चाहिए और बड़ा ट्यूब में एक बड़े दृश्य गोली वहाँ होना चाहिए।
- हड्डियों के साथ 0.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब त्यागें।
- उचित समाधान में अस्थि मज्जा (जैसे, पीबीएस, संस्कृति, मीडिया, FACS बफर) और प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल (डीएनए, आरएनए, या प्रोटीन अलगाव के साथ आगे बढ़ना निलंबित,FACS विश्लेषण, या प्राथमिक सेल संस्कृति)।
Representative Results
यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल माउस फीमर और हड्डी के ऊतकों को नुकसान का एक न्यूनतम के साथ टिबिया के तेजी से विच्छेदन के लिए अनुकूलित है। और ऊतक विज्ञान (चित्रा 1 सी) 4,7 - इस तकनीक को बायोमैकेनिक्स अध्ययन, histomorphometry (बी चित्रा 1 ए) सहित बहाव के विश्लेषण के एक नंबर के लिए उपयुक्त है। प्रतिनिधि histomophometric micoCT 3 डी पुनर्निर्माण (चित्रा 1 ए - बी) के यह दर्शाता है कि दोनों जालीदार हड्डी और cortical खोल रखा जाता है कि घरनदार नंबर, मोटाई, और रिक्ति सहित हड्डी histomorphometry, के लिए मानकीकृत संरचनात्मक मापदंडों की सटीक quantitation के लिए अनुमति देता है; हड्डी की मात्रा; और cortical मोटाई, अन्य उपायों 8 के बीच में। प्रतिनिधि histologic खंड एक एच एंड ई दाग formalin-तय की और decalcified टिबिअ (चित्रा 1 सी) से पता चलता है। छवि दोनों calcified ख की अखंडता को दर्शाता हैएक और histologic विश्लेषण के लिए सेलुलर अस्थि मज्जा।
अस्थि मज्जा अलगाव प्रक्रिया अस्थि मज्जा अंतरिक्ष के बाँझपन को बरकरार रखता है, कम से निपटने है प्रदूषण को कम करने के लिए, और लंबे समय हड्डी के काटने की आवश्यकता नहीं है, इस प्रकार अस्थि मज्जा उपज के नुकसान को कम करने। यह अस्थि मज्जा cytometry 5 और पीसीआर विश्लेषण प्रवाह सहित कई बहाव के अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त है। 4.6 - इसके अलावा, इस प्रक्रिया अस्थिशोषकों और अस्थिकोरक (बी 2A चित्रा) सहित अस्थि मज्जा की कोशिकाओं, के प्राथमिक सेल संस्कृति के लिए अस्थि मज्जा को अलग किया जा सकता है।
में एक माउस (ए) cortical बाहरी खोल और टिबिया के दिखा चित्रा 1. Histomorphological और माउस लंबी हड्डी के histological विश्लेषण। तीन आयामी microCT के पुनर्निर्माण (बी trong>) घरनदार हड्डी (पैमाने बार = 0.5 मिमी)। (सी) ऊतकीय एच ई एक decalcified और sectioned टिबिअ (4x) का दाग। छवियाँ कैथरीन Weilbaecher, चिकित्सा, संयुक्त राज्य अमेरिका के वॉशिंगटन विश्वविद्यालय के स्कूल के सौजन्य। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2. अस्थिशोषकों और अस्थिकोरक के भेदभाव के लिए प्राथमिक अस्थि मज्जा सेल संस्कृति। Osteoclastogenic मीडिया (4x) के 7 दिनों के बाद multinucleated अस्थिशोषकों के लिए (ए) जाल धुंधला हो जाना। (बी) अस्थिकोरक और Alizarin लाल (लाल रंग) के मीडिया में osteogenic 21 दिनों के बाद खनिजीकरण के लिए दाग़ लिए क्षारीय फॉस्फेट (बैंगनी रंग)। छवियाँ कैथरीन Weilbaecher के सौजन्य से, चिकित्सा, संयुक्त राज्य अमेरिका के वाशिंगटन विश्वविद्यालय के स्कूल।Iles / ftp_upload / 53936 / 53936fig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Pinboard | |||
Pins | |||
70% Ethanol | |||
Dissection scissors | |||
Dissection forceps | |||
Kimwipes | Kimberly-Clark | 34120 | |
16 G needle | |||
1.5 ml Microcentrifuge tube | |||
0.5 ml Microcentrifuge tube | |||
Microcentrifuge |
References
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