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LC-MS El análisis de las plaquetas humanas como una plataforma para el estudio del metabolismo mitocondrial

Published: April 4, 2016 doi: 10.3791/53941
* These authors contributed equally

Summary

Aquí mostramos plaquetas humanas aisladas se pueden utilizar como un accesible ex vivo modelo para estudiar adaptaciones metabólicas en respuesta al complejo I inhibidor de la rotenona. Este enfoque emplea trazado isotópico y la cuantificación relativa mediante espectrometría de cromatografía de masa líquida y se puede aplicar a una variedad de diseños de estudio.

Introduction

Metabolismo mitocondrial disfuncional se ha implicado en una amplia gama de enfermedades, incluyendo neurodegeneración, el cáncer y la enfermedad cardiovascular 30. Como tal, un gran esfuerzo se ha colocado en la caracterización de defectos metabólicos que contribuyen a la patogénesis de la enfermedad. Cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS / MS) se considera el estándar de oro para la cuantificación de analitos de matrices biológicas complejas y con frecuencia se emplea para estudios metabólicos 8. Sin embargo, como es a menudo el caso con los estudios biomédicos, la consecución de un modelo accesible y bien definida correspondiente a la enfermedad humana es un desafío.

Muchos estudios emplean modelos celulares transformadas para sondear el impacto de xenobióticos o anomalías genéticas en el metabolismo celular 7,9. La reprogramación metabólica que se produce en las células cancerosas pueden introducir factores de confusión 21 y por lo tanto no son ideales. Estos problemas pueden ser circumvented con modelos celulares primarios, aunque la obtención de biomasa suficiente para los análisis metabólicos puede ser un reto. Por otra parte, el impacto de altas cantidades de antibióticos que se utilizan en la cultura se ha destacado como estudios mitocondriales 16 de confusión potenciales.

Las plaquetas humanas ofrecen la oportunidad de utilizar un modelo celular primario con suficiente contenido mitocondrial para estudios metabólicos 5,22,27,32. En primer lugar, las plaquetas se pueden adquirir fácilmente, a través de la extracción de sangre de donantes individuales, o en grandes volúmenes de bancos de sangre, y por lo tanto proporcionar un modelo en el que factores externos pueden ser controlados fácilmente. En segundo lugar, debido a su pequeño tamaño, las plaquetas pueden ser fácilmente aislados de otros componentes de la sangre con un mínimo de trabajos de preparación en laboratorios incluso mínimamente equipados 5. Es de destacar que las plaquetas no contienen núcleos y por lo tanto se pueden utilizar para estudiar alteraciones en el metabolismo de manera independiente de la regulación transcripcional. Aquí nos muestran queAdemás de la cuantificación relativa de tioésteres de acil-coenzima A (CoA), el sistema de plaquetas aislado se puede utilizar para examinar el metabolismo del carbono. En concreto, el informe de uso de marcaje metabólico con isótopo estable (no radiactivo) marcado con [13 C 6] -glucosa y [13 C 16] palmitato para sondear la incorporación de [13C] -label en el metabolito importante acetil- CoA a través de la glicólisis o de la oxidación de ácidos grasos. Esto proporciona una plataforma de gran alcance, generalizable, y versátil debido a la amplia participación de especies acil-CoA reductasa en las vías bioquímicas 13,24 y la tratabilidad de este sistema para probar otras variables, tales como la inhibición del complejo I con rotenona 3,33. Además de la información proporcionada en el Protocolo a continuación, una descripción detallada de los métodos utilizados para el etiquetado de isótopos y para los análisis basados ​​en CL-EM se puede encontrar en Basu y Blair 4.

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Protocol

Ética Declaración: Todos los protocolos relativos al tratamiento de muestras humanas siguen las directrices de la Universidad de Pennsylvania comité de ética de investigación humana.

1. Preparación de tampones y 100x Soluciones madre

  1. Preparar 1 L de tampón de base de Tyrode. Combinar 8.123 g de NaCl, 1,428 g de NaHCO3, 0,466 g de CaCl2 ∙ 2 H2O, 0,224 g de KCl, y 0,095 g de MgCl 2. Ajustar el volumen total de 1 litro con ddH2O Esterilizar por filtración búfer base de Tyrode.
  2. Preparar soluciones madre 100x de la glucosa y el ácido palmítico. Para 100x soluciones madre de glucosa, se disuelven 100 mg de glucosa o [13 C 6] -glucosa en 1 ml de ddH 2 O. Para soluciones palmitato de 100x, se disuelven 2,56 mg de ácido palmítico o 2,72 mg de ácido -palmitic [13 C 16] en 1 ml de etanol. Esterilizar por filtración 100x soluciones madre.
  3. Los tampones de preparar apropiado Enriquecido Tyrode Para los estudios no etiquetado, añadir 1 ml de solución de glucosa 100x y 100x 1 ml de solución madre de ácido palmítico a 98 ml de tampón de base de Tyrode.
  4. Para los estudios de etiquetado de glucosa, añadir 1 ml de 100x [13 C 6] solución madre-glucosa y 1 ml de solución madre de ácido 100x palmítico a 98 ml de tampón de base de Tyrode.
  5. Para los estudios de etiquetado ácido palmítico, añadir 1 ml de solución madre 100x glucosa y 1 ml de [13 C 16] solución madre de ácido -palmitic a 98 ml de tampón de base de Tyrode.
  • Preparar soluciones para el tratamiento rotenona
    1. Preparar una solución de 10 mM social de rotenona en dimetilsulfóxido (DMSO).
    2. Para los estudios de dosis-respuesta no etiquetado, proceder a 1.4.3. Para los estudios de etiquetado en una sola dosis, continúe con el 1.4.5.
    3. Realizar una dilución en serie de la rotenona de stock 10 mM en DMSO para obtener soluciones con concentraciones de rotenona que van de 1 nM a 100 mM. Estos son 100x socials.
    4. Añadir 50 l de cada población a 5 ml de tampón de base de Tyrode + glucosa + ácido palmítico de 1.3.1 para preparar soluciones con concentraciones de rotenona que varían de 10 pM a 1 mM. Alternativamente, se añaden 50 l de DMSO para servir como un control del vehículo. Proceder a 2,1.
    5. Diluir la solución madre 10 mM 1.000 veces en DMSO para obtener una solución de trabajo de 10 micras.
    6. Añadir 50 l de esta población a 5 ml cada una de búfer base de Tyrode + [13 C 6] -glucosa + ácido palmítico de 1.3.2 y la base de tampón + glucosa + [13 C 16] ácido -palmitic de 1.3.3 de Tyrode. La concentración final es 100 nM rotenona. Alternativamente, se añaden 50 l de DMSO a cada memoria intermedia para servir como controles del vehículo.
  • 2. Aislamiento de plaquetas

    Nota: Este método es susceptible de plaquetas derivadas de todo, ya sea de sangre o de bolsas de plaquetas. Los datos de ejemplo contenidas en este documento se preparóel uso de las plaquetas derivadas de bolsas de plaquetas. Por favor, véase Basu et al. 5 para más detalles sobre el uso de las plaquetas aisladas de la sangre entera.

    1. El aislamiento de plaquetas partir de sangre total
      NOTA: Si el aislamiento de las plaquetas de una bolsa de plaquetas, proceder a 2.2.1.
      1. Centrifugar la sangre entera a 175 x g durante 15 min sin frenos.
      2. Se transfiere 1 ml de la parte superior de plasma rico en plaquetas (PRP) capa a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
      3. Centrifugar el PRP a 400 x g durante 5 min.
      4. Aspirar el sobrenadante y proceda al paso 3.1 o 3.2.
    2. El aislamiento de plaquetas a partir de una bolsa de plaquetas
      1. Transferir 1 ml de la suspensión de plaquetas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
      2. Centrifugar la suspensión a 400 xg durante 5 min.
      3. Aspirar el sobrenadante y proceda al paso 3.1. o 3.2.

    3. Realización de un experimento

    1. Para determinar el efecto de xenobióticostratamiento (por ejemplo, la rotenona) en los niveles de un metabolito de interés (por ejemplo, acetil-CoA), proceda a 3.1.1. Para determinar el efecto de un xenobiótico (por ejemplo., Rotenona) en la incorporación de un precursor metabólico en un metabolito aguas abajo de interés, proceder a 3.2.1.
      1. El uso de no menos de tres repeticiones biológica para cada condición, resuspender sedimento de plaquetas de la etapa 2.1.4 o 2.2.3 en 1 ml de cada solución de la etapa 1.4.4.
      2. Se incuban las plaquetas se resuspendieron en un incubador de CO2 con camisa de agua ajustado a 95% de humedad, 5% de CO2 y 37 ° C durante 1 hora. Continúe con el paso 4.1
        Nota: Aquí se describe un experimento de respuesta a la dosis. Alternativamente, un experimento de transcurso de tiempo se podría hacer en el que la dosis se fijó y la duración de la incubación se varió en su lugar.
    2. Para determinar el efecto del tratamiento de xenobióticos en la incorporación de un precursor metabólico en un metabolito aguas abajo de interés.
      1. Tcantar no menos de tres repeticiones biológica para cada condición, volver a suspender sedimento de plaquetas de la etapa 2.1.4 o 2.2.3 en 1 ml de cada formulación de tampón de Tyrode marcado desde el paso 1.4.6.
      2. Se incuban las plaquetas se resuspendieron en un incubador de CO2 con camisa de agua ajustado a 95% de humedad, 5% de CO2 y 37 ° C durante 1 hora. Continúe en el paso 4.1.

    4. La extinción y extracción CoA

    1. Se precipitan las plaquetas por centrifugación a 3000 xg durante 3 min.
    2. Aspirar el sobrenadante.
    3. Volver a suspender las plaquetas en 750 l de hielo ácido tricloroacético al 10% frío (w / v).
    4. Añadir estándar interno marcado isotópicamente estable apropiado. Por ejemplo, si el objetivo es comparar los niveles de especies CoA a través de muestras, utilice 100 l de una mezcla de isótopos estables tioésteres CoA marcados obtenidos a partir de la levadura como se describe anteriormente (técnica SILEC) 29.
    5. Pulse-sonicado cada muestra 30 veces con pulsos de 0,5 seg.
    6. Centrifugar las muestras a 16.000 xg durante 10 min a 4 ° C.
    7. Colocar las columnas de extracción en fase sólida C18 (SPE) para colector de vacío.
    8. Acondicionar las columnas con metanol 1 ml.
    9. Equilibrar las columnas con 1 ml de ddH2O
    10. Ejecutar sobrenadante derivado de muestra (aproximadamente 850 l en este caso) a través de las columnas.
    11. Se lavan las columnas con 1 ml de agua.
    12. Cargar 10 ml tubos de centrífuga de vidrio en el colector de vacío para recoger la fracción de elución.
    13. Eluir las columnas con 1 ml de acetato de amonio 25 mM en metanol.
    14. eluato seca bajo gas nitrógeno.
    15. Resuspender residuos secos en 50 l 5% (w / v) de ácido 5-sulfosalicílico y transferir a viales de HPLC.

    5. Configuración de HPLC

    1. Usando el software de control para el sistema de HPLC, crear un método con condiciones de HPLC optimizados para los analitos objetivo y la columna utilizada, tal como aparece en la Tabla 1.
      Nota: La columna de temperature utilizado para la generación de estos datos fue 25 ° C, pero los parámetros específicos variará según el instrumento y con respecto a los compuestos de interés. Para acil-CoA cuantificación, se ha informado de varios métodos de análisis LC-MS, y validado para diferentes analitos en diferentes condiciones de LC 14,19,20.
    2. Deje que la HPLC se equilibre adecuadamente.
      Nota: Este debe incluir tanto el cebado de disolventes antes de conectar una columna y equilibrado de la columna en las condiciones de disolvente de partida para el método. El volumen de equilibrio debe seguir las instrucciones del fabricante, y el efluente resultante debe ser desviado a perder.
      Nota: Consulte a Basu y Blair 5 para más detalles sobre la configuración de HPLC.

    6. Configuración del Espectrómetro de Masas

    1. Usando el software de control para el espectrómetro de masas, crear un método objetivo para la detección de formas ionizadas de los compuestos de interés. Parámetros se presentanen la Tabla 2.
      Nota: análogos de isótopos estables de estos compuestos deben ser utilizados para determinar si un modo positivo o negativo da una sensibilidad superior y para optimizar la fuente y la condición óptica para su detección. El tiempo de detección total del método espectrómetro de masas debe corresponder a la componente de tiempo del método de HPLC asociado.
      Nota: Como se ha mencionado anteriormente, se han descrito varios métodos de análisis de acil-CoA, incluyendo positivas 14 y negativos de ionización 15 modos y el uso de un espectrómetro de masas de alta resolución 17 en lugar de un instrumento de triple cuadrupolo 28.
    2. Limpiar y calibrar el instrumento, establecer una pulverización estable en el espectrómetro, y dar tiempo a la solución de calibración para disipar adecuadamente de la fuente y la óptica de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    3. Configurar una secuencia para todas las muestras con el software de control espectrómetro de masas. includes el nombre o identificadores numéricos e indicar el método de volumen de inyección y el instrumento apropiado. Prepare un blanco antes de la primera muestra, y ejecutar otros espacios en blanco y lavados entre las muestras según sea necesario para mitigar los efectos de matriz o de arrastre.
      Nota: Un método de tratamiento para la integración de los picos de los cromatogramas líquidos analitos seleccionados 'a menudo se puede ajustar dentro de esta secuencia o posteriormente aplicado en el procesamiento de datos.
    4. Comience la secuencia y supervisar el sistema de espectrómetro de masas y HPLC periódicamente de problemas, incluyendo fluctuaciones de presión o fallos del sistema y la pérdida de intensidad de la señal durante la carrera.
      Nota: Los problemas severos o fallos de ejecución persistentes pueden requerir detener la carrera y las purgas y volver a equilibrar el sistema HPLC, así como la limpieza y calibración del espectrómetro de masas. Consultar Basu y Blair 5 para más detalles sobre la configuración y el procesamiento de datos MS.

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    Representative Results

    Para demostrar la utilidad de esta metodología hemos reproducido la generalización de la adaptación metabólica compensatoria se ha descrito previamente como resultado de la exposición a la rotenona. Este hallazgo fue identificado previamente en modelos de cultivo celular y esta investigación tenía por objeto poner a prueba si este cambio metabólico también se produce en las plaquetas, que son anuclear y no es propenso a los mismos artefactos experimentales como cultivo celular. Este trabajo se realizó con las plaquetas 6 días de edad, desde el Centro de Trauma de Penn, que había sido considerado demasiado viejo para perfusión humana, a pesar de que conservan su actividad metabólica. El aislamiento se realizó como se muestra en la Figura 1. El flujo de trabajo total puede escalarse fácilmente a partir de un número limitado de muestras clínicas o condiciones experimentales para mayor rendimiento basado placa de 96 pocillos con la disponibilidad de las plaquetas que ya no son útiles para la infusión en pacientes.

    (Figura 2). Específicamente hemos observado en las células SH-SY5Y una disminución dependiente de la dosis en la succinil-CoA (IC 50 = 25 nM) con un aumento simultáneo de la β-hidroxibutiril (HB) -CoA (ED 50 = 75 nM), mientras que los niveles de acetil-CoA reductasa se mantuvieron sin cambios 1. Nuestro análisis de las plaquetas humanas tratadas con rotenona reveló resultados altamente consistentes (Figura 3). Esto proporciona un conjunto único de datos experimentales en plaquetas humanas que apuntan a la dependencia mitocondrial de la respuesta a la rotenona. Esta respuesta no puede ser mediada a través de mecanismos transcripcionales convencionales porque las plaquetas carecen de núcleos.

    Cuantificación relativa proporciona una dimensión de la información metabólica, peromarcaje isotópico proporciona una visión complementaria de gran valor en la actividad de las vías metabólicas específicas. Esto es crítico en estudios metabólicos porque múltiples vías pueden converger a través de un único intermedio. Para demostrar este punto, las plaquetas se trataron con 100 nM rotenona o DMSO en presencia de cualquiera de [13 C 6] -glucosa o [13 C 16] palmitato para 1 hr. Co-elución de isotopólogos de acil-CoA de la columna de LC permite la determinación definitiva de la composición isotópica de los analitos (Figura 4). Después de la corrección para la abundancia natural de isótopos pesados ​​como se describe 11 este enfoque mostró una disminución significativa en la producción glicolítica de acetil-CoA en las plaquetas, mientras que la incorporación de palmitato se aumentó significativamente (Figura 5). Estos hallazgos son similares a los observados previamente en el modelo de cultivo celular SH-SY5Y 33 y así proporcionan evidencia adicional tsombrero esta vía podría ser importante in vivo.

    Tiempo (min) 0 0 15 5 12 17 18 23 25 30
    Total de Flujo (l / min) 200 200 200 200 200 250 200 200 200 200
    % UN 98 98 98 80 0 0 0 0 98 98
    % B 2 2 2 20 100 100 0 0 2 2
    % C 0 0 0 0 0 0 100 100 0 0

    . Tabla 1. Cromatografía Líquida de gradiente de disolvente A: 5 mM de acetato de amonio en agua, disolvente B: 5 mM de acetato de amonio en 95: 5 ACN / agua Solvente C: 80:20 ACN / agua al 0,1% de ácido fórmico

    Parámetro Valor
    Pulverizar Voltaje (V) 4.000
    Vaporizador de temperatura (° C) 400
    La presión de la envoltura de gas 35
    Presión de gas auxiliar 10
    Capilar de temperatura (° C) 350
    Lente tubo de compensación (V) 100

    Tabla 2. Parámetros espectrómetro de masas.

    Figura 1
    Figura 1. Generalizado de flujo de trabajo para la preparación de muestras y análisis. Este esquema representa el flujo de trabajo para el aislamiento de plaquetas y el tratamiento para los estudios metabólicos mediante análisis LC-MS / MS. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Figura 2
    Figura 2. Esquema metabólico de la glucosa y el metabolismo lipídico y la cadena de trans. Acetil-CoA se pueden sintetizar a partir de glucosa o palmitato. Rotenona inhibe la shuttling adecuada de electrones por I. complejo mitocondrialTPS: //www.jove.com/files/ftp_upload/53941/53941fig2large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    figura 3
    Figura 3. La cuantificación de CoA-tioésteres en respuesta al tratamiento rotenona. Rotenona no afecta los niveles de acetil-CoA reductasa, pero induce una disminución dependiente de la dosis en succinil-CoA (IC 50 = 4,1 nM) con un aumento concomitante en βHB-CoA (ED 50 = 4,2 nM). Las barras de error representan el error estándar de la media (SEM); n = 4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Figura 4
    Figura 4. Representante cromatogramas Mostrando isotópica de etiquetado de palmitatoen acetil-CoA. rotenona tratamiento aumenta la incorporación de palmitato en acetil-CoA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Figura 5
    Figura 5. La incorporación relativa de [13 C 6] -glucosa o [13 C 16] palmitato en el tratamiento de acetil-CoA. Rotenona disminuye la incorporación de glucosa en acetil-CoA y aumenta la incorporación de palmitato. Las barras de error representan el SEM; n = 4. Los asteriscos indican p <(sin pareja prueba t de Student) 0.05. Por favor, haga clic aquípara ver una versión más grande de esta figura.

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    Discussion

    Aquí hemos demostrado la utilidad de plaquetas aisladas como una plataforma para el estudio del metabolismo mitocondrial perturbado. En concreto, hemos caracterizado adaptación metabólica en respuesta a la inhibición del complejo I de la rotenona.

    El presente estudio se ha extendido hallazgos presentados con anterioridad sobre el papel de la inhibición del complejo I de la rotenona en líneas celulares a las plaquetas humanas. Es importante destacar que esto se ha puesto de manifiesto que la formación de la rotenona plaquetas también inhibió la succinil-CoA, estimulado un aumento en las plaquetas βHB-CoA y no tuvo efecto sobre los niveles de plaquetas de la acetil-CoA.

    El gran cuidado se debe tomar para asegurar la validez y reproducibilidad de cualquier análisis de este tipo. Si las plaquetas deben ser aislados de la sangre entera, el aislamiento debe proceder exactamente como se describe anteriormente con el fin de evitar la contaminación de linfocitos y la activación de las plaquetas, con atención especial dedicada a salir de la capa leucocitaria que contiene los linfocitos Undisperturba-. A fin de que las curvas de respuesta de dosis sean significativos, diluciones en serie se deben realizar con precisión, con mezcla hasta la homogeneidad en cada paso. Después de la resuspensión de las plaquetas, las condiciones de incubación pueden ser modificados de los que se detalla más arriba, pero deben ser estandarizados rigurosamente en todos los grupos de tratamiento para permitir comparaciones significativas a realizar. Quizás el paso más importante en cualquier análisis cuantitativo LC / basado en MS es el uso de patrones internos marcados con isótopos estables.

    El uso de estándares internos es fundamental en este contexto, ya que protege contra los efectos potenciales de confusión "por lotes", tales como la eficiencia de extracción de variables y la estabilidad del analito a través de muestras. La adición del patrón interno, (de nuevo, mezclando hasta la homogeneidad) tan pronto como sea posible en un protocolo experimental reduce el potencial de artefactos. Finalmente, como en cualquier experimento, el uso de múltiples repeticiones para cada condición experimental es esencial, y si es posible, Los cálculos de potencia sobre la base de experimentos piloto pueden ser útiles.

    Las plaquetas pueden ser rápidamente aislados de fuentes individuales o agrupados 5,27,32, haciendo de este enfoque susceptible a una amplia gama de aplicaciones. Es importante tener en cuenta que la capacidad para llevar a cabo estudios que implican tanto la cuantificación relativa y el etiquetado isotópico permite una caracterización más completa de un sistema metabólico. Actualmente, esto exige dos ensayos separados, lo que aumenta la demanda de biomasa necesaria para el experimento. Por esta razón, las plaquetas, que se pueden obtener fácilmente en gran número, son más eficientes que otros modelos de cultivo celular.

    Sin embargo, a pesar de las numerosas ventajas conferidas por el uso de plaquetas, hay inconvenientes. En primer lugar, se debe tener cuidado en la selección de donantes humanos, porque hay muchos trastornos que afectan a la fisiología plaquetaria 25. Además, la activación de las plaquetas durante el curso de la muestrapreparación y análisis es una variable de confusión potencial en cualquier ensayo basado en plaquetas. Por estas razones, la evaluación simultánea de los marcadores de activación de las plaquetas por ELISA 26, citometría de flujo 1, o ensayos tales como el ensayo de agregometría transmisión de la luz (LTA) 34 podría ser prudente.

    Aunque el presente estudio se ha centrado en el análisis de los tioésteres de acil-CoA, este enfoque se puede ampliar fácilmente para incluir una gama más amplia de analitos. Enfoques orientados metabolómica están proporcionando una visión mecanicista en un conjunto de 23 estados de la enfermedad. La aplicación de estos enfoques orientados a plaquetarios modelos es probable que arrojar nueva luz sobre los mecanismos bioquímicos subyacentes implicados en el metabolismo celular desordenado.

    Este enfoque se puede ampliar fácilmente para incluir investigaciones de otros productos químicos ambientales y fármacos que interfieren con el metabolismo mitocondrial 6,12,18,31, así como un sistema para probar los efectos de xenobióticos como posibles moduladores del metabolismo de CoA 10. Además, el enfoque general se puede emplear para estudiar los defectos metabólicos en enfermedades genéticas tales como la ataxia de Friedreich 5,32. Por otra parte, ninguno de los diseños experimentales antes mencionadas podría acompañarse de un ensayo de respiración funcional con el fin de caracterizar con mayor fuerza el estado de las mitocondrias en cada contexto 2. Por lo tanto, el acoplamiento de isótopos estables y análisis LC-MS con estudios metabólicos en plaquetas aisladas es probable que pagar nuevas oportunidades para caracterizar mejor el metabolismo mitocondrial aberrante.

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    Disclosures

    Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

    Acknowledgments

    Reconocemos el apoyo de NIH subvenciones P30ES013508 y T32ES019851.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Reagent
    Sodium Chloride (NaCl) Sigma-Aldrich 746398
    Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S5761
    Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2 * H2O) Sigma-Aldrich 223506
    Potassium Chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9541
    Magnesium Chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich 208337
    Glucose Sigma-Aldrich G8270
    13C6-Glucose Sigma-Aldrich 389374
    Palmitic acid Cayman 10006627
    13C16-Palmitic Acid Sigma-Aldrich 605573
    Rotenone Sigma-Aldrich R8875
    Trichloro Acetic Acid Sigma-Aldrich T6399
    5-Sulfosalicylic Acid Sigma-Aldrich 390275
    Acetonitirle Fischer Scientific A996-4 (optima)
    Water (H2O) Fischer Scientific W7-4 (optima)
    Formic acid Fischer Scientific 85171 (optima)
    Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich 472301
    Ethanol Fischer Scientific 04-355-222
    Methanol Fischer Scientific A454-4 (optima)
    Ammonium Acetate Fischer Scientific A639-500
    2 ml Eppendorf Tubes BioExpress C-3229-1
    LC vials (plastic) Waters 186002640
    10 ml Glass Centrifuge Tubes Kimble Chase 73785-10
    Oasis Solid Phase Extraxtion (SPE) Columns Waters WAT094225
    Pastuer Pipets Fischer Scientific 13-678-200
    Name Company Catalog Number Comments
    Equipment
    CO2 Water-Jacketed Incubator Nuaire AutoFlow NU-8500
    Triple Quadropole Mass Spectrometer Thermo Scientific Finnigan TSQ Quantum
    HPLC Thermo Scientific Dionex Ultimate 3000
    Source Thermo Scientific HESI II
    HPLC Column Phenomenex Luna C18 3 μm particle size, 200 mm x 2 mm

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Ault, K. A. The clinical utility of flow cytometry in the study of platelets. Semin. Hematol. 38 (2), 160-168 (2001).
    2. Avila, C., et al. Platelet mitochondrial dysfunction is evident in type 2 diabetes in association with modifications of mitochondrial anti-oxidant stress proteins. Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 120 (4), 248-251 (2012).
    3. Basu, S. S., Blair, I. A. Rotenone-mediated changes in intracellular coenzyme A thioester levels: implications for mitochondrial dysfunction. Chem. Res. Toxicol. 24 (10), 1630-1632 (2011).
    4. Basu, S. S., Blair, I. A. SILEC: a protocol for generating and using isotopically labeled coenzyme A mass spectrometry standards. Nat. Protoc. 7 (1), 1-12 (2012).
    5. Basu, S. S., Deutsch, E. C., Schmaier, A. A., Lynch, D. R., Blair, I. A. Human platelets as a platform to monitor metabolic biomarkers using stable isotopes and LC-MS. Bioanalysis. 5 (24), 3009-3021 (2013).
    6. Berson, A., et al. Mechanisms for experimental buprenorphine hepatotoxicity: major role of mitochondrial dysfunction versus metabolic activation. J. Hepatol. 34 (2), 261-269 (2001).
    7. Castell, J. V., Jover, R., Martinez-Jimenez, C. P., Gomez-Lechon, M. J. Hepatocyte cell lines: their use, scope and limitations in drug metabolism studies. Expert. Opin. Drug Metab Toxicol. 2 (2), 183-212 (2006).
    8. Ciccimaro, E., Blair, I. A. Stable-isotope dilution LC-MS for quantitative biomarker analysis. Bioanalysis. 2 (2), 311-341 (2010).
    9. Dang, C. V. Links between metabolism and cancer. Genes Dev. 26 (9), 877-890 (2012).
    10. Darnell, M., Weidolf, L. Metabolism of xenobiotic carboxylic acids: focus on coenzyme A conjugation, reactivity, and interference with lipid metabolism. Chem. Res. Toxicol. 26 (8), 1139-1155 (2013).
    11. Des Rosiers, C., Fernandez, C. A., David, F., Brunengraber, H. Reversibility of the mitochondrial isocitrate dehydrogenase reaction in the perfused rat liver. Evidence from isotopomer analysis of citric acid cycle intermediates. J. Biol. Chem. 269 (44), 27179-27182 (1994).
    12. Ellis, J. K., et al. Metabolic profiling detects early effects of environmental and lifestyle exposure to cadmium in a human population. BMC. Med. 10, 61 (2012).
    13. Grevengoed, T. J., Klett, E. L., Coleman, R. A. Acyl-CoA metabolism and partitioning. Annu. Rev. Nutr. 34, 1-30 (2014).
    14. Haynes, C. A., et al. Quantitation of fatty acyl-coenzyme As in mammalian cells by liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry. J. Lipid Res. 49 (5), 1113-1125 (2008).
    15. Ikegawa, S., et al. Characterization of cholyl-adenylate in rat liver microsomes by liquid chromatography/electrospray ionization-mass spectrometry. Anal. Biochem. 266 (1), 125-132 (1999).
    16. Kalghatgi, S., et al. Bactericidal antibiotics induce mitochondrial dysfunction and oxidative damage in Mammalian cells. Sci. Transl. Med. 5 (192), 192ra85 (2013).
    17. Liu, X., et al. High-Resolution Metabolomics with Acyl-CoA Profiling Reveals Widespread Remodeling in Response to Diet. Mol. Cell Proteomics. 14 (6), 1489-1500 (2015).
    18. Lopez-Gallardo, E., Iceta, R., Iglesias, E., Montoya, J., Ruiz-Pesini, E. OXPHOS toxicogenomics and Parkinson's disease. Mutat. Res. 728 (3), 98-106 (2011).
    19. Magnes, C., Sinner, F. M., Regittnig, W., Pieber, T. R. LC/MS/MS method for quantitative determination of long-chain fatty acyl-CoAs. Anal. Chem. 77 (9), 2889-2894 (2005).
    20. Mauriala, T., Herzig, K. H., Heinonen, M., Idziak, J., Auriola, S. Determination of long-chain fatty acid acyl-coenzyme A compounds using liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 808 (2), 263-268 (2004).
    21. Murphy, T. A., Dang, C. V., Young, J. D. Isotopically nonstationary 13C flux analysis of Myc-induced metabolic reprogramming in B-cells. Metab Eng. 15, 206-217 (2013).
    22. Paglia, G., et al. Metabolomic analysis of platelets during storage: a comparison between apheresis- and buffy coat-derived platelet concentrates. Transfusion. 55 (2), 301-313 (2015).
    23. Patti, G. J. Separation strategies for untargeted metabolomics. J. Sep. Sci. 34 (24), 3460-3469 (2011).
    24. Robishaw, J. D., Neely, J. R. Coenzyme A metabolism. Am. J. Physiol. 248 (1 Pt 1), E1-E9 (1985).
    25. Rodgers, G. M. Overview of platelet physiology and laboratory evaluation of platelet function. Clin. Obstet. Gynecol. 42 (2), 349-359 (1999).
    26. Salles, I., et al. Development of a high-throughput ELISA assay for platelet function testing using platelet-rich plasma or whole blood. Thromb. Haemost. 104 (2), 392-401 (2010).
    27. Snyder, N. W., Basu, S. S., Worth, A. J., Mesaros, C., Blair, I. A. Metabolism of propionic acid to a novel acyl-coenzyme A thioester by mammalian cell lines and platelets. J. Lipid Res. 56 (1), 142-150 (2015).
    28. Snyder, N. W., Basu, S. S., Zhou, Z., Worth, A. J., Blair, I. A. Stable isotope dilution liquid chromatography/mass spectrometry analysis of cellular and tissue medium- and long-chain acyl-coenzyme A thioesters. Rapid Commun. Mass Spectrom. 28 (16), 1840-1848 (2014).
    29. Snyder, N. W., et al. Production of stable isotope-labeled acyl-coenzyme A thioesters by yeast stable isotope labeling by essential nutrients in cell culture. Anal. Biochem. 474, 59-65 (2015).
    30. Wallace, D. C. Mitochondrial diseases in man and mouse. Science. 283 (5407), 1482-1488 (1999).
    31. Wojtovich, A. P., Brookes, P. S. The complex II inhibitor atpenin A5 protects against cardiac ischemia-reperfusion injury via activation of mitochondrial KATP channels. Basic Res. Cardiol. 104 (2), 121-129 (2009).
    32. Worth, A. J., et al. Stable isotopes and LC-MS for monitoring metabolic disturbances in Friedreich's ataxia platelets. Bioanalysis. 7 (15), 1843-1855 (2015).
    33. Worth, A. J., Basu, S. S., Snyder, N. W., Mesaros, C., Blair, I. A. Inhibition of neuronal cell mitochondrial complex I with rotenone increases lipid beta-oxidation, supporting acetyl-coenzyme A levels. J. Biol. Chem. 289 (39), 26895-26903 (2014).
    34. Zhou, L., Schmaier, A. H. Platelet aggregation testing in platelet-rich plasma: description of procedures with the aim to develop standards in the field. Am. J. Clin. Pathol. 123 (2), 172-183 (2005).

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