Summary
Weergegeven is het protocol voor co-immobiliserende hele cellen biokatalysatoren voor cofactorregeneratiesysteem en betere herbruikbaarheid, via de productie van L-xylulose als voorbeeld. De cofactor regeneratie wordt bereikt door het koppelen van twee Escherichia coli-stammen die functionele complementariteit enzymen; de hele cellen biokatalysator immobilisatie wordt bereikt door celinkapselende in calciumalginaat parels.
Abstract
We hebben onlangs een eenvoudige, herbruikbaar en gekoppeld whole-cell biokatalytische systeem de mogelijkheid cofactorregeneratiesysteem en biokatalysator immobilisatie verbeterde productieopbrengst en aanhoudende synthese. Beschreven is hierbij de experimentele procedure voor de ontwikkeling van een dergelijk systeem bestaat uit twee E. coli-stammen die functioneel complementair zijn enzymen uit te drukken. Samen kunnen deze twee enzymen functioneren coöperatief aan de regeneratie van kostbare co-factoren bemiddelen betere productopbrengst van de bioreaction. Bovendien wordt de werkwijze voor het synthetiseren van een geïmmobiliseerde vorm van het gekoppelde biokatalytische systeem inkapselen van gehele cellen in calciumalginaat parels gerapporteerd. Als voorbeeld geven we de verbeterde biosynthese van L-xylulose van L-arabinitol door koppeling E. coli-cellen die de enzymen L-arabinitol dehydrogenase en NADH oxidase. Onder optimale omstandigheden en met een beginconcentratie van 150mM L-arabinitol, de maximale L-xylulose opbrengst bedroeg 96%, wat hoger is dan die in de literatuur. De geïmmobiliseerde vorm van de gekoppelde whole-cell biokatalysatoren aangetoond operationeel stabiel handhaven 65% van de opbrengst verkregen bij de eerste cyclus na 7 cycli van opeenvolgende hergebruik, terwijl de vrije celsysteem de katalytische activiteit bijna volledig verloren. Daarom is de hier vermelde werkwijzen levert twee strategieën die kunnen bijdragen aan de industriële productie van L-xylulose, alsmede andere verbindingen met toegevoegde waarde waarbij het gebruik van co-factoren in het algemeen.
Introduction
Reductieve hele cellen biotransformatie middels micro-organismen is uitgegroeid tot een wijdverspreide werkwijze voor de chemo-enzymatische synthese van commercieel en therapeutisch belangrijke biomoleculen 1-3. Het biedt verschillende voordelen boven het gebruik van geïsoleerde enzymen, met name de eliminatie van dure stroomafwaartse zuiveringsprocessen en de demonstratie van een langere levensduur 4-7. Voor biokatalytische paden indien cofactoren nodig voor productvorming, whole-cell-systemen is in situ cofactorregeneratiesysteem te voorzien via de toevoeging van goedkope elektronendonerende cosubstraten 5,8,9. Dit is echter verminderd vermogen voor reacties die een stoichiometrische concentratie van zeldzame en dure cosubstraten 10 vereisen - 13. Samen met een slechte hergebruik van hele cellen, belemmert dit de oprichting van een schaalbare en continue productie systeem. Strategische modificaties volle-celsystemen deze cofactor-afhankelijke biotransformaties moeten de bovengenoemde beperkingen te overwinnen. Specifiek zijn de combinatie van whole-cell biokatalysatoren die samen te werken aangetoond aanzienlijke verbetering van de productiviteit en stabiliteit van de enzymen 14 herbergde. Deze factoren, die vaak kritiek voor het mogelijk maken grootschalige productie van commercieel levensvatbare producten zijn, kunnen verder worden geoptimaliseerd door co-immobiliseren biokatalytische microben 15. We hebben onlangs een eenvoudige en herbruikbare whole-cell biokatalytische systeem dat zowel cofactorregeneratiesysteem en biokatalysator immobilisatie maakt de L-xylulose productie 16. In deze studie werd dit systeem gebruikt als een voorbeeld voor de experimentele procedures van toepassing van deze twee strategieën voor verbeterde productieopbrengst biotransformatie en biokatalysator herbruikbaarheid illustreren.
L-xylulose behoort tot een class van biologisch bruikbare moleculen genaamd zeldzame suikers. Zeldzame suikers zijn uniek monosachariden of suiker derivaten die zeer zelden in de natuur voorkomen, maar een cruciale rol spelen als een erkenning elementen in biologisch actieve moleculen 17,18. Ze hebben een verscheidenheid aan toepassingen, variërend van zoetstoffen, functionele voedingsmiddelen potentiële therapeutische 19. L-xylulose kunnen worden gebruikt als een mogelijke remmer van verschillende α-glucosidases, en kunnen ook worden gebruikt als een indicator van hepatitis of levercirrose 17,20. Hoge omzettingsefficiëntie van xylitol L-xylulose geheel-celsystemen werd voorheen in Pantoea ananatis 21,22, Alcaligenes sp. 701B 23, Bacillus pallidus Y25 24,25 en Escherichia coli 26. In E. coli, maar het werd uitsluitend gebruik van lage (<67 mM) concentraties xylitol 26 vanwege mogelijke remmende effecten van een eerste xylitol concentratie hoger dan 100 mM xylitol on-4-dehydrogenase activiteit 21,26. Thermodynamisch evenwicht tussen xylulose en xylitol is blijkt sterk begunstigen de vorming van xylitol 25,27. Bovendien wordt xylulose opbrengst beperkt door de hoeveelheid dure cofactoren die bij afwezigheid van een in situ cofactorregeneratiesysteem te leveren hebben. Samen vormen deze factoren beperken de mogelijkheden voor schaalvergroting in duurzame systemen voor de L-xylulose biosynthese.
Om deze beperkingen te overwinnen en het verbeteren van de L-xylulose biotransformatie opbrengst, werd de strategie van cofactorregeneratiesysteem eerste in dienst van de oprichting van een gekoppelde whole-cell biokatalytische systeem. Specifiek, L-arabinitol 4-dehydrogenase (EC 1.1.1.12) van Hypocrea jecorina (HjLAD), een enzym in de L-arabinose afbraakproduct van schimmels, werd geselecteerd om de omzetting van L-arabinitol katalyseren in L-xylulose 28,29 . Net als veel biosynthetische enzymen, een belangrijke BEPERKIn van HjLAD is dat het een stoichiometrische hoeveelheid van het dure nicotinamide adenine dinucleotide-cofactor (NAD +, de geoxideerde vorm van NADH) deze omzetting uit te voeren. NADH oxidase in Streptococcus pyogenes (SpNox) is aangetoond dat hoge cofactor-activiteit regeneratie 30,31 weergegeven. Door gebruik te maken van deze eigenschap van SpNox, E. coli-cellen die HjLAD voor de productie van L-xylulose gekoppeld met E. coli-cellen die SpNox voor de regeneratie van NAD + op de L-xylulose productie beschreven door gekoppelde reactie figuur 1A stimuleren. Onder optimale omstandigheden en met een aanvankelijke concentratie van 150 mM L-arabinitol, de maximale L-xylulose opbrengst bedroeg 96%, waardoor dit systeem veel efficiënter dan die gerapporteerd in de literatuur.
De strategie van whole-cell immobilisatie werd gebruikt naast de verdere versterking van de herbruikbaarheid van de gekoppelde biocatalytic-systeem. Algemeen gebruikte werkwijzen voor whole-cell immobilisatie omvatten adsorptie / covalente koppeling aan vaste matrices, verknoping / invangen en inkapselen in polymere netwerken 32. Onder deze benaderingen, de meest geschikte methode voor mobiele inkapseling immobilisering in calciumalginaat parels. Hun milde geleringseigenschappen, inerte waterige matrix en hoge porositeit bijdragen aan het behoud van de fysiologische eigenschappen en functionaliteit van de ingekapselde biologicals 33. Daarom is de combinatie biokatalysator systeem dat zowel E. coli cellen die HjLAD of SpNox geïmmobiliseerd in calciumalginaat parels meerdere cycli van L-xylulose productiewijzen (figuur 2) .De geïmmobiliseerde biokatalysator systeem aangetoond operationeel stabiel handhaven 65% van het omzettingsrendement van de eerste cyclus na 7 cycli opeenvolgende hergebruik, terwijl de vrije celsysteem de katalytische activiteit bijna volledig verloren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Whole-cell Biokatalysatoren Voorbereiding
LET OP: De recombinante E. coli cellen die pET28a- SpNox 31 of pET28a- HjLAD 28 zijn hierna E. SpNox coli en E. coli HjLAD respectievelijk.
- Inoculeer een enkele kolonie van E. coli HjLAD in 3 ml Luria-Bertani (LB) medium aangevuld met kanamycine (50 ug / ml) en geïncubeerd in een incubator shaker O / N bij 37 ° C, 250 rpm.
- Verdun de kweek van 1: 100 in 200 ml vers LB dat 50 ug / ml kanamycine en incubeer bij 37 ° C, 250 rpm tot de OD600 0,6 bereikt ~.
- HjLAD eiwitexpressie induceren door toevoeging van 0,1 mM isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) aan het kweekmedium en incubeer bij 16 ° C, 180 rpm gedurende 16 uur.
- Als alternatief uit te voeren inductie bij 25 ° C, 200 rpm 6 uur als de L-xylulose biosynthese (Stap 2 hieronder) wordt op dezelfde dag uitgevoerd.
- Oogst de geïnduceerde E. HjLAD coli cellen door centrifugeren bij 3200 xg gedurende 20 min bij 4 ° C Verwijder het supernatant en ga naar stap 2 om de cel pellet te verwerken.
- Tegelijkertijd voeren de stappen 1,1-1,4 voor E. coli SpNox.
2. biosynthese van L-xylulose door koppeling E. HjLAD coli en E. coli SpNox voor cofactorregeneratiesysteem
- Resuspendeer de celpellets E. HjLAD coli en E. coli SpNox afzonderlijk in 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8,0) bij een celdichtheid van 5,0 g droog celgewicht (gDCW) / L.
Opmerking: Een correlatie tussen gDCW en de optische dichtheid gemeten bij 600 nm (OD 600) kan worden vastgesteld om het experiment te vergemakkelijken. De formule die inDit protocol is 1 gDCW / L = 0,722 * OD 600-,0965, die kan variëren tussen verschillende spectrometers. - Meng 600 ul van 5,0 gDCW / L E. coli HjLAD, 600 ul van 5,0 gDCW / L E. coli SpNox, 100 gl 20 mM NAD +, en 150 pl 2 M L-arabinitol in een 14 ml rondbodem buis en breng het reactievolume tot 2 ml door toevoeging van 550 pl 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) .
Noot: De verhouding van de twee whole-cell biokatalysatoren bedrag kan worden geoptimaliseerd om de biosynthese van het product te verbeteren. Voor het beschreven systeem, een verhouding van E. SpNox coli: E. coli HjLAD = 1: 1 werd gevonden optimaal voor L-xylulose biosynthese (figuur 1B) te zijn. - Incubeer het reactiemengsel bij 30 ° C, 200 rpm gedurende 8 uur.
- Verzamel de supernatant na centrifugeren bij 4 ° C, 3200 g gedurende 10 min eennd overgaan tot de L-xylulose productie kwantificeren zoals beschreven in stap 3 hieronder.
3. colorimetrische bepaling van L-xylulose Kwantificering
- Verzamelbak 100 gl van de reactie supernatant verzameld uit stap 2.4 in een 1,5 ml buis.
- Voeg 50 ul van 1,5% cysteïne, 900 pi 70% zwavelzuur en 50 pi 0,1% carbazool opgelost in ethanol en meng voorzichtig door het buisje 3 keer.
- Incubeer het reactiemengsel bij 37 ° C, 200 rpm gedurende 20 min.
- Meet de optische absorptie van het reactiemengsel bij 560 nm (560 A) met een spectrofotometer.
- Verdun het reactiemengsel als de A 560 aflezing boven 1.
4. Immobilisatie van Recombinant Whole-cell Catalysts in calciumalginaat Kralen
- Ontbinden 4 g natriumalginaat in 100 ml gedestilleerd water. Bereid alginaatoplossing door toevoeging sodium alginaat water om de vorming van klonten te vermijden. Verwarm het mengsel indien nodig.
- Voeg 600 ul van 5,0 gDCW / L E. coli HjLAD en 600 ui 5,0 gDCW / l E. coli SpNox in 1,2 ml 4% alginaat bereid in stap 4.1 en meng de cellen en alginaat door zachte pipetteren te borrelen vorming te voorkomen.
- Zuig het alginaat / cel suspensie in een spuit met een naald en voeg het mengsel druppelsgewijs een 0,3 M calciumchloride (CaCl2) oplossing in een 100 ml bekerglas onder voortdurend roeren.
Opmerking: Het volume van CaCl 2-oplossing voor de vorming alginaat bead moet genoeg zijn om het alginaat druppels volledig wordt ondergedompeld. Bovendien moet de afstand tussen de naald en het oppervlak van de calciumchloride-oplossing binnen een optimaal bereik te handhaven om de vorming van uniforme bolvormige korrels waarborgen. Het optimale bereik afstand kan worden bepaald experimentally en is afhankelijk van de binnendiameter van de naald. Als een schatting, een afstand van ~ 15 ± 5 cm werd gevonden optimaal voor een 0,6 cm (binnendiameter) spuitnaald te zijn. - Laat de parels in de CaCl2-oplossing voor 2-3 uur bij kamertemperatuur zonder roeren verknoping en vorming gelkorrels toe.
- Schenk de CaCl2 oplossing zonder de korrels storen door voorzichtig gieten van de CaCl2 oplossing in een 50 ml conische buis, en draagt de resterende parels in CaCl 2-oplossing in een 50 ml conische buis.
- Was de kralen met 10 ml 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) buffer driemaal overmatig CaCl 2 en niet-ingekapselde cellen te verwijderen.
NOTITIE: Op een gegeven stap, niet centrifugeren de parels als dit te doen zal ze scheuren. Om de kralen te scheiden uit de oplossing, zodat de schorsing ongestoord staan voor 3-5 min. De kralen zal vestigen op de bodem en het wassen buffer kan worden overgegotenin een schoon vat.- Heeft de gebruikte wassen buffer niet weg. Verzamel de gebruikte Tris-HCl wasbuffer (30 ml) met de gebruikte CaCl 2-oplossing vanuit stap 4,5.
- Pellet de-un geïmmobiliseerde E. coli-cellen door centrifugatie van de gepoolde CaCl 2 en Tris-HCl-oplossing vanuit stap 4,6 bij 3200 xg gedurende 20 min. De immobilisatie-effectiviteit vaststelling, de dichtheid van de niet-ingekapselde gepelleteerde cellen in gDCW / L, zoals beschreven in stap 2.1.
- Breng de gewassen korrels uit stap 4.6 in een buis. Volg stap 2,2-3,4 voor de L-xylulose biosynthese via alle gewassen kralen in plaats van celpellets evalueren.
5. Stabiliteit Assay van geïmmobiliseerde Biokatalysatoren voor L-xylulose Production
- Verzamel de kralen van stap 4,8 en tweemaal wassen met 10 ml 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) -buffer zonder centrifugeren (zoals beschreven in stap 4.6).
- gebruik allevan de gewassen kralen om de reactie uit te voeren zoals beschreven in stap 2,2-3,4.
- Herhaal stap 5,1-5,2 voor gewenste aantal productiecycli en meet de hoeveelheid L-xylulose bij de reactie supernatant in elke cyclus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om cofactor regeneratie mogelijk te maken, werd L-xylulose synthese in een gekoppelde whole-cell biokatalytische systeem dat E. uitgevoerd HjLAD coli en E. SpNox coli cellen. Na de optimalisering van verschillende parameters, de herbruikbaarheid van het systeem verbeterd door immobiliseren in calciumalginaat parels (figuur 2).
L-xylulose-productie met cofactorregeneratiesysteem door koppeling E. HjLAD coli en E. SpNox coli cellen.
Om de biologische omzetting van L-arabinitol verbetering in L-xylulose, E. HjLAD coli en E. SpNox coli cellen werden gekoppeld inschakelencofactor regeneratie. Ter compensatie van de verschillen in eiwitexpressie en cofactor voorraad van E. SpNox coli en E. HjLAD coli cellen, een vergelijkende studie van de L-xylulose rendement op verschillende E. coli SpNox -to- E. coli HjLAD ratio werd uitgevoerd. Zoals getoond in figuur 1B, de opbrengst verhoogd E. coli SpNox -to- E. coli HjLAD verhouding toe van 0,13: 1 tot 1: 1. De opbrengsten verkregen verhouding 1: 1 en 1,33: 1 equivalent waren en maximaal voor deze gekoppelde systeem. Alle verdere experimenten werden uitgevoerd met E. coli SpNox -to- E. coli HjLAD verhouding van 1: 1. Beginnend met een initiële concentratie van 150 mM L-arabinitol, het gebruik van E. coli HjLAD biokatalysator alleen geproduceerd 118 mm L-xylulose na 8 uur (verzadigingspuntvoor L-xylulose concentratie), wat neerkomt op een rendement van 79% (figuur 1C). Ter vergelijking, het gebruik van de E. HjLAD coli en E. SpNox coli cellen bij een 1: 1 verhouding geproduceerd 144 mM L-xylulose, het verbeteren van de opbrengst tot 96%.
Optimalisatie van Whole-cell Biokatalysator Immobilisatie
Immobilisatie van biokatalysatoren in calciumalginaat parels biedt vele voordelen, zoals een verbeterde levensvatbaarheid als gevolg van de zachte gel milieu dat de cellen beschermt tegen fysische spanningen in een bioreactor. De eigenschappen van deze alginaatparels wordt grotendeels bepaald door de formulering en verwerkingsparameters 34. De productieopbrengst van L-xylulose optimaliseren door een geïmmobiliseerde vorm van de gekoppelde whole-cell biokatalysator bovenbeschreven twee parameters, namelijk natriumalginaat concentratie en CaCl2 concentratie geëvalueerd. Dit zijnde belangrijkste parameters die de integriteit en stijfheid van het calciumalginaat parels, waardoor de biokatalysator immobilisatie-effectiviteit en moleculaire diffusie beïnvloeden te bepalen.
Zoals getoond in figuur 3A, de biokatalysator immobilisatie-effectiviteit toonden een stijgende trend bij toenemende natriumalginaat concentratie in het bereik van 1-3% (w / v). Wanneer de concentratie natriumalginaat gebruikt in de immobilisatie matrix minder dan 1%, de verkregen kralen waren kwetsbaar en gemakkelijk gebroken door lage mechanische stabiliteit, het vrijgeven van de meeste cellen in het omringende CaCl 2-oplossing (gegevens niet getoond). Bij toenemende natriumalginaat concentratie hoger dan 2%, de verkregen korrels gehard uiterst belangrijke problemen in moleculaire diffusie 35 (figuur 4). Het variëren van de CaCl2 concentratie leverde een soortgelijke trend in de biokatalysator immobilization efficiency. Voor een vaste concentratie van natriumalginaat (2% w / v) en in het bereik van 0,1-0,4 M CaCl2, lagere concentraties CaCl2 resulteerde in verminderde stijfheid van de kralen en verhoogde lekkage van cellen in de omringende oplossing. Dit komt door de beperkte beschikbaarheid van Ca2 + -ionen te verknopen van het guluronate blokken op de alginaat polymeerketens 36 (figuur 3B). Het verhogen van de CaCl2-concentratie van 0,3 M tot 0,4 M verbeterde de biokatalysator immobilisatie-effectiviteit slechts marginaal. Door de hoge immobilisatie rendement (> 90%), CaCl2 concentraties die 0,4 M werden niet geëvalueerd. CaCl2 bij concentraties van minder dan 0,1 M werd gebruikt, het natrium- alginaat druppel met de biokatalysator viel uiteen in de CaCl2-oplossing en geen bolvormige korrels werden gevormd (gegevens niet getoond).
Om het maximaliserenbiokatalysator immobilisatie-effectiviteit zonder significante vertraging van de moleculaire diffusie in calciumalginaat parels, het natrium- alginaat en CaCl2-concentratie werden vervolgens aan verbeterde L-xylulose productie geoptimaliseerd. Met dezelfde concentratiebereik als voor immobilisatie-effectiviteit (1-3% w / v natriumalginaat en 0,1-0,4 M CaCl 2), een optimale natriumalginaat concentratie van 2% werd waargenomen dat maximale opbrengst aan L-xylulose productie te komen (Figuur 4A ). Afgezien van deze optimale concentratie, de opbrengst vertoonde een dalende tendens. Dit werd verwacht vanwege de diffusie kwesties verbonden met de buitengewone starheid van calciumalginaat parels. Evenzo werd de optimale CaCl2 concentratie bleek 0,3 M (figuur 4B) zijn. In combinatie met de in figuur 3, de optimale natriumalginaat concentratie (2%) en CaCl2 concentratie (0,3 M) dat de vorming van korrels toegestaan datageschikte stijfheid en permeabiliteit werd opgericht, waardoor minimale cel lekkage en maximale L-xylulose productieopbrengst.
Opgemerkt wordt dat een andere factor die de totale katalytische efficiëntie van de geïmmobiliseerde biokatalysator beïnvloedt, is het gewicht van de celkweek ingekapseld. De katalytische efficiëntie toe met toenemende cel inoculum tot een optimale inoculum gewicht, waarna het een dalende trend 37 toont. Een mogelijke verklaring voor deze daling cellulaire overbevolking, die moleculaire diffusie verhindert gehele calciumalginaat parels en vermindert de katalytische efficiëntie van het systeem. Met de geoptimaliseerde toestand immobilisatie bovenstaande werd de hoogste L-xylulose productie verkregen met een cel belading van 3,75 (gDCW) / L 16 (gegevens niet getoond).
Herbruikbaarheid van het geïmmobiliseerde en Free Whole-cell Biokatalysatoren voorL-xylulose Production.
Gebruik van het ingestelde optimale conditie van 1: 1 E. coli SpNox E. coli HjLAD verhouding 2% (w / v) natriumalginaat en 0,3 M CaCl2, de geïmmobiliseerde gekoppelde hele cellen biokatalysator uitgang een maximale L-xylulose rendement van 64%, vergeleken met een veel hogere opbrengst van 96% voor het vrije gekoppelde gehele celsysteem (cyclus 1 van figuur 5). Merk op dat de opbrengst van geïmmobiliseerde E. HjLAD coli cel alleen was slechts 32,5% (gegevens niet getoond), lager dan die van de geïmmobiliseerde gekoppelde systeem en de vrije interne biokatalysator systeem (79%, figuur 1C). Deze vermindering werd verwacht omdat immobilisatie is bekend dat de activiteit van biokatalysatoren, mogelijk vanwege diffusiebeperkingen substraat af, maar werd gecompenseerd door het voordeel van verbeterde herbruikbaarheid van een biokatalysator bij immobilisatie. Dit effect op de stabiliteit van de biokatalysator isblijkt uit de dalende trend in L-xylulose rendement waargenomen op herhaaldelijk onderwerpen van de vrije en geïmmobiliseerde systemen voor de partij reactieproces, zie figuur 5. De opbrengst van het vrije systeem toonde een veel sterkere daling dan het geïmmobiliseerde systeem, hetgeen een sneller verlies van enzymactiviteit in het vrije systeem. Daardoor beide systemen hadden een vergelijkbare L-xylulose opbrengst productiecyclus 2. Aan het eind van 7 cycli van opeenvolgende hergebruik, het ingekapselde biokatalysatoren behielden hun stabiliteit en behield 65% van de oorspronkelijke opbrengst terwijl de vrije whole-cell systeem behouden minder dan 10% van het vermogen om L-xylulose produceren. Dit toont aan dat het geïmmobiliseerde biokatalysatoren doeltreffend kan worden hergebruikt voor de productie van L-xylulose en dat het voordeel van verbeterde herbruikbaarheid en stabiliteit veroorzaakt door immobilisatie veel groter dan de vermindering van de activiteit van de biokatalysator, waaraan een belangrijk voordeel voor de productie opgratis hele celsysteem.
Figuur 1. Gekoppeld Whole-cell systeem voor Biokatalytische productie van L-xylulose. (A) Schematische illustratie van de cofactorregeneratiesysteem reactie treedt een gekoppelde hele cellen omvattende E. coli cellen die HjLAD of SpNox, respectievelijk. (B) Variatie van de opbrengst aan L-xylulose met verschillende E. coli SpNox E. coli HjLAD verhoudingen. (C) L-xylulose opbrengst van gehele-cel biokatalysator omvat alleen E. coli HjLAD vergeleken met die van een gekoppelde hele celsysteem bestaande uit E. HjLAD coli en E. SpNox coli cellen die in staat cofactorregeneratiesysteem. De getoonde kavels vertegenwoordigen gemiddeld en standard afwijking van drie onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Immobilisatie van de Whole-cell Biokatalysatoren via inkapselen in alginaat kralen. Schematische die de vorming van uniforme grootte Ca 2+ alginaat kralen door druppelsgewijze toevoeging van het natriumalginaat-celsuspensie aan een oplossing van calciumchloride. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. parameters beïnvloeden de efficiëntie van de immobilisatie van Gehele-cel Biokatalysator in alginaatkorrels. immobilisatie-effectiviteit als functie van (A) natriumalginaat (% w / v) (B) CaCl 2 (M) concentratie. De getoonde percelen geven de gemiddelde en de standaardafwijking van drie onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Evaluatie van de opbrengst aan L-xylulose van het geïmmobiliseerde Coupled Whole-cell Biokatalysator als functie van (A) natriumalginaat (% w / v) (B) CaCl 2 (M) concentratie. De getoonde kavels geven het gemiddelde en de standaardafwijking van drie onafhankelijke experimenten.lank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Beoordeling van de Biokatalysator Herbruikbaarheid. De opbrengst van de L-xylulose productie voor 7 opeenvolgende cycli van hergebruik van geïmmobiliseerd en vrij gekoppeld whole-cell biokatalysator wordt getoond in donker en licht grijs, respectievelijk. De getoonde plot geeft de gemiddelde en de standaardafwijking van drie onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Recente technologische ontwikkelingen hebben een sterke stijging in de commercialisering van recombinant biotherapeutica ingeschakeld, wat resulteert in een geleidelijke stijging van hun marktwaarde in de biotechnologie-industrie. Eén zo'n vooruitgang is de komst van metabolic engineering in recombinante micro-organismen, die een grote belofte bij het vaststellen schaalbare industriële systemen 38 is getoond. Zoals bij de meeste processen succesvolle commercialisering van recombinant biomoleculen door genetisch gemanipuleerde microben is sterk afhankelijk van de productieopbrengst van het systeem 39. Dit heeft geleid tot de snelle ontwikkeling van "brute force" genetica 39, waar gerichte evolutie van biokatalytische enzymen om biokatalysator activiteit 3 verbeteren geïmplementeerd. Voor bepaalde metabole routes, zoals redox pathways, alleen biokatalysator verbetering niet voldoende om besparing productiekosten vanwege de significant effect oth beïnvloedener essentiële reactie eisen, zoals dure co-factoren. Opschaling van een dergelijk systeem, zelfs met verbeterde biokatalysatoren, zal alleen dienen om de productiekosten te verhogen. Zo worden extra strategische methoden die nodig zijn voor de commercialisering van bioreactions waarbij stoichiometrische verhoudingen van co-factoren. Bovendien, de recycleerbaarheid van een biokatalysator is ook nodig voor de verbetering van de economische haalbaarheid van een bioproces. De beperkende effect van snelle cofactor consumptie en slechte herbruikbaarheid van whole-cell biokatalysatoren overwinnen, hebben we eerder ontwikkelde een geïmmobiliseerd, gekoppeld whole-cell biokatalytische voor cofactorregeneratiesysteem en stabiele hergebruik 16. Beschreven in deze studie zijn de experimentele procedures die te koppelen en co-immobiliseren twee hele cellen biokatalysatoren voor betere biotransformatie opbrengst en herbruikbaarheid, samen met de representatieve resultaten.
Een kritische factor worden beschouwd voor het koppelen van de gehele-cel Biocatalysts is het handhaven van een nauwkeurige controle over de voor eiwit inductie en biokatalytische productvorming de reproduceerbaarheid van het systeem voorwaarden. Variaties in parameters zoals inductie OD 600, inductietijd en IPTG-concentratie moet worden vermeden om batch-tot-batch variatie te minimaliseren. Bovendien wordt herevaluatie van de cel-cel verhouding vereist voor verschillende biotransformaties. Merk op dat de E. HjLAD coli: E. coli SpNox verhouding van 1: 1 die in dit onderzoek werd bepaald door experimentele optimalisatie dan de theoretische stoichiometrische verhouding. Immobilisatie van het recombinante gehele-cel biokatalysator in calciumalginaat parels, zijn er verschillende kritische stappen Om uniformiteit wat betreft de kraal stijfheid en verdeling van cellen. Ten eerste moet de alginaatoplossing worden bereid door langzaam toevoegen van natriumalginaat in water en niet vice versa om klonteren te voorkomen dat de could invloed op de lokale alginaatconcentratie en dus de mate van verknoping. Ten tweede moet voorzichtig pipetteren worden toegepast bij het hanteren van de cel-suspensie alginaat om de vorming van luchtbellen die schuifspanning toebrengen aan de ingekapselde cellen voorkomen, belemmeren efficiënte massaoverdracht en zelfs dat de korrels drijven. Indien luchtbellen worden ingebracht in de suspensie, zodat de cel-suspensie alginaat onaangeroerd staan voor 20-30 minuten te laten de ontwijkt. Ten derde, bij het maken van de korrels, de cel-suspensie alginaat worden langzaam en voorzichtig toegevoegd in een druppelsgewijze wijze in een voldoende hoeveelheid calciumchlorideoplossing uniforme grootte en morfologie. Parels onvolledig ondergedompeld in calciumchloride zal een onregelmatige vorm en slechte stijfheid die kunnen bijdragen tot cel lekkage. Tot slot, de variabiliteit in de reactie volume van de resten van het wassen buffer te voorkomen, kan de kralen in stap 4.8 lichtvaardig worden uitgewist met filter papier (niet de lucht drogen).
E. SpNox coli en E. coli HjLAD celculturen, die een betere controle bij het handhaven van een gewenste verhouding tussen de twee enzymen. Daarnaast, cellen die één eiwitten minder belast dan co-expressie van meerdere eiwitten, wat zou kunnen leiden tot verminderde eiwit misfolding en verhoogde eiwitexpressie 40,41. Aldus direct whole-cell koppeling geeft de mogelijkheid om multi-enzym katalytische processen mediëren zonder op significante afbreuk productopbrengst. Echter, opgericht strategieën, zoals een zorgvuldige selectie van bacteriële promotors met variërende sterkte 42,43 en verbeteringen in ribosoombindingsplaatsen 44 kan employe zijnd de beperkte controle over de verhouding van doelwit enzymen in co-cultuur of co-expressiesystemen beperken. Onder de vele immobilisatietechnieken inkapseling biedt tal van voordelen voor het immobiliseren whole-cell biokatalysatoren via alternatieve methoden zoals verknoping en adsorptie, die meer geschikt voor gezuiverde enzymen. Inkapseling van cellen kan ook worden uitgevoerd in een verscheidenheid van biomaterialen zoals agar, chitosan, gommen, carrageenan, gelatine en alginaat 45 ter verbetering van de herbruikbaarheid van de biokatalysatoren. Echter, calciumalginaat inkapseling aangetoond dat de meest effectieve aanpak met betrekking tot immobilisatie-effectiviteit en productie 46,47 biomolecuul zijn.
Een belangrijke beperking van het gebruik van bacteriële whole-cell biokatalysatoren zijn de minimale vermogen voor post-translationele modificatie van heterologe eiwitten in wild-type E. coli 48. Dit beperkt het succesvolle gebruik van eukaryote biokatalysatoren wedurende dit systeem. Een alternatief voor deze beperking te omzeilen kan het gebruik van organismen zoals gist die beter met eukaryote post-translationele machinerie. Een andere beperking van het beschreven systeem is gerelateerd aan het gebruik van immobilisatie voor betere herbruikbaarheid. Immobilisatie is een veel voorkomende kosteneffectieve strategie gebruikt om de slechte stabiliteit van biokatalysatoren tegen te gaan en het verbeteren van hun omloopsnelheid door vereenvoudiging van de Bioprocess 49-51. De belangrijkste parameters die de katalytische werking van ingekapselde whole-cell biokatalysatoren betreffen zijn natriumalginaat concentratie CaCl2 concentratie celbelading en korrelafmeting. Het is belangrijk te erkennen dat deze parameters niet onafhankelijk van elkaar. Derhalve was een uitgebreide analyse van alle factoren in één onderzoek is zeer tijdrovend, waardoor het noodzakelijk is de meest cruciale parameters te optimaliseren selecteren. Geëvalueerd en die hier zijn de effecten vantwee parameters, natriumalginaat en CaCl 2 concentratie. Hoewel niet in detail besproken, hebben we eerder uitgevoerde optimalisatie van celbelading, het vergelijken van de afhankelijkheid van de opbrengst van het gewicht van geïmmobiliseerde cellen 16. Rapporten in de literatuur geven aan dat de variatie van korrelgrootte kan ook moduleren de productieopbrengst door verhoging enzym inkapselen, verbetering activiteit via grotere oppervlak van het geïmmobiliseerde systeem of door de diffusie van substraten en producten als gevolg van veranderde transporteigenschappen. Afhankelijk van de biokatalytische reacties in kwestie, kan selectie van alternatieve kritische factoren vereist, die kunnen leiden tot de vorming van een andere set van optimale omstandigheden. Een gedetailleerde studie voor de oprichting van optimale omstandigheden voor extra parameters geeft ruimte voor verdere verbetering van de prestaties van het gekoppelde whole-cell-systeem.
Samengevat, melden wij de experimentele uitvoeging van een gekoppelde whole-cell biokatalytische systeem geïmmobiliseerd in calciumalginaat parels, illustreren de verbeterde productie van L-xylulose. Door die verschillende recombinant-enzymen die andere cofactor-afhankelijke biokatalytische routes, hoge opbrengsten van vele biologisch relevante moleculen gemakkelijker kunnen worden verkregen met de hier beschreven protocol. Bovendien kan dit systeem worden uitgebreid tot meer dan twee recombinante biokatalysatoren één-pot multi-enzym biosynthese van producten 52 en met uitzondering biokatalytische productie toepassingen, zoals microbiële biosensoren voor biochemisch zuurstofverbruik 53 tegemoet. Gebruikmakend van de synergistische van dit systeem, kan inkapselen van symbiotische bacteriële consortia worden gebruikt voor een groot aantal toepassingen zoals bioremediatie 54-56, whole-cell bioprocessing biobrandstoffen 57, groei bevorderende bacteriën door bodemmicro bioaugmentatie 58 en biomining voor metaalterugwinning 59
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen. Het papier is gericht op het rapporteren van gedetailleerde methodologie om een gekoppelde whole-cell biokatalytische systeem geïmmobiliseerd in alginaat kralen te genereren. Wetenschappelijke nieuwigheden gemeld in een eerdere studie 16.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gesteund door Basic Science Research Program door de National Research Foundation Korea (NRF), gefinancierd door het Ministerie van Onderwijs, Wetenschap en Technologie (NRF-2013R1A1A2012159 en NRF-2013R1A1A2007561), Konkuk University, en het Department of Chemical Engineering en mCubed Program aan de Universiteit van Michigan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB broth | Sigma Aldrich | L3022-6X1KG | |
| Kanamycin | Fisher | BP906-5 | |
| Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma Aldrich | I6758-10G | |
| Tris base | Fisher | BP1521 | |
| B-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate | Sigma Aldrich | N7004-1G | |
| L-Arabinitol | Sigma Aldrich | A3506-10G | |
| L-Cysteine | Sigma Aldrich | 168149 | |
| Sulfuric acid | Sigma Aldrich | 320501-500ML | |
| Carbazole | Sigma Aldrich | C5132 | |
| Ethanol | Fisher | BP2818-4 | |
| Sodium alginate | Sigma Aldrich | W201502 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | 223506-500G | |
| Excella E24 shaker incubator | New Brunswick Scientific | ||
| Cary 60 UV-Vis Spectrophotometer | Agilent Technologies | ||
| Centrifuge 5810R | Eppendrof | ||
| Beakers | Fisher | ||
| Syringe | Fisher | ||
| Needle | Fisher | ||
| Pioneer Analytical and Precision Weighing Balance | Ohaus |
References
- Carballeira, J. D., et al. Microbial cells as catalysts for stereoselective red-ox reactions. Biotech Adv. 27 (6), 686-714 (2009).
- Sun, B., Kantzow, C., Bresch, S., Castiglione, K., Weuster-Botz, D. Multi-enzymatic one-pot reduction of dehydrocholic acid to 12-keto-ursodeoxycholic acid with whole-cell biocatalysts. Biotechnol. Bioeng. 110 (1), 68-77 (2013).
- Smith, M. R., Khera, E., Wen, F. Engineering novel and improved biocatalysts by cell surface display. Ind. Eng. Chem. Res. 54 (16), 4021-4032 (2015).
- Wen, F., Sun, J., Zhao, H. Yeast surface display of trifunctional minicellulosomes for simultaneous saccharification and fermentation of cellulose to ethanol. Appl. Environ. Microbiol. 76 (4), 1251-1260 (2009).
- Siedler, S., Bringer, S., Bott, M. Increased NADPH availability in Escherichia coli: improvement of the product per glucose ratio in reductive whole-cell biotransformation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 92 (5), 929-937 (2011).
- Kim, C. S., Seo, J. H., Kang, D. G., Cha, H. J. Engineered whole-cell biocatalyst-based detoxification and detection of neurotoxic organophosphate compounds. Biotech Adv. 32 (3), 652-662 (2014).
- Tufvesson, P., Lima-ramos, J., Nordblad, M., Woodley, J. M. Guidelines and cost analysis for catalyst production in biocatalytic processes. Org. Process Res. Dev. 15 (1), 266-274 (2011).
- Mouri, T., Michizoe, J., Ichinose, H., Kamiya, N., Goto, M. A recombinant Escherichia coli whole cell biocatalyst harboring a cytochrome P450cam monooxygenase system coupled with enzymatic cofactor regeneration. Appl Microbiol Bioechnol. 72 (3), 514-520 (2006).
- Xiao, Z., et al. A novel whole-cell biocatalyst with NAD+ regeneration for production of chiral chemicals. PloS one. 5 (1), e8860 (2010).
- Zhao, H., van der Donk, W. A. Regeneration of cofactors for use in biocatalysis. Curr. Opin. Biotechnol. 14 (6), 583-589 (2003).
- Thomas, S. M., Dicosimo, R., Nagarajan, V. Biocatalysis: applications and potentials for the chemical industry. Trends Biotechnol. 20 (6), 238-242 (2002).
- Wang, Y., Li, L., Ma, C., Gao, C., Tao, F., Xu, P. Engineering of cofactor regeneration enhances (2S,3S)-2,3-butanediol production from diacetyl. Sci Rep. 3, 2643 (2013).
- Uppada, V., Bhaduri, S., Noronha, S. B. Cofactor regeneration - an important aspect of biocatalysis. Curr. Sci. India. 106 (7), 946-957 (2014).
- Fu, N., Peiris, P., Markham, J., Bavor, J. A novel co-culture process with Zymomonas mobilis and Pichia stipitis for efficient ethanol production on glucose/xylose mixtures. Enzyme Microb. Technol. 45 (3), 210-217 (2009).
- Chen, H. -Y., Guan, Y. -X., Yao, S. -J. A novel two-species whole-cell immobilization system composed of marine-derived fungi and its application in wastewater treatment. J. Chem. Technol. Biotechnol. 89 (11), 1733-1740 (2014).
- Gao, H., et al. Repeated production of L-xylulose by an immobilized whole-cell biocatalyst harboring L-arabinitol dehydrogenase coupled with an NAD+ regeneration system. Biochem. Eng. J. 96, 23-28 (2015).
- Beerens, K., Desmet, T., Soetaert, W. Enzymes for the biocatalytic production of rare sugars. J Ind Microbiol Biotechnol. 39 (6), 823-834 (2012).
- Poonperm, W., Takata, G., Izumori, K. Polyol conversion specificity of Bacillus pallidus. Biosci., Biotechnol., Biochem. 72 (1), 231-235 (2008).
- Leviiz, G., Zehner, L., Saunders, J., Beedle, J. Sugar substitutes: their energy values, bulk characteristics and potential health benefits. Am. J. Clin. Nutr. 62 (5), 1161S-1168S (1995).
- Zhang, Y. -W., Tiwari, M. K., Jeya, M., Lee, J. -K. Covalent immobilization of recombinant Rhizobium etli CFN42 xylitol dehydrogenase onto modified silica nanoparticles. Appl Microbiol Bioechnol. 90 (2), 499-507 (2011).
- Aarnikunnas, J. S., Pihlajaniemi, A., Palva, A., Leisola, M., Nyyssölä, A. Cloning and expression of a Xylitol-4-Dehydrogenase gene from Pantoea ananatis. Appl. Environ. Microbiol. 72 (1), 368-377 (2006).
- Doten, R. C., Mortlock, R. P. Production of D- and L-Xylulose by mutants of Klebsiella pneumoniae and Erwinia uredovora. Appl. Environ. Microbiol. 49 (1), 158-162 (1985).
- Khan, A. R., Tokunaga, H., Yoshida, K., Izumori, K. Conversion of Xylitol to L-Xylulose by Alcaligenes sp. 701B-cells. J. Ferment. Bioeng. 72 (6), 488-490 (1991).
- Poonperm, W., Takata, G., Morimoto, K., Granström, T. B., Izumori, K. Production of L-xylulose from xylitol by a newly isolated strain of Bacillus pallidus Y25 and characterization of its relevant enzyme xylitol dehydrogenase. Enzyme Microb. Technol. 40 (5), 1206-1212 (2007).
- Takata, G., Poonperm, W., Morimoto, K., Izumori, K. Cloning and overexpression of the xylitol dehydrogenase gene from Bacillus pallidus and its application to L-xylulose production. Biosci., Biotechnol., Biochem. 74 (9), 1807-1813 (2010).
- Usvalampi, A., Kiviharju, K., Leisola, M., Nyyssölä, A. Factors affecting the production of L-xylulose by resting cells of recombinant Escherichia coli. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 36 (10), 1323-1330 (2009).
- Rizzi, M., Harwart, K., Bui-Thananh, N. -A., Dellweg, H. A kinetic study of the NAD+-Xylitol-Dehydrogenase from the yeast Pichia stipitis. J. Ferment. Bioeng. 67 (1), 25-30 (1989).
- Pail, M., et al. The metabolic role and evolution of L-arabinitol 4-dehydrogenase of Hypocrea jecorina. Eur. J. Biochem. 271 (10), 1864-1872 (2004).
- Tiwari, M. K., et al. pH-rate profiles of L-arabinitol 4-dehydrogenase from Hypocrea jecorina and its application in L-xylulose production. Bioorg. Med. Chem. Lett. 24 (1), 173-176 (2014).
- Gao, H., et al. Role of surface residue 184 in the catalytic activity of NADH oxidase from Streptococcus pyogenes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 98 (16), 7081-7088 (2014).
- Gao, H., Tiwari, M. K., Kang, Y. C., Lee, J. -K. Characterization of H2O-forming NADH oxidase from Streptococcus pyogenes and its application in L-rare sugar production. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22 (5), 1931-1935 (2012).
- Roy, I., Gupta, M. N. Hydrolysis of starch by a mixture of glucoamylase and pullulanase entrapped individually in calcium alginate beads. Enzyme Microb. Technol. 34 (1), 26-32 (2004).
- Gombotz, W. R., Wee, S. F. Protein release from alginate matrices. Adv Drug Deliv Rev. 31 (3), 267-285 (1998).
- Smrdel, P., Bogataj, M., Mrhar, A. The influence of selected parameters on the size and shape of alginate beads prepared by ionotropic Gelation. Sci Pharm. 76 (1), 77-89 (2008).
- Idris, A., Wahidin, S. Effect of sodium alginate concentration, bead diameter, initial pH and temperature on lactic acid production from pineapple waste using immobilized Lactobacillus delbrueckii. Process Biochem. 41 (5), 1117-1123 (2006).
- Lee, K. Y., Mooney, D. J. Alginate: properties and biomedical applications. Prog. Polym. Sci. 37 (1), 106-126 (2012).
- Chen, X. -H., Wang, X. -T., et al. Immobilization of Acetobacter sp. CCTCC M209061 for efficient asymmetric reduction of ketones and biocatalyst recycling. Microb. Cell Fact. 11 (1), 119-131 (2012).
- Yadav, V. G., et al. The future of metabolic engineering and synthetic biology: Towards a systematic practice. Metab. Eng. 14 (3), 233-241 (2012).
- Demain, A. L. From natural products discovery to commercialization: a success story. J Ind Microbiol Biotechnol. 33 (7), 486-495 (2006).
- Baneyx, F., Mujacic, M. Recombinant protein folding and misfolding in Escherichia coli. Nature Biotechnol. 22 (11), 1399-1408 (2004).
- De Marco, A., Deuerling, E., Mogk, A., Tomoyasu, T., Bukau, B. Chaperone-based procedure to increase yields of soluble recombinant proteins produced in E. coli. BMC Biotechnol. 7, 32-40 (2007).
- Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72 (2), 211-222 (2006).
- Alper, H., Fischer, C., Neviogt, E., Stephanopoulos, G. Tuning genetic control through promoter engineering. PNAS. 103 (8), 12678-12683 (2006).
- Salis, H. M., Mirsky, E. A., Voigt, C. A. Automated design of synthetic ribosome binding sites to control protein expression. Nat. Biotechnol. 27 (10), 946-950 (2009).
- Riaz, Q. U., Masud, T. Recent trends and applications of encapsulating materials for probiotic stability. Crit Rev Food Sci Nutr. 53 (3), 231-244 (2013).
- Hossain, G. S., Li, J., et al. One-step biosynthesis of α-keto-γ-methylthiobutyric acid from L-methionine by an Escherichia coli whole-cell biocatalyst expressing an engineered L-amino acid deaminase from Proteus vulgaris. PloS one. 9 (12), e114291 (2014).
- Bhushan, B., Pal, A., Jain, V. Improved enzyme catalytic characteristics upon glutaraldehyde cross-linking of alginate entrapped xylanase Isolated from Aspergillus flavus MTCC 9390. Enzyme Res. (218704), (2015).
- Chen, R. Bacterial expression systems for recombinant protein production: E. coli and beyond. Biotech Adv. 30 (5), 1102-1107 (2012).
- Truppo, M. D., Hughes, G. Development of an improved immobilized CAL-B for the enzymatic resolution of a key intermediate to odanacatib. Org. Process Res. Dev. 15 (5), 1033-1035 (2011).
- Twala, B. V., Sewell, B. T., Jordaan, J. Immobilisation and characterisation of biocatalytic co-factor recycling enzymes, glucose dehydrogenase and NADH oxidase, on aldehyde functional ReSyn polymer microspheres. Enzyme Microb. Technol. 50 (6-7), 331-336 (2012).
- Wang, X. -T., et al. Biocatalytic anti-Prelog stereoselective reduction of ethyl acetoacetate catalyzed by whole cells of Acetobacter sp. CCTCC M209061. J. Biotechnol. 163 (3), 292-300 (2013).
- Rios-Solis, L., et al. Modelling and optimisation of the one-pot, multi-enzymatic synthesis of chiral amino-alcohols based on microscale kinetic parameter determination. Chem. Eng. Sci. 122, 360-372 (2015).
- Wang, B., Barahona, M., Buck, M. A modular cell-based biosensor using engineered genetic logic circuits to detect and integrate multiple environmental signals. Biosens Bioelectron. 40 (1), 368-376 (2013).
- Saratale, R. G., Saratale, G. D., Kalyani, D. C., Chang, J. S., Govindwar, S. P. Enhanced decolorization and biodegradation of textile azo dye Scarlet R by using developed microbial consortium-GR. Bioresour. Technol. 100 (9), 2493-2500 (2009).
- Malik, A. Metal bioremediation through growing cells. Environ. Int. 30 (2), 261-278 (2004).
- Bazot, S., Lebeau, T. Effect of immobilization of a bacterial consortium on diuron dissipation and community dynamics. Bioresour. Technol. 100 (18), 4257-4261 (2009).
- Brethauer, S., Studer, M. H. Consolidated bioprocessing of lignocellulose by a microbial consortium. Energy Environ Sci. 7 (4), 1446 (2014).
- Malusá, E., Sas-Paszt, L., Ciesielska, J. Technologies for beneficial microorganisms inocula used as biofertilizers. Sci World J. 2012 (491206), (2012).
- Brune, K. D., Bayer, T. S. Engineering microbial consortia to enhance biomining and bioremediation. Front Microbiol. 3 (203), (2012).
