Introduction
Växter är allmänt används för att producera livsmedelsråvaror såsom fruktjuicer, men de kan också utvecklas som plattformar för tillverkning av högre värde biofarmaceutiska produkter 1-3. I båda fallen, nedströms (DSP) börjar ofta med extraktion av vätskor från vävnader såsom blad eller frukter, följt av klargörande av partikelbemängd extrakt 4,5. För tillverkning av biologiska läkemedel, kan kostnaderna för DSP står för upp till 80% av de totala produktionskostnaderna 6,7 och detta delvis återspeglar den höga partikelbördan närvarande i extrakt framställda av störande metoder såsom bladbaserade homogenisering 8,9 . Även rationell urval av filterskikt för att matcha partikelstorleksfördelningen i extraktet kan öka filterkapacitet och minska kostnaderna 10,11, kan förbättringen aldrig överstiga ett tak på absoluta kapacitet definieras av antalet partiklar som måste bevaras perenhet av filterytan för att uppnå förtydligande.
Taket kan lyftas om färre partiklar når ytan av de finaste filter i filtrerings tåg, och detta kan uppnås om spridda partiklar blandas med polymerer som är kända som flockningsmedel som främjar aggregering att bilda stora flockar 12. Sådana flockar kan behållas längre uppströms av grövre och billigare påsfilter, vilket minskar partikelbördan når finare och dyrare djupfilter. Polymer måste ha säkerhetsprofiler som är lämpliga för sina ansökningar, till exempel för bioläkemedel de måste vara kompatibel med god tillverkningssed (GMP), och typiskt måste ha en molmassa> 100 kDa och kan antingen vara neutral eller debiteras 13. Medan neutrala flockuleringsmedel fungerar däremot i allmänhet genom tvärbindning dispergerade partiklarna orsakar deras aggregering och bildandet av flockar med diametrar> 1 mm 11, laddade polymerer neutralisera laddningen av dispersed partiklar, vilket minskar deras löslighet och därmed orsakar utfällning 14.
Flockning kan förbättras genom att justera parametrar såsom pH eller konduktivitet, och typen polymer eller koncentration, för att matcha egenskaperna hos extraktet 15,16. För tobaksextrakt förbehandlats med 0,5-5,0 g L -1 polyetylenimin (PEI), en mer än två-faldig ökning av djupfilter kapacitet rapporterades i en 100-L pilotskala process. Kostnaden för denna polymer är mindre än € 10 kg -1 så dess införande i processen resulterat i kostnadsbesparingar på cirka 6000 € för filter och förbrukningsartiklar per sats 16 eller ännu mer när de kombineras med cellulosabaserat filterhjälpmedel 17. Trots detta är prediktiva modeller som krävs för att utvärdera a priori ekonomiska fördelarna med flockningsmedel eftersom deras integration kan kräva håll stegen 15-30 min 16,18, vilket resulterar i ytterligare investeringskostnader för lagringtankar. Men det finns för närvarande inga mekanistiska modeller som kan förutsäga resultatet av dessa experiment på grund av den komplicerade karaktären av flockning. Därför var en mer lämplig utformning-of-experiment (DOE) metod 19 utvecklats som beskrivs i denna artikel. Ett protokoll för den allmänna DoE förfarande har nyligen publicerats 20.
Små produkter finns nu tillgängliga för high-throughput screening av flockningsförhållanden 21. Dock kan dessa enheter inte realistiskt simulera förhållanden under flockning av växtextrakt, eftersom dimensionerna hos reaktionskärlet (~ 7 mm för brunnar på en 96-brunnar) och partiklar eller flockar kan vara mindre än en storleksordning isär. Detta kan påverka blanda mönster och därmed prognosförmåga av modellen. Dessutom kan det vara svårt att skala ner processer som involverar utfällning på grund av icke-linjära förändringar i blandnings beteende och fällning staheten 22. Därför denna artikel beskriver en bänk-top-skala screeningsystem med en kapacitet på 50-75 prover per dag, ger resultat som är skalbara från den ursprungliga 20 ml reaktionsvolym till en 100 L pilotskala process 16. När de kombineras med en DoE tillvägagångssätt, ger detta de prediktiva modeller som ska användas för processoptimering och dokumentation som en del av en kvalitet-för-designkoncept.
Metoden som beskrivs nedan kan också anpassas till biologiska läkemedel som produceras i cellkultur-baserade processer, där flockningsmedel är också betraktas som en kostnadsbesparande verktyg 23. Den kan också användas för att modellera den utfällning av målproteiner från ett råextrakt som en del av en strategi för rening, såsom visats för β-glukuronidas som produceras i raps, majs och sojaböna 24,25. Kan hittas En detaljerad beskrivning av flockningsegenskaper på andra ställen 16,26 och det är viktigt att säkerställa att polymer concentrheten är antingen icke-toxiska eller under skadliga nivåer i slutprodukten 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utveckla en tillräcklig experimentell strategi
- Identifiera de miljömässiga och processparametrar som är relevanta för flockningsförfarande som skall upprättas eller optimeras, dvs vilka faktorer har den starkaste effekten på flockning. Vanligtvis finns det flera sådana parametrar så ett DOE tillvägagångssätt som nyligen beskrivits 20 är nödvändig på grund av bristen på mekanistiska modeller.
- Välj parametrar (faktorer) baserat på litteraturdata 12, tidigare kunskaper och erfarenheter med systemet. Typiska faktorer inkluderar pH, buffert ledningsförmåga, inkubationstid och temperatur samt polymertyp och koncentration 15,16,27.
- Använd samma referenser (se 1.1) för att definiera meningsfulla områden för varje numerisk faktor och nivåer för kategoriska faktorer.
- Definiera de experimentella resultat (svar) som skall övervakas och användas för att utvärdera effektiviteten av flockulering. Beroende på systemet, dettakan vara filtrat eller supernatant grumlighet, lösa hastighet, aggregatstorlek eller kapaciteten hos ett efterföljande filter 16,23,28-30.
- Se till att analyser används för att mäta svaren är kvantitativ, robust och repeterbar / reproducerbara så att de resulterande högkvalitativa data kan utökas med experiment som utförs senare eller av en annan operatör.
- Välj ett DOE typ passar det antal faktorer som skall undersökas och graden av kunskap som redan samlats om systemet. Använd tillgänglig litteratur för att identifiera en lämplig DoE typ 20.
- Välj en screening design om det finns lite information om flocksystem som skall undersökas, ett stort antal parametrar måste undersökas eller lite är känt om meningsfulla intervall för parametrarna. Typiska screening mönster är fullständiga och fraktionella faktor. Inkludera centrumpunkter i utformningen om parametrarna förväntas ha en icke-linjär effekt, t.ex. 19.
- Välj ett svar yta metod (RSM), t.ex. central sammansatt konstruktion (CCD) 31 eller optimal 32,33, om bara ett fåtal faktorer med kända intervall behöver karakteriseras exakt.
- Inrätta DOE med lämplig mjukvara, säkerställa a priori kvalitetskriterier som den del av design utrymme är uppfyllda 20.
2. Förbered flocknings Experiment
Figur 1: Växtextrakt flock arbetsflöde: process skala (till vänster) och bänkskala (till höger). Efter proteinextraktion med vattenhaltiga buffertar, är dispergerade partiklar av cellfragment aggregeras genom tillsats av flockningsmedel. Aggregaten avlägsnas sedan genom en kaskad av påse och djupfiltrering och kapaciteten hos dessafilter tillsammans med filtratet turbiditet kan användas direkt för att mäta effektiviteten i flockulering.
- Utveckla en allmän experimentellt arbete Flow (Figur 1).
- Använda en extraktionsanordning som resulterar i samma partikelstorleksfördelning förväntade (eller redan observerade) vid den slutliga tillämpningen skala, t ex en specialiserad homogenisator. Om möjligt utforma en skala-down-modellen av extraktorn såsom beskrivits för homogenisering av tobaksbladen 10.
- Definiera extraktvolymerna som används vid flockningsförsök (här 20 ml). Välj en volym som gör att ett representativt antal partiklar att vara närvarande i reaktionskärlet, t.ex. flockningsförsök i 20 ml portioner gav reproducerbara och skalbara resultat för tobaksextrakt innehållande ~ 7% [w / v] fasta ämnen 34 och partikelstorlekar av ~ 0,5 im till ~ 3 mm 16.
- Utforma all övervakning och efter flock verksamhet så att they är representativa för den slutliga ansökan skala, till exempel väljer filter med samma partikelkvarhållande beteende som de som används vid produktionen skala.
- Odla växter som extrakten kan bygga på.
- Använd samma växtlinjen, här Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1, och odlingsbetingelser som kommer att användas under produktion som tidigare beskrivits 33.
- Om andra foderlager kommer att behandlas, förbereda dessa foderlager så att de är representativa för den slutliga ansökan skala, till exempel använda autentiska buffertar, ta hänsyn till eventuella utspädningssteg under processen och hålla sig till det förväntade pH och konduktivitet, här pH 7,5 och konduktivitet 30 mS cm -1.
- Förbered Filtrering Utilities, turbiditet-övervakningsutrustning och provtagningskärl.
- Skär filtermaterialen till de önskade storlekarna, här 15 x 15 cm 2, om de inte är färdiga att osse moduler. Se till att alla övervaknings- och analysanordningar är funktionella och märka alla provrör.
- Även om dessa är enkla uppgifter, förbereda dessa poster i tid för att se till att de inte kommer att orsaka avbrott under själva flockningsförsök. Undvika förseningar eftersom de kan störa resultaten med tanke på att flockning är en tidsberoende process.
- Förbereda Flocculant stamlösningar. VARNING: Använd lämplig personlig skyddsutrustning vid hantering av flockningsmedel, till exempel handskar. Materialen kan vara farliga (varningsetiketter enligt Europa UE 67/548 / EEG, 1999/45 / EG omfattar N, Xi eller Xn). Undvik damm och hänvisar till materialsäkerhetsdatabladen. Arbeta under ett dragskåp.
- Välj en stamkoncentration för varje flockningsmedel, här 80,0 g L -1 för de två PEI flockningsmedel som användes. Välj koncentrationer så höga som möjligt för att undvika provspädning när du lägger till flockningsmedel, vilket skulle minska partikel Concentration och därmed påverka flocknings effektivitet.
- Konto för förhand utspädning som återspeglar tillverkarens formuleringen av polymeren, t ex om polymeren redan levereras som en vattenbaserad 50% [w / v] lösning. Flockningsstamlösningar av 4-8% [vikt / volym] befanns vara den mest lämpliga hittills.
- Med tanke på de frågor som diskuterats ovan, se till att flock koncentrationen inte genererar en mycket viskös lösning som hämmar pipettering, vilket kan orsaka fel eftersom det slutliga flock koncentrationen inte är korrekt inställd.
- Använd samma förrådskoncentration för alla flockningsmedel om det är möjligt eftersom detta kommer att underlätta installationen av en pipetteringssystemet (2,5) vilket minskar risken för fel.
- Justera pH och ledningsförmågan hos varje flockningsmedel stamlösning för att matcha villkoren för extrakt, här pH 4-10 och konduktivitet 15-55 mS cm -1. Förbered enskilda aktier för en enda flockningsmedel om mmalm än en uppsättning av pH och / eller konduktivitet förhållanden testas för denna polymer.
- Bered flockningsstamlösningar nytt, inte längre än 48 timmar före användning. Även om flock kan induceras med polymerlager som lagrats i mer än 4 veckor, kan effektiviteten minska på grund av polymer hydrolys vid höga eller låga pH-värden. Se tillverkarens dokumentation för ytterligare information.
- Se till att de parametrar som valts för DOE kan finjusteras för varje prov under experimentet, t ex se till att det finns värme / kyla bad tillgängliga för att justera inkubationstemperaturer, här 4 ° C, 20 ° C och 37 ° C. Om blandning under flock är en del av försöket, se till att blandningsanordningen är representativ för den slutliga ansökan skala i form av kritiska parametrar såsom ineffekt.
- Konvertera DOE schema i en Pipettering schema.
- Konvertera olika flocknings koncentrationer vara tesTed i volymer av stamlösning som kommer att läggas till extrakt prover: dela de slutliga flockningskoncentrationer av stamkoncentration och multiplicera med den provvolym som används i flockningsförsök. Identifiera de största resulterande slutliga volymen, till exempel om 20 ml av provet blandas med högst 2 ml flockstamlösning detta kommer att vara 22 ml.
- Beräkna volymer buffert som krävs för att bibehålla samma slutvolym i alla flock portioner baserat på den största volymen flock lager som skall tillsättas, till exempel om 0,75 ml av flockningsmedel lager måste tillsättas till ett prov då 1,25 ml buffert krävs för att upprätthålla slutlig provvolym på 22 ml (2.5.1).
- Summera volymerna av flockningsmedel-stamlösning för varje polymer och flock tillstånd för att beräkna de absoluta volymer av stamlösning som krävs för DOE: t.
- Harvest tobaksblad och förbereda extraktet.
- Ta bort de sex leaves (eller så många som visas med i process instruktioner) från tobaksplantor av en lämplig ålder, t.ex. 6 veckor gammal, och överför till en lämplig utsugningsanordning, såsom en homogenisator eller skruvpress.
- Tillsätt tre volymer extraktionsbuffert per gram biomassa, t ex 300 ml per 100 g, och blanda i 8 min.
- Förbered enskilda extrakt med lämpliga buffertar om olika pH och / eller ledningsförmåga testas. Här handlar det om homogenisering av växtmaterial för 3 x 30 sekunder i en mixer eller en juicepress 34.
- Alternativt förbereda extraktet på ett sätt som är representativt för den process som undersöks.
- Alikvotera Extract och Tillsätt buffert.
- Manuellt och grundligt rör extraktet under hela förfarandet för att säkerställa att proven är homogena med en jämn fördelning av partiklar.
- Just fördela extraktet bland pre-märkta reaktionsrören genom dekantering,Här 20 ml i varje kärl. Fristående 50 ml rör förenkla hanteringen och är idealiska för 20 ml prover.
- Lägga volymen för varje extraktionsbuffert krävs för att bibehålla den fasta slutvolym för varje enskild reaktionsrör med en lämplig pipett.
3. flocka växtextrakt med olika polymerer
- Pipettera den erforderliga volymen av flockningsmedel stamlösning, här 0,1-2,0 ml, till proverna sekventiellt såsom indikeras av den randomiserade run order av DOE: t. Blandas omsorgsfullt provet omedelbart efter tillsatsen av flockningsmedel av intensiv manuell skakning under exakt 20 sek.
- Vid behov justera skakningen för andra foderlager för att säkerställa noggrann blandning, men strikt konsekventa blandningstider för alla prover. Tänk på att långvarig blandning kan orsaka irreversibel störning av flockarna och tillämpas inkonsekvent kraft under skakning kan snedvrida flockningsresultat.
- Valfritt: Ändra den procedur som beskrivs ovan för samtidig tillämpning av två eller flera flockningsmedel.
- Alternativ 1: I stället för en enda polymer tillsätts en blandning av två eller flera flockningsmedel, här PEI och kitosan. Använd flocknings kombinationer som definieras i DOE. Införliva förhållandet och absoluta koncentrationer av polymerer som individuella parametrar under DOE installationen (1,1).
- Alternativ 2: Lägg till två eller flera polymerer sekventiellt till extraktet.
- Använd de individuella polymerkoncentrationer, deras typ, och inkubationstiden mellan varje tillsats till extraktet, som ytterligare faktorer under DOE installationen.
- använder också denna metod för att testa om upprepad tillsats av en enda polymer kan förbättra flockning. Använd en stegvis tillsats för att simulera den långsamma tillsatsen av ett flockningsmedel, till exempel fyra steg, kan varje tillsats av 0,25 ml 80 g L -1 flock lager till en 20 ml volym under 4 min härma tillsats av flockningsmedel meden flödeshastighet av 0,25 ml min -1.
- I samtliga fall identifiera en ny maximal slutlig provvolym för denna inställning genom att lägga till de högsta volymerna av alla flockningsmedel till provvolymen, här fortfarande 22 ml, och räkna de erforderliga volymerna av flockningsstamlösningar och buffertar för att justera volymen vid behov.
- Inkubera proverna under de tider som anges i DOE, typiskt 3-30 min, för att möjliggöra flockbildning. Se till att alla andra inkubationsbetingelser, t.ex. temperatur, sätts enligt DOE.
- Observera och dokumentera flockbildning. Registrera förloppet för flockbildning såsom erfordras, t ex som mm av flock sedimente per min genom mätning av höjden av de sedimenterade fasta ämnena. Om så är nödvändigt, förlänga flockulering under en utsträckt tidsperiod, såsom under natten.
- Filtrera flockade Extract.
- Använd filtermaterial som framställts tidigare (2,3) för att klargöra den flockade extraktet efter lämpliginkubationstid genom dekantering av den flockulerade prover genom filtermaterialet och in i ett rent kärl eller reaktionsrör.
- Behöver inte återsuspendera de sedimente flockarna före filtrering och applicera extraktet med en hastighet av ~ 300 ml min -1 till filtret, vilket motsvarar 3-4 sek för ett 20 ml prov.
- Bekräfta utförandet av filtreringssteget, om ett annat material används i det bänkexperiment jämfört med den slutliga processen i termer av partikelkvarhållande, t ex genom mätning av partikelstorleksfördelningen i både provtyper 11.
- Analysera filtratet i termer av grumlighet och / eller partikelstorleksfördelning som krävs med hjälp av lämpliga anordningar, t ex en turbidimeter.
- Valfritt: upprepa analysen efter förlängda inkubationstider, t ex 12-24 timmar, för att undersöka bildandet eller reformering av instabila flockar.
- Använd filtermaterial som framställts tidigare (2,3) för att klargöra den flockade extraktet efter lämpliginkubationstid genom dekantering av den flockulerade prover genom filtermaterialet och in i ett rent kärl eller reaktionsrör.
- Analysera prov i termer av Pre definierade Responses (1.1.3).
- Ta prover från filtraten och analysera dem för ytterligare svarsparametrar, till exempel halterna av olika målproteiner eller värdefulla produkter.
- Valfritt: Analysera retentatet (mestadels fast material) för samma parametrar för att stänga massbalans för processen. I synnerhet kvantifiera effekten av flockningsmedel på flytande återhämtning genom att jämföra det fasta massa som återstår efter prover behandlas eller inte behandlas med flockningsmedel.
- Kontrollera kvaliteten på uppgifterna och överföra resultaten till DOE programmet.
- Leta efter extrema värden i de insamlade responsdata, t.ex. oväntat höga värden.
- Se till att alla svarsdata är korrekt i linje med motsvarande experimentella betingelser.
- Överföra resultaten till DOE programmet och se till att de vanliga och randomiserade springa order inte blandas ihop.
4. UtvärderaDOE
- Använd de inbyggda verktyg för dataanalys av DOE programvara för att utveckla en prediktiv modell som tidigare beskrivits 20.
- Välj en lämplig dataomvandlingsläge om det behövs för att underlätta modellbygge, här log 10. Ett förhållande större än 10 för största kontra minsta respons värde indikerar att en datatransformation kan krävas. Identifiera den mest lämpliga omvandling med hjälp av lämpliga statistiska verktyg, exempelvis en låda-Cox plot 35.
- Välj en basmodell som (i) passar till den valda DoE (1,2) och (ii) överensstämmer med tidigare kunskap om systemet under utredning bygger på en analys av varians (ANOVA) verktyg DOE programvara, till exempel ett andra ordningens polynom ofta passar bättre till den observerade effekten av inkubationstid än en första ordningens polynom.
- Ta bort obetydliga modell faktorer, t ex p> 0,05, eller faktor interaktioner iterativt genom att avmarkera dem,Reby minska modellen komplexiteten och öka sin prognosförmåga.
- Bekräfta modellkvalitet genom att jämföra R2, justerat R2 och förutspådde R2 tillsammans med normalfördelningsplot av studentized restprodukter restprodukter-vs-run, förutspådde-vs-faktiska och Box-Cox tomter 36. Alla R 2 värden bör ligga inom ett 0,2 intervall.
- Se till att den slutliga modellen överensstämmer med de grundläggande antaganden om fysik och termodynamik, t ex inga negativa koncentrationer förutses.
- Använda modellen för att förutsäga villkor som är mest fördelaktiga för systemet under utredning, här låg grumlighet.
- Välj de viktigaste svaren och deras föredragna tillstånd, t ex minimal grumlighet. Kombinera dessa val genom att maximera en önskvärda funktion eller liknande verktyg, som är inbyggda funktioner för flera DOE programvarupaket 36.
- Beroende på den avsedda tillämpningen of modellen körs väljer bekräftelse att kontrollera de optimala förhållanden och / eller prognosförmåga av modellen i allmänhet, till exempel om de villkor som förutsägs vara mest gynnsamma var inte en del av den ursprungliga DoE välja dem som uppföljningsexperiment.
5. förbättra modellen och verifiera prognosförmåga
- Begränsa den ursprungliga design utrymme till de mest eftertraktade driftsförhållanden, exempelvis låg grumlighet i 0-1,000 nefelometriska grumligheter (NTU) intervall, baserat på modellprediktioner (4,2).
- Inrätta en ny DoE inom dessa områden, med endast de faktorer som har identifierats som betydande eller relevant (4.1.2)).
OBS: En faktor kan vara betydande när det gäller modellanalys men irrelevant för en process, det vill säga dess effekt på ett svar är <1% jämfört med andra faktorer. - Upprepa steg 1 till 5,2 tills kvaliteten på modellprediktioner matchar requirements, standardavvikelsen av modellen som anges av programvaran är tillräcklig för den avsedda tillämpningen, t.ex.. Ändra den experimentella strategin om det krävs för dessa upprepningar, t.ex. använda endast ett flockningsmedel i förfining.
- Överföra och bekräfta resultaten från vågen-down-modellen till pilotskala eller slutproduktion skala.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Flockning av tobaksextrakt med olika polymerer
Den ovan beskrivna metoden användes med framgång för att utveckla ett förfarande för flockning av tobaksextrakt under tillverkningen av en monoklonal antikropp (HIV-neutraliserande antikropp 2G12) och ett fluorescerande protein (DsRed) (Figur 1) 16, och har sedan överförts till andra proteiner, inklusive lektiner, malariavaccinkandidater och fusionsproteiner (opublicerade data). Typiskt tillämpningen av flockningsmedel minskade grumligheten bag-filtrerad växtextrakt från ~ 6000 NTU (10.000 NTU efter extraktion) till ~ 1000 NTU. I en inledande screening experiment en 91-run IV-optimal utformning används för att testa 18 olika polymerer i tre olika koncentrationer (eftersom denna faktor påverkar flock effektivitet 13,27) och observerade flock över en ~ 12 timmars inkubation period (figur 2A och B). Den långa inkubationstiden kan vara viktigt att identifiera meningsfulla tidsramar för flockningsprocessen. Även pH-värden av 4-8 testades eftersom dessa kan vara relevant i framtida processer på grund av egenskaperna hos specifika målproteiner 13,25,27,37. Bland de 18 testade polymerer har sex visat sig minska extrakt turbiditet efter påse filtrering i typiska extrakt med en konduktivitet av 25 ms cm -1.
Modellen förfinades genom att utesluta alla ineffektiva polymerer i två iterationer och sedan inklusive ytterligare processparametrar, såsom ledningsförmåga i 15-45 mS cm -1 räckvidd, en inkubationstid på 5-75 minuter och temperaturer på 4-30 ° C, att generera modeller som är lämpliga för ett bredare spektrum av processbetingelser. Den prediktiva kraften i modellen ökade efter varje iteration, vilket resulterar i en i hög grad tillförlitlig modell (figur 3A). >
Efter fyra iterationer, var högt laddad katjonisk och grenade polymer PEI visade sig vara den mest effektiva för sammanläggning av dispergerade partiklar i tobaksextrakt. Emellertid effektiviteten hos denna polymer minskade med ökande extrakt ledningsförmåga. Egenskaperna molekyl storlek, laddning, struktur (förgrenad eller linjär), laddningsdensitet och grad av aminsubstitution (primär, sekundär, tertiär eller kvartar) testades som faktorer i en doe och de sista två parametrarna hade störst effekt. Detaljerna har rapporterats på annat håll 16. Baserat på denna kunskap om polymeregenskaper från DOE resultat, var fem andra polymerer väljs med molekylära egenskaper liknande PEI (laddningsdensitet> mekv g -1 och kvartar amin). En av dessa fem polymerer visade större flock effektivitet vid högre konduktiviteter (Figur 3B) 11.
nt. "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Som en del av DOE tillvägagångssätt bekräftades det att ingen av de PEI påverkade produktutvinningen under någon av de testade villkor Faktum kapacitet djupfilter används därefter avlägsna kvarvarande dispergerade fasta partiklar ökade med en faktor på 3,2 till 5,7 och nådde ~ 110 L m -2 beroende på filter. Dessa resultat bekräftas också i en 100 L pilotskala process, där tillämpningen av flockningsmedel minskas förtydligandet -relaterade produktionskostnaderna med> 50% och de totala produktionskostnaderna med ca 20%.
Figur 2: Effektivitet av olika flockningsmedel inom ramen för olika processförhållanden (A). Utdrag prover direkt efter flockning och väska filtrering kan fortfarande visas grumlig. (B) Efter sedimentering under flera timmar, grumligheten hossamma prov kan minskas betydligt. Men grumlighet värden som erhålls omedelbart efter filtrering är ofta att föredra eftersom förlängda väntetider inte kan vara möjligt i storskaliga tillverkningsprocesser. (C) Flockulering är effektiv även när den appliceras på växtextrakt som genererats med en skruvpress i stället för en mixer såsom indikeras av den klara röd vätska vid botten av de 50 ml rör (den röda färgen beror på närvaron av det fluorescerande proteinet DsRed ). (D) Blandningar av olika flockningsmedel kan också framkalla flock.
Figur 3:. Modellering flockulering med användning av en DoE tillvägagångssätt (A) Noggrannheten av modellen förutsägelser ökade när antalet polymerer i modellen minskades från initial screening för att förfining även om antalet av processparametrar ökade från two till fem. (B) Växla polymer (här från en PEI till en annan) som en följd av en förändring i processparametrar (här ledningsförmåga) bibehåller effektiv partikelflockning och motsvarande låg filtratgrumlighet jämfört med icke-behandlade kontrollextrakt (fast röd linje). Felstaplar i A och B anger standardavvikelser av modellprediktioner. Streckade röda linjer visar standardavvikelser för icke-behandlade extraktet (n = 10). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Flockning av tobaksextrakt framställda med en skruv-press
De flock Resultaten överfördes också från tobaksextrakt som framställts med en homogenisator till de som framställts med en skruv-press, vilket genererade färre spridda partiklar i mm storleksordningen men merpartiklar i pm storleksområdet. I en 29-run IV-optimal utformning, visade det sig att PEI är också effektivt för denna typ av extrakt i ett liknande koncentrationsområde och att återhämtningen av målproteiner påverkas inte (figur 2C). Detta visar (i) att flocknings villkor som anges för en typ av råvara kan vara till viss del överförts till andra foderlager, vilket sparar tid under processutveckling, och (ii) att DOE strategi kan användas för att bekräfta detta överföra inte bara för individuella processförhållanden utan över hela design utrymme.
Flockningsförsök med flocknings blandningar
Kombinationer av flockningsmedel kan vara mer effektiv än enstaka polymerer, t.ex. på grund av mer förstärkt koppling mellan partiklar 12. Därför beskrivna metoden ovan var anpassad att inrymma tillägget av två polymerer (3,2) 26. Tre icke-syntetiska polymerer testades ensamma, i kombination med varandra eller i kombination med PEI. Den mest effektiva flockning av tobaksextrakt uppnåddes med PEI ensam, men en kombination av PEI och kitosan eller polyfosfater kan reducera koncentrationen av PEI krävs. Dessutom DOE tillvägagångssätt tillät oss att identifiera de mest effektiva polymerkombinationer när utelämnar PEI (med eller utan kitosan och polyfosfater), vilket bidrar till att definiera optimala flockningsförhållanden i processer där PEI är oförenligt med målproteinet, t.ex. på grund av nederbörd, som rapporterats för βglucuronidase 24,25. Dessutom var DOE kunna karaktärisera en komplex design utrymme för vilka ingen mekanistisk modell fanns (figur 2D). Använda ANOVA verktyg DOE programmet var det möjligt att skilja mellan tillförlitliga prediktiva modeller och dåligt utvärderade motsvarigheter (Figur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den viktigaste aspekten att tänka på när inrätta ett DOE att karakterisera partikelflock är att konstruktionen måste i princip kunna upptäcka och beskriva de förväntade eller möjliga effekter 36,38, t ex påverkan av pH, polymertyp och polymerkoncentration 16. Därför är det viktigt att utvärdera den del av design utrymme (FDS) innan den verkliga experiment. FDS är den del av den flerdimensionella experimentella utrymmet (som omfattas av konstruktionsfaktorer, t.ex. pH) inom vilka det är möjligt att detektera fördefinierade skillnader mellan två experimentella resultat givna ett system med känd variation, t ex detektering av en skillnad i grumligheten 250 NTU ges en variabilitet av 125 NTU. FDS kan ökas genom att öka den designen med ytterligare körningar och bör ≥0.95 för konstruktioner som är avsedda att styra processreglering 36. Vidare, om antalet körningar inte tillåter than hela experimentet som skall utföras på en enda dag, block bör fördefinierade i DOE att ta hänsyn till sats till sats och dag-till-dag variation. När du arbetar med växtmaterial, införandet av referens körs i varje block (t.ex. icke-behandlade kontroller) hjälper till att kompensera för variationer, vilket gör jämförelsen av data från flera körningar varje normaliserade till motsvarande referenskörning. I detta sammanhang, en ökning av antalet upprepade körningar i DoE är också användbart.
När ett stort antal polymerer siktas, är det lämpligt att använda de individuella egenskaperna hos flockningsmedel, till exempel laddningsdensitet och molekylvikt, som diskreta numeriska faktorer snarare än polymererna själva som kategoriska faktorer. Detta minskar antalet experiment eftersom experimentell design behöver ofta replikeras för kategoriska faktorer, medan ytterligare nivåer av numeriska faktorer behöver bara ett litet antal extra körningar. Informationen contält experimentet ökar också och möjliggör identifiering av polymeregenskaper som förbättrar flock, t.ex. hög laddningsdensitet som återfinns i de experiment som beskrivs här. CCD och RSM experimentell design är användbara för att fastställa modeller med hög prognosförmåga, vilket gör att identifiera robusta processbetingelser (t.ex. för att styra processkontroll) och används vanligen för att följa upp screening mönster. Om flera faktorer och faktorer nivåer under undersökningsresultaten i DoE med mer än 400 individuella experiment, kan det vara lämpligt att minska antalet faktornivåer eller byta till andra typer konstruktions eftersom antalet prov som lätt kan hanteras med tekniken presenteras här är begränsad till ~ 100 per dag.
Ur experimentell synpunkt, måste polymerer förbli stabil under de valda experimentella betingelser, till exempel de inte får depolymerisera vid lågt pH. Noggranna förberedelser av flockningsmedellager i form av koncentration är också nödvändigt att få reproducerbara resultat och hög kvalitet modeller. I detta sammanhang kan flockningsmedlet behöva förbehandlas, t.ex. svullnad tider eller pH-justering för kitin, för att säkerställa fullständig solubilisering, och således för att erhålla en homogen lösning. Högviskösa bestånd bör undvikas eftersom detta kan orsaka pipetteringsfel vid överföring av polymeren till extraktet. Många polymerer kan ha en stark buffrande effekt och lagren har extrema pH-värden, t ex pH ~ 9,5 för 8% [w / v] PEI. Detta kan påverka pH-värdet i extraktet om bestånden inte är färdigjusterade och kommer att snedvrida de experimentella resultaten. Till exempel om flockulering är mer effektivt vid högt pH och en icke-pH-justerad PEI lager används sedan en DoE kan antyda att höga PEI-koncentrationer är effektivare. Dock kommer denna effekt orsakas av det högre pH som orsakas av den större volymen av lager som tillsattes inte av den ökade polymerkoncentrationen per se. Aktiekoncentrationer används bör också likna de som används i storskaliga tillämpningar för att undvika olika utspädningseffekter mellan de skalor som kan påverka partikelkoncentrationen och därmed flockning. Vissa lerbaserade flockningsmedel såsom kaolin innehåller ett stort antal fina partiklar själva som kan maskera flockeffekten, t.ex. grumlighet minskning efter inledande filtrering och andra svar bör väljas för att utvärdera effektiviteten av dessa ämnen, till exempel nedströms filterkapacitet.
För dataanalys är det viktigt att utvärdera det samlade resultatet i form av extremvärden, avvikelser och allmän konsekvens, t.ex. extrema värden kan indikera en kopiera och klistra fel, en förskjutning i decimal eller ett fel på utrustning / analysutrustning. En grundlig analys kommer att säkerställa att endast högkvalitativa data används för modellbygge. Under modellbygge är det viktigt att hela tiden bedöma the bred uppsättning av kvalitetsindikatorer som tillhandahålls av DOE programmet. De grundläggande kriterierna är R2, justerat R2 och förutspådde R 2 värden, men normala rester, rester-vs-run och faktiska-vs-förutsedda tomter (Figur 4) är ännu viktigare eftersom de ger information om varje körning i ett experiment i stället för en summa parameter. Dessutom bör samstämmigheten den slutliga modellen och dess förutsägelser med de kända mekanismerna för flock alltid undersökas. Stora skillnader mellan prognoser och vetenskapliga förväntningar kan uppstå på grund DOE modeller är endast beskrivande snarare än mekanistisk, t.ex. modeller kan förutsäga extremvärden vid kanterna av en design utrymme som återspeglar användning av polynom passande algoritmer.
Figur 4:. Kvalitetsindikatorer över Doe modeller ingenrmal tomt på studentized rester bör likna en rak linje så nära som möjligt (A) med endast mindre avvikelser (gröna pilar) acceptabla för högkvalitativa modeller. En böjd utseende (C) med starka avvikelser (röda pilar) från ideallinjen (röd) indikerar en dålig modell, till exempel på grund av saknad viktiga faktorer. Ytterst den förutspådda och experimentella (faktiska) värden ska matcha (B) och återigen följa en rak linje. Avvikelser från ideallinjen (röd cirkel och streckad linje) indikerar dåliga modellprediktioner (D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
DOE tillvägagångssätt kan bidra till att karakterisera flock i komplexa foderlager såsom växtextrakt, även om det inte finns några uppgifter. Flockning av tobaksextrakt optimerades med en arbetsbelastning av två vieks och förbrukningsvaror kostnader för ~ 500 €. Detta minskade antalet djupfilter som krävs för en enda pilotskala sats omfattar ~ 800 liter växtextrakt med 60%, som uppnådde en motsvarande minskning av förbrukningsvaror kostnader.
De flockningsmedel har också tillämpas på olika växtextrakt och cellkulturhomogenat. Även om samma flockmedel var effektivt för alla dessa foderlager, hade polymerkoncentrationen som skall justeras för att rymma de olika koncentrationer av dispergerade partiklar. Dessutom, när en effektiv polymeren har identifierats kan filtrerings- och / eller centrifugeringssteg behöva justeras för att matcha de olika partikelstorleksfördelning 11.
Den metod som beskrivs här kan lätt anpassas till andra foderlager och är därför också relevant för forskare och ingenjörer att utveckla strategier för förtydligande för däggdjurscellkulturer och mat / foder produktionsprocesser. especially växtbaserade processer kommer att gynnas av de mellanliggande provvolymer föreslås här eftersom växtextrakt kan innehålla partiklar upp till 1 mm i diameter som är oförenliga med mikroformat 21, till exempel på grund blandningsdynamiken skiljer sig på grund av en partikeldiameter diameterförhållande fartyg som är inte representativ för processen skala.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författaren har inga intressekonflikter att lämna ut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100P Portable Turbidimeter | Hach | 4650000 | Turbidimeter |
| 2G12 antibody | Polymun | AB002 | Reference antibody |
| Biacore T200 | GE Healthcare | 28-9750-01 | SPR device |
| BP-410 | Furh | 2632410001 | Bag filter |
| Catiofast VSH | BASF | 79002360 | Flocculating agent |
| Centrifuge 5415D | Eppendorf | 5424 000.410 | Centrifuge |
| Centrifuge tube 15 ml | Labomedic | 2017106 | Reaction tube |
| Centrifuge tube 50 ml self-standing | Labomedic | 1110504 | Reaction tube |
| Chitosan | Carl Roth GmbH | 5375.1 | Flocculating agent |
| Design-Expert(R) 8 | Stat-Ease, Inc. | n.a. | DoE software |
| Disodium phosphate | Carl Roth GmbH | 4984.3 | Media component |
| Ferty 2 Mega | Kammlott | 5.220072 | Fertilizer |
| Forma -86C ULT freezer | ThermoFisher | 88400 | Freezer |
| Greenhouse | n.a. | n.a. | For plant cultivation |
| Grodan Rockwool Cubes 10 x 10 cm | Grodan | 102446 | Rockwool block |
| HEPES | Carl Roth GmbH | 9105.3 | Media component |
| K700P 60D | Pall | 5302305 | Depth filter layer |
| KS50P 60D | Pall | B12486 | Depth filter layer |
| Miracloth | Labomedic | 475855-1R | Filter cloth |
| MultiLine Multi 3410 IDS | WTW | WTW_2020 | pH meter / conductivity meter |
| Osram cool white 36 W | Osram | 4930440 | Light source |
| Phytotron | Ilka Zell | n.a. | For plant cultivation |
| Polymin P | BASF | 79002360 | Flocculating agent |
| POLYTRON PT 6100 D | Kinematica | 11010110 | Homogenization device with custom blade tool |
| Protein A | Life technologies | 10-1006 | Antibody binding protein |
| Sodium chloride | Carl Roth GmbH | P029.2 | Media component |
| Synergy HT | BioTek | SIAFRT | Fluorescence plate reader |
| TRIS | Carl Roth GmbH | 4855.3 | Media component |
| Tween-20 | Carl Roth GmbH | 9127.3 | Media component |
| VelaPad 60 | Pall | VP60G03KNH4 | Filter housing |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | DLS particle size distribution measurement |
References
- Godfray, H. C. J., et al. Food Security: The Challenge of Feeding 9 Billion People. Science. 327, 812-818 (2010).
- Fischer, R., Schillberg, S., Buyel, J. F., Twyman, R. M. Commercial aspects of pharmaceutical protein production in plants. Curr. Pharm. Des. 19, 5471-5477 (2013).
- Pastores, G. M., et al. A Phase 3, multicenter, open-label, switchover trial to assess the safety and efficacy of taliglucerase alfa, a plant cell-expressed recombinant human glucocerebrosidase, in adult and pediatric patients with Gaucher disease previously treated with imiglucerase. Blood Cells Mol. Dis. 53, 253-260 (2014).
- De Paepe, D., et al. A comparative study between spiral-filter press and belt press implemented in a cloudy apple juice production process. Food Chem. 173, 986-996 (2015).
- Buyel, J. F., Twyman, R. M., Fischer, R. Extraction and downstream processing of plant-derived recombinant proteins. Biotechnol. Adv. 33, 902-913 (2015).
- Wilken, L. R., Nikolov, Z. L. Recovery and purification of plant-made recombinant proteins. Biotechnol. Adv. 30, 419-433 (2012).
- Buyel, J. F. Process development trategies in plant molecular farming. Curr. Pharm. Biotechnol. 16, 966-982 (2015).
- Hassan, S., Keshavarz-Moore, E., Ma, J., Thomas, C. Breakage of transgenic tobacco roots for monoclonal antibody release in an ultra-scale down shearing device. Biotechnol. Bioeng. 111, 196-201 (2014).
- Hassan, S., van Dolleweerd, C. J., Ioakeimidis, F., Keshavarz-Moore, E., Ma, J. K. Considerations for extraction of monoclonal antibodies targeted to different subcellular compartments in transgenic tobacco plants. Plant Biotechnol. J. 6, 733-748 (2008).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Scale-down models to optimize a filter train for the downstream purification of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco leaves. Biotechnol. J. 9, 415-425 (2014).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Downstream processing of biopharmaceutical proteins produced in plants: the pros and cons of flocculants. Bioengineered. 5, 138-142 (2014).
- Gregory, J., Barany, S. Adsorption and flocculation by polymers and polymer mixtures. Adv. Colloid Interface Sci. 169, 1-12 (2011).
- Zhou, Y., Franks, G. V. Flocculation mechanism induced by cationic polymers investigated by light scattering. Langmuir. 22, 6775-6786 (2006).
- Runkana, V., Somasundaran, P., Kapur, P. C. Mathematical modeling of polymer-induced flocculation by charge neutralization. J. Colloid Interface Sci. 270, 347-358 (2004).
- Hjorth, M., Jorgensen, B. U. Polymer flocculation mechanism in animal slurry established by charge neutralization. Water Res. 46, 1045-1051 (2012).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Flocculation increases the efficacy of depth filtration during the downstream processing of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco. Plant Biotechnol. J. 12, 240-252 (2014).
- Buyel, J. F., Opdensteinen, P., Fischer, R. Cellulose-based filter aids increase the capacity of depth filters during the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins. Biotechnol. J. 10, 584-591 (2014).
- Yasarla, L. R., Ramarao, B. V. Dynamics of Flocculation of Lignocellulosic Hydrolyzates by Polymers. Ind. Eng. Chem. Res. 51, 6847-6861 (2012).
- Montgomery, D. C. Design and Analysis of Experiments. , John Wiley & Sons Incorporated. (2007).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Characterization of complex systems using the design of experiments approach: transient protein expression in tobacco as a case study. J. Vis. Exp. , e51216 (2014).
- Espuny Garcia Del Real, G., Davies, J., Bracewell, D. G. Scale-down characterization of post-centrifuge flocculation processes for high-throughput process development. Biotechnol. Bioeng. 111, 2486-2498 (2014).
- Rathore, A. S., Sofer, G. Process Validation in Manufacturing of Biopharmaceuticals, 3rd edn, Vol. 1. , Taylor & Francis. (2012).
- Kang, Y., et al. Development of a Novel and Efficient Cell Culture Flocculation Process Using a Stimulus Responsive Polymer to Streamline Antibody Purification Processes. Biotechnol. Bioeng. 110, 2928-2937 (2013).
- Menkhaus, T. J., Eriksson, S. U., Whitson, P. B., Glatz, C. E. Host selection as a downstream strategy: Polyelectrolyte precipitation of beta-glucuronidase from plant extracts. Biotechnol. Bioeng. 77, 148-154 (2002).
- Holler, C., Vaughan, D., Zhang, C. M. Polyethyleneimine precipitation versus anion exchange chromatography in fractionating recombinant beta-glucuronidase from transgenic tobacco extract. J. Chromatogr. A. 1142, 98-105 (2007).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Synthetic polymers are more effective than natural flocculants for the clarification of tobacco leaf extracts. J. Biotechnol. 195, 37-42 (2014).
- Pearson, C. R., Heng, M., Gebert, M., Glatz, C. E. Zeta potential as a measure of polyelectrolyte flocculation and the effect of polymer dosing conditions on cell removal from fermentation broth. Biotechnol. Bioeng. 87, 54-60 (2004).
- Buyel, J. F., Gruchow, H. M., Boes, A., Fischer, R. Rational design of a host cell protein heat precipitation step simplifies the subsequent purification of recombinant proteins from tobacco. Biochem. Eng. J. 88, 162-170 (2014).
- Wang, S., Liu, C., Li, Q. Impact of polymer flocculants on coagulation-microfiltration of surface water. Water Res. 47, 4538-4546 (2013).
- Menkhaus, T. J., Anderson, J., Lane, S., Waddell, E. Polyelectrolyte flocculation of grain stillage for improved clarification and water recovery within bioethanol production facilities. Bioresour. Technol. 101, 2280-2286 (2010).
- Mune, M. A. M., Minka, S. R., Mbome, I. L. Optimising functional properties during preparation of cowpea protein concentrate. Food Chem. 154, 32-37 (2014).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Predictive models for transient protein expression in tobacco (Nicotiana tabacum L.) can optimize process time, yield, and downstream costs. Biotechnol. Bioeng. 109, 2575-2588 (2012).
- Buyel, J. F., Kaever, T., Buyel, J. J., Fischer, R. Predictive models for the accumulation of a fluorescent marker protein in tobacco leaves according to the promoter/5'UTR combination. Biotechnol. Bioeng. 110, 471-482 (2013).
- Buyel, J. F., Fischer, R. A juice extractor can simplify the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins compared to blade-based homogenizers. Process Biochem. 50, 859-866 (2014).
- Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. DOE Simplified: Practical Tools for Effective Experimentation. Vol. 1. 1, Taylor & Francis. (2000).
- Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. Response Surface Methods Simplified. , Productivity Press. (2005).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Generic chromatography-based purification strategies accelerate the development of downstream processes for biopharmaceutical proteins produced in plants. Biotechnol. J. 9, 566-577 (2014).
- Myers, R. H., Montgomery, D. C., Anderson-Cook, C. M. Response Surface Methodology: Process and Product Optimization Using Designed Experiments. , Wiley. (2009).
