Introduction
Planter er vidt anvendt til at producere fødevarer råvarer som frugtjuice, men de kan også udvikles som platforme til fremstilling af højere værdi biofarmaceutiske produkter 1-3. I begge tilfælde nedstrøms (DSP) begynder ofte med udvinding af væsker fra væv såsom blade eller frugter, efterfulgt af afklaringen af partikel-lastet ekstrakter 4,5. Til fremstilling af biofarmaceutiske, kan omkostningerne ved DSP udgøre op til 80% af de samlede produktionsomkostninger 6,7, og dette til dels afspejler den høje partikel byrde stede i ekstrakter fremstillet af forstyrrende metoder såsom klinge-baserede homogenisering 8,9 . Selv rationel udvælgelse af filterlag, der passer partikelstørrelsesfordelingen i ekstrakten kan øge filter kapacitet og reducere omkostningerne 10,11, kan forbedringen aldrig overstige loftet for absolut kapacitet defineres af antallet af partikler, der beholdes prenhed af filterareal at opnå afklaring.
Loftet kan ophæves, hvis færre partikler nå overfladen af de fineste filtre i filtrering toget, og dette kan opnås, hvis dispergerede partikler er blandet med polymerer kendt som flokkuleringsmidler, der fremmer sammenlægning til at danne store flokke 12. Sådanne flokke kan tilbageholdes længere opstrøms ved grovere og mindre dyre posefiltre, hvilket reducerer partikel byrde nå finere og dyrere dybdefiltre. Polymererne skal have sikkerhedsprofil er egnede til deres formål, f.eks til biofarmaceutiske de skal være i overensstemmelse med god fremstillingspraksis (GMP), og typisk skal de have en molær masse> 100 kDa og kan enten være neutral eller opkrævet 13. Ud fra følgende betragtninger neutrale flokkuleringsmidler generelt virker ved krydsbinding dispergerede partikler forårsager deres sammenlægning og dannelse af flokke med diametre> 1 mm 11, ladede polymerer neutralisere ladningen af dispersed partikler, hvilket reducerer deres opløselighed og dermed forårsager nedbør 14.
Flokkulering kan forbedres ved at justere parametre såsom pH eller konduktivitet, og polymeren type eller koncentration, der svarer egenskaberne af ekstraktet 15,16. For tobak ekstrakter forbehandlet med 0,5-5,0 g L -1 polyethylenimin (PEI), en større end 2 gange stigning i dybden filter kapaciteten blev rapporteret i et 100-L pilotskala proces. Omkostningerne ved denne polymer er mindre end € 10 kg -1 så sin introduktion i processen resulterede i besparelser på omkring € 6000 for filtre og hjælpematerialer pr parti 16 eller endnu mere, når det kombineres med cellulose-baseret filter hjælpemidler 17. Alligevel er prognosemodeller forpligtet til at vurdere de a priori økonomiske fordele ved flokkuleringsmidler fordi deres optagelse kan kræve hold trin på 15-30 min 16,18, hvilket resulterer i yderligere investeringsomkostninger for opbevaringtanke. Men der er i øjeblikket ingen mekanistiske modeller, der kan forudsige resultatet af sådanne forsøg på grund af den komplekse karakter af flokkulering. Derfor blev en mere passende design-for-eksperimenter (DOE) tilgang 19 udviklet som beskrevet i denne artikel. En protokol til den almindelige DoE fremgangsmåde er for nylig blevet offentliggjort 20.
Små enheder er nu tilgængelige for high-throughput screening af flokkulering vilkår 21. Imidlertid kan disse anordninger ikke realistisk simulere betingelser under flokkulering af planteekstrakter fordi dimensionerne af reaktionsbeholderen (~ 7 mm for brønde på en plade med 96 brønde) og partiklerne eller flokkene kan være mindre end en størrelsesorden fra hinanden. Dette kan påvirke blande mønstre og dermed den prædiktive effekt af modellen. Desuden kan det være vanskeligt at nedskalere processer, der involverer udfældning på grund af ikke-lineære ændringer i blanding adfærd og bundfald stahed 22. Derfor er denne artikel beskriver en bench-top-skala screening system med en kapacitet på 50-75 prøver om dagen, hvilket giver resultater, der er skalerbar fra den oprindelige 20 ml reaktion volumen til et 100 L pilotskala proces 16. Når det kombineres med en doe tilgang, tillader dette prædiktive modeller, der skal anvendes til procesoptimering og dokumentation som del af en kvalitet-by-design koncept.
Den nedenfor beskrevne metode kan også tilpasses til biofarmaceutiske produceret i cellekultur-baserede processer, hvor flokkuleringsmidler bliver også betragtes som en omkostningsbesparende værktøj 23. Den kan også bruges til at modellere udfældning af målproteiner fra et råt ekstrakt som en del af en rensning strategi, som demonstreret for β-glucuronidase produceret i raps, majs og sojabønne 24,25. En detaljeret beskrivelse af flokkuleringsmiddel egenskaber kan findes andre steder 16,26 og det er vigtigt at sikre, at polymeren concentrtioner er enten ikke-giftige eller under skadelige niveauer i det endelige produkt 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Udvikle en tilstrækkelig eksperimentel strategi
- Identificer de miljømæssige og procesparametre, der er relevante for flokkulering procedure, der skal etableres eller optimeret, dvs. hvilke faktorer har den stærkeste effekt på flokkulering. Typisk er der flere sådanne parametre så en doe metode som for nylig beskrevet 20 er nødvendig på grund af manglen på mekanistiske modeller.
- Vælg parametre (faktorer) baseret på data fra litteraturen 12, forudgående viden og erfaring med systemet. Typiske faktorer omfatter pH, buffer ledningsevne, inkubationstid og temperatur samt polymer type og koncentration 15,16,27.
- Brug de samme referencer (se 1.1) for at definere meningsfulde intervaller for hver numerisk faktor og niveauer for kategoriske faktorer.
- Definer de eksperimentelle resultater (svar), der skal overvåges og anvendes til at vurdere effektiviteten af flokkulering. Afhængigt af systemet, dettekan være filtrat eller supernatant uklarhed, faldhastighed, aggregat størrelse eller kapacitet et efterfølgende filter 16,23,28-30.
- Sørg analyserne anvendes til måling svarene er kvantitative, robust og gentagelig / reproducerbare, således at de resulterende data af høj kvalitet kan suppleres med forsøg udført senere, eller af en anden operatør.
- Vælg en DoE typen passer antallet af faktorer, der skal undersøges, og graden af viden, der allerede akkumuleret om systemet. Brug tilgængelig litteratur til at identificere en egnet DoE typen 20.
- Vælg en screening design, hvis der er lidt information om flokkuleringssystemet, der skal undersøges, et stort antal parametre skal screenes eller lidt om meningsfulde intervaller for parametrene. Typiske screening designs er fulde og fraktilblok designs. Indbefatter center punkter i konstruktionen, hvis forventes de parametre, der har en ikke-lineær effekt, f.eks 19.
- Vælg et svar overflade metode (RSM), f.eks centrale komposit design (CCD) 31 eller optimal 32,33, hvis kun et par faktorer med kendte intervaller skal karakteriseres præcist.
- Opsætning af DoE med passende software, der sikrer a priori kvalitetskriterier såsom den del af design plads er opfyldt 20.
2. Forbered flokkulering Eksperimenter
Figur 1: Plant ekstrakt flokkulering arbejdsgang: proces skala (til venstre) og stationære skala (til højre). Efter protein ekstraktion med vandige buffere, er dispergeret partikler af cellerester aggregeret ved tilsætning af flokkuleringsmidler. Aggregaterne fjernes derefter ved en kaskade af pose og dybdefiltrering og kapaciteten af dissefiltre sammen med filtratet turbiditeter kan anvendes direkte til at måle effektiviteten af flokkulering.
- Udvikle en generel eksperimentel Work Flow (figur 1).
- Brug en ekstraktionsindretning, der resulterer i den samme partikelstørrelsesfordeling forventede (eller allerede observeret) til endelige ansøgning skala, fx en specialiseret homogenisator. Hvis det er muligt, designe en skala-down modellen af ekstraktoren som beskrevet for homogenisering af tobaksblade 10.
- Definer de ekstrakt mængder anvendes under flokkulering eksperimenter (her 20 ml). Vælg et volumen, der tillader et repræsentativt antal partikler at være til stede i reaktionsbeholderen, f.eks flokkulering eksperimenter i 20 ml aliquoter gav reproducerbare og skalerbare resultater for tobak ekstrakter indeholdende ~ 7% [w / v] faststoffer 34 og partikelstørrelser på ~ 0,5 um til ~ 3 mm 16.
- Design alle overvågnings- og post-flokkulering operationer, således at they er repræsentative for den endelige ansøgning skala, fx vælge filtre med samme adfærd fastholdelse partikel som dem, der anvendes ved produktionen skala.
- Dyrk de planter, som ekstrakterne kan afledes.
- Brug samme plantelinie, her Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1, og dyrkningsbetingelser der vil blive anvendt i produktionen som tidligere beskrevet 33.
- Hvis andre foder lagre vil blive behandlet, forberede disse foder lagrene, så de er repræsentative for den endelige ansøgning skala, fx bruge autentiske buffere, tage hensyn til eventuelle fortyndingstrin under processen og holde sig til den forventede pH og ledningsevne, her pH 7,5 og ledningsevne 30 ms cm-1.
- Forbered Filtration Utilities, Turbiditet-overvågningsudstyr og Sampling Fartøjer.
- Skær filtermaterialer til de ønskede størrelser, her 15 x 15 cm 2, hvis de ikke er klar til ose moduler. Sikre alle overvågning og analyse enheder er funktionelle og mærke alle prøverør.
- Selvom disse er simple opgaver, forberede disse elementer i tide at sikre, at de ikke vil forårsage afbrydelser i løbet af de faktiske flokkulering eksperimenter. Undgå forsinkelser, fordi de kan forstyrre de resultater, eftersom flokkulering er en tidsafhængig proces.
- Forbered flokkuleringsmiddel Stock Solutions. ADVARSEL: Bær passende personlige værnemidler ved håndtering flokkuleringsmidler, f.eks handsker. Materialerne kan være farlige (faresedler i henhold til Europa UE 67/548 / CEE, 1999/45 / CE omfatter N, Xi eller Xn). Undgå støv og henviser til de sikkerhedsdatablade. Arbejde under en emhætte.
- Vælg en bestand koncentration for hver flokkuleringsmiddel, her 80,0 g L -1 for de to PEI flokkuleringsmidler, der blev brugt. Vælg koncentrationer så høje som muligt for at undgå prøve fortynding ved tilsætning af flokkuleringsmiddel, hvilket ville reducere partikel koncention og dermed påvirke flokkulering effektivitet.
- Konto for en på forhånd fortynding, der afspejler producentens formulering af polymeren, f.eks hvis polymeren allerede leveres som en vandig 50% [w / v] løsning. Flokkuleringsmiddel stamopløsninger af 4-8% [w / v] viste sig at være den mest egnede hidtil.
- I betragtning af de ovennævnte forhold, skal du sørge for flokkuleringsmiddel koncentrationen ikke genererer en meget tyktflydende løsning, der hæmmer pipettering, hvilket kan forårsage fejl, fordi den endelige flokkuleringsmiddel fusion ikke er justeret korrekt.
- Brug den samme bestand koncentration for alle flokkuleringsmidler hvis muligt, fordi det vil gøre det lettere at opsætning af en pipettering ordning (2.5) og dermed reducere risikoen for fejl.
- Justér pH og ledningsevne af hvert flokkuleringsmiddel stamopløsning til at matche betingelserne for ekstrakterne, her pH 4-10 og ledningsevne 15-55 mS cm -1. Forbered individuelle aktier for et enkelt flokkuleringsmiddel hvis mmalm end ét sæt af pH og / eller ledningsevne betingelser testes for denne polymer.
- Forbered flokkuleringsmiddel stamopløsninger frisk, ikke længere end 48 timer før brug. Selvom flokkulering kan induceres med polymer lagre opbevares i mere end 4 uger, kan effektiviteten falde som følge af polymer hydrolyse ved høje eller lave pH-værdier. Se producentens dokumentation for yderligere detaljer.
- Sørge for, at de udvalgte for DoE parametre kan justeres præcist for hver prøve under forsøget, fx sikre, at der varme / køle bade rådighed til at justere inkubationstemperaturer, her 4 ° C, 20 ° C og 37 ° C. Hvis blanding under flokkulering er en del af forsøget, at blandingsforholdet enheden er repræsentativ for den endelige ansøgning skalaen i form af kritiske parametre som effekt.
- Konverter DoE Schedule i en Pipetting Scheme.
- Konverter de forskellige flokkuleringsmiddel koncentrationer at være tested i mængder stamopløsning, der vil blive til ekstraktet prøver: opdele endelige flokkuleringsmiddel koncentrationer af bestanden koncentrationen og gange med prøven anvendte volumen i flokkulering eksperimenter. Identificer den største resulterende endelige volumen, fx hvis 20 ml prøve blandes med et maksimum på 2 ml flokkuleringsmiddel stamopløsning dette vil være 22 ml.
- Beregn rumfang puffer nødvendig for at opretholde den samme endelige volumen i alle flokkulering portioner baseret på den største mængde flokkuleringsmiddel materiel, der skal tilføjes, fx hvis skal tilføjes 0,75 ml flokkuleringsmiddel lager til en prøve derefter 1,25 ml buffer er nødvendig for at opretholde den endelige prøve volumen på 22 ml (2.5.1).
- Opsummere de volumener af flokkuleringsmiddel stamopløsning for hver polymer og flokkulering betingelse at beregne de absolutte mængder af stamopløsningen, der er nødvendige for DoE.
- Harvest tobaksblade samt Forbered Uddrag.
- Fjern det øverste seks leaves (eller så mange som angives med i processen vejledning) fra tobaksplanter af en passende alder, fx 6 uger gamle, og i en passende udsugning enhed såsom en homogenisator eller skrue presse.
- Tilføj tre volumener ekstraktionsbuffer per gram biomasse, f.eks 300 ml pr 100 g, og blend i 8 min.
- Forbered individuelle ekstrakter med de relevante buffere hvis forskellig pH og / eller ledningsevne testes. Her drejer det sig homogenisering af plantematerialet i 3 x 30 sekunder i en blender eller en saftpresser 34.
- Alternativt forberede ekstrakten på en måde, repræsenterer hele processen, der undersøges.
- Alikvot Udtræk og Tilsæt Buffer.
- Manuelt og grundigt omrøres ekstrakten under hele proceduren for at sikre at prøverne er homogene med en jævn fordeling af partikler.
- Netop distribuere ekstrakten blandt de præ-mærkede reaktionsrør ved dekantering,her 20 ml i hver beholder. Self-stående 50 ml rør forenkler håndtering og er ideelle til 20 ml prøver.
- Tilsæt mængden af hver ekstraktion buffer, der kræves for at opretholde det faste slutvolumen for hver enkelt reaktionsrør under anvendelse af en egnet pipette.
3. flokkulere planteekstrakter med forskellige polymerer
- Pipette den nødvendige mængde flokkuleringsmiddel stamopløsning, her 0,1-2,0 ml, til prøverne i rækkefølge som angivet af det randomiserede løb orden DoE. Bland hver prøve umiddelbart efter tilsætning af flokkuleringsmiddel ved intens manuel rystning i præcist 20 sek.
- Om nødvendigt justeres ryster tid til andre foder bestande at sikre grundig blanding, men strengt sikre ensartede blandingsforhold tider for alle prøver. Husk på, at langvarig blanding kan forårsage irreversibel forstyrrelse af flokke og anvendes på uensartet kraft i løbet ryster kan fordreje flokkulering resultater.
- Valgfrit: Ændre proceduren beskrevet ovenfor for samtidig anvendelse af to eller flere flokkuleringsmidler.
- Mulighed 1: I stedet for en enkelt polymer tilføje en blanding af to eller flere flokkuleringsmidler, her PEI og chitosan. Brug flokkuleringsmiddel kombinationer defineret i DoE. Indarbejd forholdet og absolutte koncentrationer af polymerer som individuelle parametre under DoE setup (1.1).
- Mulighed 2: Tilføj to eller flere polymerer sekventielt til ekstraktet.
- Brug de individuelle polymerkoncentrationer, deres type, og inkubationstiden mellem hver tilføjelse til ekstraktet, som yderligere faktorer under DoE opsætningen.
- Brug også denne fremgangsmåde til at teste, om den gentagne tilføjelse af en enkelt polymer kan forbedre flokkulering. Brug en trinvis tilsætning for at simulere langsom tilsætning af et flokkuleringsmiddel, fx fire trin, kan hver tilsætning 0,25 ml 80 g L -1 flokkuleringsmiddel lager til et 20 ml volumen over 4 min efterligne tilsætning af flokkuleringsmiddel meden strømningshastighed på 0,25 ml min-1.
- I alle tilfælde, identificere en ny maksimal slutprøven volumen for denne opsætning ved at tilføje de maksimale mængder af alle flokkuleringsmidler til prøvevolumenet, her stadig 22 ml, og genberegne den fornødne mængde flokkuleringsmiddel stamopløsninger og buffere til justering volumen evt.
- Inkuber prøverne for de tider, der er defineret i DoE, typisk 3-30 min, for at tillade fnug formation. Sørg for at alle andre inkubationsbetingelser, fx temperatur, der er indstillet i henhold til DoE.
- Observer og dokumenter fnug formation. Optag forløbet af fnugdannelse efter behov, fx som mm af fnug afregning pr min ved måling af højden af de afviklede faststoffer. Hvis det er nødvendigt, forlænge flokkulering i en længere tidsperiode, såsom natten over.
- Filtrer flokkulerede Extract.
- Brug filtermaterialer forberedt tidligere (2.3) for at afklare flokkulerede ekstrakt efter den relevanteinkubationstid ved dekantering den flokkulerede prøver gennem filtermaterialet og ind i en ren beholder eller reaktionsrør.
- Må ikke genbruges suspendere afregnet flokkene før filtrering og anvende ekstraktet med med en hastighed på ~ 300 ml min-1 til filteret, svarende til 3-4 sek for en 20 ml prøve.
- Bekræft udførelsen af filtreringstrinnet hvis et andet materiale anvendes i de bench-top forsøg sammenlignet med den endelige proces hvad angår bevarelsen partikel, fx ved måling af partikelstørrelsesfordelingen i begge prøvetyper 11.
- Analyser filtratet i form af uklarhed og / eller partikelstørrelsesfordeling som kræves ved hjælp af passende anordninger, fx en turbidimeter.
- Valgfrit: gentage analysen efter forlænget inkubationstider, fx 12-24 timer, for at undersøge dannelsen eller reformation af ustabile flokke.
- Brug filtermaterialer forberedt tidligere (2.3) for at afklare flokkulerede ekstrakt efter den relevanteinkubationstid ved dekantering den flokkulerede prøver gennem filtermaterialet og ind i en ren beholder eller reaktionsrør.
- Analyser Prøver i form af Pre-definerede responser (1.1.3).
- Tag prøver fra filtraterne og analysere dem for yderligere respons parametre, f.eks koncentrationerne af forskellige målgrupper proteiner eller værdifulde produkter.
- Valgfrit: Analyser retentatet (hovedsagelig tørstof) for de samme parametre for at lukke massebalancen af processen. Især kvantificere virkningen af flokkuleringsmidler på flydende genvinding ved at sammenligne de faste stoffer masse tilbage efter prøver behandles eller ikke behandlet med flokkuleringsmiddel.
- Bekræft datakvalitet og overføre resultaterne til DoE softwaren.
- Kig efter ekstreme værdier i de indsamlede svardata, f.eks uventet høje værdier.
- Sørg for, at alle svardataene flugter deres tilsvarende eksperimentelle betingelser.
- Overfør resultaterne i DoE software og sørg standard og randomiserede køre ordrer ikke er blandet op.
4. Evaluerden DoE
- Brug de indbyggede data analyseværktøjer i DoE software til at udvikle en prædiktiv model som tidligere beskrevet 20.
- Vælg en ordentlig data transformation tilstand, hvis der kræves for at lette model bygning, her log 10. Et forhold større end 10 for største vs. mindste respons værdi indikerer, at der kan kræves en transformation af data. Identificer den mest passende transformation ved hjælp af de relevante statistiske værktøjer, fx en Box-Cox plot 35.
- Vælg en base model, der (i) passer til den valgte DoE (1.2) og (ii) er enig med tidligere viden om systemet, der undersøges, er baseret på en analyse af varians (ANOVA) værktøjer af DoE software, fx en anden ordens polynomium ofte passer bedre til den observerede effekt af inkubationstid end en første ordens polynomium.
- Fjern ubetydelige model faktorer, fx p> 0,05, eller faktor interaktioner iterativt ved at fravælge dem, denreby reducere model kompleksitet og øge dens forudsigelseskraft.
- Bekræft model kvalitet ved at sammenligne R2, justeret R2 og forudsagde R2 sammen med den normale sandsynlighed plot af de studentized restprodukter, restprodukter-vs-run, forudsagde-vs-aktuelle og Box-Cox plotter 36. Alle R 2 værdier skal være inden for en 0,2 interval.
- Sørg for, at den endelige model er enig med grundlæggende antagelser i fysik og termodynamik, fx ingen negative koncentrationer forudsagt.
- Brug modellen til at forudsige forhold, som er mest gunstig for systemet under efterforskning, her en lav turbiditet.
- Vælg de vigtigste reaktioner og deres foretrukne tilstande, f.eks minimal turbiditet. Kombiner disse markeringer ved at maksimere en ønskelige funktion eller lignende værktøjer, som er indbygget i træk af flere ministeriets softwarepakker 36.
- Afhængigt af den tilsigtede anvendelse of modellen, skal du vælge bekræftelse løber at kontrollere de optimale betingelser og / eller den prædiktive effekt af modellen i almindelighed, fx hvis de betingelser, forventes at være mest fordelagtige var ikke en del af den oprindelige DoE vælge dem som opfølgende eksperimenter.
5. Forbedre Model og Kontroller Predictive Power
- Indsnævre det oprindelige design plads til de mest eftertragtede driftsforhold, f.eks lav turbiditet i 0-1,000 nephelometriske turbiditetsenheder (NTU) område, baseret på modelberegninger (4.2).
- Opsæt en ny DoE inden for disse områder, herunder kun de faktorer, der er blevet identificeret som væsentlig eller relevant (4.1.2)).
BEMÆRK: En faktor kan være betydelige i kraft af model analyse, men irrelevant for en proces, dvs. dens virkning på et svar er <1% i forhold til andre faktorer. - Gentag trin 1 til 5,2, indtil kvaliteten af modelforudsigelser matcher requirements, f.eks standardafvigelsen af modellen som angivet af softwaren er tilstrækkelig til den tilsigtede anvendelse. Ændre den eksperimentelle strategi, hvis det kræves for disse iterationer, fx kun bruge én flokkuleringsmiddel i raffinement.
- Overfør og bekræfte resultaterne fra skalaen-down model til pilotskala eller endelige produktion skala.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Flokkulering af tobaksekstrakt med forskellige polymerer
Den ovenfor beskrevne metode blev med held anvendt til at udvikle en fremgangsmåde til flokkulering af tobaksekstrakter under fremstillingen af et monoklonalt antistof (HIV-neutraliserende antistof 2G12) og et fluorescerende protein (DsRed) (figur 1) 16, og er siden blevet overført til andre proteiner, herunder lectiner, malaria vaccinekandidater og fusionsproteiner (upublicerede data). Typisk anvendelse af flokkuleringsmidler reduceret turbiditet bag-filtrerede planteekstrakt fra ~ 6.000 NTU (10.000 NTU efter ekstraktion) til ~ 1.000 NTU. I en indledende screening eksperiment blev en 91-run IV-optimalt design anvendes til at teste 18 forskellige polymerer i tre forskellige koncentrationer (fordi denne faktor påvirker flokkulering effektivitet 13,27) og observeret flokkulering over en ~ 12 timers inkubation period (figur 2A og B). Den lange inkubationstid kan være vigtigt at identificere meningsfulde tidsrammer for flokkulering processen. Også pH-værdier på 4-8 blev testet, fordi disse kan være relevant i fremtidige processer på grund af de egenskaber specifikke målproteiner 13,25,27,37. Blandt de 18 testede polymerer, blev seks sig at reducere ekstrakt turbiditet efter taske filtrering i typiske ekstrakter med en ledningsevne på 25 mS cm-1.
Modellen blev raffineret ved at udelukke alle ineffektive polymerer i to iterationer og derefter herunder supplerende procesparametre, såsom ledningsevne i 15-45 mS cm-1 interval, en inkubationstid på 5-75 minutter og temperaturer på 4-30 ° C, at generere modeller er egnede til en bredere vifte af procesbetingelser. Den prædiktive effekt af modellen steg efter hver iteration, hvilket resulterer i en yderst pålidelig model (figur 3A). >
Efter fire iterationer blev den stærkt ladede kationiske og forgrenede polymer PEI findes at være det mest effektive til aggregering af dispergerede partikler i tobaksekstrakter. Effektiviteten af denne polymer faldt med stigende ekstrakt ledningsevne. Egenskaberne molekyle størrelse, ladning, struktur (forgrenet eller lineær), ladningsdensitet og graden af amin substitution (primær, sekundær, tertiær eller kvaternær) blev testet som faktorer i en doe og de sidste to parametre havde den største effekt. Detaljerne er blevet rapporteret andetsteds 16. Baseret på denne viden af polymer egenskaber fra DOE resultater blev fem andre polymerer valgt med molekylære egenskaber svarende til PEI (ladningstæthed> meq g -1 og kvaternær amin). En af disse fem polymerer demonstreret større flokkulering effektivitet ved højere ledningsevner (figur 3B) 11.
nt. "fo: holde-together.within-side =" 1 "> Som en del af DoE tilgang, blev det bekræftet, at ingen af de PEI'er påvirkede produkt opsving under nogen af de testede betingelser Faktisk kapacitet dybdefiltre bruges efterfølgende til fjerne de resterende spredte faste stoffer steg med en faktor på 3,2 til 5,7, når ~ 110 L m -2 afhængig af filtertype. Disse resultater blev også bekræftet i en 100 L pilotskala proces, for hvilke anvendelsen af flokkuleringsmidler reduceret afklaring -relaterede produktionsomkostninger med> 50%, og de samlede produktionsomkostninger med ~ 20%.
Figur 2: Effektivitet af forskellige flokkuleringsmidler under forskellige procesbetingelser (A). Uddrag prøver direkte efter flokkulering og taske filtrering kan stadig forekomme uklar. (B) Efter bilæggelse i adskillige timer, turbiditeten afsamme prøver kan reduceres betydeligt. Imidlertid turbiditetsværdier opnået umiddelbart efter filtrering er ofte at foretrække, fordi forlænget holdetider måske ikke er muligt i stor skala fremstillingsprocesser. (C) Flokkulering er også effektiv, når den påføres planteekstrakter genereret med en skruepresse stedet for en blender som angivet ved det klare røde væske på bunden af de 50 ml rør (den røde farve skyldes tilstedeværelsen af det fluorescerende protein DsRed ). (D) Blandinger af forskellige flokkuleringsmidler kan også fremkalde flokkulering.
Figur 3:. Modeling flokkulering ved hjælp af en DoE tilgang (A) Nøjagtigheden af model forudsigelser steget som antallet af polymerer i modellen blev reduceret fra indledende screening til raffinement, selvom antallet af procesparametre steget fra two til fem. (B) Skift polymertypen (her fra en PEI til en anden) som følge af en ændring i procesparametre (her ledningsevne) opretholder effektiv partikel flokkulering og tilsvarende lav filtratturbiditet sammenlignet med ikke-behandlet kontrol-ekstrakt (solid rød linje). Fejl barer i A og B angiver standardafvigelser af model forudsigelser. Stiplede røde linjer angiver standardafvigelser af ikke-behandlede ekstrakt (n = 10). Klik her for at se en større version af dette tal.
Flokkulering af tobak ekstrakter fremstillet med en skrue-tryk
De flokkulering resultater blev også overført fra tobak ekstrakter fremstillet med en homogenisator til dem parat med en skrue-presse, som genereres færre spredte partikler i mm størrelsesorden, men merepartikler i um størrelse. I en 29-run IV-optimalt design, blev det vist, at PEI er også effektiv for denne type ekstrakt i en lignende koncentrationsområde, og at genvinding af målproteiner påvirkes ikke (figur 2C). Dette viser (i) at flokkulering betingelser identificeret for én type foder bestand kan være til en vis grad overføres til andre foder lagre, sparer tid under procesudvikling, og (ii) at DoE strategi kan bruges til at bekræfte dette omsættelighed ikke kun for individuelle procesbetingelser men hele design plads.
Flokkulering eksperimenter med flokkuleringsmiddel blandinger
Kombinationer af flokkuleringsmidler kan være mere effektiv end en enkelt polymerer, fx på grund af mere forbedret overgang mellem partikler 12. Derfor beskrevne fremgangsmåden ovenfor blev tilpasset til at rumme tilsætningen af to polymerer (3.2) 26. Tre ikke-syntetiske polymerer blev testet alene, i kombination med hinanden eller kombineret med PEI. Den mest effektive flokkulering af tobaksekstrakter blev opnået med PEI alene, men en kombination af PEI og chitosan eller polyphosphater kan reducere koncentrationen af PEI påkrævet. Desuden DoE tilgang tillod os at identificere de mest effektive polymer kombinationer, når udelade PEI (med eller uden chitosan og polyphosphater), hvilket bidrager til at definere optimale flokkuleringsprocesser forhold i processer, hvor PEI er uforenelig med målproteinet, f.eks på grund af nedbør, som rapporteret for βglucuronidase 24,25. Desuden DoE var i stand til at karakterisere en kompleks design plads, hvor der ikke mekanistisk model var til rådighed (figur 2D). Brug af ANOVA redskaber DoE software var det muligt at skelne mellem pålidelige prædiktive modeller og dårligt evaluerede modstykker (figur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det vigtigste aspekt at overveje, når du konfigurerer en DoE at karakterisere partikel flokkulering er, at designet i princippet skal kunne opdage og beskrive de forventede eller mulige virkninger 36,38, fx påvirkning af pH, polymer type og polymerkoncentrationen 16. Derfor er det vigtigt at evaluere den del af design plads (FDS) inden starten de faktiske eksperimenter. Den FDS er den del af den flerdimensionale eksperimentelle rum (omfattet af design faktorer, fx pH), inden for hvilken det er muligt at påvise foruddefinerede forskelle mellem to eksperimentelle resultater givet et system med kendt variation, fx detektere en forskel i turbiditet på 250 NTU givet en variabilitet på 125 NTU. Den FDS kan øges ved at øge design med ekstra kørsler og bør ≥0.95 for design har til formål at vejlede processtyring 36. Hvis endvidere antallet af kørsler ikke tillader than hele eksperiment, der skal udføres på en enkelt dag, blokke skal være præ-defineret i DoE at tage højde for batch-til-batch og dag-til-dag-variation. Når du arbejder med plantemateriale, inddragelse af henvisningen kører i hver blok (f.eks ubehandlede kontroller) er med til at kompensere for variation, så sammenligningen af data fra flere kørsler hver normaliseret til deres tilsvarende henvisning løb. I den forbindelse øge antallet af gentagne kørsler i DoE er også nyttigt.
Når et stort antal polymerer er screenet, er det tilrådeligt at anvende de individuelle egenskaber af flokkuleringsmidler, f.eks ladningsdensitet og molekylmasse, som diskrete numeriske faktorer snarere end polymererne selv som kategoriske faktorer. Dette reducerer antallet af forsøg, fordi forsøgsdesign ofte brug for at blive gentaget for kategoriske faktorer, mens yderligere niveauer af numeriske faktorer behøver kun et lille antal ekstra kørsler. Informationen contelt af eksperimentet øger også og tillader identifikation af polymeregenskaber, der forbedrer flokkulering, fx en høj ladningstæthed som fundet i forsøgene beskrevet her. CCD og RSM eksperimentelle design er nyttigt at etablere modeller med høj forudsigelseskraft, muliggør identifikation af robuste procesbetingelser (f.eks til at guide processtyring) og anvendes typisk til at følge op screening designs. Hvis antallet af faktorer og faktorer niveauer under undersøgelsesresultater i DoE med mere end 400 individuelle eksperimenter, kan det være tilrådeligt at reducere antallet af faktor niveauer eller skifte til andre design typer, fordi antallet af prøve, der let kan håndteres med teknikken præsenteres her er begrænset til ~ 100 per dag.
Fra en eksperimentel synsvinkel, skal polymerer forblive stabilt under de valgte eksperimentelle betingelser, fx de ikke må depolymerisere ved lav pH. Omhyggelig forberedelse af flokkuleringsmiddelbestande i form af koncentration er også nødvendigt at opnå reproducerbare resultater og høj kvalitet modeller. I den forbindelse kan flokkuleringsmidlet være nødvendigt at forbehandlet, fx hævelse gange eller pH-justering for chitin, for at sikre fuldstændig solubilisering, og således at opnå en homogen opløsning. Meget tyktflydende lagre bør undgås, da dette kan medføre pipetteringsfejl ved overførsel af polymer til ekstraktet. Mange polymerer kan have en stærk buffer effekt og bestandene har ekstreme pH-værdier, f.eks pH ~ 9,5 til 8% [w / v] PEI. Dette kan påvirke pH i ekstraktet, hvis bestandene ikke pre-justeret og vil forvride de eksperimentelle resultater. For eksempel, hvis flokkulering er mere effektiv ved høj pH og en ikke-pH-justeret PEI lager anvendes så en doe kunne antyde, at høje PEI-koncentrationer er mere effektive. Imidlertid vil denne effekt være forårsaget af den højere pH forårsaget af større volumen af materiel, der blev tilsat, ikke af den øgede polymerkoncentration per se. Bestanden koncentrationer anvendes, bør også ligne dem, der anvendes i store applikationer til at undgå afvigende udvandingseffekt mellem skalaerne, der kan påvirke koncentrationen partikel og dermed flokkulering. Nogle lerbaserede flokkuleringsmidler, såsom kaolin indeholder et stort antal af fine partikler selv, der kan maskere flokkulering virkning, f.eks turbiditet reduktion efter indledende filtrering, og andre reaktioner bør vælges til at vurdere effektiviteten af disse stoffer, fx nedstrøms filter kapacitet.
For dataanalyse er det vigtigt at evaluere de indsamlede resultater i form af ekstreme værdier, forskydninger og generelle sammenhæng, fx ekstreme værdier kan indikere en copy-paste fejl, et skift i decimal eller en fejl i udstyr / analytiske enheder. En grundig analyse vil sikre, at kun data af høj kvalitet anvendes til modelbygning. Under model bygning er det vigtigt hele tiden at vurdere the bred vifte af kvalitetsindikatorer, som den DoE softwaren. De mest grundlæggende kriterier er R2, justeret R2 og forudsagde R 2 værdier, men normale residualer, residualer-vs-run og faktiske-vs-forudsagte plots (Figur 4) er endnu vigtigere, fordi de giver oplysninger om hver løb et eksperiment snarere end en sum parameter. Endvidere bør sammenhængen i den endelige model og dens forudsigelser med de kendte mekanismer flokkulering altid undersøges. Større afvigelser mellem forudsigelser og videnskabelige forventninger kan opstå, fordi ministeriets modeller er kun beskrivende snarere end mekanisk, fx modeller kan forudsige ekstreme værdier i kanterne af et design rum afspejler brugen af polynomiel montering algoritmer.
Figur 4:. Kvalitetsindikatorer for ministeriets modeller nejrmal plot af studentized rester skal ligne en lige linje så tæt som muligt (A) med kun mindre afvigelser (grønne pile) acceptable for høj kvalitet modeller. En buet udseende (C) med stærke afvigelser (røde pile) fra den ideelle linje (rød) indikerer en dårlig model, fx på grund af manglende væsentlige faktorer. I sidste ende, den forudsagte og eksperimentelle (faktiske) værdier skal matche (B) og igen følger en lige linje. Afvigelser fra den ideelle linje (rød cirkel og stiplet linje) angiver dårlige modelforudsigelser (D). Klik her for at se en større version af dette tal.
DOE tilgang kan være med til at karakterisere flokkulering i komplekse foder bestande såsom planteekstrakter, selv om der ikke er nogen eksisterende data. Den flokkulering af tobaksvarer ekstrakter blev optimeret med en arbejdsbyrde på 2 vieks og hjælpematerialer omkostninger til ~ € 500. Dette reducerede antallet af dybdefiltre kræves for en enkelt batch pilotskala involverer ~ 800 L af planteekstrakt med 60%, der opnåede en tilsvarende reduktion i hjælpematerialer omkostninger.
De flokkuleringsmidler blev også anvendt til forskellige planteekstrakter og cellekultur homogenater. Selv om den samme flokkuleringsmiddel var effektiv til alle disse foderstoffer bestande, måtte justeres for at imødekomme de forskellige koncentrationer af dispergerede partikler polymerkoncentrationen. Derudover når en effektiv polymer er blevet identificeret, kan være nødvendigt at justere så den passer til forskellige partikelstørrelsesfordeling 11 de filtrerings- og / eller centrifugeringstrin.
Den her beskrevne metode kan let tilpasses andre foder lagre og er derfor også relevant for forskere og ingeniører udvikler afklaring strategier for mammale cellekulturer og mad / foder produktionsprocesser. especially plantebaserede processer vil drage fordel af de mellemliggende prøvevolumener foreslog her, fordi planteekstrakter kan indeholde partikler op til 1 mm i diameter, som er uforenelige med mikropladeformater 21, fx fordi de blandingsforhold dynamik varierer på grund af en partikel diameter forhold mellem fartøj diameter, ikke er repræsentativt for fremgangsmåden skala.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren har ingen interessekonflikter at afsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100P Portable Turbidimeter | Hach | 4650000 | Turbidimeter |
| 2G12 antibody | Polymun | AB002 | Reference antibody |
| Biacore T200 | GE Healthcare | 28-9750-01 | SPR device |
| BP-410 | Furh | 2632410001 | Bag filter |
| Catiofast VSH | BASF | 79002360 | Flocculating agent |
| Centrifuge 5415D | Eppendorf | 5424 000.410 | Centrifuge |
| Centrifuge tube 15 ml | Labomedic | 2017106 | Reaction tube |
| Centrifuge tube 50 ml self-standing | Labomedic | 1110504 | Reaction tube |
| Chitosan | Carl Roth GmbH | 5375.1 | Flocculating agent |
| Design-Expert(R) 8 | Stat-Ease, Inc. | n.a. | DoE software |
| Disodium phosphate | Carl Roth GmbH | 4984.3 | Media component |
| Ferty 2 Mega | Kammlott | 5.220072 | Fertilizer |
| Forma -86C ULT freezer | ThermoFisher | 88400 | Freezer |
| Greenhouse | n.a. | n.a. | For plant cultivation |
| Grodan Rockwool Cubes 10 x 10 cm | Grodan | 102446 | Rockwool block |
| HEPES | Carl Roth GmbH | 9105.3 | Media component |
| K700P 60D | Pall | 5302305 | Depth filter layer |
| KS50P 60D | Pall | B12486 | Depth filter layer |
| Miracloth | Labomedic | 475855-1R | Filter cloth |
| MultiLine Multi 3410 IDS | WTW | WTW_2020 | pH meter / conductivity meter |
| Osram cool white 36 W | Osram | 4930440 | Light source |
| Phytotron | Ilka Zell | n.a. | For plant cultivation |
| Polymin P | BASF | 79002360 | Flocculating agent |
| POLYTRON PT 6100 D | Kinematica | 11010110 | Homogenization device with custom blade tool |
| Protein A | Life technologies | 10-1006 | Antibody binding protein |
| Sodium chloride | Carl Roth GmbH | P029.2 | Media component |
| Synergy HT | BioTek | SIAFRT | Fluorescence plate reader |
| TRIS | Carl Roth GmbH | 4855.3 | Media component |
| Tween-20 | Carl Roth GmbH | 9127.3 | Media component |
| VelaPad 60 | Pall | VP60G03KNH4 | Filter housing |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | DLS particle size distribution measurement |
References
- Godfray, H. C. J., et al. Food Security: The Challenge of Feeding 9 Billion People. Science. 327, 812-818 (2010).
- Fischer, R., Schillberg, S., Buyel, J. F., Twyman, R. M. Commercial aspects of pharmaceutical protein production in plants. Curr. Pharm. Des. 19, 5471-5477 (2013).
- Pastores, G. M., et al. A Phase 3, multicenter, open-label, switchover trial to assess the safety and efficacy of taliglucerase alfa, a plant cell-expressed recombinant human glucocerebrosidase, in adult and pediatric patients with Gaucher disease previously treated with imiglucerase. Blood Cells Mol. Dis. 53, 253-260 (2014).
- De Paepe, D., et al. A comparative study between spiral-filter press and belt press implemented in a cloudy apple juice production process. Food Chem. 173, 986-996 (2015).
- Buyel, J. F., Twyman, R. M., Fischer, R. Extraction and downstream processing of plant-derived recombinant proteins. Biotechnol. Adv. 33, 902-913 (2015).
- Wilken, L. R., Nikolov, Z. L. Recovery and purification of plant-made recombinant proteins. Biotechnol. Adv. 30, 419-433 (2012).
- Buyel, J. F. Process development trategies in plant molecular farming. Curr. Pharm. Biotechnol. 16, 966-982 (2015).
- Hassan, S., Keshavarz-Moore, E., Ma, J., Thomas, C. Breakage of transgenic tobacco roots for monoclonal antibody release in an ultra-scale down shearing device. Biotechnol. Bioeng. 111, 196-201 (2014).
- Hassan, S., van Dolleweerd, C. J., Ioakeimidis, F., Keshavarz-Moore, E., Ma, J. K. Considerations for extraction of monoclonal antibodies targeted to different subcellular compartments in transgenic tobacco plants. Plant Biotechnol. J. 6, 733-748 (2008).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Scale-down models to optimize a filter train for the downstream purification of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco leaves. Biotechnol. J. 9, 415-425 (2014).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Downstream processing of biopharmaceutical proteins produced in plants: the pros and cons of flocculants. Bioengineered. 5, 138-142 (2014).
- Gregory, J., Barany, S. Adsorption and flocculation by polymers and polymer mixtures. Adv. Colloid Interface Sci. 169, 1-12 (2011).
- Zhou, Y., Franks, G. V. Flocculation mechanism induced by cationic polymers investigated by light scattering. Langmuir. 22, 6775-6786 (2006).
- Runkana, V., Somasundaran, P., Kapur, P. C. Mathematical modeling of polymer-induced flocculation by charge neutralization. J. Colloid Interface Sci. 270, 347-358 (2004).
- Hjorth, M., Jorgensen, B. U. Polymer flocculation mechanism in animal slurry established by charge neutralization. Water Res. 46, 1045-1051 (2012).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Flocculation increases the efficacy of depth filtration during the downstream processing of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco. Plant Biotechnol. J. 12, 240-252 (2014).
- Buyel, J. F., Opdensteinen, P., Fischer, R. Cellulose-based filter aids increase the capacity of depth filters during the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins. Biotechnol. J. 10, 584-591 (2014).
- Yasarla, L. R., Ramarao, B. V. Dynamics of Flocculation of Lignocellulosic Hydrolyzates by Polymers. Ind. Eng. Chem. Res. 51, 6847-6861 (2012).
- Montgomery, D. C. Design and Analysis of Experiments. , John Wiley & Sons Incorporated. (2007).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Characterization of complex systems using the design of experiments approach: transient protein expression in tobacco as a case study. J. Vis. Exp. , e51216 (2014).
- Espuny Garcia Del Real, G., Davies, J., Bracewell, D. G. Scale-down characterization of post-centrifuge flocculation processes for high-throughput process development. Biotechnol. Bioeng. 111, 2486-2498 (2014).
- Rathore, A. S., Sofer, G. Process Validation in Manufacturing of Biopharmaceuticals, 3rd edn, Vol. 1. , Taylor & Francis. (2012).
- Kang, Y., et al. Development of a Novel and Efficient Cell Culture Flocculation Process Using a Stimulus Responsive Polymer to Streamline Antibody Purification Processes. Biotechnol. Bioeng. 110, 2928-2937 (2013).
- Menkhaus, T. J., Eriksson, S. U., Whitson, P. B., Glatz, C. E. Host selection as a downstream strategy: Polyelectrolyte precipitation of beta-glucuronidase from plant extracts. Biotechnol. Bioeng. 77, 148-154 (2002).
- Holler, C., Vaughan, D., Zhang, C. M. Polyethyleneimine precipitation versus anion exchange chromatography in fractionating recombinant beta-glucuronidase from transgenic tobacco extract. J. Chromatogr. A. 1142, 98-105 (2007).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Synthetic polymers are more effective than natural flocculants for the clarification of tobacco leaf extracts. J. Biotechnol. 195, 37-42 (2014).
- Pearson, C. R., Heng, M., Gebert, M., Glatz, C. E. Zeta potential as a measure of polyelectrolyte flocculation and the effect of polymer dosing conditions on cell removal from fermentation broth. Biotechnol. Bioeng. 87, 54-60 (2004).
- Buyel, J. F., Gruchow, H. M., Boes, A., Fischer, R. Rational design of a host cell protein heat precipitation step simplifies the subsequent purification of recombinant proteins from tobacco. Biochem. Eng. J. 88, 162-170 (2014).
- Wang, S., Liu, C., Li, Q. Impact of polymer flocculants on coagulation-microfiltration of surface water. Water Res. 47, 4538-4546 (2013).
- Menkhaus, T. J., Anderson, J., Lane, S., Waddell, E. Polyelectrolyte flocculation of grain stillage for improved clarification and water recovery within bioethanol production facilities. Bioresour. Technol. 101, 2280-2286 (2010).
- Mune, M. A. M., Minka, S. R., Mbome, I. L. Optimising functional properties during preparation of cowpea protein concentrate. Food Chem. 154, 32-37 (2014).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Predictive models for transient protein expression in tobacco (Nicotiana tabacum L.) can optimize process time, yield, and downstream costs. Biotechnol. Bioeng. 109, 2575-2588 (2012).
- Buyel, J. F., Kaever, T., Buyel, J. J., Fischer, R. Predictive models for the accumulation of a fluorescent marker protein in tobacco leaves according to the promoter/5'UTR combination. Biotechnol. Bioeng. 110, 471-482 (2013).
- Buyel, J. F., Fischer, R. A juice extractor can simplify the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins compared to blade-based homogenizers. Process Biochem. 50, 859-866 (2014).
- Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. DOE Simplified: Practical Tools for Effective Experimentation. Vol. 1. 1, Taylor & Francis. (2000).
- Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. Response Surface Methods Simplified. , Productivity Press. (2005).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Generic chromatography-based purification strategies accelerate the development of downstream processes for biopharmaceutical proteins produced in plants. Biotechnol. J. 9, 566-577 (2014).
- Myers, R. H., Montgomery, D. C., Anderson-Cook, C. M. Response Surface Methodology: Process and Product Optimization Using Designed Experiments. , Wiley. (2009).
