Murin bakbenen rörben Dissection och benmärg Isolering

Protocol

Alla djur arbete godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén i enlighet med rekommendationerna som beskrivs i handledningen för vård och användning av försöksdjur i National Institutes of Health.

1. bakbenen Long Bone Dissection

1. Avliva musen i enlighet med institutionens riktlinjer.
2. Placera musen i ryggläge och anbringa genom att klämma fast alla fyra benen genom de mus tassarna nedan fotleden.
3. Spraya musen med 70% etanol, grundligt dousing benen.
4. Gör ett litet snitt till höger om mittlinjen i nedre delen av buken, precis ovanför höften.
5. Förlänga incisionen ner benet och förbi fotleden.
6. Dra tillbaka huden och skär quadricepsmuskeln förankrad i proximala änden av lårbenet för att exponera den främre sidan av lårbenet och stift ut från benet, placera tappen på en 45-graders vinkel från brädet.
7. Med blade på saxen mot den bakre sidan av lårbenet, skär hamstrings bort från knäleden.
8. Dra tillbaka huden och hamstringsmusklerna förankrade till proximala änden av lårbenet för att exponera den bakre sidan av lårbenet och stift ut från benet, placera tappen på en 45-graders vinkel från brädet.
9. Med pincett, håll den distala änden av lårbenet, precis ovanför knäleden. Guide bladen i saxen på vardera sidan av lårbensskaftet mot höftleden, försiktigt så att inte skära in i lårbenet själv.
10. Efter att ha nått lårbenshuvudet, vilket indikeras av saxen öppnas något, vrid saxen med den övre bladet på saxen rör sig direkt över lårbenshuvudet för att flytta ut lårbenet, försiktigt så att inte knäppa benet under lårbenshuvudet.
11. Ta tag i övre delen av lårbenet med pincett, skära mjuka vävnaden bort från lårbenshuvudet för att frigöra den från acetabulum.
12. Dra hela benet ben, inklusivefemur, knä, och skenbenet, upp och bort från kroppen, att försiktigt skäras bort bindväv och muskler som förbinder benet till huden.
13. Overextend fotleden och återigen använda saxen i en vridande rörelse för att flytta ut den skenbenet.
14. Greppa den distala änden av skenbenet, till att inte avskilja senorna, dra skenbenet uppåt och bort från kroppen och stiftet kortet.
15. Skär eventuellt kvarvarande bindväv fästa långt ben till musen vid knäet.
16. Avlägsnande av eventuellt extra muskel eller bindväv fäst vid lårbenet och skenbenet.
17. För alla program som kräver benet förbli intakt (histologi, histomorfometri, biomekanisk testning, osv.), Fortsätt med standard interna protokoll (som i ^4-7). För att isolera benmärgen, gå vidare till avsnitt 2.

2. Långa ben Förberedelse för Benmärgs Isolering

1. Med hjälp av pincett, ta tag i lårbenet med knäskålen vänd bort ennd den proximala änden (lårbenshuvudet) nedåt.
2. Overextend knäleden och använda saxen i en vridande rörelse för att flytta ut skenbenet och lårbenet.
3. Klipp någon bindväv håller lårben och skenben tillsammans.
4. Med användning av pincett, ta tag i lårbenet med den främre sidan som är vänd bort och den proximala änden (lårbenshuvudänden) nedåt.
5. Guide saxen upp lårbensskaftet till kondylerna.
6. Rotera försiktigt saxen fram och tillbaka för att ta bort kondylerna, knäskålen och epifysen att exponera metafysen.
7. Ta bort eventuella extra muskler eller bindväv fäst vid lårbenet med hjälp av pincett, sax och Kimwipes.
8. Med hjälp av pincett, ta tag i skenbenet med den främre sidan vänd bort och den bortre änden (fotled slut) nedåt.
9. Om skenbens epifysen är intakt, vägleda saxen upp tibia axeln till kondylerna.
10. Rotera försiktigt saxen fram och tillbaka för att ta bort kondylerna och epifysen att exponera metaphlys.
11. Ta bort eventuella extra muskler eller bindväv fäst vid skenbenet med pincett, sax och Kimwipes.

3. Benmärgs Isolering

1. Knuffa en 18 G nål genom botten av ett 0,5 ml mikrocentrifugrör.
2. Placera långa ben (max 2 lårben och två tibiae) i röret, knä-end ner slut ner och stäng locket.
3. Kapsla 0,5 ml mikrocentrifugrör i en 1,5 ml mikrocentrifugrör.
4. Centrifugera kapslade rören vid ≥10,000 xg i en mikrocentrifug under 15 sek.
5. Verifiera att benmärgen har spunnits ut ur benen genom visuell inspektion. Benen ska visas vita och det bör finnas en stor visuell pellets i det grövre röret.
6. Kasta 0,5 ml mikrocentrifugrör med benen.
7. Suspendera benmärgen i lämplig lösning (t.ex. PBS, odlingsmedier, FACS-buffert) och fortsätter med försöksprotokoll (DNA, RNA eller proteinisolering,FACS-analys, eller primär cellkultur).

Representative Results

Protokollet som beskrivs här är optimerad för snabb dissekering av musen lårbenet och skenbenet med ett minimum av skada på benvävnad. Denna teknik är lämplig för ett antal analyser nedströms, inklusive biomekanik studier, histomorfometri (Figur 1A - B), och histologi (Figur 1C) ^4,7. Den representativa histomophometric micoCT 3D-rekonstruktion (Figur 1A - B) visar att både den porösa benet och kortikala skal bibehålls som möjliggör noggrann kvantifiering av de standardiserade strukturella parametrar för benhistomorfometri, inklusive trabekulära antal, tjocklek och avstånd; benvolym; och kortikal tjocklek, bland andra åtgärder ^8. Den representativa histologiska avsnitt visar en H & E färgade formalinfixerade och urkalkade tibia (Figur 1C). Bilden visar integritet både förkalkad ben och cellulär benmärg för histologisk analys.

Benmärgen isoleringsförfarandet bevarar steriliteten hos benmärgen utrymme, har låg hantering för att minska kontaminering, och som inte kräver skärning av den långa ben, vilket minskar förlusten av benmärgs utbyte. Denna benmärg är lämplig för många tillämpningar nedströms, inklusive flödescytometri ⁵ och PCR-analyser. Dessutom kan detta förfarande användas för att isolera benmärg för primär cellkultur av benmärgsceller, inklusive osteoklaster och osteoblaster (Figur 2A - B) ^4,6.

Figur 1. Histomorphological och histologiska analyser av mus rörben. Tredimensionell microCT rekonstruktion av en mus tibia visar (A) den yttre kortikala skalet och (B Trong>) trabekulärt ben (skala bar = 0,5 mm). (C) Histologisk H & E färgning av en avkalkat och sektionerad tibia (4x). Bilder med tillstånd av Katherine Weilbaecher, Washington University School of Medicine, USA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2. Primär Bone Marrow Cell Culture för Differentiering av osteoklaster och osteoblaster. (A) TRAP-färgning för multinukleära osteoklaster efter 7 dagar i osteoclastogenic media (4x). (B) alkaliskt fosfatas (lila färg) för osteoblaster och alizarin röd (röd färg) fläck för mineralisering efter 21 dagar i osteogent media. Bilder artighet av Katherine Weilbaecher, Washington University School of Medicine, USA.iles / ftp_upload / 53936 / 53936fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pinboard
Pins
70% Ethanol
Dissection scissors
Dissection forceps
Kimwipes	Kimberly-Clark	34120
16 G needle
1.5 ml Microcentrifuge tube
0.5 ml Microcentrifuge tube
Microcentrifuge