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Biology

Procedura per valutare l'efficienza di flocculanti per la rimozione di particelle disperse di estratti di piante

Published: April 9, 2016 doi: 10.3791/53940

Introduction

Le piante sono ampiamente utilizzati per la produzione di prodotti alimentari quali succhi di frutta, ma possono anche essere sviluppati come piattaforme per la fabbricazione di maggior valore biofarmaceutici 1-3. In entrambi i casi, la lavorazione a valle (DSP) spesso inizia con l'estrazione di liquidi dai tessuti come foglie o frutti, seguita dalla chiarificazione di estratti di particelle cariche 4,5. Per la fabbricazione dei prodotti biofarmaceutici, i costi di DSP possono rappresentare fino al 80% dei costi di produzione complessivi 6,7 e ciò in parte riflette l'alta pressione di particelle presenti negli estratti preparati con metodi di disturbo come omogeneizzazione blade basato 8,9 . Sebbene la scelta razionale di strati filtranti per abbinare la distribuzione granulometrica nell'estratto può aumentare la capacità filtrante e ridurre i costi 10,11, il miglioramento può non superare il limite di capacità di assoluta definito dal numero di particelle che devono essere conservati perunità di superficie filtrante per ottenere chiarimenti.

Il soffitto può essere sollevato se meno particelle raggiungono la superficie dei migliori filtri nel treno filtrazione, e questo può essere raggiunto se particelle disperse sono miscelati con polimeri noti come flocculanti che promuovono l'aggregazione a formare grandi flocculi 12. Tali fiocchi possono essere conservati più a monte da filtri a maniche grossolane e meno costosi, riducendo il carico di particelle di raggiungere il più fine e filtri di profondità più costosi. I polimeri devono avere profili di sicurezza adeguati per le loro applicazioni, ad esempio per prodotti biofarmaceutici devono essere conformi alle buone pratiche di fabbricazione (GMP), e in genere devono avere un molare di massa> 100 kDa e possono essere sia neutro o addebitato 13. Considerando flocculanti neutri genere agiscono mediante reticolazione particelle disperse causando la loro aggregazione e la formazione dei fiocchi di diametro> 1 mm 11, polimeri applicati neutralizzare la carica di dparticelle ispersed, riducendo la loro solubilità e provocando così la precipitazione 14.

Flocculazione può essere migliorata regolando parametri quali tampone di pH o conducibilità, e il tipo di polimero o di concentrazione, in base alle proprietà dell'estratto 15,16. Per gli estratti di tabacco pretrattati con 0,5-5,0 g L -1 polietilenimmina (PEI), un incremento maggiore di 2 volte della capacità di filtro di profondità è stato segnalato in un processo su scala pilota 100-L. Il costo di questo polimero è inferiore a 10 kg -1 così la sua introduzione nel processo portato a risparmi di costo di circa € 6.000 per filtri e materiali di consumo per lotto 16 o anche di più se combinato con filtro a base di cellulosa aiuti 17. Anche così, modelli predittivi sono necessari per valutare i benefici economici a priori flocculanti perché la loro inclusione può richiedere fasi di attesa di 15-30 min 16,18, con conseguente ulteriore costi di investimento per lo stoccaggiocarri armati. Tuttavia, attualmente non esistono modelli meccanicistici disponibili che possono predire l'esito di tali esperimenti a causa della natura complessa di flocculazione. Pertanto, un approccio 19 esperimenti progettazione di-più appropriati (DoE) è stato sviluppato come descritto in questo articolo. Un protocollo per la procedura generale DoE è stato recentemente pubblicato 20.

Dispositivi di piccole dimensioni sono ora disponibili per l'high-throughput screening di condizioni di flocculazione 21. Tuttavia, questi dispositivi non possono realisticamente simulare le condizioni durante la flocculazione di estratti vegetali perché le dimensioni del recipiente di reazione (~ 7 mm per pozzetti su una piastra a 96 pozzetti) e le particelle o fiocchi possono essere inferiore ad un ordine di grandezza a parte. Questo può influenzare i modelli e quindi il potere predittivo del modello di miscelazione. Inoltre, può essere difficile per scalare i processi che coinvolgono precipitazioni dovute a variazioni non lineari nel comportamento di miscelazione e precipitato stabilità 22. Pertanto, questo articolo illustra un sistema di screening banco scala con una portata di 50-75 campioni al giorno, producendo risultati che sono scalabile dal volume iniziale reazione 20 ml ad un processo su scala pilota 100 L 16. Quando combinato con un approccio DoE, questo permette ai modelli predittivi da utilizzare per l'ottimizzazione del processo e la documentazione come parte di un concetto di qualità by design.

Il metodo descritto di seguito può anche essere adattato alle biofarmaceutici prodotte nei processi basati su colture cellulari, in cui flocculanti sono anche essere considerato come uno strumento di risparmio di costi 23. Può anche essere usata per modellare la precipitazione delle proteine ​​target da un estratto grezzo come parte di una strategia di purificazione, come dimostrato per β-glucuronidasi prodotto in canola, soia e granoturco 24,25. Una descrizione dettagliata delle proprietà flocculanti può essere trovato altrove 16,26 ed è importante per garantire che il polimero Concni sono o non tossici o nocivi di sotto dei livelli nel prodotto finale 11.

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Protocol

1. Sviluppare una strategia sperimentale adeguato

  1. Identificare i parametri ambientali e di processo che sono rilevanti per la procedura di flocculazione essere stabilito o ottimizzate, vale a dire che i fattori hanno l'effetto più forte sul flocculazione. Tipicamente, ci sono parecchi tali parametri così un approccio DoE come recentemente descritti 20 è necessario a causa della mancanza di modelli meccanicistici.
    1. Selezionare i parametri (fattori) sulla base di dati di letteratura 12, previa conoscenza ed esperienza con il sistema. Fattori tipici includono tampone pH, conducibilità del buffer, il tempo di incubazione e la temperatura così come il tipo di polimero e la concentrazione 15,16,27.
    2. Utilizzare gli stessi riferimenti (vedere 1.1) per definire gli intervalli significativi per ciascun fattore numerico e livelli per i fattori categoriali.
    3. Definire i risultati sperimentali (risposte) da monitorare e utilizzati per valutare l'efficienza di flocculazione. A seconda del sistema, questapuò essere filtrato o surnatante torbidità, velocità di sedimentazione, la dimensione globale o la capacità di un ulteriore filtro 16,23,28-30.
    4. Assicurarsi che i test utilizzati per misurare le risposte sono quantitative, robusto e ripetibile / riproducibili in modo che i dati di alta qualità risultanti possono essere aumentati con esperimenti condotti in seguito o da un altro operatore.
  2. Scegliere un tipo DoE atto a soddisfare il numero di fattori da indagare e il grado di conoscenza già accumulata sul sistema. Utilizzare letteratura disponibile per identificare un tipo adatto DoE 20.
    1. Selezionare un progetto di screening, se ci sono poche informazioni circa il sistema di flocculazione di essere indagato, un gran numero di parametri deve essere schermato o poco si sa circa gli intervalli significativi per i parametri. disegni di screening tipici sono completi e frazionari disegni fattoriali. Includere punti centrali nella progettazione, se si prevede che i parametri per avere un impatto non lineare, ad esempio, 19.
    2. Selezionare una metodologia superficie di risposta (RSM), ad esempio, centrale disegno composito (CCD) 31 o ottimale 32,33, anche se solo un paio di fattori con intervalli di ben noti devono essere caratterizzati con precisione.
  3. Impostare il DoE con software appropriato, garantendo un criterio di qualità a priori, come la frazione di spazio di progettazione sono soddisfatte 20.

2. Preparare i Esperimenti flocculazione

Figura 1
Figura 1: Estratto di piante flocculazione flusso di lavoro: scala di processo (a sinistra) e la scala da banco (a destra). Dopo estrazione di proteine ​​con tamponi acquosi, particelle disperse di detriti cellulari sono aggregati con l'aggiunta di flocculanti. Gli aggregati vengono eliminati tramite una cascata di sacchetto e profondità filtrazione e la capacità di questifiltri insieme con i torbidità del filtrato può essere utilizzato direttamente per misurare l'efficienza della flocculazione.

  1. Sviluppare un Sperimentale lavoro flusso generale (figura 1).
    1. Utilizzare un dispositivo di estrazione che provoca la stessa distribuzione granulometrica atteso (o già osservato) a scala applicazione finale, ad esempio un omogeneizzatore specializzata. Se possibile, la progettazione di un modello in scala-down dell'estrattore come descritto per l'omogeneizzazione di foglie di tabacco 10.
    2. Definire i volumi di estratto utilizzato durante gli esperimenti di flocculazione (qui 20 ml). Selezionare un volume che consente a un numero rappresentativo di particelle ad essere presente nel recipiente di reazione, ad esempio, gli esperimenti di flocculazione in 20 ml aliquote ha prodotto risultati riproducibili e scalabile per gli estratti di tabacco che contengono ~ 7% [w / v] solidi 34 e particelle di dimensioni ~ 0.5 micron a ~ 3 mm 16.
    3. Progettare tutte le operazioni di monitoraggio e post-flocculazione in modo che esimoey sono rappresentative della scala dell'applicazione finale, ad esempio, selezionare filtri con lo stesso comportamento di trattenimento delle particelle come quelli utilizzati nella scala di produzione.
  2. Coltivare le piante da cui deriverà la Estratti.
    1. Usare la stessa linea dell'impianto, qui Nicotiana tabacum cv. Petit Avana SR1, e le condizioni di coltivazione che verranno utilizzati durante la produzione, come precedentemente descritto 33.
    2. Se altre scorte di mangimi saranno trattati, preparare questi scorte di mangimi in modo che siano rappresentative della scala dell'applicazione finale, ad esempio, utilizzano tamponi autentici, tener conto di eventuali passaggi di diluizione durante il processo e rispettare il pH previsto e conducibilità, qui pH 7,5 e conducibilità 30 mS cm -1.
  3. Preparare Utilità di filtrazione, Dispositivi di torbidità-Monitoring e recipienti di campionamento.
    1. Tagliare i materiali filtranti alle dimensioni richieste, qui 15 x 15 cm 2, se non sono pronti da noie moduli. Assicurarsi che tutti i dispositivi di monitoraggio e di analisi sono funzionali ed etichettare tutte le provette dei campioni.
    2. Anche se questi sono compiti semplici, preparare questi elementi nel tempo per garantire che essi non causare interruzioni durante gli esperimenti flocculazione attuali. Evitare ritardi perché possono interferire con i risultati riportati che flocculazione è un processo dipendente dal tempo.
  4. Preparare soluzioni flocculante archivio. ATTENZIONE: Indossare opportuni dispositivi di protezione individuale durante la manipolazione flocculanti, guanti ad es. I materiali possono essere pericolosi (etichette di pericolo secondo in Europa UE 67/548 / CEE, 1999/45 / CE includono N, Xi o Xn). Evitare polvere e consultare le schede di sicurezza dei materiali. Lavorare sotto una cappa aspirante.
    1. Scegli una concentrazione magazzino per ogni flocculante, qui 80.0 g L -1 per i due flocculanti PEI che sono stati utilizzati. Seleziona concentrazioni elevate come possibile evitare la diluizione del campione durante l'aggiunta del flocculante, che ridurrebbe concentrazione di particellezione e quindi influenzano l'efficienza flocculazione.
    2. Account per qualsiasi pre-diluizione che riflette formulazione del polimero del produttore, ad esempio se il polimero viene già fornita come acquosa al 50% [w / v] soluzione. soluzioni stock flocculante di 4-8% [w / v] sono stati trovati per essere il più adatto finora.
    3. Tenendo presente i punti di cui sopra, assicurarsi che la concentrazione flocculante non genera una soluzione viscosa che inibisce pipettaggio, causando potenzialmente errori perché la concentrazione flocculante finale non è regolato correttamente.
    4. Utilizzare la stessa concentrazione stock per tutti i flocculanti, se possibile, perché questo faciliterà la messa a punto di un sistema di dispensazione (2.5) riducendo così la probabilità di errori.
    5. Regolare il pH e conducibilità di ogni soluzione madre flocculante in base alle condizioni degli estratti, qui di pH e conducibilità 4-10 15-55 mS cm -1. Preparare singoli titoli per un singolo flocculante se mminerale di una serie di condizioni di pH e / o conducibilità è testato per tale polimero.
    6. Preparare soluzioni flocculante di fresco, non più di 48 ore prima dell'utilizzo. Anche se flocculazione può essere indotta con le scorte di polimeri conservati per più di 4 settimane, l'efficienza può diminuire a causa di idrolisi polimero a valori alti o bassi di pH. Vedere la documentazione del produttore per ulteriori dettagli.
    7. Assicurarsi che i parametri selezionati per il DoE possono essere regolati con precisione per ogni campione durante l'esperimento, ad esempio, assicurarsi che non vi sono bagni di riscaldamento / raffreddamento a disposizione per regolare la temperatura di incubazione, qui 4 ° C, 20 ° C e 37 ° C. Se miscelazione durante flocculazione è parte dell'esperimento, assicurarsi che il dispositivo di miscelazione rappresentativa della scala applicazione finale in termini di parametri critici come ingresso di alimentazione.
  5. Convertire il DoE pianificazione in uno schema di pipettaggio.
    1. Convertire le diverse concentrazioni flocculante essere tesTed in volumi di soluzione di riserva che verranno aggiunti ai campioni estratto: dividere le concentrazioni flocculante finali dal magazzino concentrazione e moltiplicare per il volume del campione utilizzato negli esperimenti flocculazione. Identificare il maggior volume finale risultante, ad esempio se 20 ml di campione viene miscelato con un massimo di 2 ml di soluzione flocculante questo sarà di 22 ml.
    2. Calcolare i volumi di tampone necessario per mantenere lo stesso volume finale in tutte le aliquote flocculazione in base al maggior volume di flocculante magazzino da aggiungere, ad esempio se 0,75 ml di magazzino flocculante deve essere aggiunto ad un campione quindi 1,25 ml di tampone è necessario per mantenere la volume finale del campione di 22 ml (2.5.1).
    3. Riassumere i volumi di soluzione madre flocculante per ogni polimero e flocculazione condizioni per calcolare i volumi assoluti di soluzione di riserva che sono necessari per il DoE.
  6. Harvest foglie di tabacco e Preparare dell'estratto.
    1. Rimuovere i primi sei leaves (o come molti come indicato dai nelle istruzioni di processo) da piante di tabacco di un'epoca del caso, ad esempio, 6 settimane di vita, e il trasferimento ad un dispositivo di estrazione adeguato, come un omogeneizzatore o vite stampa.
    2. Aggiungere tre volumi di tampone di estrazione per grammo di biomassa, per esempio 300 ml per 100 g, e si fondono per 8 min.
    3. Preparare singoli estratti con i tamponi appropriati se pH e / o conducibilità differente vengono testati. Qui, si tratta di omogeneizzazione del materiale vegetale per 3 x 30 secondi in un frullatore o spremiagrumi 34.
    4. In alternativa, preparare l'estratto in un modo che è rappresentativo del processo in esame.
  7. Aliquota del estratto e aggiungere la soluzione tampone.
    1. Manualmente e accuratamente mescolare l'estratto durante l'intera procedura per assicurare i campioni sono omogenea con una distribuzione uniforme delle particelle.
    2. Proprio distribuire l'estratto tra i tubi di reazione pre-etichettati per decantazione,qui 20 ml di ciascuna nave. Autoportante provette da 50 ml semplificano la gestione e sono ideali per 20 ml campioni.
    3. Aggiungere il volume di ciascun tampone di estrazione richiesta per mantenere il volume finale fissato per ciascun tubo di reazione individuo con una pipetta adatto.

3. flocculato la estratti vegetali con diversi polimeri

  1. Pipettare il volume richiesto di soluzione flocculante, qui 0.1-2.0 ml, per i campioni in sequenza come indicato dall'ordine corsa randomizzato del DoE. Mescolare bene ogni campione subito dopo l'aggiunta di flocculante da intensa manuale agitazione proprio per 20 sec.
    1. Se necessario, regolare il tempo di agitazione per altre scorte di mangimi per permettere una miscelazione accurata, ma rigorosamente garantire tempi di miscelazione coerenti per tutti i campioni. Tenete a mente che la miscelazione prolungata può causare la rottura irreversibile di fiocchi e forza incoerente applicata durante l'agitazione può falsare i risultati flocculazione.
  2. Facoltativo: modificare la procedura sopra descritta per l'applicazione simultanea di due o più flocculanti.
    1. Opzione 1: Invece di un singolo polimero aggiungere una miscela di due o più flocculanti, qui PEI e chitosano. Utilizzare le combinazioni flocculante definiti nel DoE. Incorporare il rapporto e le concentrazioni assolute dei polimeri come singoli parametri durante la configurazione del DoE (1.1).
    2. Opzione 2: Aggiungere due o più polimeri in sequenza per l'estratto.
      1. Utilizzare le singole concentrazioni di polimero, il loro tipo, e il tempo di incubazione tra ogni aggiunta al estratto, come fattori aggiuntivi durante l'installazione del DoE.
      2. Anche utilizzare questo metodo per verificare se l'aggiunta ripetuta di un singolo polimero può migliorare la flocculazione. Utilizzare un aggiunta graduale per simulare la lenta aggiunta di un flocculante, per esempio quattro fasi, ciascuna aggiungendo 0,25 ml 80 g L -1 flocculante stock da 20 ml volume di oltre 4 minuti può imitare l'aggiunta di flocculante conuna portata di 0,25 ml min -1.
      3. In tutti i casi, identificare un nuovo volume massimo campione finale per questa configurazione aggiungendo i volumi massimi di tutti i flocculanti al volume del campione, qui ancora 22 ml, e ricalcolare i volumi richiesti di soluzione madre flocculante e tamponi per la regolazione del volume, se necessario.
  3. Incubare i campioni per i tempi definiti nel DoE, tipicamente 3-30 minuti, per permettere la formazione floc. Assicurarsi che tutte le altre condizioni di incubazione, ad esempio la temperatura, sono impostati secondo il DoE.
  4. Osservare e formazione documento floc. Registrare il progresso della formazione di fiocchi come richiesto, ad esempio come mm di floc sedimentazione per min misurando l'altezza dei solidi sedimentati. Se necessario, prolungare flocculazione per un periodo di tempo prolungato ad esempio di notte.
  5. Filtrare l'estratto flocculato.
    1. Utilizzare i materiali filtranti preparato in precedenza (2.3) per chiarire l'estratto flocculato dopo l'appropriatatempo di incubazione per decantazione campioni flocculate attraverso il materiale filtrante e in un tubo o recipiente di reazione pulito.
      1. Non risospendere flocculi risolta prima filtrazione e applicare l'estratto con ad una velocità di ~ 300 ml min -1 al filtro, corrispondente a 3-4 sec per un campione di 20 ml.
      2. Conferma le prestazioni della fase di filtrazione se un materiale diverso viene usato negli esperimenti da banco rispetto al processo finale in termini di ritenzione delle particelle, ad esempio misurando la distribuzione della dimensione delle particelle in entrambi i tipi di campioni 11.
    2. Analizzare il filtrato in termini di torbidità e / o distribuzione granulometrica come richiesto utilizzando opportuni dispositivi, ad esempio un torbidimetro.
    3. Opzionale: ripetere l'analisi dopo lunghi tempi di incubazione, ad esempio 12-24 ore, per studiare la formazione o la riformazione di fiocchi instabili.
  6. Analizzare i campioni in termini di Pre-definito le risposte (1.1.3).
    1. Prelevano i campioni filtrati e analizzarli per i parametri di risposta aggiuntivi, ad esempio le concentrazioni di diverse proteine ​​bersaglio o prodotti di valore.
    2. Opzionale: Analizzare il retentato (per lo più solidi) per gli stessi parametri per chiudere il bilancio di massa del processo. In particolare, quantificare l'effetto di flocculanti sul recupero liquido confrontando i solidi massa rimanenti dopo che i campioni vengono trattati o non trattati con flocculante.
  7. Confermare la qualità dei dati e trasferire i risultati al software DoE.
    1. Cercare valori estremi dei dati di risposta raccolti, ad esempio, i valori inaspettatamente alti.
    2. Assicurarsi che tutti i dati di risposta siano correttamente allineati con le loro condizioni sperimentali corrispondenti.
    3. Trasferire i risultati nel software DoE e assicurarsi che gli ordini di esecuzione standard e randomizzati non si confondono.

4. Valutareil DoE

  1. Utilizzare gli strumenti di analisi dei dati incorporati del software DoE per sviluppare un modello predittivo come descritto in precedenza 20.
    1. Selezionare una modalità di trasformazione dei dati adeguata, se necessario per facilitare la costruzione di modelli, qui log 10. Un rapporto maggiore di 10 per il più grande valore di risposta più piccolo rispetto indica che una trasformazione di dati può essere richiesto. Identificare la trasformazione più idoneo utilizzando gli strumenti statistici appropriati, ad esempio, un diagramma Box-Cox 35.
    2. Ha scelto un modello di base che (i) Misure ai DoE selezionato (1.2) e (ii) è d'accordo con precedente conoscenza del sistema in esame sulla base delle analisi della varianza (ANOVA) strumenti del software DoE, ad esempio, un polinomio di secondo grado spesso si adatta meglio l'effetto osservato del tempo di incubazione di un polinomio di primo ordine.
    3. Rimuovere fattori insignificanti modello, ad esempio, p> 0.05, o le interazioni tra fattori iterativo deselezionandoli, lareby riducendo la complessità del modello e aumentando la sua capacità predittiva.
    4. Verificare la qualità del modello confrontando R 2, regolato R 2 e R 2 ha previsto insieme alla normale rappresentazione della probabilità dei residui studentizzati, residui-vs-run, ha predetto-vs-reale e Box-Cox traccia 36. Tutti R 2 valori dovrebbero essere all'interno di un intervallo di 0,2.
    5. Assicurarsi che il modello finale è d'accordo con le ipotesi di base della fisica e della termodinamica, per esempio concentrazioni negativi sono prevedibili.
  2. Utilizzare il modello per prevedere condizioni più favorevoli per il sistema in esame, ecco una bassa torbidità.
    1. Selezionare le risposte più importanti e le loro stati preferiti, ad esempio torbidità minimi. Combinare queste selezioni massimizzando una funzione di desiderabilità o di strumenti simili, che sono built-in caratteristiche di diversi pacchetti software DoE 36.
    2. A seconda della destinazione d'applicazione of il modello, selezionare la conferma viene eseguito per verificare le condizioni ottimali e / o il potere predittivo del modello in generale, ad esempio, se le condizioni previsti per essere più favorevole, non facevano parte del primo DoE selezionarli come esperimenti di follow-up.

5. migliorare il modello e Verifica il potere predittivo

  1. Affina lo spazio progettazione iniziale delle condizioni di esercizio più desiderabili, ad esempio bassa torbidità nella gamma 0-1,000 unità nefelometriche (NTU), basata sulle previsioni del modello (4.2).
  2. Impostare un nuovo DoE all'interno di questi intervalli, tra cui solo quei fattori che sono stati identificati come significativi o rilevante (4.1.2)).
    NOTA: Un fattore può essere significativo in termini di analisi modello, ma irrilevante per un processo, cioè il suo effetto sulla risposta è <1% rispetto a quello di altri fattori.
  3. Ripetere i passaggi 1-5,2 fino a quando la qualità delle previsioni dei modelli corrisponde ai requirements, ad esempio la deviazione standard del modello come indicato dal software è sufficiente per l'applicazione prevista. Modificare la strategia sperimentale se richiesto per queste iterazioni, ad esempio, utilizzare un solo flocculante nella raffinatezza.
  4. Trasferire e confermare i risultati del modello in scala verso il basso alla scala pilota o scala di produzione finale.

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Representative Results

Flocculazione di estratto di tabacco con diversi polimeri

Il metodo sopra descritto è stato usato con successo per sviluppare un processo per la flocculazione di estratti di tabacco durante la produzione di un anticorpo monoclonale (anticorpi HIV-neutralizzanti 2G12) e una proteina fluorescente (DsRed) (Figura 1) 16, e da allora è stato trasferito ad altre proteine, tra cui lectine, malaria candidati vaccini e proteine ​​di fusione (dati non pubblicati). Tipicamente, l'applicazione di flocculanti ridotto la torbidità di estratto vegetale sacchetto-filtro da ~ 6000 NTU (10.000 NTU dopo estrazione) a ~ 1.000 NTU. In un esperimento screening iniziale, un disegno 91-run IV-ottimale è stato usato per testare 18 diversi polimeri in tre diverse concentrazioni (perché questo fattore influisce efficienza flocculazione 13,27) e osservato flocculazione su uno ~ 12 ore di incubazione period (Figura 2A e B). Il periodo di incubazione può essere importante identificare tempi significativi per il processo di flocculazione. Anche valori di pH di 4-8 sono stati testati in quanto questi possono essere rilevanti nei processi futuri a causa delle proprietà di specifiche proteine ​​bersaglio 13,25,27,37. Tra i 18 polimeri testati, sei sono stati trovati per ridurre la torbidità estratto dopo la filtrazione bag in estratti tipici con conducibilità 25 ms cm -1.

Il modello è stato affinato escludendo tutti i polimeri inefficaci in due iterazioni e quindi inclusi i parametri di processo aggiuntivi, come conduttività nelle 15-45 mS cm -1 gamma, un tempo di incubazione di 5-75 min e temperature di 4-30 ° C, generare modelli adatti per una vasta gamma di condizioni di processo. Il potere predittivo del modello incrementato dopo ogni iterazione, con un conseguente altamente affidabile modello (Figura 3A). >

Dopo quattro iterazioni, cationico fortemente carica e polimero ramificato PEI è risultato essere il più efficiente per l'aggregazione delle particelle disperse in estratti di tabacco. Tuttavia, l'efficienza di questo polimero è diminuita con l'aumentare estratto di conducibilità. Le proprietà di dimensione molecola, di carica, la struttura (ramificato o lineare), densità di carica e grado di sostituzione ammina (primaria, secondaria, terziaria o quaternaria) sono stati testati come fattori in un DoE e gli ultimi due parametri ha avuto il più grande effetto. I dettagli sono stati riportati altrove 16. Sulla base di questa conoscenza delle proprietà dei polimeri dai risultati DoE, altri cinque polimeri sono stati selezionati con caratteristiche molecolari simili a PEI (densità di carica> meq g -1 e ammine quaternario). Uno di questi cinque polimeri hanno dimostrato una maggiore efficienza flocculazione a conducibilità superiori (figura 3b) 11.

nt. "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Come parte dell'approccio DoE, è stato confermato che nessuno dei Peis colpito di recupero del prodotto in alcuna delle condizioni testate, infatti la capacità di filtri di profondità utilizzato successivamente per rimuovere restante solidi dispersi aumentato di un fattore di 3,2-5,7, raggiungendo ~ 110 L m -2 a seconda del tipo di filtro. Questi risultati sono stati confermati anche in un processo su scala pilota 100 L, a cui l'applicazione di flocculanti ridotto il chiarimento i costi di produzione -related di> 50% e il totale dei costi di produzione di ~ 20%.

figura 2
Figura 2: rendimento di diverse flocculanti in condizioni di processo diverse (A). Estrarre i campioni subito dopo flocculazione e filtrazione a sacco possono ancora apparire torbida. (B) Dopo decantazione per diverse ore, la torbidità dellastessi campioni possono essere ridotti in modo significativo. Tuttavia, i valori di torbidità ottenuti subito dopo la filtrazione sono spesso preferibili perché i tempi di attesa prolungati potrebbe non essere possibile in processi di produzione su larga scala. (C) flocculazione è efficace anche quando applicato ad estratti di piante generate con una pressa a vite, invece di un miscelatore come indicato dal liquido rosso chiaro al fondo delle provette 50 ml (il colore rosso è dovuto alla presenza della proteina fluorescente DsRed ). (D) miscele di diversi flocculanti possono anche indurre flocculazione.

Figura 3
Figura 3:. Modellazione flocculazione utilizzando un approccio DoE (A) La precisione del modello predizioni aumentato il numero di polimeri nel modello è stato ridotto da screening iniziale all'affinamento anche se il numero di parametri di processo aumentata da two a cinque. (B) di commutazione del tipo di polimero (qui da un PEI all'altro) in conseguenza di una variazione dei parametri di processo (qui conducibilità) mantiene flocculazione delle particelle efficiente e corrispondente bassa torbidità filtrato rispetto all'estratto di controllo non trattato (solido linea rossa). Le barre di errore in A e B indicano deviazioni standard delle previsioni dei modelli. Linee rosse tratteggiate indicano deviazioni standard di estratto non trattato (n = 10). Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Flocculazione di tabacco estratti preparati con una pressa a vite

I risultati flocculazione sono stati trasferiti da estratti di tabacco preparati con un omogeneizzatore a quelli preparati con una pressa a vite, che ha generato meno particelle disperse nella gamma di dimensioni mm ma piùparticelle nella gamma di dimensioni micron. In un 29-run disegno IV-ottimale, è stato dimostrato che PEI è anche efficace per questo tipo di estratto in un intervallo di concentrazione simile e che il recupero di proteine ​​bersaglio non è influenzata (Figura 2C). Questa mostra (i) che le condizioni di flocculazione identificati per un tipo di scorta di alimentazione può essere in qualche modo trasferito ad altre scorte di mangimi, risparmiando tempo durante il processo di sviluppo, e (ii) che la strategia DoE può essere utilizzato per confermare la trasferibilità non solo per condizioni di processo individuali, ma su tutto lo spazio di progettazione.

esperimenti di flocculazione con miscele flocculante

Combinazioni di flocculanti può essere più efficace di singoli polimeri, ad esempio a causa di più avanzata ponte tra le particelle 12. Pertanto, il metodo sopra descritto è stato adattato per ospitare l'aggiunta di due polimeri (3.2) 26. Tre polimeri non-sintetici sono stati testati soli, in combinazione tra loro o combinati con PEI. La flocculazione più efficiente di estratti di tabacco è stato ottenuto con PEI sola, ma una combinazione di PEI e chitosano o polifosfati può ridurre la concentrazione di PEI richiesto. Inoltre, l'approccio DoE ha permesso di individuare le combinazioni di polimeri più efficaci quando omettendo PEI (con o senza chitosano e polifosfati), contribuendo così a definire le condizioni di flocculazione ottimali nei processi in cui Pei è incompatibile con la proteina bersaglio, ad esempio a causa di precipitazioni, come riportato per βglucuronidase 24,25. Inoltre, il DoE è stato in grado di caratterizzare uno spazio disegno complesso per il quale non modello meccanicistico era disponibile (Figura 2D). Utilizzando gli strumenti ANOVA del software DoE era possibile distinguere tra modelli predittivi affidabili e controparti mal valutati (Figura 4).

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Discussion

L'aspetto più importante da considerare quando si imposta un DoE per caratterizzare flocculazione delle particelle è che il design deve in linea di principio essere in grado di individuare e descrivere gli effetti attesi o possibili 36,38, come ad esempio l'influenza del pH, tipo di polimero e la concentrazione di polimero 16. Pertanto, è importante valutare la frazione di spazio di progettazione (FDS) prima di iniziare gli esperimenti reali. L'FDS è la frazione di spazio sperimentale multidimensionale (coperto dai fattori di progetto, ad esempio pH) all'interno del quale è possibile rilevare le differenze pre-definiti tra due risultati sperimentali che un sistema di variabilità noto, ad esempio rilevando una differenza di torbidità 250 NTU dato una variabilità di 125 NTU. La FDS può essere aumentata aumentando il design con prove aggiuntive e dovrebbe essere ≥0.95 per progetti destinati a guidare il controllo di processo 36. Inoltre, se il numero di corse non consente tegli intero esperimento da effettuare in un solo giorno, blocchi dovrebbero essere pre-definiti nel DoE per spiegare lotto a lotto e variabilità giorno per giorno. Quando si lavora con materiale vegetale, l'inclusione di riferimento viene eseguito in ogni blocco (ad esempio, i controlli non trattati) aiuta a compensare la variabilità, che consente la comparazione dei dati provenienti da diverse corse ogni normalizzati per la loro corsa di riferimento corrispondente. In questo contesto, aumentando il numero di corse ripetute nel DoE è anche utile.

Quando un gran numero di polimeri sono proiettati, è consigliabile utilizzare le singole proprietà flocculanti, densità di esempio carica e massa molecolare, come fattori numerici discreti piuttosto che i polimeri stessi fattori come categoriali. Questo riduce il numero di esperimenti perché disegni sperimentali spesso bisogno di essere replicati per i fattori categoriali, mentre ulteriori livelli di fattori numerici solo bisogno di un piccolo numero di corse in più. L'aria informazionitenda dell'esperimento aumenta e permette l'identificazione di proprietà dei polimeri che migliorano flocculazione, ad esempio una alta densità di carica come si trova negli esperimenti qui descritti. Disegni CCD e RSM sperimentale sono utili per stabilire modelli ad alto potere predittivo, consentendo l'individuazione di condizioni di lavorazione robuste (ad esempio, per guidare il controllo di processo) e sono in genere utilizzati per seguire i disegni di screening. Se il numero di fattori e fattori livelli sotto risultati investigativi DoE con più di 400 singoli esperimenti, può essere consigliabile ridurre il numero di livelli di fattore o passare ad altri tipi di progettazione poiché il numero di campioni che possono essere facilmente trattato con la tecnica qui presentata è limitato a ~ 100 al giorno.

Da un punto di vista sperimentale, polimeri devono rimanere stabili nelle condizioni sperimentali selezionati, ad esempio, essi non devono depolimerizzano a pH basso. Una preparazione accurata del flocculantescorte in termini di concentrazione è anche necessario per ottenere risultati riproducibili e modelli di alta qualità. In questo contesto, il flocculante può essere necessario pretrattati, ad es volte o regolazione del pH gonfiore per chitina, per garantire la completa solubilizzazione, e quindi di ottenere una soluzione omogenea. Altamente scorte viscosi dovrebbero essere evitati, perché questo può causare errori di pipettamento quando si trasferisce il polimero all'estratto. Molti polimeri possono avere un forte effetto tampone e le scorte hanno valori di pH estremi, ad esempio, pH ~ 9,5 per l'8% [w / v] PEI. Questo può influenzare il pH dell'estratto se gli stock non sono pre-regolati e verrà falsare i risultati sperimentali. Ad esempio, se flocculazione è più efficace a pH elevato e un non-pH regolato PEI archivio viene utilizzata poi un DoE potrebbe suggerire che alte concentrazioni di PEI sono più efficaci. Tuttavia, questo effetto sarà causata dal maggiore pH causato dalla maggior volume di magazzino che è stata aggiunta, non dalle maggiori pe concentrazione di polimeroR SE. Le concentrazioni rotabile utilizzato dovrebbe somigliare a quelli utilizzati in applicazioni su larga scala per evitare differenti effetti di diluizione tra le scale che possono influenzare la concentrazione di particelle e quindi flocculazione. Alcuni flocculanti a base di argilla come il caolino contengono un gran numero di particelle fini stessi che può mascherare l'effetto flocculazione, ad esempio riduzione torbidità dopo filtrazione iniziale, e altre risposte dovrebbero essere selezionati per valutare l'efficacia di queste sostanze, ad esempio capacità del filtro a valle.

Per l'analisi dei dati, è importante valutare i risultati raccolti in termini di valori estremi, disallineamenti e la coerenza generale, ad esempio, valori estremi possono indicare un errore di copia-incolla, un cambiamento nella posizione decimale o un malfunzionamento di dispositivi analitici attrezzature /. Un'analisi approfondita farà in modo che solo i dati di alta qualità vengono utilizzati per la creazione del modello. Durante la costruzione di un modello che è importante valutare costantemente °e ampio set di indicatori di qualità forniti dal software DoE. I criteri di base sono la R 2, regolato R 2 e previsti R 2 valori, ma residui normali, residui-vs-run ed effettiva-vs-previsti trame (Figura 4) sono ancora più importanti perché forniscono informazioni su ogni corsa nel un esperimento piuttosto che un parametro somma. Inoltre, la coerenza del modello finale e le sue previsioni con i meccanismi noti di flocculazione devono sempre essere esaminati. Le principali differenze tra le previsioni e le aspettative scientifiche può verificarsi a causa modelli DoE sono solo descrittive piuttosto che meccanicistico, modelli ad esempio, possono prevedere i valori estremi ai bordi di uno spazio di design che riflette l'uso di algoritmi di adattamento polinomiale.

Figura 4
Figura 4:. Indicatori di qualità dei modelli DoE Il noplot rmal di residui studentizzati dovrebbe assomigliare ad una linea retta il più possibile (A) con solo piccole deviazioni (frecce verdi) accettabili per i modelli di alta qualità. Un aspetto curvo (C) con deviazioni forti (frecce rosse) dalla linea ideale (rosso) indica un modello povero, ad esempio, a causa della mancanza fattori significativi. In definitiva, il predetto e valori sperimentali (effettivo) deve corrispondere (B) e ancora una volta seguire una linea retta. Deviazioni dalla linea ideale (cerchio rosso e la linea tratteggiata) indicano poveri previsioni basate su modelli (D). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

L'approccio DoE può aiutare a caratterizzare flocculazione in scorte di mangimi complessi come estratti di piante, anche se non ci sono dati esistenti. La flocculazione degli estratti di tabacco è stato ottimizzato con un carico di lavoro di 2 siamoeks ei costi di consumo di ~ 500 €. Questo ha ridotto il numero di filtri di profondità necessari per un singolo lotto scala pilota che coinvolge ~ 800 L di estratto vegetale del 60%, che ha raggiunto una corrispondente riduzione dei costi di consumo.

I flocculanti sono stati applicati anche ai diversi estratti di piante e di omogenati di coltura cellulare. Anche se lo stesso flocculante è efficace per tutte queste scorte di mangimi, la concentrazione del polimero doveva essere adeguati per accogliere le diverse concentrazioni di particelle disperse. Inoltre, una volta un polimero efficace è stato identificato, potrebbe essere necessario regolare in modo che corrisponda la distribuzione delle dimensioni delle particelle differenti 11 le fasi di filtrazione e / o centrifugazione.

Il metodo descritto qui può essere facilmente adattato ad altre scorte di mangimi ed è quindi rilevante anche per gli scienziati e gli ingegneri di sviluppo strategie di chiarimento per colture cellulari di mammifero e dei processi di produzione degli alimenti / dei mangimi. Especially processi a base di piante potranno beneficiare dei volumi di campione intermedi suggerito qui perché estratti vegetali possono contenere particelle fino a 1 mm di diametro, che sono incompatibili con i formati di micropiastre 21, ad esempio, perché le dinamiche di miscelazione differiscono a causa di un diametro delle particelle in rapporto al diametro del vaso che non è rappresentativo della scala processo.

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Disclosures

L'autore non ha conflitti di interesse da dichiarare.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2100P Portable Turbidimeter Hach 4650000 Turbidimeter
2G12 antibody Polymun AB002 Reference antibody
Biacore T200 GE Healthcare 28-9750-01 SPR device
BP-410 Furh 2632410001 Bag filter
Catiofast VSH BASF 79002360 Flocculating agent
Centrifuge 5415D Eppendorf 5424 000.410 Centrifuge
Centrifuge tube 15 ml Labomedic 2017106 Reaction tube
Centrifuge tube 50 ml self-standing Labomedic 1110504 Reaction tube
Chitosan Carl Roth GmbH 5375.1 Flocculating agent
Design-Expert(R) 8 Stat-Ease, Inc. n.a. DoE software
Disodium phosphate Carl Roth GmbH  4984.3  Media component
Ferty 2 Mega Kammlott 5.220072 Fertilizer
Forma -86C ULT freezer ThermoFisher 88400 Freezer
Greenhouse n.a. n.a. For plant cultivation
Grodan Rockwool Cubes 10 x 10 cm Grodan 102446 Rockwool block
HEPES Carl Roth GmbH 9105.3 Media component
K700P 60D Pall 5302305 Depth filter layer
KS50P 60D Pall B12486 Depth filter layer
Miracloth Labomedic 475855-1R Filter cloth
MultiLine Multi 3410 IDS WTW WTW_2020 pH meter / conductivity meter
Osram cool white 36 W Osram 4930440 Light source
Phytotron Ilka Zell n.a. For plant cultivation
Polymin P BASF 79002360 Flocculating agent
POLYTRON PT 6100 D Kinematica 11010110 Homogenization device with custom blade tool
Protein A Life technologies 10-1006 Antibody binding protein
Sodium chloride Carl Roth GmbH P029.2 Media component
Synergy HT BioTek SIAFRT Fluorescence plate reader
TRIS Carl Roth GmbH 4855.3 Media component
Tween-20 Carl Roth GmbH 9127.3 Media component
VelaPad 60 Pall VP60G03KNH4 Filter housing
Zetasizer Nano ZS Malvern ZEN3600 DLS particle size distribution measurement

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References

  1. Godfray, H. C. J., et al. Food Security: The Challenge of Feeding 9 Billion People. Science. 327, 812-818 (2010).
  2. Fischer, R., Schillberg, S., Buyel, J. F., Twyman, R. M. Commercial aspects of pharmaceutical protein production in plants. Curr. Pharm. Des. 19, 5471-5477 (2013).
  3. Pastores, G. M., et al. A Phase 3, multicenter, open-label, switchover trial to assess the safety and efficacy of taliglucerase alfa, a plant cell-expressed recombinant human glucocerebrosidase, in adult and pediatric patients with Gaucher disease previously treated with imiglucerase. Blood Cells Mol. Dis. 53, 253-260 (2014).
  4. De Paepe, D., et al. A comparative study between spiral-filter press and belt press implemented in a cloudy apple juice production process. Food Chem. 173, 986-996 (2015).
  5. Buyel, J. F., Twyman, R. M., Fischer, R. Extraction and downstream processing of plant-derived recombinant proteins. Biotechnol. Adv. 33, 902-913 (2015).
  6. Wilken, L. R., Nikolov, Z. L. Recovery and purification of plant-made recombinant proteins. Biotechnol. Adv. 30, 419-433 (2012).
  7. Buyel, J. F. Process development trategies in plant molecular farming. Curr. Pharm. Biotechnol. 16, 966-982 (2015).
  8. Hassan, S., Keshavarz-Moore, E., Ma, J., Thomas, C. Breakage of transgenic tobacco roots for monoclonal antibody release in an ultra-scale down shearing device. Biotechnol. Bioeng. 111, 196-201 (2014).
  9. Hassan, S., van Dolleweerd, C. J., Ioakeimidis, F., Keshavarz-Moore, E., Ma, J. K. Considerations for extraction of monoclonal antibodies targeted to different subcellular compartments in transgenic tobacco plants. Plant Biotechnol. J. 6, 733-748 (2008).
  10. Buyel, J. F., Fischer, R. Scale-down models to optimize a filter train for the downstream purification of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco leaves. Biotechnol. J. 9, 415-425 (2014).
  11. Buyel, J. F., Fischer, R. Downstream processing of biopharmaceutical proteins produced in plants: the pros and cons of flocculants. Bioengineered. 5, 138-142 (2014).
  12. Gregory, J., Barany, S. Adsorption and flocculation by polymers and polymer mixtures. Adv. Colloid Interface Sci. 169, 1-12 (2011).
  13. Zhou, Y., Franks, G. V. Flocculation mechanism induced by cationic polymers investigated by light scattering. Langmuir. 22, 6775-6786 (2006).
  14. Runkana, V., Somasundaran, P., Kapur, P. C. Mathematical modeling of polymer-induced flocculation by charge neutralization. J. Colloid Interface Sci. 270, 347-358 (2004).
  15. Hjorth, M., Jorgensen, B. U. Polymer flocculation mechanism in animal slurry established by charge neutralization. Water Res. 46, 1045-1051 (2012).
  16. Buyel, J. F., Fischer, R. Flocculation increases the efficacy of depth filtration during the downstream processing of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco. Plant Biotechnol. J. 12, 240-252 (2014).
  17. Buyel, J. F., Opdensteinen, P., Fischer, R. Cellulose-based filter aids increase the capacity of depth filters during the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins. Biotechnol. J. 10, 584-591 (2014).
  18. Yasarla, L. R., Ramarao, B. V. Dynamics of Flocculation of Lignocellulosic Hydrolyzates by Polymers. Ind. Eng. Chem. Res. 51, 6847-6861 (2012).
  19. Montgomery, D. C. Design and Analysis of Experiments. , John Wiley & Sons Incorporated. (2007).
  20. Buyel, J. F., Fischer, R. Characterization of complex systems using the design of experiments approach: transient protein expression in tobacco as a case study. J. Vis. Exp. , e51216 (2014).
  21. Espuny Garcia Del Real, G., Davies, J., Bracewell, D. G. Scale-down characterization of post-centrifuge flocculation processes for high-throughput process development. Biotechnol. Bioeng. 111, 2486-2498 (2014).
  22. Rathore, A. S., Sofer, G. Process Validation in Manufacturing of Biopharmaceuticals, 3rd edn, Vol. 1. , Taylor & Francis. (2012).
  23. Kang, Y., et al. Development of a Novel and Efficient Cell Culture Flocculation Process Using a Stimulus Responsive Polymer to Streamline Antibody Purification Processes. Biotechnol. Bioeng. 110, 2928-2937 (2013).
  24. Menkhaus, T. J., Eriksson, S. U., Whitson, P. B., Glatz, C. E. Host selection as a downstream strategy: Polyelectrolyte precipitation of beta-glucuronidase from plant extracts. Biotechnol. Bioeng. 77, 148-154 (2002).
  25. Holler, C., Vaughan, D., Zhang, C. M. Polyethyleneimine precipitation versus anion exchange chromatography in fractionating recombinant beta-glucuronidase from transgenic tobacco extract. J. Chromatogr. A. 1142, 98-105 (2007).
  26. Buyel, J. F., Fischer, R. Synthetic polymers are more effective than natural flocculants for the clarification of tobacco leaf extracts. J. Biotechnol. 195, 37-42 (2014).
  27. Pearson, C. R., Heng, M., Gebert, M., Glatz, C. E. Zeta potential as a measure of polyelectrolyte flocculation and the effect of polymer dosing conditions on cell removal from fermentation broth. Biotechnol. Bioeng. 87, 54-60 (2004).
  28. Buyel, J. F., Gruchow, H. M., Boes, A., Fischer, R. Rational design of a host cell protein heat precipitation step simplifies the subsequent purification of recombinant proteins from tobacco. Biochem. Eng. J. 88, 162-170 (2014).
  29. Wang, S., Liu, C., Li, Q. Impact of polymer flocculants on coagulation-microfiltration of surface water. Water Res. 47, 4538-4546 (2013).
  30. Menkhaus, T. J., Anderson, J., Lane, S., Waddell, E. Polyelectrolyte flocculation of grain stillage for improved clarification and water recovery within bioethanol production facilities. Bioresour. Technol. 101, 2280-2286 (2010).
  31. Mune, M. A. M., Minka, S. R., Mbome, I. L. Optimising functional properties during preparation of cowpea protein concentrate. Food Chem. 154, 32-37 (2014).
  32. Buyel, J. F., Fischer, R. Predictive models for transient protein expression in tobacco (Nicotiana tabacum L.) can optimize process time, yield, and downstream costs. Biotechnol. Bioeng. 109, 2575-2588 (2012).
  33. Buyel, J. F., Kaever, T., Buyel, J. J., Fischer, R. Predictive models for the accumulation of a fluorescent marker protein in tobacco leaves according to the promoter/5'UTR combination. Biotechnol. Bioeng. 110, 471-482 (2013).
  34. Buyel, J. F., Fischer, R. A juice extractor can simplify the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins compared to blade-based homogenizers. Process Biochem. 50, 859-866 (2014).
  35. Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. DOE Simplified: Practical Tools for Effective Experimentation. Vol. 1. 1, Taylor & Francis. (2000).
  36. Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. Response Surface Methods Simplified. , Productivity Press. (2005).
  37. Buyel, J. F., Fischer, R. Generic chromatography-based purification strategies accelerate the development of downstream processes for biopharmaceutical proteins produced in plants. Biotechnol. J. 9, 566-577 (2014).
  38. Myers, R. H., Montgomery, D. C., Anderson-Cook, C. M. Response Surface Methodology: Process and Product Optimization Using Designed Experiments. , Wiley. (2009).

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Procedura per valutare l&#39;efficienza di flocculanti per la rimozione di particelle disperse di estratti di piante
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Buyel, J. F. Procedure to Evaluate the Efficiency of Flocculants for the Removal of Dispersed Particles from Plant Extracts. J. Vis. Exp. (110), e53940, doi:10.3791/53940 (2016).

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