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Immunology and Infection

Murino arto posteriore osso lungo dissezione e isolamento di midollo osseo

doi: 10.3791/53936 Published: April 14, 2016

Protocol

Tutto il lavoro animale è stato approvato dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa in conformità con le raccomandazioni delineate nella guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health.

La dissezione 1. arto posteriore delle ossa lunghe

  1. Euthanize il mouse in conformità con le linee guida istituzionali.
  2. Posizionare il mouse in posizione supina e apporre da appuntare tutte e quattro le gambe attraverso le pastiglie del mouse zampa sotto l'articolazione della caviglia.
  3. Spruzzare il mouse con il 70% di etanolo, accuratamente dousing le gambe.
  4. Fai una piccola incisione a destra di linea mediana nel basso addome, appena sopra l'anca.
  5. Estendere l'incisione lungo la gamba e oltre la caviglia.
  6. Tirare indietro la pelle e tagliare il muscolo quadricipite ancorato all'estremità prossimale del femore per esporre il lato anteriore del femore e il pin out dalla gamba, posizionando il perno con un angolo di 45 gradi dalla scheda.
  7. Con la fogliae delle forbici contro il lato posteriore del femore, tagliare i femorali dal ginocchio.
  8. Tirare indietro la pelle ed i muscoli adduttori ancorati alla estremità prossimale del femore per esporre il lato posteriore del femore e il pin dalla gamba, mettendo il perno in un angolo di 45 gradi dalla scheda.
  9. Con la pinza, tenere l'estremità distale del femore, appena sopra il ginocchio. Guida lame delle forbici su entrambi i lati del femore verso l'anca, facendo attenzione a non tagliare nel femore stesso.
  10. Dopo aver raggiunto la testa del femore, indicato dalle forbici apertura leggermente, ruotare le forbici con lama superiore delle forbici muovono direttamente sopra la testa femorale di dislocare femore, facendo attenzione a non scattare l'osso sotto della testa femorale.
  11. Afferrare la parte superiore del femore con la pinza, tagliare il tessuto molle dalla testa del femore per liberarla dal dell'acetabolo.
  12. Estrarre l'intero osso della gamba, tra cuifemore, ginocchio e tibia, alto e lontano dal corpo, accuratamente tagliando via il tessuto connettivo e muscolare che collega la gamba alla pelle.
  13. Sovraccaricare l'articolazione della caviglia e di nuovo usare le forbici in un movimento rotatorio di dislocare la tibia.
  14. Afferrando l'estremità distale della tibia, facendo attenzione a non recidere i tendini, tirare la tibia alto e lontano dal corpo e la lavagna.
  15. Tagliare qualsiasi tessuto connettivo restante fissaggio del osso lungo al mouse al ginocchio.
  16. Rimuovere qualsiasi muscolo supplementare o tessuto connettivo attaccata al femore e la tibia.
  17. Per tutte le applicazioni che richiedono l'osso di mantenere intatte (istologia, istomorfometria, test biomeccanico, ecc.), Procedere con protocolli standard in-house (come nel 4-7). Per isolare il midollo osseo, passare alla sezione 2.

2. Preparazione delle ossa lunghe per isolamento di midollo osseo

  1. Utilizzando le pinze, afferrare il femore con la rotula rivolto verso unND l'estremità prossimale (testa del femore) verso il basso.
  2. Sovraccaricare l'articolazione del ginocchio e usare le forbici in un movimento rotatorio di dislocare la tibia e il femore.
  3. Tagliare qualsiasi tessuto connettivo che tiene il femore e tibia insieme.
  4. Utilizzando le pinze, afferrare il femore con il lato anteriore rivolto verso e l'estremità prossimale (lato testa del femore) verso il basso.
  5. Guida le forbici la diafisi femorale ai condili.
  6. Delicatamente ruotare le forbici avanti e indietro per rimuovere i condili, rotula, e l'epifisi per esporre metafisi.
  7. Rimuovere ogni muscolo supplementare o del tessuto connettivo attaccato al femore usando pinze, forbici, e Kimwipes.
  8. Utilizzando le pinze, afferrare la tibia con il lato anteriore rivolto verso e l'estremità distale (fine caviglia) verso il basso.
  9. Se l'epifisi tibiale è intatto, guidare le forbici il pozzo tibia ai condili.
  10. Delicatamente ruotare le forbici avanti e indietro per rimuovere i condili e dell'epifisi per esporre la MetYsis.
  11. Rimuovere ogni muscolo supplementare o del tessuto connettivo attaccato alla tibia usando pinze, forbici, e Kimwipes.

Isolamento 3. midollo osseo

  1. Inserire un ago G 18 attraverso il fondo di un tubo di 0,5 ml microcentrifuga.
  2. Posizionare le ossa lunghe (massimo 2 femori e tibie 2) nel tubo, ginocchio-end verso il basso end verso il basso e chiudere il coperchio.
  3. Nest il tubo di 0,5 ml microcentrifuga in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga.
  4. Centrifugare le provette annidati a ≥10,000 xg in una microcentrifuga per 15 sec.
  5. Verificare che il midollo osseo è stata filata su ossa mediante ispezione visiva. Le ossa dovrebbero apparire bianco e ci dovrebbe essere una grande pellet visivo nel tubo più grande.
  6. Scartare il tubo di 0,5 ml microcentrifuga con le ossa.
  7. Sospendere il midollo osseo in soluzione appropriata (ad esempio, PBS, terreni di coltura, di buffer FACS) e procedere con il protocollo sperimentale (DNA, RNA, o isolamento delle proteine,analisi FACS, o colture cellulari primarie).

Representative Results

Il protocollo qui descritto è ottimizzato per una rapida dissezione del femore e della tibia del mouse con un minimo di danni al tessuto osseo. Questa tecnica è adatta per un numero di analisi a valle, compresi gli studi biomeccanica, istomorfometria (Figura 1A - B), e l'istologia (Figura 1C) 4,7. Il histomophometric rappresentante ricostruzione micoCT 3D (Figura 1A - B) dimostra che sia l'osso spongioso e corticale guscio sono mantenuti che consente la precisa quantificazione dei parametri strutturali standardizzate per Istomorfometria ossa, compreso il numero trabecolare, lo spessore e la spaziatura; volume osseo; e lo spessore corticale, tra le altre misure 8. La sezione istologica mostra un rappresentante fissati in formalina e decalcificata tibia H & E macchiato (Figura 1C). L'immagine dimostra l'integrità sia del calcificata buno e del midollo osseo cellulari per l'analisi istologica.

La procedura di midollo osseo isolamento conserva la sterilità dello spazio midollare, ha bassa movimentazione per ridurre la contaminazione, e non richiede il taglio del osso lungo, riducendo così la perdita di resa midollo osseo. Questo midollo osseo è adatta a molte applicazioni a valle, tra cui citometria a flusso 5 e PCR analisi. Inoltre, questa procedura può essere utilizzata per isolare midollo osseo per colture primarie di cellule di midollo osseo, tra osteoclasti e osteoblasti (Figura 2A - B) 4,6.

Figura 1
Figura 1. istomorfologiche e analisi istologiche di mouse osso lungo. Ricostruzione microCT tridimensionale di una tibia del mouse mostrando (A) il guscio corticale esterno e (B Trong>) dell'osso trabecolare (scala bar = 0,5 mm). (C) istologico H & E macchia di una tibia decalcificata e sezionato (4x). Immagini per gentile concessione di Katherine Weilbaecher, Washington University School of Medicine, Stati Uniti d'America. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2. primaria midollo osseo coltura cellulare per la differenziazione degli osteoclasti e gli osteoblasti. Colorazione (A) trappola per osteoclasti multinucleate dopo 7 giorni in mezzi osteoclastogenico (4x). (B) La fosfatasi alcalina (colore viola) per osteoblasti e alizarin rosso (colore rosso) della macchia per la mineralizzazione dopo 21 giorni di mezzi osteogenico. Immagini per gentile concessione di Katherine Weilbaecher, Washington University School of Medicine, Stati Uniti d'America.iles / ftp_upload / 53936 / 53936fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pinboard
Pins
70% Ethanol
Dissection scissors 
Dissection forceps
Kimwipes Kimberly-Clark 34120
16 G needle
1.5 ml Microcentrifuge tube
0.5 ml Microcentrifuge tube
Microcentrifuge

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References

  1. McHayleh, W. M., Ellerman, J., Roodman, G. D. Ch. 80. Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral Metabolism. American Socieyt for Bone and Mineral Research. 379-381 (2008).
  2. Weilbaecher, K. N., Guise, T. A., McCauley, L. K. Cancer to bone: a fatal attraction. Nat Rev Cancer. 11, (6), 411-425 (2011).
  3. Pedersen, E. A., Shiozawa, Y., Pienta, K. J., Taichman, R. S. The prostate cancer bone marrow niche: more than just 'fertile soil. Asian J Androl. 14, (3), 423-427 (2012).
  4. Amend, S. R., et al. Thrombospondin-1 regulates bone homeostasis through effects on bone matrix integrity and nitric oxide signaling in osteoclasts. J Bone Miner Res. 30, (1), 106-115 (2015).
  5. Hurchla, M. A., et al. The epoxyketone-based proteasome inhibitors carfilzomib and orally bioavailable oprozomib have anti-resorptive and bone-anabolic activity in addition to anti-myeloma effects. Leukemia. 27, (2), 430-440 (2013).
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  7. Su, X., et al. The ADP receptor P2RY12 regulates osteoclast function and pathologic bone remodeling. J Clin Invest. 122, (10), 3579-3592 (2012).
  8. Dempster, D. W., et al. Standardized nomenclature, symbols, and units for bone histomorphometry: a 2012 update of the report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee. J Bone Miner Res. 28, (1), 2-17 (2013).
  9. Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483, (7391), 531-533 (2012).
  10. Festing, M. F., Altman, D. G. Guidelines for the design and statistical analysis of experiments using laboratory animals. ILAR J. 43, (4), 244-258 (2002).
Murino arto posteriore osso lungo dissezione e isolamento di midollo osseo
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Cite this Article

Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation. J. Vis. Exp. (110), e53936, doi:10.3791/53936 (2016).More

Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation. J. Vis. Exp. (110), e53936, doi:10.3791/53936 (2016).

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