Summary
私たちは、16S rRNA遺伝子アンプリコンシークエンシングを用いて細菌群集の特徴付けのために綿棒から核酸を抽出するための、効率的で堅牢、かつコスト効果的な方法を説明します。方法は、複数のサンプルタイプのための一般的な処理アプローチを可能にし、下流分析プロセスの数を収容します。
Abstract
人間の健康と病気の重要な調節因子として微生物群集の役割のための成長の感謝があります。ハイスループットシークエンシング技術は、さまざまなソースからの16S rRNA遺伝子の塩基配列決定を使用して細菌群集の迅速かつ効率的な特徴付けのために許可されています。 16S rRNA配列の分析のために容易に利用可能なツールは、計算ワークフローを標準化しているが、DNA抽出のための試料処理は、研究間の変動の継続元のままです。ここでは、綿棒から核酸を抽出するための、効率的で堅牢、かつコスト効果的な方法を説明します。我々はまた、シーケンシングライブラリーの生成、データ品質管理、および配列分析を含む16S rRNA遺伝子配列決定のための下流の方法を描きます。ワークフローは、解剖学的位置と宿主種の多様から収集した便や綿棒など、複数のサンプルタイプを、対応することができます。また、DNAを回収し、RNAを分離して使用することができます全ゲノムシーケンシングまたはRNA-seqのなど、他のアプリケーションのため。記載された方法は、複数のサンプルのタイプのための一般的な処理アプローチを可能にし、ゲノムメタゲノムおよび転写情報を下流の解析に対応しています。
Introduction
人間の下生殖器官、消化器系、呼吸器、皮膚を組織の恒常性を維持し、ホスト1の健康をサポートするために重要である複雑な細菌群集によって植民地化されています。例えば、特定の乳酸菌は、膣円蓋を酸性抗菌エフェクターを生成し、ローカルホスト免疫2-4を調節することにより、病原体のための無愛想環境を作成します。細菌microbiomeの重要性の高まり感謝も多くの臨床の状況で細菌群集を特徴づけるの関心を増大させました。ここでは、生殖器スワブからの細菌microbiomeの組成を決定する方法を説明します。プロトコルは、容易に他の解剖学的位置および他の宿主種から収集便試料及びスワブ用に修正することができます。
与えられたスタッドから収集し、保存することができるサンプル数に固有の制限のためにYの参加者は、このプロトコルは、適合フェノール-クロロホルムベースのビーズビーティング法5,6を使用して単一の綿棒から潜在的にDNA、RNA、さらにタンパク質を抽出するために設計されました。洗剤とビーズビーティングおよび化学的破壊を有する細菌の細胞壁の物理的破壊の組み合わせは、追加の酵素消化段階なしに、グラム陽性、グラム陰性、および抗酸菌の迅速な溶解を可能にします。高品質のRNAを得るためには、すぐに回収後、実験（該当する場合）への輸送中に、またはC°4以下に保たれた乾燥綿棒を使用することをお勧めし、-80℃で長期間保存されます。
与えられた試料内の細菌microbiomeを決定するには、この手順は、現在、総合的に細菌の分類を割り当て、相対定量を行うための最も費用対効果の高い手段である16S rRNA遺伝子アンプリコンのシーケンシングを利用します。代替方法では、標的のqPCR 7、カスタムmicroarrを含みますAYS 8、及び全ゲノム配列9。 16S rRNA遺伝子は、9超可変領域を含み、膣microbiome研究のためのシーケンスに最適なV領域に関するコンセンサスはありません。ここでは、515F / 806Rプライマーセットを使用し、Caporaso らによって設計されたパイプラインの上に構築。10-12。 Caporaso らの515F / 806Rプライマーセットが原因検証バーコードプライマーとイルミナシーケンシングプラットフォームとの互換性の何千もの可用性に単一の配列決定ランでのサンプルの何百もの多重化を可能にします。人間Microbiomeプロジェクトの27F / 338Rプライマーセット13とは異なり、515F / 806Rも有効Bifidobacteriaceaeを増幅し 、したがって、正確ガードネレラ膣 、一部の女性では膣の微生物群集の重要なメンバーは、キャプチャします。あるいは、338F / 806Rプライマー対は、正常膣サンプル14及び515F / 926Rプライマー対はRECEを有するのパイロシーケンシングのために使用されていますntly次世代シーケンス12のために利用できるようになります。
最後に、このプロトコルは、微生物生態学（QIIME）ソフトウェアパッケージ15に定量的洞察を使用して、16Sアンプリコンの分析を実行するための基本的な手順を説明します。ここで説明するQIIMEコマンドの実装を成功させるには、各サンプルの細菌分類学上の存在量を含むテーブルを生成します。 QIIMEウェブサイト（http://qiime.org/index.html）に詳細に記載されるように多くの付加的な品質管理工程、分類学的分類方法、及び分析ステップは、分析に組み込むことができます。分析は、Appleコンピュータ上で実行する場合は、MacQIIMEパッケージ16は QIIMEとその依存関係の簡単なインストールを提供します。 16S rRNAの遺伝子配列解析のための代替ソフトウェアパッケージはMothur 17とUPARSE 18が含まれます。
Protocol
研究プロトコールは、によって承認され、クワズール・ナタール州（ダーバン、南アフリカ）とマサチューセッツ総合病院施設内倫理委員会（2012P001812 / MGH、ボストン、MA）の大学の生物医学研究倫理委員会のガイドラインに従いました。
頸膣スワブからの全核酸の1の抽出
注：16サンプルまたは少数のセットで核酸抽出を行います。以下に記述されたようなプロトコルは、参加者のID番号、年齢等のメタデータを含む（直列抽出バッチの数と各サンプルの抽出をバッチ番号、ならびに他のサンプルの情報を記録し、抽出の複数のラウンドを実行した場合、サンプルは、12組で処理することを前提としてい、 表1のスワブコレクション、ホルモン避妊薬の種類、性感染症検査の結果など ）の日付/時刻。
- 試薬およびヒュームフードの調製
- 、1ミリリットルのフェノールあたりトリスアルカリ性バッファー65μLを加え2分間振とうして、には2つのフェーズを可能にすることにより、pHを7.9にクロロホルム：イソアミルアルコール（IAA）（1：25：24）フェノールのpHを調整します室温で5分間万×gで自然にまたは遠心分離によって分離します。
注意：吸入した場合、飲み込んだ、または皮膚や目に接触した場合フェノールは有毒です。煙を吸入しないこと。不浸透性の手袋、サイドシールド付き安全メガネ、と白衣を着用してください。 - フィルター滅菌0.22μmフィルターを通して20％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を25ミリリットル。滅菌SDSの5ミリリットルのアリコートを行います。
- -20℃でイソプロパノール10mlのアリコートを冷やします。
- 各秒間ビーズビーティングチューブを準備しますWABは、ビーズビーターに適している、無菌の2mlチューブにガラスビーズを0.3gを秤量することによって処理されます。
- 滅菌吸収性綿棒で子宮膣部をサンプリングして綿棒を取得します。すぐに回収後、実験室に輸送中1〜4時間に4℃で空と無菌クリオバイアル、店に綿棒を置き、-80℃で数ヶ月間保管します。濡れた氷に処理される（個々のチューブ内に含まれる）綿棒を転送します。
- 生物学的安全キャビネット（BSC）を準備します。揮発性化学物質の適正除去を確実にするために、建物の排気と接続「シンブル」とBSCを使用してください。
- フードからすべての材料を削除します。
- RNアーゼ、DNアーゼ、および表面からDNAを除去する除染が続く漂白剤とフードのすべての表面をきれいにしてください。後続のすべてのアイテムをきれいに手袋などの核酸汚染除去、続いて漂白剤を使用したフードに持ち込ま。 Pなどの新鮮なRNアーゼ/ DNアーゼフリーの試薬を、使用してくださいipetteのヒント、可能な限り。
- フードの後部に滅菌化学バイオハザードバッグをテープで固定します。フェノールやクロロホルムを含むすべての乾燥廃棄物適正処理のためにこのバッグの中に配置する必要があります。
- フェノールやクロロホルムを含有する液体廃棄物を収集するためにフード内に無菌ボトルを置きます。
- 、1ミリリットルのフェノールあたりトリスアルカリ性バッファー65μLを加え2分間振とうして、には2つのフェーズを可能にすることにより、pHを7.9にクロロホルム：イソアミルアルコール（IAA）（1：25：24）フェノールのpHを調整します室温で5分間万×gで自然にまたは遠心分離によって分離します。
- フェノール - クロロホルム抽出。
- フードでは、各ビーズビーティングチューブのため、緩衝液500μlを追加し、20％ドデシル硫酸ナトリウムの210μlを、フェノール500μlの（ステップ1.1.1から）：クロロホルム：IAA（25：24：1、pHは7.9 ）。
- 滅菌ピンセットの新しいペアを使用して、ビーズビーティング管に輸送バイアルから綿棒を転送します。徹底的に少なくとも30秒間ビーズビーティング管の内部壁に対して綿棒ヘッドをこします。再キャップに実施されるサンプル。複数の綿棒からの抽出を行う場合は、各サンプル間の手袋を変更します。
- 少なくとも10分間氷上でサンプルを冷やします。から綿棒を削除クリーンP200チップを使用して、内部の管壁に綿棒ヘッドを押しながら滅菌ピンセットと綿棒のハンドルを保持することによって、チューブを破っビーズ。ドライ化学廃棄物バッグに綿棒を破棄します。注：「スキージ」アクション（綿棒の頭を押す）は、吸収性綿棒から液体を放出し、核酸回収が増加します。
- ビーズビーターにビーズビーティングチューブを置き、4℃で2分間均質化します。
- 遠心分離機6000×gで、4℃で3分間ビーズビーティング管破片をペレット化し、水とフェノール相を分離します。
- 無菌の1.5mlチューブに - （600μL〜500）の水相を転送します。等量のフェノールを追加：クロロホルム：IAA。反転、短時間のボルテックスで混和します。
- 16,000×gで5分間、4℃のためのチューブを遠心。
- 新しい滅菌1.5mlチューブに水層を移します。保守的であると相間層または基礎となるフェノールから素材を転送しません段階。転送水相の量に注意してください。将来のタンパク質単離のためのフェノール相を保存します。
- イソプロパノール0.8体積との3M酢酸ナトリウム（pH5.5）の0.1容量を追加します。反転、短時間ボルテックスで混ぜます。
- （O / Nまで）、少なくとも2時間、-20℃でチューブを冷却することにより核酸を沈殿させます。
- イソプロパノール沈殿及びエタノール洗浄
- 約16,000×gで、4℃で30分間チューブを遠心。慎重に無傷のペレットを残し、上澄み液を除去するために、ピペットを使用しています。
- 100％エタノール500μlのを追加します。ペレットを触れることなく穏やかにボルテックスまたはピペッティングでペレットを取り除きます。 16,000×gで4℃で5分間遠心します。
- 慎重にエタノール上清を捨てます。ペレットを乱すことなく、できるだけ多くのエタノールを除去するために、P10ピペットを使用してください。
- 空気は、15分間、室温でペレットを乾燥させます。
- Uの20μlにペレットを再懸濁LTRA純0.1×トリス-EDTA緩衝液。完全な再懸濁を確実にするために、サンプルを繰り返し10分とピペット氷上で冷やしできるようにします。ペレットが溶解しない場合、溶解を助けるために10分まで、40℃のヒートブロックにチューブを移します。
- 分光光度計19を用いて、核酸濃度を測定します。
- 必要であれば、製造業者のプロトコル20以下、カラムクリーンアップキットを用いてRNAとは別のDNA。
- -80℃で核酸を保存したり、続行します。
16S rRNAの遺伝子V4超可変領域の2 PCR増幅
注：汚染とヒューマンエラーのリスクを最小限にするために12個のサンプルまたは少数のセットでPCR増幅を行います。増幅の複数のラウンドを行う場合は、シリアル増幅バッチを数と表1に各サンプルの増幅バッチ番号を記録します。
- 準備O試薬およびPCRフードF
- 配列分析段階でマッピングファイルの基礎として役立つであろう、 表1に情報を設定し、PCR増幅を加えます。
- PCRフードからすべての物質を除去し、RNアーゼ、DNアーゼ、およびDNAを除去する汚染除去に続いて、漂白剤で十分に内部表面をきれいにします。フードでそれらを配置する前に、すべての試薬 や機器（ 例えば、ピペット）の一部を除染するようにしてください。フードでの作業の前に、核酸汚染除去剤で洗浄新鮮な手袋を着用してください。
- 必要に応じて、50に核酸鋳型を希釈 - 100 ngの/ DNAフリー、ヌクレアーゼフリー水を使用してμlの。
- きれいなPCRフード内で5倍の高忠実度（HF）緩衝液、dNTP、及びプライマーの解凍アリコート。穏やかにボルテックスし、解凍後、すべてのソリューションを遠心分離機。凍結融解サイクルおよびストック汚染のリスクを最小限にするために、5×HF緩衝液、dNTP類、およびプライマーのアリコートを調製します。
- プレイスAきれいなマイクロ遠心チューブ用の卓上クーラーラックおよびPCRプレートフードにクーラー。
- PCR反応のために、超純水の15.5μlの、5×HFバッファーを5μl、dNTPの0.5μlを、515Fフォワードプライマーの0.5μlを、三パーセントのDMSOの0.75μL、およびのためのポリメラーゼの0.25μLを組み合わせることにより、マスターミックスを準備各反応。クーラー内のすべての反応成分を組み立て、最後のポリメラーゼを追加します。ピペッティングにより完全に混和します。マスターミックスを調製する際にピペッティング誤差を考慮して、反応数に2つの余分なサンプルを加えます。
- PCR反応のセットアップ：
注：各サンプルは3つの別々の25μlの反応で増幅されることを意味、三重に増幅を行います。各プライマー対で無テンプレート水の制御を実行します。汚染の導入を避け、迅速しかし注意深く作業してください。- 個々のキャップで8ウェルストリップをラベルし、PCRクーラーに配置します。
- 最初にピペットでマスターミックス90μlのよく。
- リバースプライマー（ 補足ファイル1）の2μlを添加します。慎重に、表1に各サンプルに使用されるリバースプライマーのバーコードをメモしておいてください。
- よく混ぜ、第四ウェル（無鋳型対照）にマスターミックス23μLを移します。
- 第四のウェルに水の2μLを加えます。
- 最初のウェルに適切なサンプルの6μlを添加します。よく混合し、第2のウェルに25μlのを転送します。変更のヒントと第3ウェルに第一のウェルから別の25μlのを転送します。しっかりと処理中のウェルまたはキャップの内側に触れないように確認しながら、すべてのよくキャップ。
- 各サンプルについて、この手順を繰り返します。
- PCR増幅を行います
- サーモサイクラーにストリップチューブを移し、次のプログラムを実行します。続いて98℃で10秒間の30サイクル、57℃で30秒間、および72℃で12秒、続いて98°C、で30秒10分は、72℃、最終保持aで開催しますトン4°C。
- クリーン実験台で次の手順を実行します。迅速壁から液体を収集するためにチューブをスピン。滅菌ラベルされたチューブに、75μlの総容量で、各試料から三連のPCR反応を兼ね備えています。また、別々の滅菌チューブにそれぞれ無鋳型対照の25μLを移します。まだ異なるサンプルからのアンプリコンを結合しないでください。
- ゲル電気泳動によるサンプルの成功したPCR増幅の検証。
- 各アンプリコン、水管理、及びラダー21を保持するのに十分な井戸を用いて1.5％アガロースゲル（1×TAEバッファーの100ミリリットル中1.5グラムアガロース粉末）を準備します。
- ゲルが硬化（約30分）が、泳動用のサンプルを準備する：新しい、ラベルされたチューブに6Xローディング色素の1μLを加えます。そのチューブに、アンプリコンの5μlを添加し、ピペッティングにより混合します。
- ゲルが設定したときは、櫛を削除する電気泳動槽にゲルを置き、1×TAE緩衝液でタンクを満たし。 第一のウェルに、DNAラダーの5μlを添加。
- 別のウェルにロードしたサンプルアンプリコンの5μLを。負荷の別々のウェルに無鋳型アンプリコンの5μlの。各試料について、必要に応じて続行します。
- すべてのサンプルがロードされたときは、所定の位置にタンクのふたをスライドさせ、120に電源をオンにV.ゲルは30のために実行を許可する - 60分。
- UV光下でゲルを表示します。
- 380bpの周りに単一の強いバンドに注目することによって、各試料の増幅の成功を確認してください。二重のバンドがある場合は、別の逆バーコード（ステップ2.3）でサンプルを再増幅します。全くバンドが存在しない場合は、同じ逆バーコードや新しい逆バーコード（ステップ2.3）のいずれかを使用してサンプルを再増幅します。再増幅に失敗した場合、PCR阻害剤は、PCR阻害物質を除去するためにカラムベースのDNAクリーンアップを実行する場合には、試料中に存在することができます。
注：成功した増幅が可能ではないかもしれない場合における細菌のDNA濃度またはiginalサンプルが不十分（<5 ngの/μL）です。 - 無鋳型対照のバンドが存在しないことに注目することによって、試薬の汚染がないことを確認します。
- 380bpの周りに単一の強いバンドに注目することによって、各試料の増幅の成功を確認してください。二重のバンドがある場合は、別の逆バーコード（ステップ2.3）でサンプルを再増幅します。全くバンドが存在しない場合は、同じ逆バーコードや新しい逆バーコード（ステップ2.3）のいずれかを使用してサンプルを再増幅します。再増幅に失敗した場合、PCR阻害剤は、PCR阻害物質を除去するためにカラムベースのDNAクリーンアップを実行する場合には、試料中に存在することができます。
- -20℃でアンプリコンの残りの70μLを保管してください。それはバンドが得られなかったと仮定し、無テンプレートコントロールの残りの20μLを捨てます。
3.図書館プールとハイスループットシーケンシング
- 単一の滅菌チューブに各アンプリコンの - （5μlの2）等容積を組み合わせることにより、アンプリコンプールを作成します。サンプルからのバンドが特に弱い見えた場合は、サンプルの残りの部分に2倍容量の相対を追加します。
- 製造元の指示22以下、PCRクリーンアップキットを使用して、アンプリコンプールからPCRプライマーを削除します。アンプリコンのプールボリュームが100μlの上にある場合は、複数の列でクリーンアップを実行します。注：各列は100μlの容量を有します。
- -20＆＃でライブラリを保存176; Cまたは次のステップに進みます。
- 該当する場合は、最終的なライブラリーを作成するために、プライマーを含まないアンプリコンプールを兼ね備えています。分光光度計や蛍光システム23を使用して、ライブラリのDNA濃度を決定します。 1.8の間で260/280比 - 2.0は、純粋なDNAの指標です。
- 20 nMのにライブラリを希釈します。電気泳動装置を用いて400 bpの周りに単一のバンドを可視化することによって、ライブラリの品質を確認してください。蛍光システム23を使用して、ライブラリの濃度を確認してください。
- 2 nmのライブラリーを希釈するために水に最終1:10希釈を行います。次に、無期限に20℃でライブラリを保存します。
- 必要な3つの配列決定プライマーを用いて、最終的なライブラリーのアリコートを送る（、1を読む2を読み、インデックス、マテリアル/機器の表を参照）イルミナシーケンサーで配列決定するために。 300未満のサンプルは、配列決定のために多重化されている場合は、Oシングルエンド300bpのランを使用し、12 bpのインデックスで読み取ります5 PMの最終ライブラリー濃度と10％の変性PHIXスパイク付きのMiSeq、ナ。詳細なシーケンシング手順についてCaporaso ら ISME J、2012 10の補足資料を参照してください。
4.配列分析
注：ここで説明はQIIME 1.8.0ソフトウェアパッケージを使用して、配列解析のための基本的なパイプラインです。簡単にするために、提供されているコマンドは、12 bpのインデックスファイルがindex.fastqと呼ばれ、300 bpのシークエンスは、ファイルがsequences.fastqと呼ばれて読んで読んで、マッピングファイルがmapping.txtと呼ばれていることを前提としています。 QIIMEまたはMacQIIME 16をインストールし、これらのコマンドを実行するには、UNIXの基本を理解しておきます。でQIIMEへの完全なガイドを読みます：
- 実験（ 表1）のためのマッピングファイルを完了します。できるだけ多くのメタデータを含みます。バッチ効果があるかどうかを決定するために、サンプルを抽出または同一バッチ内で増幅されたメモ。
- シーケンシングの品質を確認することは、FastQC（http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）として、プログラムをチェックし、高スループットシーケンスデータの品質を使用して読み取ります。 図5は、塩基当たりシーケンスの品質を実証しますそれが成功の実行から期待することができます。
注：シーケンサは、ベースが誤って呼び出されていることを確率に対応する各ヌクレオチドベースPhredクオリティスコアを割り当てます。 10のPhredクオリティスコアは、ヌクレオチドが誤って割り当てられていることを10％の確率があることを示しますedは、20 30、0.1％の確率を示し、1％の確率を示し、40（可能な限り最高のスコアが）0.01％の確率で24を示しています。 - キーとしてマッピングファイルを使用して、逆多重化、品質フィルタ配列決定データは、このコマンド25を実行することにより、（「sl_out」と呼ばれるこの場合には、）フォルダに結果を保存します。split_libraries_fastq.py --rev_comp_mapping_barcodes -i sequences.fastq -o sl_out / -b index.fastq -m mapping.txt -q 29
注：Qフラグが最大許容できないPhredクオリティスコアを示し、 例えば、「-q 29は、「ベースコールの99.9％の精度を確保、30以下PHREDスコアを有する任意の配列が除外されます。 - Greengenes 16S操作的分類単位（OTU）リファレンス・データベース26（http://qiime.org/home_static/dataFiles.html）を使用して、このコマンド27を実行することで、オープン参照OTUピッキング実行します。pick_open_reference_otus.py -i sl_out / seqs。 FNA -r 97_otus.fasta -o ucrss / -s 0.1
注：-sフラグがデノボクラスタリングに含まれる参照データベースに整列させるために失敗したシーケンスの一部。 「0.1 -s " デノボクラスタリングで失敗した配列の10％が含まれています。 OTUピッキングプロセスを並列化し、複数のコアが利用可能な場合は時間に日から処理時間を短縮するために-aフラグを使用してください。 - summarize_taxa.py -i ucress / otu_table_mc2.biom -o summarized_otuSpecies / -L 7：28このコマンドを実行することにより、種レベルでOTUsをマージすることにより、ユーザーフレンドリーな分類学的豊かさのテーブルを作成します。
注：結果のテーブルには、簡単に任意の表計算ソフトで表示することができます。 16SのrRNA塩基配列決定が確実に種レベルの分解能を提供しないことに注意してください。 - QIIMEスクリプトalpha_diversity.pyで数アルファ多様性の指標を計算することによって、各サンプル内の生態系の多様性を決定します。そして、QIIMEスクリプトbeta_diversity.pyを使用して、サンプルの対間の多様性を決定します。
- ビスデータをualize、 例えば 、天皇29プリンシパルを使用して、プロットやヒートマップを調整します。
- QIIMEのcompare_catagories.pyスクリプト30で、例えば 、マッピングファイルカテゴリの正式な統計的比較を実行します。
注意：このコマンドは、もしあれば、マッピングファイルのエラーを示す.htmlのファイルを含む、「mapping_output」と呼ばれる新しいフォルダを、作る組み込みの "validate_mapping_file.py」QIIMEのスクリプトを使用しています。
Representative Results
16S rRNA遺伝子の塩基配列決定を使用して、綿棒からの相対的な細菌の存在量の決意を可能にするプロトコルの一般的な概要は、1【選択プロトコルは人間の膣スワブ用に最適化された図に示されているが、簡単にほとんどの粘膜サンプリングサイトに適合させることができます他のホスト。 図2ビーズビーティングプロトコルを用いて単離することができる高品質のDNAとRNAを示す。 図3は、サンプルと各増幅が正しいの単一の強いバンドが得られた12サンプルの成功したPCR増幅を示しますサイズと各水対照バンドが得られなかった。 図4、配列決定前に最終的なライブラリープールの定量化を示している。 図5のシングルエンド300 bpのMiSeqランの後に典型的なシーケンスの品質プロファイルを示します。
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図1プロトコルの概略概要まず 、核酸は、イソアミルアルコール、フェノール、クロロホルムなどを含む緩衝液中でビーズビーティングによりスワブから抽出されます。 16S rRNA遺伝子の可変領域4は、その後、PCRを用いて得られた核酸から増幅されます。サンプルの数百までからのPCRアンプリコンは、単一の実行に合わせて、配列決定されます。結果のシーケンスは、相対細菌の存在量を決定するための参照データベースに一致しています。プロトコル全体は約3日で実施することができる。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図2.高品質の核酸抽出は、フェノールを用い：クロロホルムビーズはMを打ちますethod。 （A）DNAの品質、分光光度計を用いて評価しました。 1.8と2.0の間のA260 / A280比は、フェノール又はタンパク質で汚染されていない純粋な核酸を示している。（B）カラムクリーンアップの後、このプロトコルは高品質のRNAを得ることができる、強力な16Sおよび23S rRNAのピークによって示されました。サンプルは採取後（輸送および保管中に）冷たい保たれていない場合（C）RNAの分解が発生する可能性がありますまたはリボヌクレアーゼが処理中に存在している場合。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
515Fとバーコード806Rプライマーセットを使用して成功した16S rRNAの遺伝子増幅の図3.確認。トップ ）ゲル電気泳動は、380塩基対の周囲の単一バンドの存在を確認するために使用されるInはテンプレートを用いて増幅したすべてのサンプル。バンドの不在が失敗した増幅を示しています。これが原因で、ヒューマンエラーと繰り返されるべきで、そのサンプルからのPCR反応に通常である。 ボトム ）いいえテンプレート（水）コントロールは、バンドの存在を持つべきではありません同じプライマー対と並行して実行されます。水管理におけるバンドの存在は、汚染された試薬を示しています。そのプライマー対のためのテンプレートや水管理の両方のPCR増幅を汚染し、再実行することができる試薬を廃棄する。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
個々の試料のアンプリコンをプールした後、 ライブラリサイズの最終図書館プール濃度および検証の図4.定量。、目最終的なライブラリープールの電子濃度が決定されなければなりません。ライブラリプールはその後さらに2 nMの濃度を達成するために希釈しなければならない。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5.代表バー読むの各位置でのシーケンス品質スコアのプロット。シーケンスの品質は200塩基対の後にドロップするのは正常ですが、平均品質スコアが30以上に維持する必要があり、より大きなバージョンを表示するには、こちらをクリックしてください。この図の。
| #SampleID | バーコード | LinkerPrimer シーケンス | rcbcPrimer | SampleType | 抽出 バッチ | 増幅 プレート | 説明 | |||
| http://qiime.org/_static/Examples/File_：#An例マッピングファイルはで見つけることができます フォーマット/ Example_ マッピング_ FILE.TXT | ||||||||||
| AG2350 | TCCCTTGTCTCC | CCGGACTACHVGGGTWTCTAAT | rcbc000 | 頸部の 綿棒 | 1 | A | ||||
表1 のマッピングファイルのテンプレート。クレアティン正確かつ徹底したマッピングファイルが正常にプロトコルを実行するために重要です。マッピングファイルはQIIMEを実行するために必要とされるだけでなく、それはまた、サンプルバーコードとメタデータとの間のリンクを維持するために、任意の体系的バイアス（ 例えば、バッチ間変動）のデータを分析すること、および決定するために研究を可能にしますメタデータと細菌集団の間で興味深い相関関係。ベアボーンマッピング・ファイルが提供されていますが、ユーザーは、可能な限りメタデータを含むなど、多くの列を追加することをお勧めします。膣スワブのための追加のメタデータの例としては、綿棒コレクション、ホルモン避妊薬の種類（該当する場合）、性感染症検査結果などの参加の年齢、日付/時間を含みます
バーコードリバースプライマー配列 10 の補足ファイル1.一覧 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
Discussion
ここでは、人間の膣スワブ内での相対的な細菌存在量の同定および特徴付けのためのプロトコルについて説明します。このプロトコルは、容易にそのような糞便や他の身体部位のスワブのような他のサンプルタイプ、および多種多様な供給源から収集されたサンプルに適合させることができます。フェノールおよびクロロホルムの緩衝溶液中のビーズビーティングによる核酸の抽出は、臨床研究を通じて収集貴重なサンプルを扱うときに特に重要である、DNAとRNAの両方を単離することができます。 RNAの同時コレクションは、RNA-seqのを介して機能性細菌、ホスト、およびウイルスの寄与を決定する機会を提供しながら、単離された細菌DNAは、細菌の分類学的同定およびゲノムアセンブリに最適です。記載したプロトコルを正常ヒト、イヌ、および環境サンプル10を含むサンプルタイプの広範囲に展開された検証一工程プライマーセットを使用して
このプロトコルの核酸抽出部分をフェノール及びクロロホルムで作業する際に必要な安全上の注意事項、および高スループット、96ウェルプレートフォーマットへのパイプラインを自動化するという課題によって制限されます。また、積極的なビーズの鼓動は約6キロベースの断片に機械的溶解ばさみのための細菌のDNAを使用します。より長いDNA断片を、ビーズビーティング秒の期間、下流側アプリケーションに必要である場合houldを短縮します。このプロトコルの細菌同定部分の制限は、16S rRNA遺伝子の塩基配列決定に依存している任意の方法に固有です。 16S rRNAの塩基配列決定属、さらには種レベルに細菌同定のための理想的ですが、まれに歪みレベルの識別を提供しません。 16S rRNA遺伝子のV4可変領域は、ほとんどの細菌種11の間で強固な識別を提供するが、そのようなOligotyping 31のような付加的な計算方法は、正確にこのようなラクトバチルスcrispatusなどの特定の種を同定するために使用される必要があり得ます。このプロトコルは、この目的に向けて使用することができる全ゲノムDNAとRNAの抽出を可能にしても最終的には、特定のサンプル内の正確な細菌の機能的能力についての情報は、単独で、16S rRNA遺伝子の配列決定により決定することができません。
このプロトコルで成功を確保するために最も重要なステップは、汚染のDURを防止するために、細心の注意を取っていまする試料収集、核酸抽出、およびPCR増幅。清潔な手袋を着用してと滅菌綿棒、チューブ、はさみを使って、サンプル収集の時に無菌性を確認してください。コレクション物質の汚染について評価するために、サンプリング時に輸送管に直接追加未使用の綿棒を配置することによって、陰性対照スワブを収集します。ラボでは、唯一の除染物資を含有し、唯一の分子グレード、DNAフリー試薬を用いて滅菌フード内のすべての前の増幅の手順を実行します。核酸抽出時には、各サンプルに新しい滅菌ピンセット、新鮮な手袋を使用し、使用中の場合を除き閉じたすべてのチューブを維持することによって交差汚染を防止します。並行して、未使用の綿棒を処理するサンプル収集及び核酸抽出の両方の無菌性を保証します。未使用の綿棒は、イソプロパノール沈殿及びエタノール洗浄後、ペレットを得てはなりません。ペレットが表示されない場合は、の可能性のあるソースを決定するために、16S rRNA遺伝子の増幅を行います汚染（ 例えば、 連鎖球菌やブドウ球菌の存在は、皮膚の汚染を示すであろう）。また、PCR試薬と反応が汚染されていないことを確認するために並列に鋳型なしコントロール反応でPCR増幅を行います。バンドはテンプレートなしのコントロールに表示されている場合、試薬を廃棄し、新たな試薬と増幅を繰り返します。これらの予防措置をとることは目的の細菌の正常なシーケンシングを保証します。
PCR増幅工程は、ほとんどのトラブルシューティングを必要とする傾向があります。 12サンプルのセットで増幅し、効率性と一貫性の間のバランスを提供します。与えられた増幅セット内のすべてのサンプル全体でのバンドの完全な欠如は、 例えば、試薬を追加し忘れたり、間違ってサーモサイクラーのプログラミングを、系統的な障害を示します。いくつかのサンプルからのバンドの不在は通常、ヒューマンエラーによるものであり、増幅は再-Rでなければなりませんサンプルおよびリバースプライマーの同じペアとアン。バンドの連続不在の場合には、試料は、異なるバーコードを有するリバースプライマーを使用して再増幅することができます。複数のリバースプライマーを用いて繰り返し増幅の失敗は、試料中に存在する阻害剤を示すことができます。その場合には、カラムでDNAを洗浄することは、しばしば大幅に相対的な細菌の存在量を変更することなく、阻害剤を除去します。複数のバンドが増幅後に生じた場合は、異なるリバースプライマーのバーコードでサンプルを再増幅します。
ライブラリー・プールを作成する際に、環境汚染を防止し、単一の特定の製品の増幅を確保することに加えて、成功したシークエンシングは、介護に依存しています。目標は、約シーケンシング同じ数のサンプルあたりの読み込みを保証するために、各サンプルのアンプリコンの等モル量を組み合わせることです。増幅前に核酸濃度が同等である場合は、単純に各SAの等容量を追加しますmpleのアンプリコンライブラリー・プールを作成するときには十分です。核酸の濃度が非常に異なると等量で添加されている場合には、低い核酸濃度を有するサンプルは不十分読み取りの低い数で表されます。この場合には、ゲルのバンドの相対強度に基づいて、低濃度サンプルからアンプリコンのより高い量を添加することが可能です。あるいは、より厳密に各試料の等モル量を、個々のアンプリコンのプライマーを除去蛍光のdsDNA定量キットを使用して、個々のサンプルのアンプリコンの濃度を定量し、正確に組み合わせることも可能です。
バランスのとれたアンプリコンのプールが生成されると、それは慎重にプールの濃度を測定することが重要となります。その後の慎重な希釈およびスパイクでPHIXで読み取り複雑さを増加させるためには、最適な配列決定の結果を達成するために重要です。 sequenを使用するハイスループットシーケンサー合成によってcingフローセル上のクラスタ密度に非常に敏感です。あまりにも低い品質スコア、下位データ出力、および不正確な分波32と、overclusteringになります集中しているライブラリープールをロードします。あまりにも希薄されたライブラリーのプールをロードすると、低データ出力になります。慎重に配列決定前にライブラリープールを定量化することは、最適な結果を保証します。
16S rRNA遺伝子配列決定は、所与の試料内に存在する細菌の包括的な評価を提供し、仮説生成における絶対的に重要な最初のステップです。さらに、メタデータの豊富なセットの存在は、特定の細菌種及び重要な生物学的要因との関連性をテストするための研究を可能にします。また、同一の16S情報は、PICRUSt 33のようなツールを使用して細菌の機能を推定するために使用することができます。最終的な目標とすることができる新規の関連付けを識別するために16S特徴付けを使用することですさらに、ヒトの健康および疾患に対する細菌microbiomeの影響の成長を続ける当社の理解に追加、モデル系でテストおよび検証。
Acknowledgments
我々は、プロトコル上の重要なフィードバックのためにエリザベス・バーン、デイヴィッドGootenberg、クリスティーナGosmannに感謝したいと思います。サンプル調製の指導やデモのためのミーガン・ボルドリッジ、スコット・ハンドリー、シンディモナコ、そしてジェイソン・ノーマン。プロトコルのアドバイスと実りある議論のためのウェンディ・ギャレット、カーティスHuttenhower、スキップヴァージン、そしてブルース・ウォーカー。および配列決定をサポートするためのジェシカHoisington-ロペス。この作品は、ビル・アンド・メリンダ・ゲイツ財団とNIAID（1R01AI111918）によってサポートされていました。 DSKは、バローズウェルカム基金から追加支援を受けました。 MNAは、受賞数NIGMSからT32GM007753、とポールとデイジー・ソロスフェローシップによってサポートされていました。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしもNIGMSまたはNIHの公式見解を示すものではありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment: | |||
| Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | 607 | |
| PCR workstation | Any PCR hood can be used, e.g., the AirClean 600. | ||
| Thermocycler | Any thermal cycler with a heated lid can be used, e.g., MJ Research PTC-200. | ||
| Electrophoresis system | Any electrophoresis system can be used, e.g. the Thermo Scientific Owl EasyCast B1 Mini Gel Electrophoresis system. | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | 2000C | Any other DNA quantification method will be sufficient |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 | An alternative is the Agilent 2200 TapeStation Instrument. Not absolutely necessary but very helpful. |
| MiSeq or HiSeq | Illumina | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials: | |||
| Catch-All Sample Collection swab | Epibio | QEC89100 | Other swabs can be used but the Catch-All swab is recommended by the Human Microbiome Project. |
| ELIMINase | Fisher | 04-355-31 | |
| SteriFlip 50 ml filtration device (0.22 µm) | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| 0.1 mm glass beads | BioSpec | 11079101 | |
| 2 ml screw-cap tubes | Sarstedt | 72.694.006 | For bead beating |
| UltraPure 5M NaCl | Life Technologies | 24740-011 | Molecular Biology Grade |
| 1 M Tris-HCl | Ambion (Invitrogen) | AM9856 | Molecular Biology Grade |
| 0.5 M EDTA | Ambion (Invitrogen) | AM9260G | Molecular Biology Grade |
| Sodium Dodecyl Sulfate, 20% Solution | Fisher | BP1311-200 | Molecular Biology Grade |
| UltraPure DNase/RNase-free distilled water | Ambion | 10977-015 | Molecular Biology Grade, for buffer preparation |
| 2-Propanol BioReagent, for molecular biology, ≥99.5% | Sigma | I9516-500ML | Molecular Biology Grade |
| Phenol:Chloroform:IAA, 25:24:1 | Invitrogen | AM9730 | Warning: Toxic |
| 3 M Sodium Acetate, pH 5.5 | Life Technologies | AM9740 | Molecular Biology Grade |
| Disposable sterile polystyrene forceps, PS | Cole Parmer | EW-06443-20 | |
| 1.5 ml, clear, PCR clean tubes | Eppendorf | 22364120 | |
| PCR grade water | MoBio | 17000-11 | For PCR |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| dNTP mix | Sigma | D7295-0.5mL | |
| 0.2 ml PCR 8-tube with attached clear flat caps, natural | USA Scientific | 1492-3900 | Any 8-tube strips that are DNase, RNase, DNA, and PCR inhibitor free will work |
| Agarose | BioExpress | E-3121-25 | |
| 50x TAE buffer | Lonza | 51216 | |
| DNA gel stain | Invitrogen | S33102 | |
| 6x DNA Loading Dye | Thermo (Fisher) | R0611 | |
| 50 bp GeneRuler Ladder | Thermo (Fisher) | SM0373 | |
| AllPrep DNA/RNA kit | Qiagen | 80284 | |
| UltraClean PCR Clean-up Kit | MoBio | 12500-100 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P11496 | An alternative is Qubit Fluorometric Quantification (Life Technologies) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primers: | |||
| 515F (forward primer) 5'-AATGATACGGCGACCACCGAG ATCTACACTATGGTAATTGT GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3' |
Order at 100 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 µM. **Critical: primers must be resuspended with MoBio PCR Grade Water (see above) in a hood to avoid contamination.** | ||
| Reverse primers, see the Supplemental Code File and: ftp://ftp.metagenomics.anl.gov/data/misc/EMP/SupplementaryFile1_barcoded _primers_515F_806R.txt |
IDT is recommended | If ordering large sets of primers, order as a 96-well plate at the 100 nmole scale. Resuspend at 100 μM. Full directions for primer ordering and resuspension at http://www.earthmicrobiome.org/files/2013/04/EMP_primer_ordering_and _resuspension.doc. **Critical: primers must be resuspended with MoBio PCR Grade Water (see above) in a hood to avoid contamination.** |
|
| Read 1 Sequencing Primer 5'-TAT GGT AAT TGT GTG CCA GCM GCC GCG GTA A-3' | 25 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 µM. | ||
| Read 2 Sequencing Primer 5'-AGT CAG TCA GCC GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3' | 26 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 µM. | ||
| Index Sequencing Primer 5'-ATT AGA WAC CCB DGT AGT CCG GCT GAC TGA CT-3' | 27 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 µM. | ||
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | Required if performing the sequencing in-house. If the sequencing will be performed by a third-party sequencing center, they will already have PhiX. |
References
- Huttenhower, C. Structure, function and diversity of the healthy human microbiome. Nature. 486, 207-214 (2012).
- O'Hanlon, D. E., Moench, T. R., Cone, R. A. Vaginal pH and microbicidal lactic acid when lactobacilli dominate the microbiota. PloS one. 8, e80074 (2013).
- Aldunate, M. Vaginal concentrations of lactic acid potently inactivate HIV. The Journal of antimicrobial chemotherapy. 68, 2015-2025 (2013).
- Anahtar, M. N., et al. Cervicovaginal bacteria are a major modulator of host inflammatory responses in the female genital tract. Immunity. 42, 965-976 (2015).
- Reyes, A., Wu, M., McNulty, N. P., Rohwer, F. L., Gordon, J. I. Gnotobiotic mouse model of phage-bacterial host dynamics in the human gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 20236-20241 (2013).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical biochemistry. 162, 156-159 (1987).
- Srinivasan, S., et al. Temporal variability of human vaginal bacteria and relationship with bacterial vaginosis. PloS one. 5, e10197 (2010).
- Dols, J. A., et al. Microarray-based identification of clinically relevant vaginal bacteria in relation to bacterial vaginosis. American journal of obstetrics and gynecology. 204, 301-307 (2011).
- Segata, N., et al. Metagenomic microbial community profiling using unique clade-specific marker genes. Nature methods. 9, 811-814 (2012).
- Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. The ISME journal. 6, 1621-1624 (2012).
- Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, Suppl 1 4516-4522 (2011).
- 16S rRNA Amplification Protocol. Earthmicrobiome Project. , Available from: www.earthmicrobiome.org (2015).
- Ravel, J., et al. Vaginal microbiome of reproductive-age women. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, Suppl 1 4680-4687 (2011).
- Srinivasan, S., et al. Bacterial communities in women with bacterial vaginosis: high resolution phylogenetic analyses reveal relationships of microbiota to clinical criteria. PloS one. 7, e37818 (2012).
- Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature methods. 7, 335-336 (2010).
- Werner, J. MacQIIME. , Available from: http://www.wernerlab.org/software/macqiime (2015).
- Schloss, P. D., et al. Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Applied and environmental microbiology. 75, 7537-7541 (2009).
- Edgar, R. C. UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads. Nature. 10, 996-998 (2013).
- NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer, V1.0 User Manual. Thermo Fisher Scientific. , Available at: http://www.thermoscientific.com/content/dam/tfs/ATG/CAD/CAD Documents/Product Manuals & Specifications/Molecular Spectroscopy/UV Visible Spectrophotometers/Spectrophotometer Systems/NanoDrop/NanoDrop-2000-User-Manual-EN.pdf (2009).
- AllPrep DNA/RNA Mini Kit. Qiagen. , Available from: https://http://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/rna-sample-technologies/dna-rna-protein/allprep-dnarna-mini-kit/ - orderinginformation (2015).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of visualized experiments. , (2012).
- UltraClean PCR Clean-Up Kit Instruction Manual. MoBio. , Available from: http://www.mobio.com/images/custom/file/12500(1).pdf (2013).
- Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent. Invitrogen. , Available at: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/mp07581.pdf (2008).
- Quality Scores for Next-Generation Sequencing. Illumina. , Available from: http://www.illumina.com/documents/products/technotes/technote_Q-Scores.pdf (2011).
- split_libraries_fastq.py. QIIME. , Available from: http://qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.html (2015).
- DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Applied and environmental microbiology. 72, 5069-5072 (2006).
- pick_open_reference_otus.py. QIIME. , Available from: http://qiime.org/scripts/pick_open_reference_otus.html (2015).
- summarize_taxa_otus.py. QIIME. , Available from: http://qiime.org/scripts/summarize_taxa.html (2015).
- Vazquez-Baeza, Y., Pirrung, M., Gonzalez, A., Knight, R. EMPeror: a tool for visualizing high-throughput microbial community data. GigaScience. 2, 16 (2013).
- Comparing categories. QIIME. , Available from: http://qiime.org/tutorials/category_comparison.html (2015).
- Eren, A. M., et al. Exploring the diversity of Gardnerella vaginalis in the genitourinary tract microbiota of monogamous couples through subtle nucleotide variation. PloS one. 6, e26732 (2011).
- Diagnosing and preventing flow cell overclustering on the MiSeq system. Illumina. , Available from: http://support.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/products/other/miseq-overclustering-primer-770-2014-038.pdf (2015).
- Langille, M. G., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature biotechnology. 31, 814-821 (2013).
