Summary
Her viser vi isolerede humane blodplader kan anvendes som en tilgængelig ex vivo-model til at studere metaboliske tilpasninger som reaktion på komplekset I inhibitoren rotenon. Denne fremgangsmåde anvender isotopisk sporing og relativ kvantificering ved væskekromatografi-massespektrometri og kan anvendes til en række af undersøgelsestyper.
Introduction
Dysfunktionel mitochondrial metabolisme er blevet impliceret i en lang række sygdomme, herunder neurodegeneration, kræft og hjertekarsygdomme 30. Som sådan har stor indsats blevet placeret på karakterisering metaboliske defekter, der bidrager til sygdommen patogenese. Væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS / MS) betragtes som den gyldne standard for kvantificering af analytter fra komplekse biologiske matricer og er ofte ansat til metaboliske undersøgelser 8. Men som det ofte er tilfældet med biomedicinske undersøgelser, opnå en tilgængelig og veldefineret model relevant for human sygdom er en udfordring.
Mange undersøgelser beskæftiger forvandlet cellulære modeller til sondering af virkningen af miljøfremmede stoffer eller genetiske abnormiteter på cellulær metabolisme 7,9. Den metaboliske omprogrammering, der forekommer i cancerceller kan introducere forstyrrende faktorer 21 og er derfor ikke ideel. Disse spørgsmål kan være circumvented med primære celle modeller, selv om at opnå tilstrækkelig biomasse til metaboliske analyser kan være udfordrende. Endvidere har effekten af høje mængder af antibiotika, der anvendes i kultur blevet fremhævet som potentielt confounding mitokondrie undersøgelser 16.
Humane blodplader opnåelse af muligheden for at udnytte en primær celle model med tilstrækkelig mitokondrie indhold til metaboliske undersøgelser 5,22,27,32. Først kan blodplader let erhverves gennem blod trækker fra individuelle donorer, eller i store mængder fra blodbanker, og giver derfor en model, hvor eksterne faktorer kan let kontrolleres. For det andet på grund af deres lille størrelse, blodplader kan let isoleres fra andre blodkomponenter med minimal forberedende arbejde i selv minimalt udstyrede laboratorier 5. Af note, behøver blodplader ikke indeholde kerner og kan derfor anvendes til at studere ændringer i metabolisme uafhængigt af transkriptionel regulering. Her viser vi, atforuden relativ kvantificering af acyl-coenzym A (CoA) thioestere, kan det isolerede blodplade systemet, anvendes til at undersøge carbon metabolisme. Konkret rapporterer vi brug af metabolisk mærkning med stabile isotoper (ikke-radioaktivt) mærket [13C 6] glucose og [13C 16] -palmitat til sonde inkorporering af [13C] -mærket, ind i den vigtige metabolit acetyl- CoA via glykolyse eller fedtsyreoxidation. Dette giver en stærk, generaliseres, og alsidig platform på grund af den omfattende inddragelse af acyl-CoA arter i biokemiske veje 13,24 og sporbarhed af dette system til at teste andre variabler, såsom hæmning af kompleks I med rotenon 3,33. Ud over oplysningerne i protokollen nedenfor, kan en omfattende beskrivelse af de metoder, der anvendes til isotop mærkning og for LC-MS-baserede analyser findes i Basu og Blair 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Statement: Alle protokoller vedrørende behandlingen af humane prøver følge retningslinjerne fra The University of Pennsylvania menneskelige videnskabsetisk komité.
1. Udarbejdelse af buffere og 100x Stock Solutions
- Forbered 1 L basen Tyrodes buffer. Kombiner 8,123 g NaCl, 1,428 g NaHCO3, 0,466 g CaCl2 ∙ 2 H2O, 0,224 g KCI, og 0,095 g MgCl 2. Juster samlet volumen på 1 liter med Hedeselskabet 2 O. Filtersteriliser basen Tyrodes puffer.
- Forbered 100x stamopløsninger af glucose og palmitinsyre. For 100x glucose stamopløsninger opløses 100 mg glucose eller [13C 6] glucose i 1 ml Hedeselskabet 2 O. For 100x palmitat løsninger, opløses 2,56 mg palmitinsyre eller 2,72 mg [13C 16] -palmitic syre i 1 ml ethanol. Filtersteriliser 100x stamopløsninger.
- Forbered Passende beriget Tyrodes Buffere
- For glucose undersøgelser mærkning, tilsættes 1 ml 100x [13 C 6] glucose stamopløsning og 1 ml 100x palmitinsyre stamopløsning til 98 ml af base Tyrodes buffer.
- For palmitinsyre undersøgelser syre mærkning, tilsættes 1 ml 100x glukose stamopløsning og 1 ml [13C 16] -palmitic syre stamopløsning til 98 ml af base Tyrodes buffer.
- Der fremstilles en 10 mM stamopløsning af rotenon i dimethylsulfoxid (DMSO).
- For ikke-mærkning dosis-respons undersøgelser, fortsæt til 1.4.3. For undersøgelser mærkning på en enkelt dosis, fortsæt til 1.4.5.
- Udfør en seriel fortynding af 10 mM rotenon stamopløsning i DMSO for at opnå opløsninger med rotenon koncentrationer fra 1 nM til 100 uM. Disse er 100x stocks.
- Der tilsættes 50 ul af hver bestand til 5 ml af uædle Tyrodes buffer + glucose + palmitinsyre fra 1.3.1 til fremstille opløsninger med rotenon koncentrationer i området fra 10 pM til 1 uM. Alternativt tilsættes 50 pi DMSO til at tjene som en vehikelkontrol. Fortsæt til 2.1.
- Fortynd 10 mM stamopløsning 1000 gange i DMSO til opnåelse af en 10 pM arbejdsopløsning.
- Tilsæt 50 pi af denne bestand til 5 ml hver af base Tyrodes buffer + [13 C 6] glucose + palmitinsyre fra 1.3.2 og base Tyrodes buffer + glucose + [13 C 16] -palmitic syre fra 1.3.3. Den endelige koncentration 100 nM rotenon. Alternativt tilsættes 50 ul DMSO til hver buffer til at tjene som kontrol af køretøjer.
2. Trombocyt Isolering
Bemærk: Denne metode er modtagelig for blodplader afledt af enten fuldblod eller fra trombocyttal poser. De eksempler, der er indeholdt heri er udarbejdetanvendelse af blodplader afledt af blodplade poser. Se Basu et al. 5 for flere detaljer om brug af blodplader isoleret fra fuldblod.
- Trombocyt Isolering fra fuldblod
BEMÆRK: Hvis isolere blodplader fra en pose af blodplader, fortsætte til 2.2.1.- Centrifuge fuldblod ved 175 x g i 15 minutter uden bremser.
- Overføres 1 ml øverste blodpladerigt plasma (PRP) lag til et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Centrifugeres PRP ved 400 x g i 5 min.
- Aspirer supernatanten og fortsæt til trin 3.1 eller 3.2.
- Blodplader Isolering fra en Trombocyt Bag
- Overføres 1 ml blodpladesuspensionen til et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Centrifugeres suspensionen ved 400 xg i 5 min.
- Aspirer supernatanten og fortsæt til trin 3.1. eller 3.2.
3. Udførelse af et eksperiment
- For at bestemme virkningen af miljøfremmedebehandling (f.eks rotenon) det niveau for en metabolit af interesse (f.eks acetyl-CoA), fortsæt til 3.1.1. For at bestemme virkningen af en miljøfremmede (f.eks., Rotenon) om inkorporering af en metabolisk forstadium til et nedstrøms metabolit af interesse, fortsætte til 3.2.1.
- Brug ikke færre end tre biologiske replikater for hver betingelse, resuspender blodpladepellet fra trin 2.1.4 eller 2.2.3 i 1 ml af hver opløsning fra trin 1.4.4.
- Inkuber resuspenderede blodplader i en vandkappe CO2-inkubator indstillet til 95% fugtighed, 5% CO2 og 37 ° C i 1 time. Fortsæt til trin 4.1
Bemærk: Her beskriver vi en dosis respons eksperiment. Alternativt kunne et tidsforløb eksperiment gøres ved hvilken dosis blev fikseret og længden af inkubationen blev varieret i stedet.
- At bestemme virkningen af miljøfremmede behandling på inkorporering af en metabolisk precursor i en nedstrøms metabolit af interesse.
- Usynge ikke færre end tre biologiske replikater for hver tilstand, resuspender blodpladepellet fra trin 2.1.4 eller 2.2.3 i 1 ml af hver formulering af mærket Tyrodes buffer fra trin 1.4.6.
- Inkuber resuspenderede blodplader i en vandkappe CO2-inkubator indstillet til 95% fugtighed, 5% CO2 og 37 ° C i 1 time. Fortsæt til trin 4.1.
4. Quenching og CoA Ekstraktion
- Pelletere blodplader ved centrifugering ved 3.000 x g i 3 min.
- Aspirer supernatanten.
- Resuspender blodplader i 750 pi iskold 10% trichloreddikesyre (w / v).
- Tilsæt egnet stabile isotop-mærkede interne standard. For eksempel, hvis målet er at sammenligne niveauerne af CoA arter tværs prøver, bruge 100 pi af en blanding af stabil-isotop mærkede CoA thioestere opnået fra gær som beskrevet tidligere (SILEC teknik) 29.
- Puls-soniker hver prøve 30 gange med 0,5 sec pulser.
- Centrifuger prøverne ved 16.000 xg i 10 minutter ved 4 ° C.
- Anbringer C18 fastfase-ekstraktion (SPE) -søjler til vakuum manifold.
- Konditionering af kolonnerne med en ml methanol.
- Ækvilibrer kolonnerne med 1 ml Hedeselskabet 2 O.
- Kør prøve-afledte supernatant (ca. 850 pi i dette tilfælde) gennem søjlerne.
- Vask søjlerne med 1 ml vand.
- Load 10 ml glascentrifugerør ind i vakuum manifold til opsamling elueringsfraktion.
- Eluer kolonnerne med 1 ml 25 mM ammoniumacetat i methanol.
- Tør eluat under nitrogengas.
- Resuspender tørrede rester i 50 pi 5% (w / v) 5-sulfosalicylsyre og overføres til HPLC-hætteglas.
5. HPLC Setup
- Brug af styresoftware for HPLC-systemet, skabe en metode med HPLC-betingelser optimeret til målanalytterne og udnyttes kolonne, som anført i Tabel 1.
Bemærk: Kolonnen Temperature anvendes til frembringelsen af disse data var 25 ° C, men de specifikke parametre vil variere efter instrument og med hensyn til forbindelserne af interesse. For acyl-CoA kvantificering, er der rapporteret flere metoder til LC-MS-analyse, og valideret for forskellige analytter i forskellige LC betingelser 14,19,20. - Lad HPLC til Tilstrækkeligt Ækvilibrere.
Bemærk: Det bør omfatte både priming af opløsningsmidler før fastgørelse af en søjle og ækvilibrering af søjlen ved startpunktet opløsningsmiddelbetingelser for metoden. Den ligevægt volumen bør følge producentens anvisninger, og deraf spildevand skal viderestilles til spilde.
Bemærk: Kontakt Basu og Blair 5 for flere detaljer om HPLC indstillinger.
6. Mass Spectrometer Setup
- Brug af styresoftware for massespektrometeret, oprettes en målrettet metode til påvisning af ioniserede former af forbindelserne af interesse. Parametre præsenteresi tabel 2.
Bemærk: stabile isotoper analoger af disse forbindelser bør anvendes til at bestemme, om en positiv eller negativ modus giver overlegen følsomhed og optimere kilden og optik forudsætning for deres detektion. Den samlede påvisning tid af massespektrometer metode bør svare til den tid i det tilhørende HPLC-metode.
Bemærk: Som tidligere nævnt har flere metoder for acyl-CoA-analyse blevet rapporteret, herunder positive 14 og negative ionisering 15 modes og anvendelse af en høj opløsning massespektrometer 17 i stedet for en tripel kvadrupol instrument 28. - Ren og kalibrere instrumentet, etablere en stabil spray i spektrometeret, og give tid til kalibreringsopløsningen til på passende sprede fra kilden og optik i henhold til producentens anvisninger.
- Opsætning af en sekvens for alle prøverne med massespektrometer kontrol software. incluDe navn eller numeriske identifikatorer og angive den relevante injektion volumen og instrument metode. Kør en tom før den første prøve, og køre andre emner og vasker mellem prøver efter behov for at afbøde udligningsordninger eller matrix effekter.
Bemærk: En behandlingsmetode for peak integration af udvalgte analytter 'flydende kromatogrammer ofte kan indstilles inden for denne sekvens eller efterfølgende anvendt i databehandling. - Begynd rækkefølgen og overvåge massespektrometer og HPLC-system med jævne mellemrum for problemer, herunder tryksvingninger eller systemfejl og tab af signal intensitet under kørslen.
Bemærk: Alvorlige problemer eller vedvarende køre fiaskoer kan kræve at stoppe kørslen og udrensning og re-ækvilibrering af HPLC system samt rengøring og kalibrering af massespektrometer. Consult Basu og Blair 5 for flere detaljer om MS indstillinger og databehandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at demonstrere anvendeligheden af denne metode har vi gengivet den generaliserbarhed af tidligere beskrevet kompenserende metabolisk tilpasning som følge af udsættelse for rotenon. Dette fund blev tidligere identificeret i cellekulturmodeller og denne undersøgelse havde til formål at teste, om denne metaboliske skift også forekommer i blodplader, som er anuclear og ikke udsat for de samme eksperimentelle artefakter som cellekultur. Dette arbejde blev udført med 6 dage gamle blodplader fra Penn Trauma Center, som var blevet anset for gammel til human infusion, selvom de bevaret deres metaboliske aktivitet. Isoleringen blev udført som vist i figur 1. Det samlede arbejdsgang kan skaleres let fra et begrænset antal kliniske prøver eller forsøgsbetingelser til 96-brønds plade baseret højere gennemløb med tilgængeligheden af blodplader, som ikke længere anvendelige til infusion i patienter.
(figur 2). Specifikt har vi observeret i SH-SY5Y-celler en dosisafhængig formindskelse i succinyl-CoA (IC50 = 25 nM) med en samtidig stigning i β-hydroxybutyryl (HB) -COA (ED50 = 75 nM), mens acetyl-CoA-niveauer var uændret 1. Vores analyse af humane blodplader behandlet med rotenon afslørede meget ensartede resultater (figur 3). Dette tilvejebringer et unikt sæt af eksperimentelle data i humane blodplader peger på det mitokondrielle afhængighed af reaktionen på rotenon. Denne reaktion kan ikke medieret gennem konventionelle transkriptionelle mekanismer, fordi blodplader mangler kerner.
Relativ kvantificering giver en dimension af metabolisk information, menisotop mærkning giver uvurderlig supplerende indblik i aktiviteten af specifikke metaboliske veje. Dette er kritisk i metaboliske undersøgelser, fordi flere veje kan konvergere gennem et enkelt mellemprodukt. For at demonstrere dette punkt, blev blodplader behandlet med enten 100 nM rotenon eller DMSO i nærvær af enten [13 C6] glucose eller [13C 16] -palmitat i 1 time. Co-eluering af isotopologues af acyl-CoA fra LC kolonnen giver mulighed for definitivt bestemmelse af isotopiske sammensætning af analytter (figur 4). Efter korrektion for den naturlige overflod af tunge isotoper som beskrevet 11 denne fremgangsmåde viste et signifikant fald i glycolytiske produktion af acetyl-CoA i blodpladerne mens palmitat inkorporering signifikant blev øget (figur 5). Disse resultater svarer til de tidligere er observeret i SH-SY5Y cellekultur model 33 og så tilvejebringe yderligere bevis that denne vej kunne være vigtigt in vivo.
| Tid (min) | 0 | 0 | 1.5 | 5 | 12 | 17 | 18 | 23 | 25 | 30 |
| Total Flow (pl / min) | 200 | 200 | 200 | 200 | 200 | 250 | 200 | 200 | 200 | 200 |
| % A | 98 | 98 | 98 | 80 | 0 | 0 | 0 | 0 | 98 | 98 |
| % B | 2 | 2 | 2 | 20 | 100 | 100 | 0 | 0 | 2 | 2 |
| % C | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 0 | 100 | 100 | 0 | 0 |
. Tabel 1. væskekromatografi Gradient Opløsningsmiddel A: 5 mM ammoniumacetat i vand, opløsningsmiddel B: 5 mM ammoniumacetat i 95: 5 ACN / vand Opløsningsmiddel C: 80:20 ACN / vand 0,1% myresyre
| Parameter | Værdi |
| Spray Spænding (V) | 4.000 |
| Vaporizer Temperatur (° C) | 400 |
| Skede Gas Pressure | 35 |
| Auxiliary Gas Pressure | 10 |
| Kapillær Temperatur (° C) | 350 |
| Tube Lens Offset (V) | 100 |
Tabel 2. Massespektrometer Parametre.
Figur 1. Generaliseret Workflow for Prøveforberedelse og analyse. Denne skematiske viser arbejdsgangen for trombocyt isolation og behandling for metaboliske studier ved LC-MS / MS-analyse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Metabolisk Scheme of Glucose og lipidmetabolisme og elektrontransportkæden. Acetyl-CoA kan syntetiseres ud fra enten glucose eller palmitat. Rotenon hæmmer den korrekte shuttling af elektroner ved mitokondriel kompleks I.TPS: //www.jove.com/files/ftp_upload/53941/53941fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Kvantificering af CoA-thioestere i Reaktion på rotenon. Rotenon behandling indvirker ikke acetyl-CoA-niveauer, men inducerer en dosisafhængig formindskelse i succinyl-CoA (IC50 = 4,1 nM) med en samtidig stigning i βHB-CoA (ED 50 = 4,2 nM). Fejl- søjler repræsenterer standardafvigelse af middelværdien (SEM); n = 4. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Repræsentant Chromatogrammer Viser isotopmærkning fra palmitati acetyl-CoA. Rotenon behandling øger inkorporeringen af palmitat i acetyl-CoA. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Relativ Inkorporering af [13C 6] glucose eller [13C 16] -palmitat ind Acetyl-CoA. Rotenon behandling sænker glucose inkorporering i acetyl-CoA og øger palmitat inkorporering. Fejl- søjler repræsenterer SEM; n = 4. En asterisk angiver p <0,05 (Students uparrede t-test). Klik herfor at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her har vi vist nytten af isolerede blodplader som en platform for at studere forstyrres mitokondrie stofskifte. Specifikt har vi kendetegnet metabolisk tilpasning som svar på komplekse I inhibering med rotenon.
Nærværende undersøgelse har forlænget tidligere rapporterede resultater på den rolle, komplekse I hæmning af rotenon i cellelinjer til humane blodplader. Vigtigere er, har dette vist, at rotenon også inhiberede blodplade succinyl-CoA-dannelse, stimulerede en stigning i blodplade βHB-CoA og havde ingen virkning på blodplade niveauer af acetyl-CoA.
Stor forsigtighed skal træffes for at sikre gyldigheden og reproducerbarhed af enhver analyse af denne type. Hvis blodplader skal isoleres fra fuldblod, bør isoleringen fortsætte præcis som beskrevet ovenfor, for at forhindre lymfocyt forurening og blodpladeaktivering, med særlig opmærksomhed på at forlade buffy coat, der indeholder lymfocytter undisuforstyrrede. For dosisresponskurver skal give mening, skal serielle fortyndinger udføres præcist, under blanding til homogenitet ved hvert trin. Efter blodplade resuspension kan inkubationsbetingelser modificeres fra de ovenfor beskrevne, men de skal være strengt standardiseret på tværs af behandlingsgrupper for at muliggøre meningsfulde sammenligninger. Måske er det vigtigste skridt i kvantitative LC / MS-analyse er brugen af stabile-isotop mærkede interne standarder.
Brugen af interne standarder er kritisk i denne indstilling, fordi det beskytter mod potentielt forstyrrende "batch virkninger" såsom variable ekstraktionseffektiviteter og analyt stabilitet på tværs prøver. Tilsætning af intern standard, (igen, blanding til homogenitet) så tidligt som muligt i en forsøgsprotokol reducerer risikoen for artefakter. Endelig, som i enhver eksperiment, brugen af flere replikater for hver eksperimentel betingelse er vigtig, og om muligt, El-beregninger baseret på pilotforsøg kan være nyttige.
Blodplader kan hurtigt isoleres fra individuelle eller fælles kilder 5,27,32, hvilket gør denne fremgangsmåde det muligt at foretage en lang række applikationer. Det er vigtigt at bemærke, at evnen til at udføre undersøgelser med både relativ kvantificering og isotop mærkning giver mulighed for en mere omfattende karakterisering af en metabolisk system. Øjeblikket, det kræver to separate assays, hvilket øger efterspørgslen efter biomasse kræves til eksperimentet. Af denne grund, blodplader, der let kan opnås i stort antal, er mere effektive end andre cellekulturmodeller.
Trods de mange fordele, som anvendelsen af blodplader, er der ulemper. For det første skal man være omhyggelig i udvælgelsen af menneskelige donorer, fordi der er mange lidelser, der påvirker trombocytfunktionen fysiologi 25. Desuden blodpladeaktivering under prøvenforberedelse og analyse er en potentiel forvirrende variabel i enhver blodplade-baseret assay. Af disse årsager samtidig vurdering af markører for blodpladeaktivering ved ELISA 26, flowcytometri 1, eller assays såsom lystransmission aggregometry (LTA) assay 34 kan vise sig hensigtsmæssig.
Selvom den foreliggende undersøgelse har fokuseret på analysen af acyl-CoA thioestere kan denne fremgangsmåde let udvides til at omfatte en bredere vifte af analytter. Ikke-målrettede metabolomics tilgange leverer mekanistisk indsigt i et array af sygdomstilstande 23. Anvendelse af sådanne målrettede tilgange til blodplade modeller vil sandsynligvis give yderligere indsigt i de bagvedliggende biokemiske mekanismer involveret i dysreguleret cellulære stofskifte.
Denne fremgangsmåde kan let udvides til at omfatte undersøgelser af andre miljømæssige kemikalier og lægemidler, der vides at interferere med mitokondrie stofskifte 6,12,18,31 samt et system til at afprøve virkningerne af fremmedstoffer som potentielle modulatorer af CoA metabolisme 10. Desuden kan den generelle fremgangsmåde anvendes til at studere metaboliske defekter i genetiske sygdomme, såsom Friedreichs ataksi 5,32. Desuden kan enhver af de ovennævnte forsøgsdesign kobles med en funktionel respiration assay for mere robust karakterisere tilstanden af mitokondrier i hver forbindelse 2. Således kobling stabile isotoper og LC-MS-analyse med metaboliske undersøgelser i isolerede blodplader er sandsynligt at give hidtil ukendte muligheder for yderligere at karakterisere afvigende mitokondriel metabolisme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi anerkender støtten fra NIH tilskud P30ES013508 og T32ES019851.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2 * H2O) | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 208337 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| 13C6-Glucose | Sigma-Aldrich | 389374 | |
| Palmitic acid | Cayman | 10006627 | |
| 13C16-Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | 605573 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Trichloro Acetic Acid | Sigma-Aldrich | T6399 | |
| 5-Sulfosalicylic Acid | Sigma-Aldrich | 390275 | |
| Acetonitirle | Fischer Scientific | A996-4 | (optima) |
| Water (H2O) | Fischer Scientific | W7-4 | (optima) |
| Formic acid | Fischer Scientific | 85171 | (optima) |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Ethanol | Fischer Scientific | 04-355-222 | |
| Methanol | Fischer Scientific | A454-4 | (optima) |
| Ammonium Acetate | Fischer Scientific | A639-500 | |
| 2 ml Eppendorf Tubes | BioExpress | C-3229-1 | |
| LC vials (plastic) | Waters | 186002640 | |
| 10 ml Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 73785-10 | |
| Oasis Solid Phase Extraxtion (SPE) Columns | Waters | WAT094225 | |
| Pastuer Pipets | Fischer Scientific | 13-678-200 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| CO2 Water-Jacketed Incubator | Nuaire | AutoFlow NU-8500 | |
| Triple Quadropole Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Finnigan TSQ Quantum | |
| HPLC | Thermo Scientific | Dionex Ultimate 3000 | |
| Source | Thermo Scientific | HESI II | |
| HPLC Column | Phenomenex | Luna C18 | 3 μm particle size, 200 mm x 2 mm |
References
- Ault, K. A. The clinical utility of flow cytometry in the study of platelets. Semin. Hematol. 38 (2), 160-168 (2001).
- Avila, C., et al. Platelet mitochondrial dysfunction is evident in type 2 diabetes in association with modifications of mitochondrial anti-oxidant stress proteins. Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 120 (4), 248-251 (2012).
- Basu, S. S., Blair, I. A. Rotenone-mediated changes in intracellular coenzyme A thioester levels: implications for mitochondrial dysfunction. Chem. Res. Toxicol. 24 (10), 1630-1632 (2011).
- Basu, S. S., Blair, I. A. SILEC: a protocol for generating and using isotopically labeled coenzyme A mass spectrometry standards. Nat. Protoc. 7 (1), 1-12 (2012).
- Basu, S. S., Deutsch, E. C., Schmaier, A. A., Lynch, D. R., Blair, I. A. Human platelets as a platform to monitor metabolic biomarkers using stable isotopes and LC-MS. Bioanalysis. 5 (24), 3009-3021 (2013).
- Berson, A., et al. Mechanisms for experimental buprenorphine hepatotoxicity: major role of mitochondrial dysfunction versus metabolic activation. J. Hepatol. 34 (2), 261-269 (2001).
- Castell, J. V., Jover, R., Martinez-Jimenez, C. P., Gomez-Lechon, M. J. Hepatocyte cell lines: their use, scope and limitations in drug metabolism studies. Expert. Opin. Drug Metab Toxicol. 2 (2), 183-212 (2006).
- Ciccimaro, E., Blair, I. A. Stable-isotope dilution LC-MS for quantitative biomarker analysis. Bioanalysis. 2 (2), 311-341 (2010).
- Dang, C. V. Links between metabolism and cancer. Genes Dev. 26 (9), 877-890 (2012).
- Darnell, M., Weidolf, L. Metabolism of xenobiotic carboxylic acids: focus on coenzyme A conjugation, reactivity, and interference with lipid metabolism. Chem. Res. Toxicol. 26 (8), 1139-1155 (2013).
- Des Rosiers, C., Fernandez, C. A., David, F., Brunengraber, H. Reversibility of the mitochondrial isocitrate dehydrogenase reaction in the perfused rat liver. Evidence from isotopomer analysis of citric acid cycle intermediates. J. Biol. Chem. 269 (44), 27179-27182 (1994).
- Ellis, J. K., et al. Metabolic profiling detects early effects of environmental and lifestyle exposure to cadmium in a human population. BMC. Med. 10, 61 (2012).
- Grevengoed, T. J., Klett, E. L., Coleman, R. A. Acyl-CoA metabolism and partitioning. Annu. Rev. Nutr. 34, 1-30 (2014).
- Haynes, C. A., et al. Quantitation of fatty acyl-coenzyme As in mammalian cells by liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry. J. Lipid Res. 49 (5), 1113-1125 (2008).
- Ikegawa, S., et al. Characterization of cholyl-adenylate in rat liver microsomes by liquid chromatography/electrospray ionization-mass spectrometry. Anal. Biochem. 266 (1), 125-132 (1999).
- Kalghatgi, S., et al. Bactericidal antibiotics induce mitochondrial dysfunction and oxidative damage in Mammalian cells. Sci. Transl. Med. 5 (192), 192ra85 (2013).
- Liu, X., et al. High-Resolution Metabolomics with Acyl-CoA Profiling Reveals Widespread Remodeling in Response to Diet. Mol. Cell Proteomics. 14 (6), 1489-1500 (2015).
- Lopez-Gallardo, E., Iceta, R., Iglesias, E., Montoya, J., Ruiz-Pesini, E. OXPHOS toxicogenomics and Parkinson's disease. Mutat. Res. 728 (3), 98-106 (2011).
- Magnes, C., Sinner, F. M., Regittnig, W., Pieber, T. R. LC/MS/MS method for quantitative determination of long-chain fatty acyl-CoAs. Anal. Chem. 77 (9), 2889-2894 (2005).
- Mauriala, T., Herzig, K. H., Heinonen, M., Idziak, J., Auriola, S. Determination of long-chain fatty acid acyl-coenzyme A compounds using liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 808 (2), 263-268 (2004).
- Murphy, T. A., Dang, C. V., Young, J. D. Isotopically nonstationary 13C flux analysis of Myc-induced metabolic reprogramming in B-cells. Metab Eng. 15, 206-217 (2013).
- Paglia, G., et al. Metabolomic analysis of platelets during storage: a comparison between apheresis- and buffy coat-derived platelet concentrates. Transfusion. 55 (2), 301-313 (2015).
- Patti, G. J. Separation strategies for untargeted metabolomics. J. Sep. Sci. 34 (24), 3460-3469 (2011).
- Robishaw, J. D., Neely, J. R. Coenzyme A metabolism. Am. J. Physiol. 248 (1 Pt 1), E1-E9 (1985).
- Rodgers, G. M. Overview of platelet physiology and laboratory evaluation of platelet function. Clin. Obstet. Gynecol. 42 (2), 349-359 (1999).
- Salles, I., et al. Development of a high-throughput ELISA assay for platelet function testing using platelet-rich plasma or whole blood. Thromb. Haemost. 104 (2), 392-401 (2010).
- Snyder, N. W., Basu, S. S., Worth, A. J., Mesaros, C., Blair, I. A. Metabolism of propionic acid to a novel acyl-coenzyme A thioester by mammalian cell lines and platelets. J. Lipid Res. 56 (1), 142-150 (2015).
- Snyder, N. W., Basu, S. S., Zhou, Z., Worth, A. J., Blair, I. A. Stable isotope dilution liquid chromatography/mass spectrometry analysis of cellular and tissue medium- and long-chain acyl-coenzyme A thioesters. Rapid Commun. Mass Spectrom. 28 (16), 1840-1848 (2014).
- Snyder, N. W., et al. Production of stable isotope-labeled acyl-coenzyme A thioesters by yeast stable isotope labeling by essential nutrients in cell culture. Anal. Biochem. 474, 59-65 (2015).
- Wallace, D. C. Mitochondrial diseases in man and mouse. Science. 283 (5407), 1482-1488 (1999).
- Wojtovich, A. P., Brookes, P. S. The complex II inhibitor atpenin A5 protects against cardiac ischemia-reperfusion injury via activation of mitochondrial KATP channels. Basic Res. Cardiol. 104 (2), 121-129 (2009).
- Worth, A. J., et al. Stable isotopes and LC-MS for monitoring metabolic disturbances in Friedreich's ataxia platelets. Bioanalysis. 7 (15), 1843-1855 (2015).
- Worth, A. J., Basu, S. S., Snyder, N. W., Mesaros, C., Blair, I. A. Inhibition of neuronal cell mitochondrial complex I with rotenone increases lipid beta-oxidation, supporting acetyl-coenzyme A levels. J. Biol. Chem. 289 (39), 26895-26903 (2014).
- Zhou, L., Schmaier, A. H. Platelet aggregation testing in platelet-rich plasma: description of procedures with the aim to develop standards in the field. Am. J. Clin. Pathol. 123 (2), 172-183 (2005).
