Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Environment

LC-MS analyse van menselijke bloedplaatjes als een platform voor het bestuderen van mitochondriaal Metabolisme

Published: April 4, 2016 doi: 10.3791/53941
* These authors contributed equally

Summary

Hier laten we geïsoleerde humane bloedplaatjes kan worden gebruikt als een toegankelijke ex vivo model metabole aanpassingen studeren in reactie op de remmer complex I rotenon. Deze benadering maakt gebruik van isotopische tracering en relatieve kwantificatie door middel van vloeistofchromatografie-massaspectrometrie en kan worden toegepast op een verscheidenheid van studieopzetten.

Introduction

Disfunctionele mitochondriaal metabolisme is betrokken bij een groot aantal ziekten, waaronder neurodegeneratie, kanker en cardiovasculaire aandoeningen 30. Als zodanig is grote inspanning geplaatst op het karakteriseren van metabolische defecten die bijdragen aan pathogenese. Vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS / MS) wordt beschouwd als de gouden standaard voor de kwantificatie van analyten uit complexe biologische matrices en wordt vaak gebruikt voor metabolismeonderzoek 8. Echter, zoals vaak het geval is bij biomedische studies, bereiken een toegankelijke en goed gedefinieerde model voor menselijke ziekten tegen een uitdaging.

Veel studies in dienst getransformeerd cellulaire modellen voor het sonderen van de impact van xenobiotica of genetische afwijkingen op de celstofwisseling 7,9. De metabole herprogrammering die optreedt in kankercellen kan introduceren storende factoren 21 en zijn dus niet ideaal. Deze problemen kunnen worden circumvented met primaire cel modellen, hoewel het verkrijgen van voldoende biomassa voor metabole analyses kan een uitdaging zijn. Bovendien is de impact van grote hoeveelheden antibiotica gebruikt in de cultuur zijn gemarkeerd als potentieel verstorende mitochondriale studies 16.

Menselijke bloedplaatjes in de gelegenheid om een primaire cel model met voldoende mitochondriale inhoud voor metabole studies 5,22,27,32 benutten. Ten eerste kan bloedplaatjes gemakkelijk worden verkregen door bloedafnames van individuele donoren, of in grote hoeveelheden uit bloedbanken en daarom een ​​model waarin externe factoren gemakkelijk kan worden gecontroleerd. Ten tweede, als gevolg van hun geringe omvang, bloedplaatjes kan eenvoudig worden geïsoleerd van andere bloedcomponenten met minimale voorbereidende werkzaamheden in zelfs minimaal uitgeruste laboratoria 5. We merken hebben bloedplaatjes niet kernen bevatten en kunnen daarom worden gebruikt om veranderingen onafhankelijk van transcriptionele regulatie te bestuderen metabolisme. Hier laten we zien datnaast relatieve kwantificatie van acyl-coenzym A (CoA) thioesters, kan het geïsoleerde bloedplaatjes systeem worden gebruikt om koolstofmetabolisme onderzoeken. Specifiek melden wij het ​​gebruik van metabolisch labelen met stabiele isotopen (niet-radioactief) gemerkte [13 C 6] glucose en [13 C 16] -palmitate incorporatie van [13 C] -label sonde in de belangrijkste metaboliet acetyl- CoA via glycolyse of vetzuuroxidatie. Dit zorgt voor een krachtige, generaliseerbare en veelzijdig platform vanwege de grote betrokkenheid van acyl-CoA soorten biochemische pathways 13,24 en de traceerbaarheid van dit systeem onderzoeken van andere variabelen, zoals de remming van complex I met rotenon 3,33. In aanvulling op de informatie in de onderstaande protocol, kan een uitgebreide beschrijving van de gebruikte isotoop etikettering en voor de LC-MS-gebaseerde analyses methoden te vinden in Basu en Blair 4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Ethiek Verklaring: Alle protocollen met betrekking tot de behandeling van menselijke monsters volgen de richtlijnen van de Universiteit van Pennsylvania menselijk onderzoek ethische commissie.

1. Bereiding van buffers en 100x Voorraadoplossingen

  1. Bereid 1 liter bufferbasis Tyrode. Combineer 8,123 g NaCl, 1,428 g NaHCO3, 0,466 g CaCl2 ∙ 2 H 2 O, 0,224 g KCI en 0,095 g MgCl 2. Pas de totale volume op 1 L met DDH 2 O. Filter steriliseren basis Tyrode buffer.
  2. Bereid 100x voorraad oplossingen van glucose en palmitinezuur. Voor 100x glucose voorraad oplossingen, los 100 mg glucose of [13 C 6] glucose in 1 ml van DDH 2 O. Voor 100x palmitaat oplossingen, lossen 2,56 mg palmitinezuur of 2,72 mg [13 C 16] -palmitic zuur in 1 ml ethanol. Filter steriliseren 100x voorraad oplossingen.
  3. Bereid Geschikte verrijkte Tyrode Buffers Voor niet-labeling studies, voeg 1 ml van 100x glucose voorraad-oplossing en 1 ml 100x palmitinezuur stockoplossing aan 98 ml buffer basis Tyrode.
  4. Voor glucose labeling studies, voeg 1 ml 100x [13 C 6] glucose voorraad-oplossing en 1 ml 100x palmitinezuur stockoplossing aan 98 ml buffer basis Tyrode.
  5. Voor palmitinezuur labeling studies, voeg 1 ml van 100x glucose voorraad-oplossing en 1 ml van [13 C 16] -palmitic zuur stockoplossing aan 98 ml buffer basis Tyrode.
  • Bereid Oplossingen voor Rotenon Treatment
    1. Bereid een 10 mM voorraadoplossing van rotenon in dimethylsulfoxide (DMSO).
    2. Voor niet-labeling dosis-respons studies, ga dan naar 1.4.3. Voor de etikettering studies in een eenmalige dosis, ga dan naar 1.4.5.
    3. Voer een seriële verdunning van de 10 mM voorraad in DMSO rotenon oplossingen met rotenon concentraties variërend van 1 nM tot 100 urn. Dit zijn 100x voorraads.
    4. Voeg 50 ul van elk bestand tot 5 ml base Tyrode buffer + glucose + palmitinezuur 1.3.1 van oplossingen met rotenon concentraties van 10 pM tot 1 uM bereiden. Alternatief, voeg 50 ul DMSO om te dienen als controle voertuig. Ga verder met 2.1.
    5. Verdun de 10 mM voorraadoplossing 1000-voudig in DMSO tot een 10 uM werkende oplossing.
    6. Voeg 50 ul van deze voorraad aan elk van de basis Tyrode buffer + 5 ml [13 C 6] glucose + palmitinezuur van 1.3.2 en de basis Tyrode buffer + glucose + [13 C 16] -palmitic zuur uit 1.3.3. De uiteindelijke concentratie 100 nM rotenon. Alternatief, voeg 50 pl DMSO iedere buffer te dienen als controles voertuig.
  • 2. Bloedplaatjes Isolation

    Opmerking: Deze methode is vatbaar voor bloedplaatjes afgeleid van ofwel volledig bloed of bloedplaatjes zakken. Het voorbeeld gegevens hierin opgenomen werd voorbereidgebruik bloedplaatjes afgeleid van bloedplaatjes zakken. Zie Basu et al. 5 voor meer informatie met betrekking tot het gebruik van bloedplaatjes geïsoleerd uit volbloed.

    1. Bloedplaatjes Isolatie van volbloed
      LET OP: Als het isoleren van bloedplaatjes uit een zak met bloedplaatjes, ga dan naar 2.2.1.
      1. Centrifuge volbloed bij 175 x g gedurende 15 min zonder remmen.
      2. Breng 1 ml van de bovenste bloedplaatjes-rijk plasma (PRP) laag naar een 1,5 ml microcentrifugebuis.
      3. Centrifugeer de PRP bij 400 x g gedurende 5 min.
      4. Zuig supernatant en ga verder met stap 3.1 of 3.2.
    2. Bloedplaatjes Isolatie van een bloedplaatjes Bag
      1. Breng 1 ml van de bloedplaatjessuspensie een 1,5 ml microcentrifugebuis.
      2. Centrifugeer de suspensie bij 400 xg gedurende 5 minuten.
      3. Zuig supernatant en ga verder met stap 3.1. of 3.2.

    3. Het uitvoeren van een experiment

    1. Om het effect van xenobiotische bepalenbehandeling (bijvoorbeeld, rotenone) op de niveaus van een metaboliet van belang (bijvoorbeeld, acetyl-CoA), ga dan naar 3.1.1. Om het effect van xenobiotische (bijv., Rotenone) op de opname van een metabolische precursor aanwezig is in een stroomafwaarts metaboliet van belang, overgaan tot 3.2.1.
      1. Met behulp van niet minder dan drie biologische herhalingen voor elke conditie, resuspendeer bloedplaatjes pellet uit stap 2.1.4 of 2.2.3 in 1 ml van elke oplossing van stap 1.4.4.
      2. Incubeer geresuspendeerde bloedplaatjes in een watermantel CO 2 incubator ingesteld op 95% vochtigheid, 5% CO2 en 37 ° C gedurende 1 uur. Ga verder met stap 4.1
        Opmerking: Hier beschrijven we een dosis-respons-experiment. Als alternatief zou een tijdsverloop experiment uitgevoerd waarbij de dosering is vastgesteld en de lengte van de incubatie werd in plaats daarvan gevarieerd.
    2. Om het effect van xenobiotische behandeling bij de oprichting van een metabolische precursor aanwezig is in een stroomafwaarts metaboliet plaats.
      1. Uzingen niet minder dan drie biologische herhalingen voor elke conditie, resuspendeer bloedplaatjes pellet uit stap 2.1.4 of 2.2.3 in 1 ml van elke formulering van gemerkt Tyrode buffer uit stap 1.4.6.
      2. Incubeer geresuspendeerde bloedplaatjes in een watermantel CO 2 incubator ingesteld op 95% vochtigheid, 5% CO2 en 37 ° C gedurende 1 uur. Ga verder met stap 4.1.

    4. Afschrikken en CoA Extraction

    1. Bloedplaatjes pellet door centrifugeren bij 3000 g gedurende 3 minuten.
    2. Zuig supernatant.
    3. Resuspendeer bloedplaatjes in 750 ul ijskoude 10% trichloorazijnzuur (w / v).
    4. Voeg het juiste stabiele isotoop gemerkte interne standaard. Bijvoorbeeld, als het doel is om de niveaus van CoA soorten vergelijken uit verschillende monsters, gebruik 100 ui van een mengsel van stabiele isotoop gemerkte CoA thioesters verkregen uit gist zoals eerder beschreven (SILEC techniek) 29.
    5. Pulse-ultrasone trillingen elk monster 30 keer met 0,5 sec pulsen.
    6. Centrifugeer monsters bij 16.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
    7. Bevestig C18 vaste fase extractie (SPE) kolommen vacuüm spruitstuk.
    8. De kolommen geconditioneerd met 1 ml methanol.
    9. Evenwicht de kolommen met 1 ml DDH 2 O.
    10. Run-monster verkregen supernatant (ongeveer 850 ul in dit geval) door de kolommen.
    11. Was de kolommen met 1 ml water.
    12. Load 10 ml glazen centrifugebuizen in het vacuüm spruitstuk te verzamelen elutie fractie.
    13. Elueer de kolom met 1 ml 25 mM ammoniumacetaat in methanol.
    14. Droog eluaat onder stikstofgas.
    15. Resuspendeer gedroogde residuen in 50 ul 5% (w / v) 5-sulfosalicylzuur en overbrengen naar HPLC-flesjes.

    5. HPLC Setup

    1. Met de besturingssoftware voor het HPLC-systeem, maakt een methode met HPLC-omstandigheden geoptimaliseerd voor de doelanalyten en gebruikt kolom, zoals vermeld in tabel 1.
      Opmerking: De kolom temperature gebruikt voor het genereren van deze gegevens was 25 ° C maar de specifieke parameters zullen variëren volgens instrument en ten aanzien van de van belang zijnde verbindingen. Voor acyl-CoA kwantificatie zijn meerdere methoden van LC-MS analyse gerapporteerd en gevalideerd voor verschillende analyten in verschillende LC condities 14,19,20.
    2. Laat de HPLC adequaat Evenwicht.
      Opmerking: Dit dient priming van oplosmiddelen omvatten voor het bevestigen van een kolom en equilibratie van de kolom begint oplosmiddel voorwaarden voor de werkwijze. De verevening volume moeten aanwijzingen van de fabrikant te volgen, en de daaruit voortvloeiende effluent moeten worden doorgeschakeld naar afval.
      Opmerking: Raadpleeg Basu en Blair 5 voor meer details over de HPLC-instellingen.

    6. Massa Spectrometer Setup

    1. Met de besturingssoftware van de massaspectrometer, maakt een gerichte detectiemethode voor geïoniseerde vormen van de verbindingen plaats. Parameters wordenin Tabel 2.
      Opmerking: Stabiele isotopen van deze verbindingen worden gebruikt om te bepalen of een positieve of negatieve modus biedt superieure gevoeligheid en de bron en optica staat voor de signalering optimaliseren. De totale detectietijd van de massaspectrometer methode moet bij het tijdstip van het bijbehorende HPLC-methode.
      Opmerking: Zoals eerder vermeld, zijn meerdere methoden van acyl-CoA analyse gerapporteerd, waaronder positieve 14 en negatieve ionisatie 15 wijzen en het gebruik van een hoge resolutie massaspectrometer 17 in plaats van een triple quadrupole instrument 28.
    2. Schoon en kalibreren van het instrument, een stabiel verstuiving in de spectrometer en voldoende tijd voor de ijkoplossing voldoende afvoeren van de bron en optica volgens de instructies van de fabrikant.
    3. Stel een sequentie voor alle monsters met de massaspectrometer besturingssoftware. incluDe naam of numerieke identificatiemiddelen en geven de juiste injectievolume en instrument methode. Voer een blanco voordat het eerste monster, en lopen andere blanks en wast tussen de monsters die nodig zijn om overdracht of matrix gevolgen te verzachten.
      Opmerking: Een methode voor de piek integratie van geselecteerde analyten 'vloeistof chromatogrammen verwerking kan vaak worden ingesteld binnen deze sequentie of later toegepast in de gegevensverwerking.
    4. Begin de volgorde en het toezicht op de massaspectrometer en HPLC-systeem regelmatig voor problemen, waaronder drukschommelingen of systeemstoringen en het verlies van intensiteit van het signaal tijdens de run.
      Opmerking: Ernstige problemen of aanhoudende run mislukkingen kunnen eisen het stoppen van de run en de zuivering en het opnieuw in evenwicht brengen van het HPLC-systeem, alsmede het schoonmaken en het kalibreren van de massaspectrometer. Raadpleeg Basu en Blair 5 voor meer informatie over de instellingen en de verwerking van gegevens MS.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Om het nut van deze methode hebben we de generaliseerbaarheid van de eerder beschreven compenserende metabolische aanpassing als gevolg van blootstelling aan rotenon gereproduceerd demonstreren. Deze bevinding werd eerder geïdentificeerd in celcultuur modellen en dit onderzoek was erop gericht om te testen of deze metabole verschuiving komt ook voor in bloedplaatjes, die kernloze en niet gevoelig voor dezelfde experimentele artefacten als celcultuur zijn. Dit werk werd uitgevoerd met 6 dagen oude bloedplaatjes uit de Penn Trauma Center, die te oud voor menselijke infusie waren verklaard weliswaar zijn metabolische activiteit behouden. De isolatie werd uitgevoerd zoals getoond in figuur 1. De totale workflow kan eenvoudig worden opgeschaald van een beperkt aantal klinische monsters of experimentele omstandigheden 96-putjesplaat gebaseerde hogere doorvoer met de beschikbaarheid van bloedplaatjes die niet langer bruikbaar voor infusie in patiënten.

    (figuur 2). Specifiek hebben we waargenomen in SH-SY5Y cellen een dosisafhankelijke afname in succinyl-CoA (IC50 = 25 nM) met een gelijktijdige toename van β-hydroxybutyryl (HB) -COA (ED50 = 75 nM), terwijl acetyl-CoA niveaus ongewijzigd 1. Onze analyse van menselijke bloedplaatjes behandeld met rotenon bleek zeer consistente resultaten (figuur 3). Dit verschaft een unieke set van experimentele gegevens in humane bloedplaatjes wijzen op de mitochondriale afhankelijkheid van de respons op rotenon. Dit antwoord kan niet worden bemiddeld door middel van conventionele transcriptie mechanismen omdat bloedplaatjes gebrek kernen.

    Relatieve kwantificering biedt één dimensie van metabole informatie, maarisotoop labeling levert waardevolle aanvullende inzicht in de activiteit van specifieke metabole routes. Dit is essentieel in de metabole studies, omdat meerdere routes kunnen convergeren via één intermediair. Om dit punt te demonstreren, werden de bloedplaatjes behandeld met ofwel 100 nM rotenon of DMSO in aanwezigheid van hetzij [13 C 6] glucose of [13 C 16] -palmitate gedurende 1 uur. Co-elutie van isotopologen van acyl-CoA's van de LC kolom maakt definitieve vaststelling van isotopensamenstelling analyten (figuur 4). Na correctie voor de natuurlijke abundantie van zware isotopen zoals beschreven 11 deze methode toonde een significante daling van glycolytische productie van acetyl-CoA in de bloedplaatjes tijdens palmitaat opname significant verhoogd (Figuur 5). Deze bevindingen komen overeen met die eerder waargenomen in de SH-SY5Y celcultuurmodel 33 en daarin voorzien aanvullend bewijs tpet deze route kan belangrijk in vivo.

    Tijd (min) 0 0 1.5 5 12 17 18 23 25 30
    Totale stroom (pl / min) 200 200 200 200 200 250 200 200 200 200
    % EEN 98 98 98 80 0 0 0 0 98 98
    % B 2 2 2 20 100 100 0 0 2 2
    % C 0 0 0 0 0 0 100 100 0 0

    . Tabel 1. vloeistofchromatografie Gradient oplosmiddel A: 5 mM ammoniumacetaat op in water, Solvent B: 5 mm ammoniumacetaat in 95: 5 ACN / Water Solvent C: 80:20 ACN / Water 0,1% mierenzuur

    Parameter Waarde
    Spray Voltage (V) 4000
    Verdampertemperatuur (° C) 400
    Schede gasdruk 35
    Auxiliary gasdruk 10
    Capillaire Temperatuur (° C) 350
    Tube Lens Offset (V) 100

    Tabel 2. Parameters van de massaspectrometer.

    Figuur 1
    Figuur 1. Generalized Workflow voor Monstervoorbereiding en analyse. Dit schema toont de workflow voor bloedplaatjes isolatie en behandeling van metabole studies door middel van LC-MS / MS analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

    figuur 2
    Figuur 2. Metabole Scheme van glucose en Lipidenmetabolisme en de Keten van het Vervoer. Acetyl-CoA kan worden gesynthetiseerd uit ofwel glucose of palmitaat. Rotenone remt de juiste shuttling van elektronen door mitochondriale complex ITPS: //www.jove.com/files/ftp_upload/53941/53941fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

    figuur 3
    Figuur 3. Kwantificering van CoA-thioesters in reactie op Rotenone. Rotenone behandeling heeft geen invloed acetyl-CoA niveaus maar induceert een dosis-afhankelijke afname van succinyl-CoA (IC50 = 4,1 nM) met een gelijktijdige toename βHB-CoA (ED 50 = 4,2 nM). Foutbalken geven standaardfout van het gemiddelde (SEM); n = 4. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

    figuur 4
    Figuur 4. Representatieve Chromatogrammen Resultaat isotopische Labeling van Palmitatein acetyl-CoA. Rotenon behandeling de integratie van palmitaat in acetyl-CoA toeneemt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

    figuur 5
    Figuur 5. Relatieve opname van [13 C 6] glucose of [13 C 16] -palmitate in acetyl-CoA. Rotenon behandeling vermindert glucose opname in acetyl-CoA en verhoogt palmitaat oprichting. Fout balken geven SEM; n = 4. Sterretjes duiden p <(ongepaarde t-test van Student) 0,05. Klik hiervoor een grotere versie van deze figuur te bekijken.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Hier hebben we het nut van geïsoleerde bloedplaatjes weergegeven als een platform voor het bestuderen verstoord mitochondriale metabolisme. Wij hebben in het metabolische aanpassing kenmerk reactie op complex I remming door rotenon.

    Deze studie werd eerder gemeld bevindingen uitgebreid over de rol van complex I remming door rotenon in cellijnen van menselijke bloedplaatjes. Belangrijk is dat deze is gebleken dat rotenon geremd bloedplaatjes succinyl-CoA vorming stimuleerde een toename van bloedplaatjes βHB-CoA en had geen effect op bloedplaatjes van acetyl-CoA.

    Grote zorg moet worden genomen om de validiteit en reproduceerbaarheid van elke dergelijke analyse te verzekeren. Wanneer bloedplaatjes worden geïsoleerd uit volbloed, moet de isolatie exact verder zoals hierboven beschreven om lymfocyten vervuiling en bloedplaatjesactivering voorkomen, met bijzondere aandacht voor het verlaten van de buffy coat waarin de lymfocyten undisgestoord. Om dosisresponscurven te laten zijn, moeten seriële verdunningen nauwkeurig worden uitgevoerd onder mengen tot homogeniteit bij elke stap. Na bloedplaatjes resuspensie, kan incubatie voorwaarden worden gewijzigd ten opzichte van de hierboven beschreven, maar ze moeten rigoureus worden gestandaardiseerd in de behandelgroepen voor een zinvolle vergelijkingen worden gemaakt. Wellicht de belangrijkste stap in een kwantitatieve LC / MS-gebaseerde analyse is het gebruik van stabiele isotoop-gelabelde interne standaarden.

    Het gebruik van interne standaarden is essentieel in deze situatie omdat het beschermt tegen potentieel verstorende "batch effecten" zoals variabele extractie efficiëntie en stabiliteit van de analyt in de monsters. Toevoeging van de interne standaard (opnieuw mengen tot homogeniteit) zo vroeg mogelijk in een experimenteel protocol minder aanleiding tot artefacten. Tenslotte, zoals in elk experiment het gebruik van meerdere replica voor elke experimentele voorwaarde is onmisbaar en indien mogelijk, Powerberekeningen gebaseerd op pilootexperimenten nuttig zijn.

    Bloedplaatjes kunnen snel worden geïsoleerd uit individuele of samengevoegde bronnen 5,27,32, waardoor deze benadering vatbaar voor uiteenlopende toepassingen. Het is belangrijk op te merken dat het vermogen om studies waarbij zowel relatieve kwantificering en isotopische labeling kan uitvoeren voor een uitgebreide karakterisering van een metabolisch systeem. Momenteel vereist dit twee verschillende assays, waardoor de vraag naar biomassa nodig voor het experiment verhoogt. Daarom, bloedplaatjes, die gemakkelijk in grote aantallen kunnen worden verkregen, zijn efficiënter dan andere celcultuurmodellen.

    Ondanks de door het gebruik van bloedplaatjes toegekende talrijke voordelen, zijn er nadelen. Ten eerste moet aandacht worden besteed aan de keuze van humane donoren omdat er veel aandoeningen die bloedplaatjes fysiologie 25 beïnvloeden. Bovendien, bloedplaatjesactivering tijdens monsteren analyse is een potentieel verstorende variabele in een bloedplaatjes-gebaseerde test. Daarom gelijktijdige evaluatie van merkers van bloedplaatjes activering door ELISA 26, flowcytometrie 1 of assays zoals lichttransmissie aggregometrie (LTA) assay 34 kunnen blijken voorzichtig.

    Hoewel dit onderzoek heeft zich gericht op de analyse van acyl-CoA thioesters Deze benadering kan eenvoudig worden uitgebreid tot een groter aantal analyten omvatten. Ongerichte metabolomics aanpak zijn het verstrekken van mechanistisch inzicht te geven in een reeks van ziekten 23. Het toepassen van dergelijke irrelevante benaderingen van bloedplaatjes modellen zal waarschijnlijk zorgen voor extra inzicht in de onderliggende biochemische mechanismen betrokken bij ontregelde celstofwisseling.

    Deze aanpak kan gemakkelijk worden uitgebreid om onderzoeken van andere milieu-chemicaliën en drugs bekend te bemoeien met mitochondriaal metabolisme zijn 6,12,18,31 en een systeem om de effecten van xenobiotica als potentiële modulatoren van CoA metabolisme 10 testen. Bovendien kan de algemene benadering worden gebruikt om metabolische defecten bestuderen van genetische ziekten zoals ataxie van Friedreich 5,32. Bovendien kan elk van de bovengenoemde experimentele modellen kunnen worden gekoppeld met een functionele assay ademhaling om meer robuuste kenmerken de stand van mitochondriën in elke context 2. Zo, het koppelen van stabiele isotopen en LC-MS analyse met metabole studies in geïsoleerde bloedplaatjes waarschijnlijk om nieuwe kansen veroorloven om verder te karakteriseren afwijkende mitochondriale metabolisme.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

    Acknowledgments

    Wij erkennen de steun van NIH subsidies P30ES013508 en T32ES019851.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Reagent
    Sodium Chloride (NaCl) Sigma-Aldrich 746398
    Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S5761
    Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2 * H2O) Sigma-Aldrich 223506
    Potassium Chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9541
    Magnesium Chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich 208337
    Glucose Sigma-Aldrich G8270
    13C6-Glucose Sigma-Aldrich 389374
    Palmitic acid Cayman 10006627
    13C16-Palmitic Acid Sigma-Aldrich 605573
    Rotenone Sigma-Aldrich R8875
    Trichloro Acetic Acid Sigma-Aldrich T6399
    5-Sulfosalicylic Acid Sigma-Aldrich 390275
    Acetonitirle Fischer Scientific A996-4 (optima)
    Water (H2O) Fischer Scientific W7-4 (optima)
    Formic acid Fischer Scientific 85171 (optima)
    Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich 472301
    Ethanol Fischer Scientific 04-355-222
    Methanol Fischer Scientific A454-4 (optima)
    Ammonium Acetate Fischer Scientific A639-500
    2 ml Eppendorf Tubes BioExpress C-3229-1
    LC vials (plastic) Waters 186002640
    10 ml Glass Centrifuge Tubes Kimble Chase 73785-10
    Oasis Solid Phase Extraxtion (SPE) Columns Waters WAT094225
    Pastuer Pipets Fischer Scientific 13-678-200
    Name Company Catalog Number Comments
    Equipment
    CO2 Water-Jacketed Incubator Nuaire AutoFlow NU-8500
    Triple Quadropole Mass Spectrometer Thermo Scientific Finnigan TSQ Quantum
    HPLC Thermo Scientific Dionex Ultimate 3000
    Source Thermo Scientific HESI II
    HPLC Column Phenomenex Luna C18 3 μm particle size, 200 mm x 2 mm

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Ault, K. A. The clinical utility of flow cytometry in the study of platelets. Semin. Hematol. 38 (2), 160-168 (2001).
    2. Avila, C., et al. Platelet mitochondrial dysfunction is evident in type 2 diabetes in association with modifications of mitochondrial anti-oxidant stress proteins. Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 120 (4), 248-251 (2012).
    3. Basu, S. S., Blair, I. A. Rotenone-mediated changes in intracellular coenzyme A thioester levels: implications for mitochondrial dysfunction. Chem. Res. Toxicol. 24 (10), 1630-1632 (2011).
    4. Basu, S. S., Blair, I. A. SILEC: a protocol for generating and using isotopically labeled coenzyme A mass spectrometry standards. Nat. Protoc. 7 (1), 1-12 (2012).
    5. Basu, S. S., Deutsch, E. C., Schmaier, A. A., Lynch, D. R., Blair, I. A. Human platelets as a platform to monitor metabolic biomarkers using stable isotopes and LC-MS. Bioanalysis. 5 (24), 3009-3021 (2013).
    6. Berson, A., et al. Mechanisms for experimental buprenorphine hepatotoxicity: major role of mitochondrial dysfunction versus metabolic activation. J. Hepatol. 34 (2), 261-269 (2001).
    7. Castell, J. V., Jover, R., Martinez-Jimenez, C. P., Gomez-Lechon, M. J. Hepatocyte cell lines: their use, scope and limitations in drug metabolism studies. Expert. Opin. Drug Metab Toxicol. 2 (2), 183-212 (2006).
    8. Ciccimaro, E., Blair, I. A. Stable-isotope dilution LC-MS for quantitative biomarker analysis. Bioanalysis. 2 (2), 311-341 (2010).
    9. Dang, C. V. Links between metabolism and cancer. Genes Dev. 26 (9), 877-890 (2012).
    10. Darnell, M., Weidolf, L. Metabolism of xenobiotic carboxylic acids: focus on coenzyme A conjugation, reactivity, and interference with lipid metabolism. Chem. Res. Toxicol. 26 (8), 1139-1155 (2013).
    11. Des Rosiers, C., Fernandez, C. A., David, F., Brunengraber, H. Reversibility of the mitochondrial isocitrate dehydrogenase reaction in the perfused rat liver. Evidence from isotopomer analysis of citric acid cycle intermediates. J. Biol. Chem. 269 (44), 27179-27182 (1994).
    12. Ellis, J. K., et al. Metabolic profiling detects early effects of environmental and lifestyle exposure to cadmium in a human population. BMC. Med. 10, 61 (2012).
    13. Grevengoed, T. J., Klett, E. L., Coleman, R. A. Acyl-CoA metabolism and partitioning. Annu. Rev. Nutr. 34, 1-30 (2014).
    14. Haynes, C. A., et al. Quantitation of fatty acyl-coenzyme As in mammalian cells by liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry. J. Lipid Res. 49 (5), 1113-1125 (2008).
    15. Ikegawa, S., et al. Characterization of cholyl-adenylate in rat liver microsomes by liquid chromatography/electrospray ionization-mass spectrometry. Anal. Biochem. 266 (1), 125-132 (1999).
    16. Kalghatgi, S., et al. Bactericidal antibiotics induce mitochondrial dysfunction and oxidative damage in Mammalian cells. Sci. Transl. Med. 5 (192), 192ra85 (2013).
    17. Liu, X., et al. High-Resolution Metabolomics with Acyl-CoA Profiling Reveals Widespread Remodeling in Response to Diet. Mol. Cell Proteomics. 14 (6), 1489-1500 (2015).
    18. Lopez-Gallardo, E., Iceta, R., Iglesias, E., Montoya, J., Ruiz-Pesini, E. OXPHOS toxicogenomics and Parkinson's disease. Mutat. Res. 728 (3), 98-106 (2011).
    19. Magnes, C., Sinner, F. M., Regittnig, W., Pieber, T. R. LC/MS/MS method for quantitative determination of long-chain fatty acyl-CoAs. Anal. Chem. 77 (9), 2889-2894 (2005).
    20. Mauriala, T., Herzig, K. H., Heinonen, M., Idziak, J., Auriola, S. Determination of long-chain fatty acid acyl-coenzyme A compounds using liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 808 (2), 263-268 (2004).
    21. Murphy, T. A., Dang, C. V., Young, J. D. Isotopically nonstationary 13C flux analysis of Myc-induced metabolic reprogramming in B-cells. Metab Eng. 15, 206-217 (2013).
    22. Paglia, G., et al. Metabolomic analysis of platelets during storage: a comparison between apheresis- and buffy coat-derived platelet concentrates. Transfusion. 55 (2), 301-313 (2015).
    23. Patti, G. J. Separation strategies for untargeted metabolomics. J. Sep. Sci. 34 (24), 3460-3469 (2011).
    24. Robishaw, J. D., Neely, J. R. Coenzyme A metabolism. Am. J. Physiol. 248 (1 Pt 1), E1-E9 (1985).
    25. Rodgers, G. M. Overview of platelet physiology and laboratory evaluation of platelet function. Clin. Obstet. Gynecol. 42 (2), 349-359 (1999).
    26. Salles, I., et al. Development of a high-throughput ELISA assay for platelet function testing using platelet-rich plasma or whole blood. Thromb. Haemost. 104 (2), 392-401 (2010).
    27. Snyder, N. W., Basu, S. S., Worth, A. J., Mesaros, C., Blair, I. A. Metabolism of propionic acid to a novel acyl-coenzyme A thioester by mammalian cell lines and platelets. J. Lipid Res. 56 (1), 142-150 (2015).
    28. Snyder, N. W., Basu, S. S., Zhou, Z., Worth, A. J., Blair, I. A. Stable isotope dilution liquid chromatography/mass spectrometry analysis of cellular and tissue medium- and long-chain acyl-coenzyme A thioesters. Rapid Commun. Mass Spectrom. 28 (16), 1840-1848 (2014).
    29. Snyder, N. W., et al. Production of stable isotope-labeled acyl-coenzyme A thioesters by yeast stable isotope labeling by essential nutrients in cell culture. Anal. Biochem. 474, 59-65 (2015).
    30. Wallace, D. C. Mitochondrial diseases in man and mouse. Science. 283 (5407), 1482-1488 (1999).
    31. Wojtovich, A. P., Brookes, P. S. The complex II inhibitor atpenin A5 protects against cardiac ischemia-reperfusion injury via activation of mitochondrial KATP channels. Basic Res. Cardiol. 104 (2), 121-129 (2009).
    32. Worth, A. J., et al. Stable isotopes and LC-MS for monitoring metabolic disturbances in Friedreich's ataxia platelets. Bioanalysis. 7 (15), 1843-1855 (2015).
    33. Worth, A. J., Basu, S. S., Snyder, N. W., Mesaros, C., Blair, I. A. Inhibition of neuronal cell mitochondrial complex I with rotenone increases lipid beta-oxidation, supporting acetyl-coenzyme A levels. J. Biol. Chem. 289 (39), 26895-26903 (2014).
    34. Zhou, L., Schmaier, A. H. Platelet aggregation testing in platelet-rich plasma: description of procedures with the aim to develop standards in the field. Am. J. Clin. Pathol. 123 (2), 172-183 (2005).

    Tags

    Environmental Sciences Metabolism isotopische tracers bloedplaatjes massaspectrometrie mitochondria rotenon xenobiotica
    LC-MS analyse van menselijke bloedplaatjes als een platform voor het bestuderen van mitochondriaal Metabolisme
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Worth, A. J., Marchione, D. M.,More

    Worth, A. J., Marchione, D. M., Parry, R. C., Wang, Q., Gillespie, K. P., Saillant, N. N., Sims, C., Mesaros, C., Snyder, N. W., Blair, I. A. LC-MS Analysis of Human Platelets as a Platform for Studying Mitochondrial Metabolism. J. Vis. Exp. (110), e53941, doi:10.3791/53941 (2016).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter