Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Murin bakbenen rörben Dissection och benmärg Isolering

doi: 10.3791/53936 Published: April 14, 2016

Protocol

Alla djur arbete godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén i enlighet med rekommendationerna som beskrivs i handledningen för vård och användning av försöksdjur i National Institutes of Health.

1. bakbenen Long Bone Dissection

  1. Avliva musen i enlighet med institutionens riktlinjer.
  2. Placera musen i ryggläge och anbringa genom att klämma fast alla fyra benen genom de mus tassarna nedan fotleden.
  3. Spraya musen med 70% etanol, grundligt dousing benen.
  4. Gör ett litet snitt till höger om mittlinjen i nedre delen av buken, precis ovanför höften.
  5. Förlänga incisionen ner benet och förbi fotleden.
  6. Dra tillbaka huden och skär quadricepsmuskeln förankrad i proximala änden av lårbenet för att exponera den främre sidan av lårbenet och stift ut från benet, placera tappen på en 45-graders vinkel från brädet.
  7. Med blade på saxen mot den bakre sidan av lårbenet, skär hamstrings bort från knäleden.
  8. Dra tillbaka huden och hamstringsmusklerna förankrade till proximala änden av lårbenet för att exponera den bakre sidan av lårbenet och stift ut från benet, placera tappen på en 45-graders vinkel från brädet.
  9. Med pincett, håll den distala änden av lårbenet, precis ovanför knäleden. Guide bladen i saxen på vardera sidan av lårbensskaftet mot höftleden, försiktigt så att inte skära in i lårbenet själv.
  10. Efter att ha nått lårbenshuvudet, vilket indikeras av saxen öppnas något, vrid saxen med den övre bladet på saxen rör sig direkt över lårbenshuvudet för att flytta ut lårbenet, försiktigt så att inte knäppa benet under lårbenshuvudet.
  11. Ta tag i övre delen av lårbenet med pincett, skära mjuka vävnaden bort från lårbenshuvudet för att frigöra den från acetabulum.
  12. Dra hela benet ben, inklusivefemur, knä, och skenbenet, upp och bort från kroppen, att försiktigt skäras bort bindväv och muskler som förbinder benet till huden.
  13. Overextend fotleden och återigen använda saxen i en vridande rörelse för att flytta ut den skenbenet.
  14. Greppa den distala änden av skenbenet, till att inte avskilja senorna, dra skenbenet uppåt och bort från kroppen och stiftet kortet.
  15. Skär eventuellt kvarvarande bindväv fästa långt ben till musen vid knäet.
  16. Avlägsnande av eventuellt extra muskel eller bindväv fäst vid lårbenet och skenbenet.
  17. För alla program som kräver benet förbli intakt (histologi, histomorfometri, biomekanisk testning, osv.), Fortsätt med standard interna protokoll (som i 4-7). För att isolera benmärgen, gå vidare till avsnitt 2.

2. Långa ben Förberedelse för Benmärgs Isolering

  1. Med hjälp av pincett, ta tag i lårbenet med knäskålen vänd bort ennd den proximala änden (lårbenshuvudet) nedåt.
  2. Overextend knäleden och använda saxen i en vridande rörelse för att flytta ut skenbenet och lårbenet.
  3. Klipp någon bindväv håller lårben och skenben tillsammans.
  4. Med användning av pincett, ta tag i lårbenet med den främre sidan som är vänd bort och den proximala änden (lårbenshuvudänden) nedåt.
  5. Guide saxen upp lårbensskaftet till kondylerna.
  6. Rotera försiktigt saxen fram och tillbaka för att ta bort kondylerna, knäskålen och epifysen att exponera metafysen.
  7. Ta bort eventuella extra muskler eller bindväv fäst vid lårbenet med hjälp av pincett, sax och Kimwipes.
  8. Med hjälp av pincett, ta tag i skenbenet med den främre sidan vänd bort och den bortre änden (fotled slut) nedåt.
  9. Om skenbens epifysen är intakt, vägleda saxen upp tibia axeln till kondylerna.
  10. Rotera försiktigt saxen fram och tillbaka för att ta bort kondylerna och epifysen att exponera metaphlys.
  11. Ta bort eventuella extra muskler eller bindväv fäst vid skenbenet med pincett, sax och Kimwipes.

3. Benmärgs Isolering

  1. Knuffa en 18 G nål genom botten av ett 0,5 ml mikrocentrifugrör.
  2. Placera långa ben (max 2 lårben och två tibiae) i röret, knä-end ner slut ner och stäng locket.
  3. Kapsla 0,5 ml mikrocentrifugrör i en 1,5 ml mikrocentrifugrör.
  4. Centrifugera kapslade rören vid ≥10,000 xg i en mikrocentrifug under 15 sek.
  5. Verifiera att benmärgen har spunnits ut ur benen genom visuell inspektion. Benen ska visas vita och det bör finnas en stor visuell pellets i det grövre röret.
  6. Kasta 0,5 ml mikrocentrifugrör med benen.
  7. Suspendera benmärgen i lämplig lösning (t.ex. PBS, odlingsmedier, FACS-buffert) och fortsätter med försöksprotokoll (DNA, RNA eller proteinisolering,FACS-analys, eller primär cellkultur).

Representative Results

Protokollet som beskrivs här är optimerad för snabb dissekering av musen lårbenet och skenbenet med ett minimum av skada på benvävnad. Denna teknik är lämplig för ett antal analyser nedströms, inklusive biomekanik studier, histomorfometri (Figur 1A - B), och histologi (Figur 1C) 4,7. Den representativa histomophometric micoCT 3D-rekonstruktion (Figur 1A - B) visar att både den porösa benet och kortikala skal bibehålls som möjliggör noggrann kvantifiering av de standardiserade strukturella parametrar för benhistomorfometri, inklusive trabekulära antal, tjocklek och avstånd; benvolym; och kortikal tjocklek, bland andra åtgärder 8. Den representativa histologiska avsnitt visar en H & E färgade formalinfixerade och urkalkade tibia (Figur 1C). Bilden visar integritet både förkalkad ben och cellulär benmärg för histologisk analys.

Benmärgen isoleringsförfarandet bevarar steriliteten hos benmärgen utrymme, har låg hantering för att minska kontaminering, och som inte kräver skärning av den långa ben, vilket minskar förlusten av benmärgs utbyte. Denna benmärg är lämplig för många tillämpningar nedströms, inklusive flödescytometri 5 och PCR-analyser. Dessutom kan detta förfarande användas för att isolera benmärg för primär cellkultur av benmärgsceller, inklusive osteoklaster och osteoblaster (Figur 2A - B) 4,6.

Figur 1
Figur 1. Histomorphological och histologiska analyser av mus rörben. Tredimensionell microCT rekonstruktion av en mus tibia visar (A) den yttre kortikala skalet och (B Trong>) trabekulärt ben (skala bar = 0,5 mm). (C) Histologisk H & E färgning av en avkalkat och sektionerad tibia (4x). Bilder med tillstånd av Katherine Weilbaecher, Washington University School of Medicine, USA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2. Primär Bone Marrow Cell Culture för Differentiering av osteoklaster och osteoblaster. (A) TRAP-färgning för multinukleära osteoklaster efter 7 dagar i osteoclastogenic media (4x). (B) alkaliskt fosfatas (lila färg) för osteoblaster och alizarin röd (röd färg) fläck för mineralisering efter 21 dagar i osteogent media. Bilder artighet av Katherine Weilbaecher, Washington University School of Medicine, USA.iles / ftp_upload / 53936 / 53936fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pinboard
Pins
70% Ethanol
Dissection scissors 
Dissection forceps
Kimwipes Kimberly-Clark 34120
16 G needle
1.5 ml Microcentrifuge tube
0.5 ml Microcentrifuge tube
Microcentrifuge

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McHayleh, W. M., Ellerman, J., Roodman, G. D. Ch. 80. Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral Metabolism. American Socieyt for Bone and Mineral Research. 379-381 (2008).
  2. Weilbaecher, K. N., Guise, T. A., McCauley, L. K. Cancer to bone: a fatal attraction. Nat Rev Cancer. 11, (6), 411-425 (2011).
  3. Pedersen, E. A., Shiozawa, Y., Pienta, K. J., Taichman, R. S. The prostate cancer bone marrow niche: more than just 'fertile soil. Asian J Androl. 14, (3), 423-427 (2012).
  4. Amend, S. R., et al. Thrombospondin-1 regulates bone homeostasis through effects on bone matrix integrity and nitric oxide signaling in osteoclasts. J Bone Miner Res. 30, (1), 106-115 (2015).
  5. Hurchla, M. A., et al. The epoxyketone-based proteasome inhibitors carfilzomib and orally bioavailable oprozomib have anti-resorptive and bone-anabolic activity in addition to anti-myeloma effects. Leukemia. 27, (2), 430-440 (2013).
  6. Rauch, D. A., et al. The ARF tumor suppressor regulates bone remodeling and osteosarcoma development in mice. PLoS One. 5, (12), e15755 (2010).
  7. Su, X., et al. The ADP receptor P2RY12 regulates osteoclast function and pathologic bone remodeling. J Clin Invest. 122, (10), 3579-3592 (2012).
  8. Dempster, D. W., et al. Standardized nomenclature, symbols, and units for bone histomorphometry: a 2012 update of the report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee. J Bone Miner Res. 28, (1), 2-17 (2013).
  9. Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483, (7391), 531-533 (2012).
  10. Festing, M. F., Altman, D. G. Guidelines for the design and statistical analysis of experiments using laboratory animals. ILAR J. 43, (4), 244-258 (2002).
Murin bakbenen rörben Dissection och benmärg Isolering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation. J. Vis. Exp. (110), e53936, doi:10.3791/53936 (2016).More

Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation. J. Vis. Exp. (110), e53936, doi:10.3791/53936 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter