Summary
כאן אנו מראים טסיות אדם מבודדים יכולים לשמש נגיש vivo לשעבר מודל ללמוד עיבודים מטבוליים בתגובה במתחם שאני מעכב rotenone. גישה זו מעסיקה עקיבת איזוטופי וכימות ביחס ידי ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה הנוזלית וניתן ליישם במגוון רחב של עיצובי מחקר.
Introduction
מטבוליזם מתפקדת המיטוכונדריה היה מעורב במגוון רחב של מחלות ניווניות של מערכת העצבים כולל, סרטן, ומחלות לב וכלי דם 30. ככזה, במאמץ רב הושם על המאפיינים פגמים מטבוליים שתורמים בהיווצרות המחלה. כרומטוגרפיה-טנדם נוזלי ספקטרומטריית מסה (LC-MS / MS) נחשבת תקן הזהב עבור כימות של analytes מ מטריצות ביולוגיות מורכבות, והוא מועסק לעתים קרובות ללימודים מטבולית 8. עם זאת, כפי שקורה לעתים קרובות עם ללימודי ביו, השיג מודל נגיש ומוגדר היטב רלוונטי מחל אנושיות הוא אתגר.
מחקרים רבים להעסיק שינו מודלים הסלולר עבור לחקור את ההשפעה של xenobiotics או מומים גנטיים על חילוף חומרים תאיים 7,9. תכנות מחדש מטבולית המתרחש בתאי סרטן יכול להציג מבלבלים גורמי 21 ולכן הם לא אידיאליים. בעיות אלה יכולים להיות circumvented עם מודלי תא ראשוניים, למרות קבלת ביומסה מספיק עבור ניתוחים מטבולית יכולה להיות מאתגרת. יתר על כן, את ההשפעה של כמויות גבוהות של אנטיביוטיקה בשימוש בתרבות כבר מסומן כמו מחקרים המיטוכונדריה בלבול פוטנציאלי 16.
טסיות אדם להרשות לעצמו את ההזדמנות לנצל מודל תא ראשוני עם תוכן המיטוכונדריה מספיק מחקרים מטבוליים 5,22,27,32. ראשית, טסיות ניתן לרכוש בקלות, באמצעות דם שואבת מתורמים פרטיים, או בכמויות גדולות מבנקי דם, ולכן לספק מודל שבו גורמים חיצוניים ניתן לשלוט בקלות. שנית, בשל גודלם הזעיר, טסיות ניתן בקלות לבודד מרכיבים אחרים בדם עם עבודת הכנה מינימלית אפילו מינימלית 5 מצויד במעבדות. ראוי לציין, טסיות אינם מכילים גרעינים ולכן יכול לשמש כדי לחקור שינויים בחילוף החומרים באופן עצמאי הרגולציה תעתיק. כאן אנו מראים כיבנוסף כימות היחסית של acyl-אנזים (CoA) thioesters, מערכת טסיות המבודדת יכולה לשמש כדי לבחון מטבוליזם הפחמן. באופן ספציפי, אנו מדווחים על השימוש תיוג מטבולית עם איזוטופ יציב (לא רדיואקטיבי) שכותרתו [13 C 6] -glucose ו [13 C 16] -palmitate לחקור ההתאגדות של [13 C] -הוסף תווית לתוך acetyl- המטבוליט חשוב CoA דרך הגליקוליזה או חמצון חומצות שומן. זה מספק פלטפורמה חזקה, להכליל, צדדי בשל המעורבות הנרחבת של מיני acyl-CoA reductase ב הביוכימיים 13,24 ואת העקיבות של מערכת זו לבחינת משתנים אחרים, כגון עיכוב שאני מורכב עם rotenone 3,33. בנוסף המידע המופיע בפרוטוקול בהמשך, לסקירה נרחבת של האמצעים שננקטו על תיוג איזוטופ ועבור ניתוחים מבוססי LC-MS ניתן למצוא Basu ובלייר 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
משפט ואתיקה: כל הפרוטוקולים בנושא הטיפול דגימות האדם פעל בהתאם להנחיות של ועדת האתיקה לניסויים בבני אדם של אוניברסיטת פנסילבניה.
1. הכנת מאגרי 100x פתרונות מניות
- כן 1 ליטר של החיץ של הבסיס Tyrode. שלב 8.123 גרם NaCl, 1.428 גרם NaHCO 3, 0.466 גרם CaCl 2 ∙ 2 H 2 O, 0.224 גרם KCl, ו 0.095 גרם MgCl 2. התאם הנפח הכולל עד 1 ליטר עם DDH 2 O. סנן לעקר חיץ של בסיס Tyrode.
- הכינו פתרונות המניות 100x של גלוקוז וחומצה פלמיטית. לקבלת 100x פתרונות המניות גלוקוז, לפזר 100 גלוקוז מ"ג או [13 C 6] -glucose ב 1 מ"ל של DDH 2 O. לקבלת פתרונות palmitate 100x, לפזר 2.56 מ"ג של חומצה פלמיטית או 2.72 מ"ג של [13 C 16] חומצה -palmitic ב 1 מ"ל של אתנול. סנן לעקר 100x פתרונות המניות.
- כן החוצצים של המועשר Tyrode המתאים
- עבור מחקרים תיוג גלוקוז, להוסיף 1 מ"ל של 100x [13 C 6] פתרון המניות -glucose ו 1 מ"ל של 100x פתרון פלמיטית וחומצה המניה ל -98 מ"ל של חיץ של בסיס Tyrode.
- עבור מחקרים תיוג חומצה פלמיטית, להוסיף 1 מ"ל של 100x פתרון המניות גלוקוז 1 מ"ל של [13 C 16] פתרון -palmitic חומצה המניה ל -98 מ"ל של חיץ של בסיס Tyrode.
- הכן פתרון המניות 10 מ"מ של rotenone ב sulfoxide דימתיל (DMSO).
- עבור מחקרי מנת תגובה בלתי תיוג, המשך 1.4.3. עבור מחקרי תיוג במינון יחיד, המשך 1.4.5.
- בצע דילול סדרתי של המניה rotenone 10 מ"מ DMSO להשיג פתרונות עם ריכוזים rotenone הנעים בין 1 ננומטר עד 100 מיקרומטר. אלה הם 100x מניותים.
- הוסף 50 μl של כל מניה 5 מ"ל של חיץ של בסיס Tyrode + גלוקוז + חומצה פלמיטית מ 1.3.1 להכין פתרונות עם ריכוזים rotenone הנעים בין 10 בערב עד 1 מיקרומטר. לחלופין, להוסיף 50 μl של DMSO לשמש שליטה ברכב. המשך 2.1.
- לדלל את 1,000 פי פתרון המניות 10 מ"מ DMSO כדי להשיג פתרון עובד 10 מיקרומטר.
- הוסף 50 μl של המניה הזו עד 5 מ"ל כל אחד חיץ של בסיס Tyrode + [13 C 6] -glucose + חומצה פלמיטית מ 1.3.2 ובסיס חיץ + גלוקוז של Tyrode + [13 C 16] חומצה -palmitic מ 1.3.3. הריכוז הסופי הוא 100 rotenone ננומטר. לחלופין, להוסיף 50 μl של DMSO לכל חיץ לשמש פקדי הרכב.
2. בידוד טסיות
הערה: שיטה זו ניתנת טסיות נגזרה דם שלמים או משקיות טסיות. הנתונים לדוגמה הכלול במסמך שהוכןבאמצעות טסיות נגזרה שקיות טסיות. עיין Basu et al. 5 לקבלת פרטים נוספים לגבי השימוש טסיות מבודדים מהדם כולו.
- בידוד טסיות דם מלא מ
הערה: אם לבודד טסיות משקית של טסיות, המשך 2.2.1.- דם מלא צנטריפוגה ב 175 x ז במשך 15 דקות ללא בלמים.
- העברת 1 מיליליטר של הפלזמה העליונה עשירה-טסיות (PRP) שכבה לצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר.
- צנטריפוגה PRP ב g 400 x למשך 5 דקות.
- לשאוב supernatant והמשך לשלב 3.1 או 3.2.
- בידוד טסיות משקית טסיות
- העברת 1 מ"ל של ההשעיה טסיות לצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל.
- צנטריפוגה ההשעיה ב 400 XG במשך 5 דקות.
- לשאוב supernatant והמשך לשלב 3.1. או 3.2.
3. ביצוע ניסוי
- כדי לקבוע את ההשפעה של xenobioticטיפול (למשל, rotenone) על רמות של מטבוליט של עניין (למשל, אצטיל-CoA reductase), המשך 3.1.1. כדי לקבוע את ההשפעה של xenobiotic (למשל., Rotenone) על התאגדות של מבשר מטבולית לתוך המטבוליט במורד הזרם של עניין, המשך 3.2.1.
- שימוש לא פחות משלוש ביולוגי משכפל עבור כל תנאי, resuspend גלולה טסיות משלב 2.1.4 או 2.2.3 ב 1 מ"ל של כל פתרון משלב 1.4.4.
- דגירת טסיות מושעות ב CO 2 באינקובטור מים במקטורן מוגדר לחות 95%, 5% CO 2 ו -37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. עבור לשלב 4.1
הערה: כאן אנו מתארים ניסוי מנת תגובה. לחלופין, ניסוי כמובן זמן יכול להיעשות שבו המינון נקבע ואת משך הדגירה היה מגוון במקום.
- כדי לקבוע את ההשפעה של טיפול xenobiotic בזמן ההקמה של מבשר מטבולית לתוך המטבוליט במורד הזרם של עניין.
- Uלא לשיר פחות משלושה ביולוגי משכפל עבור כל תנאי, resuspend גלולה טסיות משלבת 2.1.4 או 2.2.3 ב 1ml של כל ניסוח של החיץ של שכותרתו Tyrode משלבים 1.4.6.
- דגירת טסיות מושעות ב CO 2 באינקובטור מים במקטורן מוגדר לחות 95%, 5% CO 2 ו -37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. עבור לשלב 4.1.
4. מרווה ו CoA הפקה
- גלולת טסיות על ידי צנטריפוגה ב 3000 XG במשך 3 דקות.
- לשאוב supernatant.
- טסיות Resuspend ב 750 חומצת trichloroacetic μl קרה כקרח 10% (w / v).
- הוספת תקן פנימי שכותרתו איזוטופ יציב המתאים. לדוגמא, אם המטרה היא להשוות את הרמות של מיני CoA ברחבי דגימות, השתמשו 100 μl של תערובת של thioesters CoA שכותרתו איזוטופ היציב מתקבל שמרים כפי שתואר לעיל (טכניקת SILEC) 29.
- Pulse-sonicate מדגם 30 פעמים עם 0.5 פולסים שניים.
- צנטריפוגה דגימות ב XG 16,000 במשך 10 דקות ב 4 °.
- להטביע מיצוי מוצק שלב C18 (SPE) עמודות סעפת ואקום.
- להתנות את העמודות עם מתנול 1 מ"ל.
- לאזן את העמודות עם 1 מ"ל DDH 2 O.
- הפעל supernatant הנגזרות המדגם (כ 850 μl במקרה זה) בכל העמודות.
- שטוף את העמודות עם מיליליטר מי 1.
- צינורות צנטריפוגה זכוכית טען 10 מ"ל לתוך סעפת ואקום לאסוף חלק elution.
- Elute את העמודות עם 1 מ"ל של אמוניום אצטט 25 מ"מ מתנול.
- eluate יבש תחת גז חנקן.
- Resuspend שאריות מיובשים 50 μl 5% (w / v) חומצה 5-sulfosalicylic ולהעביר לתוך צלוחיות HPLC.
5. הגדרת HPLC
- שימוש בתוכנת שליטה על מערכת HPLC, ליצור שיטה עם תנאים HPLC אופטימיזציה עבור analytes היעד ועמודה מנוצל, כמפורט בטבלה 1.
הערה: העמודה לטמפרטורותיור המשמש לייצור שהנתונים אלה C 25 ° אבל הפרמטרים הספציפיים ישתנו לפי מכשיר ביחס התרכובות של עניין. כדי לכמת את acyl-CoA, מספר שיטות של ניתוח LC-MS דווחו, ומאומת עבור analytes שונה 14,19,20 תנאי LC שונים. - אפשר HPLC באופן הולם לאזן.
הערה: זה צריך לכלול הן יחול ממסים לפני הצמדת טור ו איזון של הטור על התנאים ממסים החלו על השיטה. היקף האיזון צריך מבצע את ההוראות של היצרן, וכתוצאה מכך שפכים צריכים להיות מוסחים לבזבז.
הערה: התייעץ Basu ובלייר 5 לפרטים נוספים אודות הגדרות HPLC.
6. הגדרת ספקטרומטר מסות
- שימוש בתוכנת השליטה על ספקטרומטר המסה, ליצור שיטה ממוקדת עבור זיהוי של צורות מיוננות של התרכובות של עניין. פרמטרים מוצגיםבטבלה 2.
הערה: אנלוגים איזוטופ היציבים של תרכובות אלה יש להשתמש כדי לקבוע אם מצב חיובי או שלילי נותן הרגישות ביותר וכדי לייעל את המקור ומצבו אופטיקה לגילוי שלהם. שעת זיהוי המוחלטת של שיטת ספקטרומטר מסה צריכה מתאימה מרכיב הזמן של שיטת HPLC קשורה.
הערה: כאמור, מספר שיטות של ניתוח acyl-CoA דווחו, כולל 15 יינון שלילי 14 וחיובי מצבים ושימוש ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה 17 במקום מכשיר משולש quadrupole 28. - נקי לכייל את המכשיר, להקים תרסיס יציב לתוך ספקטרומטר, ולאפשר זמן פתרון הכיול להתפוגג כראוי מהמקור ואופטיקה פי הוראות היצרן.
- הגדרת רצף עבור כל הדגימות עם תוכנות שליטה ספקטרומטר מסה. incluדה השם או מזהה מספרי ומצביע על שיטת נפח מכשיר הזרקה המתאימה. הפעל ריק לפני הוצאת המדגם הראשון, ולהפעיל חסר ושוטף אחרים בין דגימות לפי צורך כדי להפחית השפעות שריד או מטריקס.
הערה: שיטת עיבוד לשילוב שיא של chromatograms הנוזלי 'analytes שנבחר לעתים קרובות יכולה להיות מוגדרת בתוך רצף זה או ולהחילו בעיבוד נתונים. - בגין רצף ולנטר את המערכת ספקטרומטר ו HPLC המוני מעת לעת בעיות ובין היתר, תנודות בלחץ או כשלים במערכת ואובדן עוצמת האות בזמן הריצה.
הערה: בעיות חמורות או כשלים בטווח מתמשך עשוי לדרוש לעצור את הריצה הקאה מחדש equilibrating מערכת HPLC וכן ניקוי כיול ספקטרומטר מסה. התייעץ Basu ובלייר 5 לפרטים נוספים בנוגע לדרכי טיפול נתונים והגדרות MS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי להדגים את התועלת של מתודולוגיה זו יש לנו לשכפל את יכולת ההכללה של הסתגלות מטבולית מפצה שתואר לעיל וכתוצאה מחשיפה rotenone. ממצא זה היה זוהה בעבר במודלי תרבית תאי חקירה זו נועדה לבדוק אם משמרת מטבולית זו מתרחשת גם טסיות, שהן anuclear ולא נוטה לאותו חפצים הניסיונות כמו תרבית תאים. עבודה זו בוצעה עם טסיות בן 6 ימים ממרכז הטראומה פן, אשר היה נחשב זקן מדי עבור עירוי אדם, למרות שהם שמרו על הפעילות המטבולית שלהם. הבידוד בוצע כפי שמוצג באיור 1. את העבודה הכולל וניתן לשנותם בקלות ממספר מצומצם של דוגמאות קליניות או תנאי ניסוי 96-גם צלחת מבוססת תפוקה גבוהה יותר עם הזמינות של טסיות כי הם כבר לא שימושיים עבור עירוי לתוך חולים.
ther.within-page = "1"> הקבוצה שלנו שדווח בעבר שינויים ברמות היחסי של thioesters acyl-CoA בתגובה rotenone בשורות תאי כי הם שיערו לנבוע עיכוב של לי מורכבים (איור 2). באופן ספציפי שראינו בתאי SH-SY5Y ירידה תלויה במינון succinyl-CoA (IC 50 = 25 ננומטר) עם עלייה סימולטני β-hydroxybutyryl (HB) -CoA (ED 50 = 75 ננומטר), בעוד שרמות אצטיל-CoA 1 לא השתנה. הניתוח שלנו של טסיות אדם מטופלת עם rotenone חשף תוצאות ומתואמות היטב (איור 3). זה מספק סט ייחודי של נתוני ניסוי במספר טסיות דם אדם מצביעים על תלות המיטוכונדריה של בתגובת rotenone. תגובה זו לא יכולה להיות מתווכת באמצעות מנגנוני תעתיק קונבנציונליים בגלל לטסיות חסר גרעינים.
כימות יחסית מספק מימד אחד של מידע מטבולית, אבלתיוג איזוטופי מספק תובנה משלימים יסולא בפז לתוך הפעילות של מסלולים מטבוליים ספציפיים. זה קריטי במחקרים מטבולית בגלל מסלולים עשויים להתכנס דרך אחת ביניים. כדי להדגים נקודה זו, טסיות טופלו או 100 ננומטר rotenone או DMSO בנוכחות או [13 C 6] -glucose או [13 C 16] -palmitate עבור שעה 1. Co-elution של איזוטופולוג של acyl-תעודות מקוריות מהעמודה LC מאפשר זיהוי מוחלט של ההרכב האיזוטופי של analytes (איור 4). בעקבות תיקון של השפע הטבעי של איזוטופים כבדים כמתוארים 11 גישה זו הראתה ירידה משמעותית בייצור glycolytic של אצטיל-CoA בטסיות תוך שילוב palmitate הוגדל משמעותי (איור 5). ממצאים אלה דומים לאלה שנצפו בעבר במודל תרבית תאים SH-SY5Y 33, וכך הן מספקות t ראיות נוספותכובע מסלול זה יכול להיות חשוב in vivo.
| זמן (דקות) | 0 | 0 | 1.5 | 5 | 12 | 17 | 18 | 23 | 25 | 30 |
| סה"כ תזרים (μl / min) | 200 | 200 | 200 | 200 | 200 | 250 | 200 | 200 | 200 | 200 |
| % A | 98 | 98 | 98 | 80 | 0 | 0 | 0 | 0 | 98 | 98 |
| % ב | 2 | 2 | 2 | 20 | 100 | 100 | 0 | 0 | 2 | 2 |
| % C | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 0 | 100 | 100 | 0 | 0 |
. לוח 1. נוזלי כרומטוגרפיה Gradient ממיס: 5 מ"מ אמוניום אצטט במים, B מרכך: 5 מ"מ אמוניום אצטט ב 95: 5 ACN / מים מרכך C: 80:20 ACN / מים 0.1% חומצה פורמית
| פָּרָמֶטֶר | ערך |
| תרסיס מתח (V) | 4,000 |
| טמפרטורה מאדה (° C) | 400 |
| לחץ נדן גז | 35 |
| לחץ גז עזר | 10 |
| טמפרטורת נימים (° C) | 350 |
| עדשת Tube אופסט (V) | 100 |
טבלה 2. פרמטרים ספקטרומטר מסות.
באיור 1. Workflow כללית להכנת מדגם וניתוח. סכמטית זה מתאר את זרימת העבודה עבור בידוד טסיות וטיפול ללימודי מטבולית ידי ניתוח LC-MS / MS. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. מטבולית Scheme של גלוקוז ושומן מטבוליזם ואת שרשרת העברת אלקטרונים. Acetyl-CoA יכול להיות מסונתז משני גלוקוז או palmitate. Rotenone מעכב את הדילוגים התקינים של אלקטרונים על ידי א המורכב המיטוכונדריהTPS: //www.jove.com/files/ftp_upload/53941/53941fig2large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. כימות של CoA-thioesters בתגובה Rotenone. טיפול Rotenone אינו משפיע רמות אצטיל-CoA אבל גורם ירידה תלוית-מינון succinyl-CoA (IC 50 = 4.1 ננומטר) עם עלייה מקבילה βHB-CoA (ED 50 = 4.2 ננומטר). ברי שגיאה מייצגים סטיית התקן של הממוצע (SEM); n = 4. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. נציג chromatograms מציג תיוג איזוטופי מ Palmitateאל Acetyl-CoA reductase. טיפול Rotenone מגדיל את ההתאגדות של palmitate לתוך אצטיל-CoA reductase. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. התאגדות יחסית של [13 C 6] -glucose או [13 C 16] -palmitate לתוך Acetyl-CoA reductase. טיפול Rotenone פוחתת התאגדות גלוקוז לתוך אצטיל-CoA ומגבירה התאגדות palmitate. ברי שגיאה מייצגים SEM; n = 4. כוכביות לציין p <0.05 (מבחן t מזווג של סטודנט). נא ללחוץ כאןכדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הנה הראינו את התועלת של טסיות מבודדת כפלטפורמה ללימוד מטבוליזם במיטוכונדריה מוטרדת. באופן ספציפי, יש לנו מאופיין הסתגלות מטבולית בתגובת עיכוב שאני מורכב ידי rotenone.
המחקר הנוכחי הרחיב ממצאים שדווחו בעבר על עצם את התפקיד של עיכוב שאני מורכב ידי rotenone בשורות תאיות כדי טסיות אדם. חשוב לציין, זה חשף כי גם rotenone עכבות טסיות succinyl-CoA היווצרות, מגורה עלייה טסיות βHB-CoA ולא השפיעו על רמות הטסיות של אצטיל-CoA reductase.
בזהירות רבה יש לנקוט כדי להבטיח את התוקף ואת השחזור של כל ניתוח מסוג זה. אם טסיות הם להיות מבודדים מהדם כולו, הבידוד צריך להמשיך בדיוק כפי שתואר לעיל על מנת למנוע זיהום לימפוציטים והפעלה טסיות, עם תשומת לב מיוחדת מוקדשת עוזב את המעיל באפי המכיל את לימפוציטים undisturbed. על מנת עקומות מינון תגובה כדי להיות בעל משמעות, דילולים סדרתי חייב להתבצע בדיוק, עם ערבוב עד הומוגניות בכל שלב. לאחר resuspension טסיות, תנאי דגירה עשויים להיות שונים מאלה שפורטו לעיל, אך הם חייבים להיות טופלים בקפדנות בכל קבוצות טיפול כדי לאפשר השוואתם משמעות להתבצע. אולי הצעד החשוב ביותר בכל ניתוח כמוני LC / MS מבוסס הוא השימוש סטנדרטים פנימיים שכותרתו היציבה-איזוטופ.
השימוש בסטנדרטים הפנימי הוא קריטי הגדרה זו משום שהיא מגינה מפני "השפעות אצווה" בלבול פוטנציאלי כגון יעילות מיצוי משתנה ויציבות אנליטי ברחבי דגימות. תוספת של התקן הפנימי, (שוב, ערבוב עד הומוגניות) מוקדם ככל האפשר ב פרוטוקול ניסוי מקטינה את הפוטנציאל חפץ. לבסוף, כמו בכל ניסוי, השימוש מרובה משכפל עבור כל תנאי ניסוי חיוניים, ואם ריאליחישובי כוח, המבוססים על ניסויי פיילוט עשויים להיות שימושיים.
טסיות יכול להיות מבודד במהירות ממקורות פרטיים או ונקווה 5,27,32, מה שהופך גישה זו מקובל מגוון רחב של יישומים. חשוב לציין כי היכולת לבצע מחקרים שכללו הוא כימות יחסי תיוג איזוטופי מאפשרת אפיון מקיף יותר של מערכת חילוף חומרים. נכון לעכשיו, זה דורש שני מבחנים נפרדים, אשר מגביר את הביקוש ביומסה הנדרש לצורך הניסוי. מסיבה זו, טסיות דם, אשר ניתן להשיג בקלות במספרים גדולים, הם יעילים יותר מאשר מודלי תרבית תאים אחרים.
עם זאת, למרות היתרונות הרבים שמעניקה השימוש של טסיות, יש חסרונות. ראשית, יש להקפיד בבחירת תורמי אדם כי יש הפרעות רבות שמשפיעות על פיזיולוגיה טסיות 25. בנוסף, הפעלת טסיות במהלך המדגםהכנה וניתוח הוא משתנית פוטנציאל בלבול בכל assay מבוסס טסיות. מסיבות אלה, הערכה קשורה של סמנים של הפעלת טסיות על ידי ELISA 26, cytometry זרימת 1, או מבחנים כגון aggregometry העברת האור (LTA) assay 34 יכול להוכיח נבון.
למרות שהמחקר הנוכחי התמקד בניתוח thioesters acyl-CoA, גישה זו ניתן להרחיב בקלות לכלול מגוון רחב יותר של analytes. גישות metabolomics Untargeted מספקים תובנה מכניסטית לתוך מערך של מדינות המחלה 23. יישום גישות ממוקדות כאלה טסיות מודלים סבירים יספקו תובנה נוספת לתוך המנגנונים הביוכימיים הבסיסיים מעורבים חילוף חומרים תאיים dysregulated.
גישה זו ניתן להרחיב בקלות לכלול חקירות של כימיקלים ותרופות סביבתיים אחרים ידועים להפריע במטבוליזם המיטוכונדריה 6,12,18,31, כמו גם מערכת כדי לבחון את ההשפעה של xenobiotics כמו מאפנני פוטנציאל של מטבוליזם CoA 10. בנוסף, הגישה הכללית יכול להיות מועסק על מנת ללמוד פגמים מטבוליים מחלות גנטיות כגון אטקסיה של Friedreich 5,32. יתר על כן, כל עיצובי ניסיוני הנ"ל יכול להיות בשילוב עם assay נשימה פונקציונלי כדי יותר וחסון לאפיין את המצב המיטוכונדריה בכל קשר 2. לפיכך, צימוד איזוטופים יציבים וניתוח LC-MS עם מחקרים מטבוליים טסיות מבודד עשויה להרשות הזדמנויות רומן כדי להמשיך לאפיין מטבוליזם המיטוכונדריה סוטה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
אנו מכירים את התמיכה של מענקים NIH P30ES013508 ו T32ES019851.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2 * H2O) | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 208337 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| 13C6-Glucose | Sigma-Aldrich | 389374 | |
| Palmitic acid | Cayman | 10006627 | |
| 13C16-Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | 605573 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Trichloro Acetic Acid | Sigma-Aldrich | T6399 | |
| 5-Sulfosalicylic Acid | Sigma-Aldrich | 390275 | |
| Acetonitirle | Fischer Scientific | A996-4 | (optima) |
| Water (H2O) | Fischer Scientific | W7-4 | (optima) |
| Formic acid | Fischer Scientific | 85171 | (optima) |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Ethanol | Fischer Scientific | 04-355-222 | |
| Methanol | Fischer Scientific | A454-4 | (optima) |
| Ammonium Acetate | Fischer Scientific | A639-500 | |
| 2 ml Eppendorf Tubes | BioExpress | C-3229-1 | |
| LC vials (plastic) | Waters | 186002640 | |
| 10 ml Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 73785-10 | |
| Oasis Solid Phase Extraxtion (SPE) Columns | Waters | WAT094225 | |
| Pastuer Pipets | Fischer Scientific | 13-678-200 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| CO2 Water-Jacketed Incubator | Nuaire | AutoFlow NU-8500 | |
| Triple Quadropole Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Finnigan TSQ Quantum | |
| HPLC | Thermo Scientific | Dionex Ultimate 3000 | |
| Source | Thermo Scientific | HESI II | |
| HPLC Column | Phenomenex | Luna C18 | 3 μm particle size, 200 mm x 2 mm |
References
- Ault, K. A. The clinical utility of flow cytometry in the study of platelets. Semin. Hematol. 38 (2), 160-168 (2001).
- Avila, C., et al. Platelet mitochondrial dysfunction is evident in type 2 diabetes in association with modifications of mitochondrial anti-oxidant stress proteins. Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 120 (4), 248-251 (2012).
- Basu, S. S., Blair, I. A. Rotenone-mediated changes in intracellular coenzyme A thioester levels: implications for mitochondrial dysfunction. Chem. Res. Toxicol. 24 (10), 1630-1632 (2011).
- Basu, S. S., Blair, I. A. SILEC: a protocol for generating and using isotopically labeled coenzyme A mass spectrometry standards. Nat. Protoc. 7 (1), 1-12 (2012).
- Basu, S. S., Deutsch, E. C., Schmaier, A. A., Lynch, D. R., Blair, I. A. Human platelets as a platform to monitor metabolic biomarkers using stable isotopes and LC-MS. Bioanalysis. 5 (24), 3009-3021 (2013).
- Berson, A., et al. Mechanisms for experimental buprenorphine hepatotoxicity: major role of mitochondrial dysfunction versus metabolic activation. J. Hepatol. 34 (2), 261-269 (2001).
- Castell, J. V., Jover, R., Martinez-Jimenez, C. P., Gomez-Lechon, M. J. Hepatocyte cell lines: their use, scope and limitations in drug metabolism studies. Expert. Opin. Drug Metab Toxicol. 2 (2), 183-212 (2006).
- Ciccimaro, E., Blair, I. A. Stable-isotope dilution LC-MS for quantitative biomarker analysis. Bioanalysis. 2 (2), 311-341 (2010).
- Dang, C. V. Links between metabolism and cancer. Genes Dev. 26 (9), 877-890 (2012).
- Darnell, M., Weidolf, L. Metabolism of xenobiotic carboxylic acids: focus on coenzyme A conjugation, reactivity, and interference with lipid metabolism. Chem. Res. Toxicol. 26 (8), 1139-1155 (2013).
- Des Rosiers, C., Fernandez, C. A., David, F., Brunengraber, H. Reversibility of the mitochondrial isocitrate dehydrogenase reaction in the perfused rat liver. Evidence from isotopomer analysis of citric acid cycle intermediates. J. Biol. Chem. 269 (44), 27179-27182 (1994).
- Ellis, J. K., et al. Metabolic profiling detects early effects of environmental and lifestyle exposure to cadmium in a human population. BMC. Med. 10, 61 (2012).
- Grevengoed, T. J., Klett, E. L., Coleman, R. A. Acyl-CoA metabolism and partitioning. Annu. Rev. Nutr. 34, 1-30 (2014).
- Haynes, C. A., et al. Quantitation of fatty acyl-coenzyme As in mammalian cells by liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry. J. Lipid Res. 49 (5), 1113-1125 (2008).
- Ikegawa, S., et al. Characterization of cholyl-adenylate in rat liver microsomes by liquid chromatography/electrospray ionization-mass spectrometry. Anal. Biochem. 266 (1), 125-132 (1999).
- Kalghatgi, S., et al. Bactericidal antibiotics induce mitochondrial dysfunction and oxidative damage in Mammalian cells. Sci. Transl. Med. 5 (192), 192ra85 (2013).
- Liu, X., et al. High-Resolution Metabolomics with Acyl-CoA Profiling Reveals Widespread Remodeling in Response to Diet. Mol. Cell Proteomics. 14 (6), 1489-1500 (2015).
- Lopez-Gallardo, E., Iceta, R., Iglesias, E., Montoya, J., Ruiz-Pesini, E. OXPHOS toxicogenomics and Parkinson's disease. Mutat. Res. 728 (3), 98-106 (2011).
- Magnes, C., Sinner, F. M., Regittnig, W., Pieber, T. R. LC/MS/MS method for quantitative determination of long-chain fatty acyl-CoAs. Anal. Chem. 77 (9), 2889-2894 (2005).
- Mauriala, T., Herzig, K. H., Heinonen, M., Idziak, J., Auriola, S. Determination of long-chain fatty acid acyl-coenzyme A compounds using liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 808 (2), 263-268 (2004).
- Murphy, T. A., Dang, C. V., Young, J. D. Isotopically nonstationary 13C flux analysis of Myc-induced metabolic reprogramming in B-cells. Metab Eng. 15, 206-217 (2013).
- Paglia, G., et al. Metabolomic analysis of platelets during storage: a comparison between apheresis- and buffy coat-derived platelet concentrates. Transfusion. 55 (2), 301-313 (2015).
- Patti, G. J. Separation strategies for untargeted metabolomics. J. Sep. Sci. 34 (24), 3460-3469 (2011).
- Robishaw, J. D., Neely, J. R. Coenzyme A metabolism. Am. J. Physiol. 248 (1 Pt 1), E1-E9 (1985).
- Rodgers, G. M. Overview of platelet physiology and laboratory evaluation of platelet function. Clin. Obstet. Gynecol. 42 (2), 349-359 (1999).
- Salles, I., et al. Development of a high-throughput ELISA assay for platelet function testing using platelet-rich plasma or whole blood. Thromb. Haemost. 104 (2), 392-401 (2010).
- Snyder, N. W., Basu, S. S., Worth, A. J., Mesaros, C., Blair, I. A. Metabolism of propionic acid to a novel acyl-coenzyme A thioester by mammalian cell lines and platelets. J. Lipid Res. 56 (1), 142-150 (2015).
- Snyder, N. W., Basu, S. S., Zhou, Z., Worth, A. J., Blair, I. A. Stable isotope dilution liquid chromatography/mass spectrometry analysis of cellular and tissue medium- and long-chain acyl-coenzyme A thioesters. Rapid Commun. Mass Spectrom. 28 (16), 1840-1848 (2014).
- Snyder, N. W., et al. Production of stable isotope-labeled acyl-coenzyme A thioesters by yeast stable isotope labeling by essential nutrients in cell culture. Anal. Biochem. 474, 59-65 (2015).
- Wallace, D. C. Mitochondrial diseases in man and mouse. Science. 283 (5407), 1482-1488 (1999).
- Wojtovich, A. P., Brookes, P. S. The complex II inhibitor atpenin A5 protects against cardiac ischemia-reperfusion injury via activation of mitochondrial KATP channels. Basic Res. Cardiol. 104 (2), 121-129 (2009).
- Worth, A. J., et al. Stable isotopes and LC-MS for monitoring metabolic disturbances in Friedreich's ataxia platelets. Bioanalysis. 7 (15), 1843-1855 (2015).
- Worth, A. J., Basu, S. S., Snyder, N. W., Mesaros, C., Blair, I. A. Inhibition of neuronal cell mitochondrial complex I with rotenone increases lipid beta-oxidation, supporting acetyl-coenzyme A levels. J. Biol. Chem. 289 (39), 26895-26903 (2014).
- Zhou, L., Schmaier, A. H. Platelet aggregation testing in platelet-rich plasma: description of procedures with the aim to develop standards in the field. Am. J. Clin. Pathol. 123 (2), 172-183 (2005).
