Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Процедура оценки эффективности флокулянтов для удаления дисперсных частиц из растительных экстрактов

Published: April 9, 2016 doi: 10.3791/53940

Introduction

Растения широко используются для производства продовольственных товаров , таких как фруктовые соки, но они также могут быть разработаны в качестве платформы для производства более ценных продуктов биофармацевтических 1-3. В обоих случаях, вниз по течению обработки (DSP) часто начинается с извлечения жидкости из тканей , таких как листья или плоды, а затем разъяснении частиц нагруженные экстрактов 4,5. Для изготовления биофармацевтических, стоимость DSP может составлять до 80% от общих расходов 6,7 производства , и это отчасти отражает высокий частиц шихты , присутствующий в экстрактах , полученных с помощью подрывных методов , таких как лезвия на основе усреднении 8,9 , Несмотря на то, рациональный отбор фильтрующих слоев в соответствии с распределением частиц по размерам в экстракте может увеличить пропускную способность фильтра и снизить затраты 10,11, улучшение никогда не может превышать потолок абсолютной мощности , определенной по числу частиц , которые должны быть сохранены вединица площади фильтра для достижения разъяснения.

Потолок может быть поднята , если меньше частиц достигают поверхности лучших фильтров в фильтрационной поезде, и это может быть достигнуто , если диспергированные частицы смешивают с полимерами , известными в качестве флокулянтов , которые способствуют агрегации с образованием больших хлопьев 12. Такие Хлопья могут быть сохранены дальше вверх по течению от более грубых и менее дорогие фильтры мешка, уменьшая нагрузку частиц, достигающего тоньше и более дорогие глубины фильтров. Полимеры должны иметь профили безопасности , подходящие для их применения, например , для биофармацевтических они должны быть совместимы с надлежащей производственной практики (GMP), и , как правило , они должны иметь молекулярную массу> 100 кДа и может либо быть нейтральным или заряженный 13. В то время как нейтральные флокулянты в общем действуют сшивкой дисперсные частицы , что приводит к их агрегации и образование флокул диаметром> 1 мм 11, заряженные полимеры нейтрализуют заряд Dispersed частицы, уменьшая их растворимость и , таким образом , вызывая осаждение 14.

Флокуляции может быть улучшена за счет регулировки таких параметров, как буфера рН или проводимость, а также от типа полимера или концентрации, чтобы соответствовать свойствам экстракта 15,16. Что касается табачных экстрактов , предварительно обработанных с 0,5-5,0 г L -1 полиэтиленимина (PEI), большее , чем 2-кратное увеличение емкости глубинного фильтра сообщалось в процессе опытно-промышленные 100-L. Стоимость этого полимера меньше , чем € 10 кг -1 поэтому его введение в процесс привело к экономии около € 6000 для фильтров и расходных материалов на партию 16 или даже больше , когда в сочетании с целлюлозой на основе фильтрующих средств 17. Тем не менее , прогностические модели должны оценивать априорных экономические выгоды от флокулянтов , потому что их включение может потребовать шаги трюме 15-30 мин 16,18, в результате дальнейших инвестиционных затрат на хранениетанки. Тем не менее, в настоящее время нет механистические модели доступны, которые могут предсказать исход таких экспериментов из-за сложного характера флокуляции. Таким образом, подход 19 более соответствующие эксперименты дизайн-оф-(DOE) был разработан , как описано в этой статье. Протокол общей процедуре МЭ Недавно были опубликованы 20.

Небольшие устройства теперь доступны для высокопроизводительного скрининга условий флокуляции 21. Тем не менее, эти устройства не могут реально имитировать условия во время флокуляции экстрактов растений, так как размеры реакционного сосуда (~ 7 мм для лунок на 96-луночный планшет) и частиц или хлопьев может быть меньше, чем на порядок друг от друга. Это может повлиять на смешивание модели и, следовательно, предсказательная сила модели. Кроме того, это может быть трудно сократить масштабы процессов с участием осадков из-за нелинейных изменений в поведении и смешивания осадка ГНА22 ность. Поэтому в данной статье излагается стендовая масштабную систему скрининга с пропускной способностью 50-75 образцов в день, что дает результаты, которые масштабируются от исходного 20 мл реакционного объема в процессе 16 опытно-промышленные 100 л. В сочетании с подходом DOE, это позволяет прогностические модели, которые будут использоваться для оптимизации процесса и документации в рамках концепции качества по-дизайну.

Метод , описанный ниже , может также быть адаптирован к биофармацевтических , производимых в процессе культивирования клеток на основе, где флокулянт также рассматриваются в качестве инструмента 23 экономии. Он также может быть использован для моделирования осаждения белков - мишеней из неочищенного экстракта в качестве составной части стратегии очистки, как показано на бета-глюкуронидазы , полученного в канолы, кукурузы и сои 24,25. Подробное описание флокулянтов свойств можно найти в других 16,26 и важно , чтобы гарантировать , что полимер концентрations либо нетоксичный или ниже вредных уровней в конечном продукте 11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Разработка адекватной экспериментальной стратегии

  1. Определение параметров окружающей среды и процессов , которые имеют отношение к процедуре флокуляции быть установлены или оптимизированы, т.е. какие факторы оказывают наиболее сильное влияние на флокуляции. Как правило, существует несколько таких параметров , так подход НООо недавно описанным 20 необходимо из - за отсутствия механистических моделей.
    1. Выбор параметров (факторов) на основе литературных данных 12, предварительных знаний и опыта работы с системой. Типичные факторы включают буфера рН, буфера проводимость, время инкубации и температуры, а также типа полимера и концентрации 15,16,27.
    2. Используйте те же ссылки (см 1.1), чтобы определить значимые диапазоны для каждого числового фактора и уровни для категориальных факторов.
    3. Определить экспериментальные результаты (реакции), чтобы контролировать и использовать для оценки эффективности флокуляции. В зависимости от системы, этаможет быть фильтрат или надосадочную мутность, скорость осаждения, совокупный размер или емкость последующего фильтра 16,23,28-30.
    4. Убедитесь, что анализы, используемые для измерения ответов количественные, надежные и воспроизводимые / воспроизводимые таким образом, чтобы полученные данные высокого качества могут быть дополнены экспериментов, проведенных позднее этого срока или другим оператором.
  2. Выберите тип DoE устраивающего количество факторов необходимо исследовать и степень знаний уже накопилось о системе. Используйте имеющуюся литературу , чтобы определить подходящий тип DoE 20.
    1. Выберите дизайн скрининга, если имеется мало информации о системе флокуляции необходимо исследовать, большое количество параметров должны быть экранированы или мало известно о значимых диапазонах для параметров. Типовые конструкции скрининга являются полными и дробные факторные планы. Включают центральные точки в конструкции , если , как ожидается , параметры , чтобы иметь нелинейную воздействие, например , 19.
    2. Выбор методологии поверхности отклика (RSM), например , центральный композитный дизайн (CCD) 31 или оптимальная 32,33, если только несколько факторов , с хорошо известными диапазонах должны быть охарактеризованы точно.
  3. Настройка УОО с соответствующим программным обеспечением, что обеспечивает априорных критериев качества , таких как доля пространства дизайна выполнены 20.

2. Подготовка экспериментов флокуляции

Рисунок 1
Рисунок 1: растительный экстракт флокуляции рабочий процесс: масштабный процесс (слева) и шкала настольном (справа). После экстракции белка водных буферах, дисперсные частицы остатков клеток агрегируются путем добавления флокулянта. Агрегаты затем удаляют каскадом мешка и глубинной фильтрации и способности этихфильтры вместе с фильтратом мути может быть использован непосредственно для измерения эффективности флокуляции.

  1. Разработка общей экспериментальной работы Flow (Рисунок 1).
    1. С помощью устройства для экстракции , что приводит к такой же распределение частиц по размерам ожидаемой (или уже отмечалось) в конечном масштабе приложения, например , специализированной гомогенизатора. Если это возможно, разработать Масштабное вниз модель экстрактора , как описано для гомогенизации листьев табака 10.
    2. Определить объемы экстракта, используемые в процессе флокуляции экспериментов (здесь 20 мл). Выберите том , который позволяет репрезентативное количество частиц , чтобы присутствовать в реакционном сосуде, например , эксперименты флокуляции в 20 аликвоты дали воспроизводимые и масштабируемые результаты для табачных экстрактов , содержащих ~ 7% [Вт / v] твердых частиц 34 и размерами частиц ~ 0,5 мкм до ~ 3 мм 16.
    3. Дизайн все операции мониторинга и пост-флокуляции, так что йEY репрезентативны конечного масштаба приложения, например , выберите фильтры с таким же поведением удержания частиц , как те , которые используются в производственном масштабе.
  2. Выращивают растений, из которых экстракты будут получены.
    1. Используйте ту же самую линию растений, здесь Табак обыкновенный резюме. Petit Havana SR1, а также условия культивирования , которые будут использоваться в процессе производства , как описано выше 33.
    2. Если другие запасы корма будут обработаны, готовить эти запасы кормов , так что они являются репрезентативными для окончательного масштаба применения, например , использовать аутентичные буферы, принимать во внимание любые шаги разбавления во время процесса и придерживаться ожидаемого рН и проводимости, здесь рН 7,5 и проводимость 30 мСм см -1.
  3. Подготовить Фильтрационные Utilities, мутность-устройства контроля и отбора проб судов.
    1. Вырезать фильтрующие материалы с требуемыми размерами, здесь 15 х 15 см 2, если они не готовы к наме модули. Убедитесь, что все устройства мониторинга и анализа функциональных и маркировать все пробирки с образцами.
    2. Даже если эти простые задачи, подготовить эти вещи во времени, чтобы гарантировать, что они не будут вызывать перерывы во время реальных экспериментов флокуляции. Во избежание задержек, поскольку они могут повлиять на результаты, учитывая, что флокуляции представляет собой процесс, зависящий от времени.
  4. Подготовка Флокулянт маточных растворов. ВНИМАНИЕ: Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты при работе с флокулянтов, например , перчатки. Материалы могут быть опасными (знаки опасности в соответствии с Europe UE 67/548 / CEE, 1999/45 / CE включают N, Xi или Xn). Избегайте пыли и ссылаться на данные о безопасности материала. Работа под вытяжкой.
    1. Выберите концентрацию запаса для каждого флокулянта, здесь 80,0 г L -1 для двух флокулянтов PEI , которые были использованы. Выбор концентрации как можно выше, чтобы избежать разведения проб при добавлении флокулянта, что приведет к уменьшению Concentra частицции и, таким образом, влияют на эффективность флокуляции.
    2. Счет для любого предварительного разведения , который отражает формулировку производителя полимера, например , если полимер уже поставляется в виде водного 50% [вес / объем] раствора. [Вес / объем] были найдены Флокулянта Маточные растворы 4-8%, чтобы быть наиболее подходящим до сих пор.
    3. Принимая во внимание пункты, описанные выше, убедитесь, что концентрация флокулянта не создает чрезвычайно вязкий раствор, который ингибирует пипетирования, потенциально может привести к ошибкам, так как конечная концентрация флокулянта не настроена правильно.
    4. Используйте ту же концентрацию запаса для всех флокулянтов, если это возможно, потому что это облегчит настройку схемы пипетирования (2.5), таким образом, снижая вероятность возникновения ошибок.
    5. Доводят рН и проводимость каждого флокулянта исходного раствора в соответствии с условиями экстрактов, здесь рН 4-10 и проводимость 15-55 мСм см -1. Подготовьте отдельные акции для одного флокулянта, если труды, чем один набор рН и / или электропроводности на условиях проверяется на наличие этого полимера.
    6. Приготовить флокулянта растворы свеже, не более чем за 48 часов до использования. Несмотря на то, флокуляции может быть индуцирована с полимерными запасов, хранившихся в течение более 4 недель, эффективность может снижаться из-за гидролиза полимера при высоких или низких значениях рН. Обратитесь к документации производителя для получения более подробной информации.
    7. Убедитесь , что параметры , выбранные для DoE можно отрегулировать точно для каждого образца во время эксперимента, например , обеспечить наличие ванны нагрева / охлаждения , доступные для регулировки температуры инкубации, здесь 4 ° C, 20 ° C и 37 ° C. Если смешивание во время флокуляции является частью эксперимента, убедитесь, что устройство смешивания является представителем конечного масштаба применения с точки зрения критических параметров, таких как потребляемая мощность.
  5. Преобразование УОО расписание в пипетирующие схеме.
    1. Преобразование различных концентраций флокулянта быть TESTed в объемах исходного раствора, которые будут добавлены к образцам экстракта: разделить конечные концентрации флокулянт концентрацией акций и умножить на объем образца, используемого в экспериментах флокуляции. Определить наибольший полученный конечный объем, например , если 20 мл образца смешивают с максимумом 2 мл флокулянта исходного раствора это будет 22 мл.
    2. Вычислить объемы буфера , необходимого для поддержания того же конечного объема во всех аликвот флокуляции на основе наибольшего объема флокулянта запаса следует добавить, например , если 0,75 мл флокулянта запаса должны быть добавлены к пробе затем 1,25 мл буфера требуется для поддержания Конечный объем пробы 22 мл (2.5.1).
    3. Суммируем объемы исходного раствора флокулянта для каждого полимера и флокуляции условием для расчета абсолютных объемов исходного раствора, которые необходимы для НОО.
  6. Урожай табака Листья и приготовления экстракта.
    1. Снимите верхнюю шесть LeaVES (или столько , сколько указано в инструкции процесса) от табачных растений соответствующего возраста, например , 6 недель, и передача соответствующего устройства для экстракции , такие как гомогенизатор или винтового пресса.
    2. Добавьте три тома буфера для экстракции на грамм биомассы, например , 300 мл на 100 г, и смесь в течение 8 мин.
    3. Подготовить отдельные выдержки с соответствующими буферами, если она отличается рН и / или проводимостей проходят испытания. Вот, это включает в себя гомогенизацию растительного материала в течение 3 х 30 сек в блендере или соковыжималке 34.
    4. В качестве альтернативы, приготовления экстракта таким образом, что является представителем исследуемого процесса.
  7. Алиготе извлечение и буфера.
    1. Вручную и тщательно перемешайте экстракт в течение всей процедуры, чтобы обеспечить образцы однородны с равномерным распределением частиц.
    2. Точно распределить экстракт среди предварительно меченных реакционных труб путем декантации,здесь 20 мл в каждом сосуде. Само-стоя 50 мл трубки упрощают обработку и идеально подходят для 20 образцов мл.
    3. Добавить объем каждого экстракционного буфера, необходимого для поддержания фиксированного конечного объема для каждой отдельной реакционной трубке с использованием подходящей пипетки.

3. флоккулят растительных экстрактов с различными полимерами

  1. Пипетировать необходимый объем флокулянта исходного раствора, здесь 0,1-2,0 мл, к образцам последовательно, как это указано в рандомизированном порядке выполнения НОО. Тщательно перемешать каждую пробу сразу после добавления флокулянта под воздействием интенсивного руководства встряхивания в течение ровно 20 с.
    1. При необходимости отрегулировать время встряхивания для других кормовых запасов, чтобы обеспечить тщательное смешивание, но строго обеспечить постоянное время смешивания для всех образцов. Имейте в виду, что длительное смешивание может привести к необратимому нарушению хлопьями и непоследовательно применили силу при сотрясении может исказить результаты флокуляции.
  2. Необязательно: Измените процедуру, описанную выше, для одновременного применения двух или более флокулянтов.
    1. Вариант 1: Вместо одного полимера добавляют смесь из двух или более флокулянтов, здесь PEI и хитозана. Используйте флокулянта комбинации, определенные в НОО. Включать соотношение и абсолютные концентрации полимеров в качестве индивидуальных параметров во время установки DoE (1.1).
    2. Вариант 2: Добавление двух или более полимеров последовательно к экстракту.
      1. Используйте отдельные концентрации полимера, их тип и время инкубации между каждым добавлением к экстракту, в качестве дополнительных факторов в процессе установки НОО.
      2. Также используют этот подход, чтобы проверить, является ли повторное добавление одного полимера может улучшить флокуляции. Используйте ступенчатое добавление для имитации медленное добавление флокулянта, например , четыре этапа, каждый из которых добавляет 0,25 мл 80 г л -1 флокулянта запас до 20 мл объема в течение 4 мин может имитировать добавление флокулянта сскорость потока 0,25 мл · мин -1.
      3. Во всех случаях, определить новый максимальный конечный объем выборки для этой установки путем добавления максимальных объемов всех флокулянтов к объему образца, вот еще 22 мл, и повторно вычислить необходимые объемы флокулянта маточных растворов и буферов для регулировки громкости при необходимости.
  3. Инкубируйте образцы в течение времени, определенных в НОО, как правило, 3-30 мин, чтобы обеспечить образование хлопьев. Убедитесь , что все другие условия инкубации, например , температуры, устанавливаются в соответствии с НОО.
  4. Обратите внимание и формирование документов флок. Записывают ход образования флокул по мере необходимости, например , в качестве мм осаждения таких в минуту путем измерения высоты оседлых твердых частиц. При необходимости, продлить срок флокуляции в течение длительного периода времени, например в течение ночи.
  5. Фильтр экстракт флокулированная.
    1. Используйте фильтрующие материалы, подготовленные ранее (2.3) для уточнения флоккулированной экстракта после соответствующейВремя инкубации путем декантации флокулированной образцов через фильтрующий материал и в чистый сосуд или реакционной трубки.
      1. Не ресуспендируйте осажденных хлопь перед фильтрацией и применять экстракт с со скоростью ~ 300 мл · мин -1 до фильтра, что соответствует 3-4 сек в течение 20 мл образца.
      2. Подтверждения эффективности стадии фильтрации , если иной материал используется в стендовых экспериментах по сравнению с конечным процессом с точки зрения удержания частиц, например , путем измерения распределения частиц по размерам в обоих типов образцов 11.
    2. Анализ фильтрата с точки зрения мутности и / или распределения частиц по размерам в соответствии с требованиями с использованием соответствующих устройств, например, мутномере.
    3. Дополнительно: повторить анализ после продолжительного времени инкубации, например , 12-24 ч, чтобы исследовать образование или реформацию нестабильных хлопьями.
  6. Анализа образцов в терминах Prе определенные ответы (1.1.3).
    1. Возьмите образцы из фильтратов и анализировать их для дополнительных параметров реакции, например , концентрации различных белков - мишеней или ценных продуктов.
    2. Дополнительно: Анализ ретентата (в основном твердых веществ) для одних и тех же параметров, чтобы закрыть массовый баланс процесса. В частности, количественно влияние флокулянтов на жидком восстановление путем сравнения твердых веществ масса оставшихся после того, как образцы обрабатывают или не обрабатывают флокулянта.
  7. Подтвердите качество данных и передачи результатов в программу НОО.
    1. Посмотрите на экстремальные значения в собранных данных ответа, например , неожиданно высокие значения.
    2. Убедитесь в том, что все данные ответа правильно выровнены с соответствующими условиями эксперимента.
    3. Передача результатов в программное обеспечение НОО и убедитесь, что стандартные и рандомизированные заказы прогона не перепутать.

4. ОценкаУОО

  1. С помощью встроенных средств анализа данных программного обеспечения МЭ разработать прогностическую модель , как описано выше 20.
    1. Выберите правильный режим преобразования данных при необходимости для облегчения построения модели, здесь log 10. Соотношение больше , чем 10 для самого большого по сравнению наименьшим значением отклика указывает на то, что преобразование данных может потребоваться. Определить наиболее подходящее преобразование , используя соответствующие статистические инструменты, например, сюжет Box-Cox 35.
    2. Выбрали базовую модель , которая (я) соответствует к выбранному DoE (1.2) и (II) согласуется с предыдущими знаниями о рассматриваемой системе , основанной на анализе отклонений (ANOVA) инструментов программного обеспечения Doe, например, полином второго порядка часто лучше подходит для наблюдаемого эффекта времени инкубации, чем полином первого порядка.
    3. Удалить незначительные факторы модели, например , р> 0,05, или фактор взаимодействия итеративно, отменив их,льтате уменьшая сложность модели и увеличивая его предсказательной силы.
    4. Подтвердите качество модели путем сравнения R 2, с доведением R 2 и предсказал R 2 вместе с нормальной вероятностью участке Стьюдентизированная остатков, невязок-против-бега, предсказывал-против-фактическое и Box-Cox участки 36. Все значения R 2 должны быть в пределах 0,2 диапазона.
    5. Убедитесь , что окончательная модель согласуется с основными предположениями физики и термодинамики, например , никаких отрицательных концентраций не прогнозируется.
  2. Используйте модель для прогнозирования условий, которые являются наиболее благоприятными для исследуемой системы, то здесь низкой мутности.
    1. Выберите наиболее важные ответы и их предпочтительные состояния, например , минимальную мутность. Объедините эти выборы путем максимизации функции желательности или аналогичные инструменты, которые встроенные функции нескольких программных пакетов Doe 36.
    2. В зависимости от предполагаемого применения Oе модели, выберите подтверждение выполняется для проверки оптимальных условий и / или предсказательную силу модели в целом, например , если условия по прогнозам, будет наиболее благоприятным не были частью первоначального DoE выбрать их в качестве последующих экспериментов.

5. Улучшение модели и Проверка предсказательной силы

  1. Конкретизируйте первоначальный дизайн пространства для самых желательных условий эксплуатации, например , низкая мутность в диапазоне 0-1000 нефелометрических единиц мутности (NTU), на основе предсказаний модели (4.2).
  2. Установить новый DoE в этих диапазонах, в том числе только те факторы, которые были идентифицированы как значимые или соответствующие (4.1.2)).
    Примечание: Коэффициент может быть существенным с точки зрения анализа модели , но не имеет значения для процесса, т.е. его влияние на реакции составляет <1% по сравнению с другими факторами.
  3. Повторите шаги 1-5.2, пока качество предсказаний модели не соответствует ТРЕБОВАНИЯтс, например , стандартное отклонение модели , как указано программное обеспечение является достаточным для предполагаемого применения. Изменить экспериментальную стратегию , если требуется для этих итераций, например , использовать только один флокулянт в уточнении.
  4. Передача и подтвердить результаты по шкале вниз модели в пилотном масштабе или окончательного масштаба производства.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Флокуляция экстракта табака с различными полимерами

Описанный выше способ был успешно применен к разработке процесса флокуляции табачных экстрактов при производстве моноклональных антител (ВИЧ-нейтрализующих антител 2G12) и флуоресцентный белок (DsRed) (рис 1) 16, и с тех пор были переданы других белков, включая лектины, кандидатов вакцины против малярии и слитых белков (неопубликованные данные). Как правило, применение флокулянтов снижается мутность растительного экстракта мешка отфильтрованный от ~ 6000 NTU (10000 NTU после экстракции) до ~ 1000 NTU. В первоначальном эксперименте скрининг, 91-прогон IV-оптимальной конструкции был использован для тестирования 18 различных полимеров в трех различных концентрациях (так как этот фактор влияет на эффективность флокуляции 13,27) и наблюдали флокуляции в течение ~ 12 ч инкубации пародонтаd (рис 2А и В). Длительный инкубационный период может иметь важное значение для выявления значимых временные рамки для процесса флокуляции. Также значения рН 4-8 были испытаны , потому что они могут быть актуальны в будущих процессах из - за свойств специфических белков - мишеней 13,25,27,37. Среди 18 протестированных полимеров, шесть из них были найдены , чтобы уменьшить мутность экстракта после фильтрации мешка в типичных экстрактов с проводимостью 25 мс см -1.

Модель была усовершенствована за счет исключения всех неэффективные полимеров в двух итераций , а затем в том числе дополнительные параметры, такие как проводимость в 15-45 мСм см -1 диапазон, времени инкубации 5-75 мин и при температуре 4-30 ° С, для создания моделей, подходящих для более широкого диапазона условий процесса. Прогностическая сила модели увеличилась после каждой итерации, в результате чего в высоконадежной модели (фиг.3А). >

После четырех итераций, было обнаружено, что сильно заряженные катионные и разветвленный полимер ПЭИ, чтобы быть наиболее эффективным для агрегации диспергированных частиц в табачных экстрактов. Однако эффективность этого полимера снизилась с увеличением проводимости экстракта. Свойства молекулы размер, заряд, структура (разветвленный или линейный), плотность заряда и степень замещения амина (первичные, вторичные, третичные или четвертичные) были испытаны в качестве факторов в УОО и двух последних параметров имели наибольший эффект. Эти данные были представлены в другом месте 16. Основываясь на этом знании свойств полимера из результатов DOE, пять других полимеров были выбраны с молекулярными характеристиками , аналогичными PEI (плотность заряда> мэкв г -1 и четвертичных аминов). Один из этих пяти полимеров продемонстрировали большую эффективность флокуляции при более высоких проводимостей (рис 3B) 11.

нт. "ВОК: Keep-together.within-странице =" 1 "> В рамках подхода DOE, было подтверждено, что ни один из ИБОП не повлияло восстановление продукта при любом из испытанных условий Действительно емкость глубинных фильтров впоследствии используется для удалить остатки диспергированных твердых частиц увеличился на коэффициент 3.2-5.7, достигая ~ 110 л м -2 в зависимости от типа фильтра. Эти результаты были также подтверждены в процессе экспериментального типа 100 L, в течение которых применение флокулянтов уменьшил уточнение затраты на производство информации о связанных по> 50%, а общие затраты на производство на ~ 20%.

фигура 2
Рисунок 2: Эффективность различных флокулянтов при разных технологических условий (А). Образцы Извлечение непосредственно после флокуляции и фильтрации мешок все еще может появиться мутная. (Б) После отстаивания в течение нескольких часов, мутностьТе же образцы могут быть значительно снижены. Тем не менее, значения мутности, полученные сразу после фильтрации часто предпочтительнее, поскольку расширенные периоды удержания не может быть возможным в крупномасштабных производственных процессов. (С) Флоккуляция также эффективен при применении к растительных экстрактов , полученных с помощью шнекового пресса , а не в блендере , как указано в прозрачной красной жидкости в нижней части 50 - мл пробирки (красный цвет обусловлен наличием флуоресцентного белка DsRed ). (D) смеси различных флокулянтов могут также вызывать флокуляцию.

Рисунок 3
Рисунок 3:. Моделирование флокуляции с использованием подхода DoE (А) Точность предсказания модели возрастает по мере роста числа полимеров , в модели была снижена с начального скрининга рафинированию , даже если число параметров процесса увеличилось с тгоре до пяти. (В) Переключение типа полимера (здесь от одного ПЭИ к другому) , как следствие изменения параметров процесса (здесь проводимость) поддерживает эффективную флокуляцию частиц и соответствующий низкий фильтрата мутности по сравнению с экстрактом нелеченной контрольной (сплошная красная линия). Столбики ошибок в A и B указывают на стандартные отклонения модельных предсказаний. Пунктирные красные линии указывают на стандартные отклонения необработанной экстракта (N = 10). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Флокуляция табака экстрактов, приготовленных с помощью винтового пресса

Результаты флокуляционные были также переведены из табачных экстрактов, приготовленных с использованием гомогенизатора с, полученные с помощью винтового пресса, который генерировал меньше дисперсных частиц в диапазоне размеров мм, но большечастицы размером в пределах мкм. В 29-выполнения IV-оптимальной конструкции, было показано , что ПЭИ также эффективен для данного типа экстракта в аналогичном диапазоне концентраций и что восстановление целевых белков не влияет (фиг.2с). Это показывает, (I), что условия флокуляции, определенные для одного типа исходного сырья может быть в некоторой степени переведены в другие кормовых запасов, что экономит время в процессе разработки процесса, и (II), что стратегия МЭ может быть использована, чтобы подтвердить эту возможность передачи не только для индивидуальные условия процесса, но в течение всего дизайна помещения.

Флокуляции эксперименты с флокулянтов смесей

Комбинации флокулянтов могут быть более эффективными , чем отдельные полимеры, например , из - за более улучшенной мостиков между частицами 12. Таким образом, способ, описанный выше, был адаптирован для размещения добавление двух полимеров (3.2) 26. Три несинтетической полимеры испытывались отдельно, в сочетании друг с другом или в сочетании с PEI. Наиболее эффективным флокуляции табачных экстрактов достигалось с PEI в одиночку, но сочетание PEI и хитозан или полифосфатов может снизить концентрацию ПЭИ требуемого. Кроме того, подход DoE позволил нам выявить наиболее эффективные комбинации полимеров при опуская PEI (с или без хитозана и полифосфатов), таким образом , помогая определить оптимальные условия флокуляции в процессах , где PEI несовместима с белком - мишенью, например , в результате осаждения, а сообщили в βglucuronidase 24,25. Кроме того, Минэнергетики смог охарактеризовать сложный дизайн пространства , для которого нет механистическая модель не была доступна (Рисунок 2D). Использование инструментов ANOVA программного обеспечения DoE можно было различить надежных моделей прогнозирования и плохо оцениваемых аналогов (рисунок 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Самый важный аспект необходимо учитывать при создании DoE для характеристики флокуляции частиц является то , что конструкция в принципе должна быть в состоянии обнаружить и описать предполагаемые или возможные эффекты 36,38, например , влияние рН, типа полимера и концентрации 16 полимера. Поэтому, важно, чтобы оценить долю пространства дизайна (FDS) перед началом реальных экспериментов. FDS есть доля многомерного экспериментального пространства (охватываемой проектных факторов, например , рН) в пределах которых можно обнаружить предопределенные различия между двумя экспериментальными результатами дана система известной изменчивостью, например , обнаружения различия в мутности 250 NTU дали изменчивость 125 NTU. FDS может быть увеличена путем увеличения конструкции с дополнительными прогонов и должны быть ≥0.95 для конструкций , предназначенных для направления управления 36 процесса. Кроме того, если число запусков не допускает тон весь эксперимент будет проводиться в течение одного дня, блоки должны быть предварительно определены в DoE для учета от партии к партии и изо дня в день изменчивости. При работе с растительным материалом, включение ссылки выполняется в каждом блоке (например , необработанный контроль) помогает компенсировать изменчивости, что позволяет сравнивать данные нескольких серий каждый нормированных к их соответствующей реперной точке . В связи с этим, увеличение количества повторных прогонов в НОО, также полезно.

Когда большое число полимеров , просеивают, то целесообразно использовать индивидуальные свойства флокулянтов, плотность , например , заряда и молекулярной массой, поскольку дискретные числовые коэффициенты , а не сами полимеры в качестве категориальных факторов. Это позволяет сократить количество экспериментов, так как экспериментальные образцы часто должны быть воспроизведен для категориальных факторов, в то время как дополнительные уровни числовых коэффициентов нужно лишь небольшое число дополнительных трасс. Информация конпалатка эксперимента также увеличивается и позволяет идентифицировать свойства полимеров , которые улучшают флокуляции, например , с высокой плотностью заряда, которые содержатся в экспериментах , описанных здесь. CCD и RSM экспериментальной конструкции могут быть использованы для создания моделей с высокой предсказательной силой, что позволяет идентифицировать надежных условий обработки (например , для руководства управления технологическим процессом) и , как правило , используются для последующих скрининга конструкций. Если число уровней факторы и факторы, при результатов исследований в DoE с более чем 400 отдельных экспериментов, может быть целесообразным, чтобы уменьшить число уровней факторов или переключиться на другие типы конструкции, так как количество образца, которые могут быть легко обработаны с техникой представленный здесь ограничен до ~ 100 в день.

С экспериментальной точки зрения, полимеры должны оставаться стабильными при выбранных условиях эксперимента, например , они не должны деполимеризации при низком значении рН. Тщательная подготовка коагулянтаакции с точки зрения концентрации также необходимо для получения воспроизводимых результатов и моделей высокого качества. В этом контексте, флокулянт , возможно , должны быть предварительно обработаны, например , набухание раз или регулирование рН для хитина, чтобы обеспечить полное растворение, и , таким образом , чтобы получить гомогенный раствор. Высоковязкие запасов следует избегать, поскольку это может привести к возникновению ошибок при передаче пипетирования полимера в экстракте. Многие полимеры могут иметь сильное буферное действие , и акции имеют экстремальные значения рН, например , рН ~ 9,5 8% [вес / объем] PEI. Это может повлиять на рН экстракта, если запасы не были предварительно настроены и будут искажать результаты эксперимента. Например, если флокуляция является более эффективным при высоких рН и неустановленным рН, доведенным ПЭИ запас используется тогда, что НОО мог бы предположить, что высокие концентрации ПЭИ, являются более эффективными. Тем не менее, этот эффект будет вызван более высоким значением рН , вызванное большим объемом запаса , который был добавлен, а не повышенной концентрации ПЭ полимераг се. Концентрации акции используются также должны напоминать те, которые используются в крупномасштабных приложений, чтобы избежать различной разбавления эффекты между шкалами, которые могут повлиять на концентрацию частиц и, следовательно, флокуляции. Некоторые из глины на основе флокулянты , такие как каолин содержат большое количество самих мелких частиц , которые могут маскировать эффект флокуляции, например , снижение мутности после начальной фильтрации, и другие ответы должны быть выбраны , чтобы оценить эффективность этих веществ, например , ниже по потоку мощности фильтра.

Для анализа данных важно оценить собранные результаты с точки зрения экстремальных значений, перекосов и общей последовательности, например , экстремальные значения могут указывать на ошибку копировать-вставить, сдвиг в десятичной дроби или неисправность оборудования / аналитических приборов. Тщательный анализ будет гарантировать, что только высококачественные данные используются для построения модели. Во время построения модели важно постоянно оценивать тысе широкий набор показателей качества предоставляемых программным обеспечением НОО. Наиболее основными критериями являются R 2, скорректированный R 2 и предсказанные значения R 2, но нормальные остатки, остатки-VS-бега и фактической-VS-предсказанных участков (рисунок 4) еще более важны , поскольку они предоставляют информацию о каждом запуске в эксперимент, а не суммарный параметр. Кроме того, согласованность окончательной модели и ее предсказания с известными механизмами флокуляции всегда должны быть исследованы. Основные расхождения между расчетными и научных ожиданий может произойти потому , что модели министерства энергетики являются лишь описательными , а не механистического, например , модели могут предсказать экстремальные значения по краям дизайна пространства , отражающего использование полиномиальных алгоритмам.

Рисунок 4
Рис . 4: Показатели качества моделей Doe The NoRMAL участок Стьюдентизированная остатков должна напоминать прямую линию как можно ближе (А) лишь с небольшими отклонениями (зеленые стрелки) приемлемых для моделей высокого качества. Изогнутый внешний вид (C) с сильными отклонениями (красные стрелки) от идеальной линии (красный) указывает на плохую модель, например , из - за отсутствия значимых факторов. В конечном счете, прогнозируемым и экспериментальные (фактические данные ) значения должны совпадать (B) , и снова по прямой линии. Отклонения от идеальной линии (красный круг и пунктирной линией) указывают на плохие предсказания модели (D). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Подход МЭ может помочь охарактеризовать флокуляции в сложных кормовых запасов, таких как растительные экстракты, даже если нет существующих данных. Флокуляции табачных экстрактов была оптимизирована с нагрузкой работы 2 мыЭКС и расходные затраты на ~ € 500. Это привело к снижению количества глубинных фильтров, необходимых для одного пилотного масштаба партии с участием ~ 800 л растительного экстракта на 60%, что достигнутый соответствующее сокращение расходов на расходные материалы.

Флокулянты были также применены к различным экстрактами растений и клеточных культур гомогенатах. Хотя тот же флокулянт был эффективен для всех этих кормовых запасов, концентрация полимера должна была быть отрегулировано для того, чтобы приспособить различные концентрации дисперсных частиц. Кроме того, как только эффективный полимер был идентифицирован, этапы фильтрации и / или центрифугировани , возможно , должны быть скорректированы в соответствии с распределением по размерам частиц разные 11.

Описанный здесь метод может быть легко адаптирована к другим кормовых запасов и, следовательно, также имеет отношение к ученым и инженерам в разработке стратегий по разъяснению для млекопитающих клеточных культур и производственных процессов пищевых продуктов / кормов. Especially процессы на основе растительных выиграют от промежуточных объемов образцов предлагаемых здесь потому , что растительные экстракты могут содержать частицы размером до 1 мм в диаметре , которые несовместимы с микропланшетов форматами 21, например , так как динамика смесительные отличаются из - за диаметра частиц отношение диаметра сосуда к этому не является представителем масштаба процесса.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Автор не имеет конфликта интересов раскрывать.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2100P Portable Turbidimeter Hach 4650000 Turbidimeter
2G12 antibody Polymun AB002 Reference antibody
Biacore T200 GE Healthcare 28-9750-01 SPR device
BP-410 Furh 2632410001 Bag filter
Catiofast VSH BASF 79002360 Flocculating agent
Centrifuge 5415D Eppendorf 5424 000.410 Centrifuge
Centrifuge tube 15 ml Labomedic 2017106 Reaction tube
Centrifuge tube 50 ml self-standing Labomedic 1110504 Reaction tube
Chitosan Carl Roth GmbH 5375.1 Flocculating agent
Design-Expert(R) 8 Stat-Ease, Inc. n.a. DoE software
Disodium phosphate Carl Roth GmbH  4984.3  Media component
Ferty 2 Mega Kammlott 5.220072 Fertilizer
Forma -86C ULT freezer ThermoFisher 88400 Freezer
Greenhouse n.a. n.a. For plant cultivation
Grodan Rockwool Cubes 10 x 10 cm Grodan 102446 Rockwool block
HEPES Carl Roth GmbH 9105.3 Media component
K700P 60D Pall 5302305 Depth filter layer
KS50P 60D Pall B12486 Depth filter layer
Miracloth Labomedic 475855-1R Filter cloth
MultiLine Multi 3410 IDS WTW WTW_2020 pH meter / conductivity meter
Osram cool white 36 W Osram 4930440 Light source
Phytotron Ilka Zell n.a. For plant cultivation
Polymin P BASF 79002360 Flocculating agent
POLYTRON PT 6100 D Kinematica 11010110 Homogenization device with custom blade tool
Protein A Life technologies 10-1006 Antibody binding protein
Sodium chloride Carl Roth GmbH P029.2 Media component
Synergy HT BioTek SIAFRT Fluorescence plate reader
TRIS Carl Roth GmbH 4855.3 Media component
Tween-20 Carl Roth GmbH 9127.3 Media component
VelaPad 60 Pall VP60G03KNH4 Filter housing
Zetasizer Nano ZS Malvern ZEN3600 DLS particle size distribution measurement

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Godfray, H. C. J., et al. Food Security: The Challenge of Feeding 9 Billion People. Science. 327, 812-818 (2010).
  2. Fischer, R., Schillberg, S., Buyel, J. F., Twyman, R. M. Commercial aspects of pharmaceutical protein production in plants. Curr. Pharm. Des. 19, 5471-5477 (2013).
  3. Pastores, G. M., et al. A Phase 3, multicenter, open-label, switchover trial to assess the safety and efficacy of taliglucerase alfa, a plant cell-expressed recombinant human glucocerebrosidase, in adult and pediatric patients with Gaucher disease previously treated with imiglucerase. Blood Cells Mol. Dis. 53, 253-260 (2014).
  4. De Paepe, D., et al. A comparative study between spiral-filter press and belt press implemented in a cloudy apple juice production process. Food Chem. 173, 986-996 (2015).
  5. Buyel, J. F., Twyman, R. M., Fischer, R. Extraction and downstream processing of plant-derived recombinant proteins. Biotechnol. Adv. 33, 902-913 (2015).
  6. Wilken, L. R., Nikolov, Z. L. Recovery and purification of plant-made recombinant proteins. Biotechnol. Adv. 30, 419-433 (2012).
  7. Buyel, J. F. Process development trategies in plant molecular farming. Curr. Pharm. Biotechnol. 16, 966-982 (2015).
  8. Hassan, S., Keshavarz-Moore, E., Ma, J., Thomas, C. Breakage of transgenic tobacco roots for monoclonal antibody release in an ultra-scale down shearing device. Biotechnol. Bioeng. 111, 196-201 (2014).
  9. Hassan, S., van Dolleweerd, C. J., Ioakeimidis, F., Keshavarz-Moore, E., Ma, J. K. Considerations for extraction of monoclonal antibodies targeted to different subcellular compartments in transgenic tobacco plants. Plant Biotechnol. J. 6, 733-748 (2008).
  10. Buyel, J. F., Fischer, R. Scale-down models to optimize a filter train for the downstream purification of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco leaves. Biotechnol. J. 9, 415-425 (2014).
  11. Buyel, J. F., Fischer, R. Downstream processing of biopharmaceutical proteins produced in plants: the pros and cons of flocculants. Bioengineered. 5, 138-142 (2014).
  12. Gregory, J., Barany, S. Adsorption and flocculation by polymers and polymer mixtures. Adv. Colloid Interface Sci. 169, 1-12 (2011).
  13. Zhou, Y., Franks, G. V. Flocculation mechanism induced by cationic polymers investigated by light scattering. Langmuir. 22, 6775-6786 (2006).
  14. Runkana, V., Somasundaran, P., Kapur, P. C. Mathematical modeling of polymer-induced flocculation by charge neutralization. J. Colloid Interface Sci. 270, 347-358 (2004).
  15. Hjorth, M., Jorgensen, B. U. Polymer flocculation mechanism in animal slurry established by charge neutralization. Water Res. 46, 1045-1051 (2012).
  16. Buyel, J. F., Fischer, R. Flocculation increases the efficacy of depth filtration during the downstream processing of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco. Plant Biotechnol. J. 12, 240-252 (2014).
  17. Buyel, J. F., Opdensteinen, P., Fischer, R. Cellulose-based filter aids increase the capacity of depth filters during the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins. Biotechnol. J. 10, 584-591 (2014).
  18. Yasarla, L. R., Ramarao, B. V. Dynamics of Flocculation of Lignocellulosic Hydrolyzates by Polymers. Ind. Eng. Chem. Res. 51, 6847-6861 (2012).
  19. Montgomery, D. C. Design and Analysis of Experiments. , John Wiley & Sons Incorporated. (2007).
  20. Buyel, J. F., Fischer, R. Characterization of complex systems using the design of experiments approach: transient protein expression in tobacco as a case study. J. Vis. Exp. , e51216 (2014).
  21. Espuny Garcia Del Real, G., Davies, J., Bracewell, D. G. Scale-down characterization of post-centrifuge flocculation processes for high-throughput process development. Biotechnol. Bioeng. 111, 2486-2498 (2014).
  22. Rathore, A. S., Sofer, G. Process Validation in Manufacturing of Biopharmaceuticals, 3rd edn, Vol. 1. , Taylor & Francis. (2012).
  23. Kang, Y., et al. Development of a Novel and Efficient Cell Culture Flocculation Process Using a Stimulus Responsive Polymer to Streamline Antibody Purification Processes. Biotechnol. Bioeng. 110, 2928-2937 (2013).
  24. Menkhaus, T. J., Eriksson, S. U., Whitson, P. B., Glatz, C. E. Host selection as a downstream strategy: Polyelectrolyte precipitation of beta-glucuronidase from plant extracts. Biotechnol. Bioeng. 77, 148-154 (2002).
  25. Holler, C., Vaughan, D., Zhang, C. M. Polyethyleneimine precipitation versus anion exchange chromatography in fractionating recombinant beta-glucuronidase from transgenic tobacco extract. J. Chromatogr. A. 1142, 98-105 (2007).
  26. Buyel, J. F., Fischer, R. Synthetic polymers are more effective than natural flocculants for the clarification of tobacco leaf extracts. J. Biotechnol. 195, 37-42 (2014).
  27. Pearson, C. R., Heng, M., Gebert, M., Glatz, C. E. Zeta potential as a measure of polyelectrolyte flocculation and the effect of polymer dosing conditions on cell removal from fermentation broth. Biotechnol. Bioeng. 87, 54-60 (2004).
  28. Buyel, J. F., Gruchow, H. M., Boes, A., Fischer, R. Rational design of a host cell protein heat precipitation step simplifies the subsequent purification of recombinant proteins from tobacco. Biochem. Eng. J. 88, 162-170 (2014).
  29. Wang, S., Liu, C., Li, Q. Impact of polymer flocculants on coagulation-microfiltration of surface water. Water Res. 47, 4538-4546 (2013).
  30. Menkhaus, T. J., Anderson, J., Lane, S., Waddell, E. Polyelectrolyte flocculation of grain stillage for improved clarification and water recovery within bioethanol production facilities. Bioresour. Technol. 101, 2280-2286 (2010).
  31. Mune, M. A. M., Minka, S. R., Mbome, I. L. Optimising functional properties during preparation of cowpea protein concentrate. Food Chem. 154, 32-37 (2014).
  32. Buyel, J. F., Fischer, R. Predictive models for transient protein expression in tobacco (Nicotiana tabacum L.) can optimize process time, yield, and downstream costs. Biotechnol. Bioeng. 109, 2575-2588 (2012).
  33. Buyel, J. F., Kaever, T., Buyel, J. J., Fischer, R. Predictive models for the accumulation of a fluorescent marker protein in tobacco leaves according to the promoter/5'UTR combination. Biotechnol. Bioeng. 110, 471-482 (2013).
  34. Buyel, J. F., Fischer, R. A juice extractor can simplify the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins compared to blade-based homogenizers. Process Biochem. 50, 859-866 (2014).
  35. Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. DOE Simplified: Practical Tools for Effective Experimentation. Vol. 1. 1, Taylor & Francis. (2000).
  36. Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. Response Surface Methods Simplified. , Productivity Press. (2005).
  37. Buyel, J. F., Fischer, R. Generic chromatography-based purification strategies accelerate the development of downstream processes for biopharmaceutical proteins produced in plants. Biotechnol. J. 9, 566-577 (2014).
  38. Myers, R. H., Montgomery, D. C., Anderson-Cook, C. M. Response Surface Methodology: Process and Product Optimization Using Designed Experiments. , Wiley. (2009).

Tags

Биологии растений выпуск 110 снижение стоимости расходных материалов дизайн экспериментов (DOE) дальнейшей переработки флокуляции растительный экстракт осветление растительного происхождения фармацевтические препараты
Процедура оценки эффективности флокулянтов для удаления дисперсных частиц из растительных экстрактов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Buyel, J. F. Procedure to EvaluateMore

Buyel, J. F. Procedure to Evaluate the Efficiency of Flocculants for the Removal of Dispersed Particles from Plant Extracts. J. Vis. Exp. (110), e53940, doi:10.3791/53940 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter