Summary
Qui mostriamo isolato piastrine umane possono essere utilizzati come accessibili ex vivo modello per studiare adattamenti metabolici in risposta al complesso I inibitore rotenone. Questo approccio impiega tracing isotopica e relativa quantificazione dal liquido spettrometria cromatografia massa e può essere applicato ad una varietà di disegni di studio.
Introduction
Metabolismo mitocondriale disfunzionale è stata implicata in una vasta gamma di malattie, tra cui neurodegenerazione, il cancro, le malattie cardiovascolari e 30. Come tale, grande sforzo è stato posto sulla caratterizzazione difetti metabolici che contribuiscono alla patogenesi della malattia. Spettrometria di massa cromatografia liquida-tandem (LC-MS / MS) è considerata il gold standard per la quantificazione di analiti da matrici biologiche complesse ed è spesso impiegato per studi metabolici 8. Tuttavia, come è spesso il caso con studi biomedici, raggiungendo un modello accessibile e ben definito rilevante per la malattia umana è una sfida.
Molti studi impiegano trasformate modelli cellulari per sondare l'impatto di xenobiotici o anomalie genetiche sul metabolismo cellulare 7,9. La riprogrammazione metabolica che si verifica nelle cellule tumorali può introdurre confusione fattori di 21 e non sono quindi l'ideale. Questi problemi possono essere circumvented con modelli cellulari primarie, anche se l'ottenimento di biomassa sufficiente per le analisi del metabolismo può essere impegnativo. Inoltre, l'impatto di elevate quantità di antibiotici utilizzati in cultura è stato evidenziato come potenzialmente confondenti studi mitocondriali 16.
Piastrine umane permettersi l'opportunità di utilizzare un modello di cellula primaria con sufficiente contenuto mitocondriale per studi metabolici 5,22,27,32. Innanzitutto, le piastrine possono essere facilmente acquisite, attraverso il sangue trae da donatori individuali o in grandi volumi da banche del sangue, e quindi fornire un modello in cui fattori esterni possono essere facilmente controllati. In secondo luogo, a causa delle loro piccole dimensioni, le piastrine possono essere facilmente isolati da altri componenti del sangue con il lavoro preparatorio minima in laboratori attrezzati minimamente 5. Da segnalare, le piastrine non contengono nuclei e possono quindi essere utilizzati per studiare le alterazioni al metabolismo indipendentemente dalla regolazione trascrizionale. Qui mostriamo cheoltre alla quantificazione relativa di (CoA) tioesteri acil-coenzima A, il sistema piastrinico isolato può essere utilizzato per esaminare il metabolismo carbonio. In particolare, si segnala l'utilizzo di marcatura metabolica con isotopi stabili (non radioattivo) marcato [13 C 6] Glucosio e [13 C 16] -palmitate per sondare incorporazione della [13 C] -label nella importante acetil metabolita CoA via glicolisi o ossidazione degli acidi grassi. Questo fornisce una piattaforma potente, generalizzabile, e versatile grazie alla massiccia partecipazione di specie acil-CoA in vie biochimiche 13,24 e la trattabilità di questo sistema per testare altre variabili, come ad esempio l'inibizione del complesso con rotenone 3,33. Oltre alle informazioni fornite nel protocollo di seguito, una descrizione dettagliata dei metodi utilizzati per l'etichettatura degli isotopi e per le analisi LC-MS-based può essere trovato in Basu e Blair 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etica Dichiarazione: Tutti i protocolli in materia di trattamento dei campioni umani seguono le linee guida del comitato di etica della ricerca human L'Università della Pennsylvania di.
1. Preparazione di buffer e 100x archivio Solutions
- Preparare 1 L di tampone di base di Tyrode. Unire 8,123 g di NaCl, 1.428 g NaHCO 3, 0,466 g CaCl 2 ∙ 2 H 2 O, 0,224 g KCl, e 0,095 g MgCl 2. Regolare il volume totale a 1 L con DDH 2 O. Filtro sterilizzare tampone di base Tyrode.
- Preparare soluzioni 100x di glucosio e acido palmitico. Per 100x soluzioni di riserva di glucosio, sciogliere 100 mg di glucosio o [13 C 6]-glucosio in 1 ml di DDH 2 O. Per soluzioni palmitato 100x, sciogliere 2,56 mg di acido palmitico o 2,72 mg di [13 C 16] acido -palmitic in 1 ml di etanolo. Filtro sterilizzare 100x azionari soluzioni.
- Preparare Buffer proprio il caso Enriched Tyrode
- Per gli studi di etichettatura di glucosio, aggiungere 1 ml di 100x [13 C 6] Glucosio soluzione madre e 1 ml di 100x palmitico acido soluzione madre a 98 ml di tampone di base di Tyrode.
- Per gli studi di etichettatura acido palmitico, aggiungere 1 ml di 100x di glucosio soluzione madre e 1 ml di [13 C 16] -palmitic acido soluzione madre a 98 ml di tampone di base di Tyrode.
- Preparare una soluzione madre di 10 mm rotenone in dimetilsolfossido (DMSO).
- Per gli studi di dose-risposta non-etichettatura, procedere alla 1.4.3. Per gli studi di etichettatura in una singola dose, procedere alla 1.4.5.
- Eseguire una diluizione seriale del 10 mM rotenone magazzino in DMSO per ottenere soluzioni con concentrazioni che vanno da rotenone 1 nM a 100 micron. Questi sono 100x magazzinoS.
- Aggiungere 50 ml di ogni stock a 5 ml di tampone di base Tyrode + glucosio + acido palmitico da 1.3.1 per preparare le soluzioni con concentrazioni che vanno da rotenone 22:00 a 1 micron. In alternativa, aggiungere 50 ml di DMSO a servire come un controllo del veicolo. Procedere alla 2.1.
- Diluire il 10 soluzione madre mM 1.000 volte in DMSO per ottenere una soluzione di lavoro 10 micron.
- Aggiungere 50 ml di questo stock a 5 ml di tampone di base di Tyrode + [13 C 6]-glucosio + acido palmitico da 1.3.2 e la base del buffer + glucosio + [13 C 16] acido -palmitic da 1.3.3 Tyrode. La concentrazione finale è 100 nM rotenone. In alternativa, aggiungere 50 ml di DMSO a ciascun buffer per servire come comandi del veicolo.
2. Isolamento delle piastrine
Nota: Questo metodo è suscettibile di piastrine derivate da sangue intero o da sacchetti piastrine. I dati di esempio contenuti nel presente documento è stato preparatoutilizzando piastrine derivate da sacchetti piastrine. Si prega di consultare Basu et al. 5 per maggiori dettagli per quanto riguarda utilizzando piastrine isolate da sangue intero.
- Isolamento delle piastrine da sangue intero
NOTA: Se isolare le piastrine da un sacchetto di piastrine, procedere alla 2.2.1.- Centrifugare il sangue intero a 175 x g per 15 minuti senza freni.
- Trasferire 1 ml di plasma ricco di piastrine superiore (PRP) strato in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga.
- Centrifugare il PRP a 400 x g per 5 min.
- Aspirare il surnatante e procedere al punto 3.1 o 3.2.
- Isolamento piastrine da una borsa di piastrine
- Trasferire 1 ml della sospensione di piastrine in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga.
- Centrifugare la sospensione a 400 xg per 5 min.
- Aspirare il surnatante e procedere al punto 3.1. o 3.2.
3. Esecuzione di un esperimento
- Per determinare l'effetto di xenobioticitrattamento (ad esempio, rotenone) sui livelli di un metabolita di interesse (ad esempio, acetil-CoA), procedere alla 3.1.1. Per determinare l'effetto di uno xenobiotico (ad es., Rotenone) sull'incorporazione di un precursore metabolico in un metabolita valle di interesse, procedere alla 3.2.1.
- Utilizzando non meno di tre repliche biologiche per ogni condizione, risospendere piastrinica pellet dal punto 2.1.4 o 2.2.3 in 1 ml di ciascuna soluzione dal punto 1.4.4.
- Incubare piastrine risospese in un incubatore CO 2 con camicia d'acqua insieme al 95% di umidità, 5% di CO 2 e 37 ° C per 1 ora. Passare al punto 4.1
Nota: Qui si descrive un esperimento di risposta alla dose. In alternativa, un esperimento decorso potrebbe essere fatto in cui la dose è stato fissato e la lunghezza di incubazione era varia invece.
- Per determinare l'effetto del trattamento xenobiotico sull'incorporazione di un precursore metabolico in un metabolita valle di interesse.
- Ucantare non meno di tre repliche biologiche per ogni condizione, risospendere piastrinica pellet dal punto 2.1.4 o 2.2.3 in 1 ml di ciascuna formulazione del marcato del buffer di Tyrode dal punto 1.4.6.
- Incubare piastrine risospese in un incubatore CO 2 con camicia d'acqua insieme al 95% di umidità, 5% di CO 2 e 37 ° C per 1 ora. Passare al punto 4.1.
4. raffreddamento e CoA Estrazione
- Pellet piastrine per centrifugazione a 3.000 xg per 3 min.
- Aspirare il surnatante.
- piastrine risospendere in 750 microlitri freddo ghiaccio acido tricloroacetico 10% (w / v).
- Aggiungere adeguato standard interno marcati con isotopi stabili. Ad esempio, se l'obiettivo è di confrontare i livelli di specie CoA tutti i campioni, utilizzare 100 ml di una miscela di tioesteri CoA etichettati ottenuti da lieviti come descritto precedentemente stabile isotopi (tecnica SILEC) 29.
- Pulse-ultrasuoni ogni campione di 30 volte con impulsi di 0,5 sec.
- Centrifugare i campioni a 16.000 xg per 10 minuti a 4 ° C.
- Fissare C18 estrazione in fase solida (SPE) colonne di collettore del vuoto.
- Condizionare le colonne con 1 ml di metanolo.
- Equilibrare le colonne con 1 ml DDH 2 O.
- Eseguire campione derivato surnatante (circa 850 microlitri in questo caso) attraverso le colonne.
- Lavare le colonne con acqua 1 ml.
- Caricare 10 ml provette di vetro centrifuga nel collettore del vuoto per raccogliere frazione di eluizione.
- Eluire le colonne di 1 ml di acetato di ammonio 25 mM in metanolo.
- eluato secco sotto azoto.
- Risospendere residui secchi in 50 microlitri 5% (w / v) di acido 5-solfosalicilico e trasferire in fiale HPLC.
Setup 5. HPLC
- Utilizzando il software di controllo per il sistema di HPLC, creare un metodo con condizioni HPLC ottimizzate per gli analiti bersaglio e colonna utilizzata, come elencato nella Tabella 1.
Nota: La colonna di temperature utilizzata per la produzione di questi dati era di 25 ° C ma i parametri specifici varierà per strumento e per quanto riguarda i composti di interesse. Per acil-CoA quantificazione, sono stati riportati diversi metodi di analisi LC-MS, e convalidato per i diversi analiti nelle diverse condizioni di LC 14,19,20. - Lasciare che il HPLC per equilibrare adeguatamente.
Nota: Questo dovrebbe includere sia innesco di solventi prima di collegare una colonna e equilibrazione della colonna in cominciando condizioni solvente per il metodo. Il volume di equilibrio deve seguire le indicazioni del produttore, e la conseguente effluente deve essere deviato da perdere.
Nota: Consultare Basu e Blair 5 per maggiori dettagli per quanto riguarda le impostazioni HPLC.
Setup 6. spettrometro di massa
- Utilizzando il software di controllo per lo spettrometro di massa, creare un metodo mirato per la rilevazione di forme ionizzate dei composti di interesse. I parametri sono presentatiin Tabella 2.
Nota: stabili analoghi isotopici di questi composti devono essere utilizzati per determinare se un modo positivo o negativo dà sensibilità superiore e di ottimizzare la sorgente e la condizione ottica di rilevazione. Il tempo di rilevamento totale del metodo spettrometro di massa deve corrispondere al componente temporale del metodo HPLC associato.
Nota: Come precedentemente accennato, sono stati riportati diversi metodi di analisi acil-CoA, compresi positivi e negativi 14 ionizzazione 15 modalità e l'uso di una massa spettrometro ad alta risoluzione 17, piuttosto che uno strumento triplo quadrupolo 28. - Pulire e calibrare lo strumento, stabilire uno spruzzo stabile nello spettrofotometro, e lasciare il tempo per la soluzione di taratura per dissipare adeguatamente dalla sorgente e ottica secondo le istruzioni del produttore.
- Impostare una sequenza per tutti i campioni con il software di controllo spettrometro di massa. include il nome o identificatori numerici e indicare il metodo di volume di iniezione e strumento appropriato. Eseguire un vuoto prima del primo campione, ed eseguire altri spazi e lavaggi tra i campioni come necessario per ridurre di riporto o di matrice effetti.
Nota: Un metodo di lavorazione per il picco di integrazione dei cromatogrammi liquidi analiti selezionati 'spesso può essere impostata all'interno di questa sequenza o successivamente applicato nel trattamento dei dati. - Iniziare la sequenza e monitorare il sistema spettrometro e HPLC di massa periodicamente per problemi tra cui variazioni di pressione o di guasti del sistema e la perdita di intensità del segnale durante la corsa.
Nota: Gravi problemi o guasti run persistenti possono richiedere l'arresto della corsa e spurgo e ri-equilibrante del sistema HPLC così come la pulizia e la taratura dello spettrometro di massa. Consultare Basu e Blair 5 per ulteriori dettagli riguardanti le impostazioni ei dati MS trattamento.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Per dimostrare l'utilità di questa metodologia abbiamo riprodotto la generalizzabilità dei precedentemente descritto adattamento metabolico compensativo esposizione al rotenone. Questo risultato è stato precedentemente identificato in modelli di coltura cellulare e questa indagine aveva lo scopo di verificare se questo cambiamento metabolico si verifica anche nelle piastrine, che sono anuclear e non incline agli stessi artefatti sperimentali come coltura cellulare. Questo lavoro è stato eseguito con 6 giorni di età piastrine dalla Penn Trauma Center, che era stato ritenuto troppo vecchio per infusione umana, anche se hanno mantenuto la loro attività metabolica. L'isolamento è stato effettuato come illustrato in Figura 1. Il flusso totale può essere scalata facilmente da un numero limitato di campioni clinici o condizioni sperimentali di base piastra a 96 pozzetti portate maggiori con la disponibilità di piastrine che non sono più utili per infusione in pazienti.
(Figura 2). In particolare abbiamo osservato in cellule SH-SY5Y una diminuzione dose dipendente in succinil-CoA (IC 50 = 25 Nm), con un contemporaneo aumento β-idrossibutirril (HB) -CoA (ED 50 = 75 Nm), mentre i livelli di acetil-CoA sono rimasti invariati 1. La nostra analisi delle piastrine umane trattate con rotenone rivelato risultati molto consistenti (Figura 3). Questo fornisce un unico insieme di dati sperimentali in piastrine umane che punta alla dipendenza mitocondriale della risposta al rotenone. Questa risposta non può essere mediata attraverso meccanismi trascrizionali convenzionali perché le piastrine mancanza di nuclei.
quantificazione relativa fornisce una dimensione delle informazioni metaboliche, maetichettatura isotopica fornisce una visione complementare prezioso nell'attività di specifiche vie metaboliche. Questo è fondamentale in studi metabolici perché molteplici vie possono convergere attraverso un unico intermedio. Per dimostrare questo punto, le piastrine sono stati trattati con 100 nM rotenone o DMSO in presenza sia di [13 C 6]-glucosio o [13 C 16] -palmitate per 1 ora. Co-eluizione di isotopologhi di acil-CoA dalla colonna LC consente determinazione definitiva della composizione isotopica di analiti (Figura 4). Dopo correzione per l'abbondanza naturale di isotopi pesanti come descritto 11 questo approccio ha mostrato una significativa diminuzione della produzione glicolitico di acetil-CoA nelle piastrine mentre incorporazione palmitato è stato aumentato significativamente (Figura 5). Questi risultati sono simili a quelli osservati in precedenza nel modello di coltura cellulare SH-SY5Y 33 e così forniscono ulteriori prove tcappello questo percorso potrebbe essere importante in vivo.
| Tempo (min) | 0 | 0 | 1.5 | 5 | 12 | 17 | 18 | 23 | 25 | 30 |
| Flusso totale (ml / min) | 200 | 200 | 200 | 200 | 200 | 250 | 200 | 200 | 200 | 200 |
| % A | 98 | 98 | 98 | 80 | 0 | 0 | 0 | 0 | 98 | 98 |
| % B | 2 | 2 | 2 | 20 | 100 | 100 | 0 | 0 | 2 | 2 |
| % C | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 0 | 100 | 100 | 0 | 0 |
. Tabella 1. cromatografia liquida Gradient solvente A: 5 mm acetato di ammonio in acqua, solvente B: 5 mm acetato di ammonio in 95: 5 ACN / Acqua solvente C: 80:20 ACN / Acqua 0,1% di acido formico
| Parametro | Valore |
| Spray Tensione (V) | 4.000 |
| Vaporizzatore Temperatura (° C) | 400 |
| Pressione guaina del gas | 35 |
| Ausiliario pressione del gas | 10 |
| Capillare Temperatura (° C) | 350 |
| Tubo Lens Offset (V) | 100 |
Tabella 2. massa Spettrometro parametri.
Figura 1. generalizzata del flusso di lavoro per la preparazione del campione e analisi. Questo schema illustra il flusso di lavoro per l'isolamento delle piastrine e di trattamento per studi metabolici mediante analisi LC-MS / MS. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Schema metabolica del metabolismo glucidico e lipidico e la catena di trasporto degli elettroni. Acetil-CoA possono essere sintetizzati da glucosio o palmitato. Rotenone inibisce la corretta spola di elettroni da mitocondriale complesso I.TPS: //www.jove.com/files/ftp_upload/53941/53941fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. La determinazione quantitativa di CoA-tioesteri in risposta al trattamento Rotenone. Rotenone non influenza i livelli di acetil-CoA, ma induce una riduzione dose-dipendente in succinil-CoA (IC50 = 4.1 nM) con un concomitante aumento βHB-CoA (ED 50 = 4.2 nM). barre di errore rappresentano l'errore standard della media (SEM); n = 4. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Rappresentante Cromatogrammi Visualizzazione isotopica etichettatura da palmitatoin acetil-CoA. trattamento rotenone aumenta l'incorporazione di palmitato in acetil-CoA. Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Costituzione relativa di [13 C 6]-glucosio o [13 C 16] -palmitate in trattamento acetil-CoA. Rotenone diminuisce l'incorporazione di glucosio in acetil-CoA e aumenta palmitato incorporazione. Le barre di errore rappresentano SEM; n = 4. Gli asterischi indicano p <(spaiato test t) 0.05. Cliccate quiper visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Qui abbiamo dimostrato l'utilità delle piastrine isolate come piattaforma per lo studio del metabolismo mitocondriale perturbato. In particolare, abbiamo caratterizzato adattamento metabolico in risposta alla inibizione del complesso I da rotenone.
Il presente studio ha esteso risultati precedentemente segnalati sul ruolo di inibizione del complesso da rotenone in linee cellulari di piastrine umane. È importante sottolineare che questo ha rivelato che la formazione delle piastrine rotenone anche inibito succinil-CoA, stimolato un aumento delle piastrine βHB-CoA e non ha avuto effetto sui livelli di piastrine di acetil-CoA.
Grande attenzione deve essere presa per assicurare la validità e la riproducibilità di qualsiasi analisi di questo tipo. Se le piastrine devono essere isolati da sangue intero, l'isolamento deve procedere esattamente come sopra descritto al fine di prevenire la contaminazione dei linfociti e l'attivazione piastrinica, con particolare attenzione dedicata lasciando il buffy coat contenente i linfociti undisperturbata. Affinché le curve dose-risposta siano significativi, diluizioni seriali devono essere eseguite con precisione, con miscelazione per omogeneità ad ogni passo. Dopo la risospensione delle piastrine, condizioni di incubazione possono essere modificati da quelli indicati sopra, ma devono essere rigorosamente standardizzati tra i gruppi di trattamento per consentire confronti significativi da effettuare. Forse il passo più importante in ogni / analisi MS basata LC quantitativa è l'uso di stabili-isotopi standard interni marcati.
L'uso di standard interni è fondamentale in questo contesto perché protegge contro i potenziali confondenti "effetti di batch", come l'efficienza di estrazione variabile e stabilità dell'analita tra campioni. L'aggiunta dello standard interno, (di nuovo, mescolando all'omogeneità) prima possibile in un protocollo sperimentale riduce il potenziale di artefatti. Infine, come in ogni esperimento, l'uso di più repliche per ogni condizione sperimentale è essenziale, e se possibile, Calcoli di potenza sulla base di esperimenti pilota possono essere utili.
Le piastrine possono essere rapidamente isolati da singoli o aggregati fonti 5,27,32, rendendo questo approccio suscettibili di una vasta gamma di applicazioni. E 'importante notare che la capacità di effettuare studi che coinvolgono sia quantificazione relativa e etichettatura isotopica consente una caratterizzazione più completa di un sistema metabolico. Attualmente, questo richiede due test separati, che aumenta la domanda di biomassa necessaria per l'esperimento. Per questa ragione, le piastrine, che possono essere facilmente ottenuti in gran numero, sono più efficienti di altri modelli di coltura cellulare.
Tuttavia, nonostante i numerosi vantaggi conferiti mediante l'uso di piastrine, ci sono svantaggi. Innanzitutto, è necessario prestare attenzione nella selezione di donatori umani perché ci sono molti disturbi che colpiscono piastrinica fisiologia 25. Inoltre, l'attivazione piastrinica nel corso di campionepreparazione e l'analisi è un potenziale variabile di confusione in qualsiasi dosaggio piastrine-based. Per queste ragioni, la valutazione contemporanea di marcatori di attivazione piastrinica mediante ELISA 26, citometria a flusso 1, o saggi, come il test 34 aggregometria trasmissione della luce (LTA) potrebbe rivelarsi prudente.
Sebbene il presente studio si è concentrato sull'analisi dei tioesteri acil-CoA, questo approccio può essere facilmente esteso per includere una gamma più ampia di analiti. Approcci metabolomica non mirati stanno fornendo una visione meccanicistica in un array di malattia stati 23. L'applicazione di tali approcci mirati piastrino modelli saranno probabilmente fornirà ulteriori indizi sui meccanismi biochimici sottostanti coinvolti nel metabolismo cellulare disregolato.
Questo approccio può essere facilmente esteso per includere ricerche di altre sostanze chimiche ambientali e farmaci noti per interferire con il metabolismo mitocondriale 6,12,18,31, nonché un sistema per verificare gli effetti di xenobiotici come potenziali modulatori del metabolismo CoA 10. Inoltre, l'approccio generale può essere impiegato per studiare difetti metabolici in malattie genetiche come l'atassia di Friedreich 5,32. Inoltre, nessuno dei suddetti disegni sperimentali potrebbe essere accoppiato con un saggio respirazione funzionale al fine di caratterizzare più robusto lo stato di mitocondri in ogni contesto 2. Così, l'accoppiamento isotopi stabili e l'analisi LC-MS con studi metabolici in piastrine isolate rischia di permettersi nuove opportunità per caratterizzare ulteriormente il metabolismo mitocondriale aberrante.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Noi riconosciamo il sostegno del NIH sovvenzioni P30ES013508 e T32ES019851.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2 * H2O) | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 208337 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| 13C6-Glucose | Sigma-Aldrich | 389374 | |
| Palmitic acid | Cayman | 10006627 | |
| 13C16-Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | 605573 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Trichloro Acetic Acid | Sigma-Aldrich | T6399 | |
| 5-Sulfosalicylic Acid | Sigma-Aldrich | 390275 | |
| Acetonitirle | Fischer Scientific | A996-4 | (optima) |
| Water (H2O) | Fischer Scientific | W7-4 | (optima) |
| Formic acid | Fischer Scientific | 85171 | (optima) |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Ethanol | Fischer Scientific | 04-355-222 | |
| Methanol | Fischer Scientific | A454-4 | (optima) |
| Ammonium Acetate | Fischer Scientific | A639-500 | |
| 2 ml Eppendorf Tubes | BioExpress | C-3229-1 | |
| LC vials (plastic) | Waters | 186002640 | |
| 10 ml Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 73785-10 | |
| Oasis Solid Phase Extraxtion (SPE) Columns | Waters | WAT094225 | |
| Pastuer Pipets | Fischer Scientific | 13-678-200 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| CO2 Water-Jacketed Incubator | Nuaire | AutoFlow NU-8500 | |
| Triple Quadropole Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Finnigan TSQ Quantum | |
| HPLC | Thermo Scientific | Dionex Ultimate 3000 | |
| Source | Thermo Scientific | HESI II | |
| HPLC Column | Phenomenex | Luna C18 | 3 μm particle size, 200 mm x 2 mm |
References
- Ault, K. A. The clinical utility of flow cytometry in the study of platelets. Semin. Hematol. 38 (2), 160-168 (2001).
- Avila, C., et al. Platelet mitochondrial dysfunction is evident in type 2 diabetes in association with modifications of mitochondrial anti-oxidant stress proteins. Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 120 (4), 248-251 (2012).
- Basu, S. S., Blair, I. A. Rotenone-mediated changes in intracellular coenzyme A thioester levels: implications for mitochondrial dysfunction. Chem. Res. Toxicol. 24 (10), 1630-1632 (2011).
- Basu, S. S., Blair, I. A. SILEC: a protocol for generating and using isotopically labeled coenzyme A mass spectrometry standards. Nat. Protoc. 7 (1), 1-12 (2012).
- Basu, S. S., Deutsch, E. C., Schmaier, A. A., Lynch, D. R., Blair, I. A. Human platelets as a platform to monitor metabolic biomarkers using stable isotopes and LC-MS. Bioanalysis. 5 (24), 3009-3021 (2013).
- Berson, A., et al. Mechanisms for experimental buprenorphine hepatotoxicity: major role of mitochondrial dysfunction versus metabolic activation. J. Hepatol. 34 (2), 261-269 (2001).
- Castell, J. V., Jover, R., Martinez-Jimenez, C. P., Gomez-Lechon, M. J. Hepatocyte cell lines: their use, scope and limitations in drug metabolism studies. Expert. Opin. Drug Metab Toxicol. 2 (2), 183-212 (2006).
- Ciccimaro, E., Blair, I. A. Stable-isotope dilution LC-MS for quantitative biomarker analysis. Bioanalysis. 2 (2), 311-341 (2010).
- Dang, C. V. Links between metabolism and cancer. Genes Dev. 26 (9), 877-890 (2012).
- Darnell, M., Weidolf, L. Metabolism of xenobiotic carboxylic acids: focus on coenzyme A conjugation, reactivity, and interference with lipid metabolism. Chem. Res. Toxicol. 26 (8), 1139-1155 (2013).
- Des Rosiers, C., Fernandez, C. A., David, F., Brunengraber, H. Reversibility of the mitochondrial isocitrate dehydrogenase reaction in the perfused rat liver. Evidence from isotopomer analysis of citric acid cycle intermediates. J. Biol. Chem. 269 (44), 27179-27182 (1994).
- Ellis, J. K., et al. Metabolic profiling detects early effects of environmental and lifestyle exposure to cadmium in a human population. BMC. Med. 10, 61 (2012).
- Grevengoed, T. J., Klett, E. L., Coleman, R. A. Acyl-CoA metabolism and partitioning. Annu. Rev. Nutr. 34, 1-30 (2014).
- Haynes, C. A., et al. Quantitation of fatty acyl-coenzyme As in mammalian cells by liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry. J. Lipid Res. 49 (5), 1113-1125 (2008).
- Ikegawa, S., et al. Characterization of cholyl-adenylate in rat liver microsomes by liquid chromatography/electrospray ionization-mass spectrometry. Anal. Biochem. 266 (1), 125-132 (1999).
- Kalghatgi, S., et al. Bactericidal antibiotics induce mitochondrial dysfunction and oxidative damage in Mammalian cells. Sci. Transl. Med. 5 (192), 192ra85 (2013).
- Liu, X., et al. High-Resolution Metabolomics with Acyl-CoA Profiling Reveals Widespread Remodeling in Response to Diet. Mol. Cell Proteomics. 14 (6), 1489-1500 (2015).
- Lopez-Gallardo, E., Iceta, R., Iglesias, E., Montoya, J., Ruiz-Pesini, E. OXPHOS toxicogenomics and Parkinson's disease. Mutat. Res. 728 (3), 98-106 (2011).
- Magnes, C., Sinner, F. M., Regittnig, W., Pieber, T. R. LC/MS/MS method for quantitative determination of long-chain fatty acyl-CoAs. Anal. Chem. 77 (9), 2889-2894 (2005).
- Mauriala, T., Herzig, K. H., Heinonen, M., Idziak, J., Auriola, S. Determination of long-chain fatty acid acyl-coenzyme A compounds using liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 808 (2), 263-268 (2004).
- Murphy, T. A., Dang, C. V., Young, J. D. Isotopically nonstationary 13C flux analysis of Myc-induced metabolic reprogramming in B-cells. Metab Eng. 15, 206-217 (2013).
- Paglia, G., et al. Metabolomic analysis of platelets during storage: a comparison between apheresis- and buffy coat-derived platelet concentrates. Transfusion. 55 (2), 301-313 (2015).
- Patti, G. J. Separation strategies for untargeted metabolomics. J. Sep. Sci. 34 (24), 3460-3469 (2011).
- Robishaw, J. D., Neely, J. R. Coenzyme A metabolism. Am. J. Physiol. 248 (1 Pt 1), E1-E9 (1985).
- Rodgers, G. M. Overview of platelet physiology and laboratory evaluation of platelet function. Clin. Obstet. Gynecol. 42 (2), 349-359 (1999).
- Salles, I., et al. Development of a high-throughput ELISA assay for platelet function testing using platelet-rich plasma or whole blood. Thromb. Haemost. 104 (2), 392-401 (2010).
- Snyder, N. W., Basu, S. S., Worth, A. J., Mesaros, C., Blair, I. A. Metabolism of propionic acid to a novel acyl-coenzyme A thioester by mammalian cell lines and platelets. J. Lipid Res. 56 (1), 142-150 (2015).
- Snyder, N. W., Basu, S. S., Zhou, Z., Worth, A. J., Blair, I. A. Stable isotope dilution liquid chromatography/mass spectrometry analysis of cellular and tissue medium- and long-chain acyl-coenzyme A thioesters. Rapid Commun. Mass Spectrom. 28 (16), 1840-1848 (2014).
- Snyder, N. W., et al. Production of stable isotope-labeled acyl-coenzyme A thioesters by yeast stable isotope labeling by essential nutrients in cell culture. Anal. Biochem. 474, 59-65 (2015).
- Wallace, D. C. Mitochondrial diseases in man and mouse. Science. 283 (5407), 1482-1488 (1999).
- Wojtovich, A. P., Brookes, P. S. The complex II inhibitor atpenin A5 protects against cardiac ischemia-reperfusion injury via activation of mitochondrial KATP channels. Basic Res. Cardiol. 104 (2), 121-129 (2009).
- Worth, A. J., et al. Stable isotopes and LC-MS for monitoring metabolic disturbances in Friedreich's ataxia platelets. Bioanalysis. 7 (15), 1843-1855 (2015).
- Worth, A. J., Basu, S. S., Snyder, N. W., Mesaros, C., Blair, I. A. Inhibition of neuronal cell mitochondrial complex I with rotenone increases lipid beta-oxidation, supporting acetyl-coenzyme A levels. J. Biol. Chem. 289 (39), 26895-26903 (2014).
- Zhou, L., Schmaier, A. H. Platelet aggregation testing in platelet-rich plasma: description of procedures with the aim to develop standards in the field. Am. J. Clin. Pathol. 123 (2), 172-183 (2005).
