Summary
예를 들어 L-크실 로스를 생산하여 보조 인자 재생 및 재사용을위한 개선 된 공동 고정화 전체 세포 생체 촉매에 대한 프로토콜이다 선보였다. 보조인 재생 기능적 상보 효소 발현이 대장균 균주를 결합함으로써 달성된다; 전체 세포 생 촉매 고정화 칼슘 알기 네이트 비드에 세포 캡슐화함으로써 달성된다.
Abstract
우리는 최근 개선 된 생산 수율 및 지속적인 합성을위한 보조 인자 재생 및 생 촉매 고정화의 능력으로, 간단한 재사용과 결합 된 전체 세포 생 촉매 시스템을 개발했다. 이것과는 E. 설명이 이루어진 상기 시스템의 발전을위한 실험 절차 기능적으로 보완 효소를 발현 대장균 균주. 함께,이 두 효소는 생물 반응의 제품 수율 향상을위한 고가의 보조 인자의 재생을 중재하기 위해 공동으로 작동 가능하게 작동 할 수 있습니다. 또한, 칼슘, 알긴산 비드의 전체 세포의 밀봉하여 결합하는 생 촉매 시스템의 고정 된 형태를 합성하는 방법이보고되어있다. 예를 들어, 우리는 E. 결합하여 L-아라 비니에서 L 크실 로스의 개선을 제시 생합성 효소 L-아라 비니 NADH 탈수소 효소 혹은 산화 효소를 발현하는 대장균 세포. 최적의 조건에서 (150)의 초기 농도를 사용하여밀리미터 L-아라 비니는 최대 L 크실 로스 수율은 문헌에보고 된 것보다 높은 96 %에 도달. 자유 전지 시스템은 거의 완전하게 촉매 활성을 상실하는 동안 결합 전체 세포 생 촉매의 고정 된 형태는 연속적으로 재사용 7 사이클 이후 첫 번째 사이클에서 얻어진 수율은 65 %로 유지하는 우수한 작동 안정성을 보여 주었다. 따라서, 여기에보고 된 방법은 L 크실 로스의 산업 생산뿐만 아니라, 일반적으로 보조 인자의 사용을 요구하는 다른 부가가치 화합물을 향상시킬 수있는 두 가지 전략을 제공한다.
Introduction
3 - 미생물을 이용한 환원 전체 세포의 생체 내 변화는 상업적 및 치료 중요한 생체 분자 하나의 화학 - 효소 합성을위한 광범위한 방법이되고있다. 7 - 그것은 절연 효소의 사용을 통해 여러 장점, 특히 비용 집약적 인 하류 정제 공정의 제거 및 연장 된 수명 (4)의 증명을 제공한다. 보조 인자가 제품의 형성에 요구되는 경로를 생 촉매를 들어, 전체 - 셀 시스템은 저렴 전자공 공동 5,8,9 기질의 첨가를 통해 원위치 팩터 재생에 제공 할 가능성이있다. 13 - 그러나, 이러한 능력은 희귀하거나 고가 공동 기판 (10)의 화학량 론적 농도를 반응에 필요로 감소된다. 함께 전체 세포의 가난한 재사용으로,이 확장 가능하고 연속의 produ의 설립을 방해ction 시스템. 이러한 보조 인자 - 의존 생물 전환을위한 전체 전지 시스템의 전략적 변형은 상기 한계를 극복해야한다. 특히, 협력 작업 전체 세포 생체 촉매의 조합은 상당히 품은 효소 (14)의 생산성 및 안정성을 향상시키는 것으로 나타났다. 종종 상업적 제품의 대량 생산을 가능하게하는 중요한 요인은 공동 고정화 미생물 생 촉매 (15)에 의해 더 최적화 될 수있다. 우리는 최근 L 크실 로스 생산 (16)에 대한 보조 인자 재생 및 생 촉매의 고정화를 모두 할 수있는 간단하고 재사용 가능한 전체 세포 생 촉매 시스템을 개발했다. 이 연구에서,이 시스템은 개선 된 생물 전환 수율 및 생체 촉매의 재사용을 위해 두 가지 전략을 적용하는 실험 절차를 설명하기위한 예로서 사용되었다.
L 크실 로스는 CIA 요원에 속하는생물학적으로 유용한 분자의 SS는 희소 당을 이름. 희귀 설탕은 자연에서 매우 드물게 발생 고유 단당류 또는 당 유도체, 그러나 생리 활성 분자 (17, 18)의 인식 요소로 중요한 역할을한다. 그들은 감미료, 기능성 식품의 잠재적 인 치료제 (19)에 이르기까지 다양한 응용 프로그램이 있습니다. L 크실 로스 여러 α-글루코의 전위 억제제로서 사용될 수 있으며, 또한 간염이나 간경변 17, 20의 지표로서 사용될 수있다. 전체 셀 시스템 L 크실 로스에 자일리톨 고효율 변환 판토 이전에보고되었다 (21, 22)는, 알칼리 게 네스 SP ananatis. 701B 23 바실러스 창백 Y25 24,25 대장균 26. E.에서 대장균은, 그러나, 높은 인해 하나 이상의 초기 자일리톨 농도 전위 억제 효과가 낮은 (<67 mM)을 자일리톨의 농도 (26)를 통해서만 이루어졌다자일리톨-4-탈수소 효소 활성 21,26에서 00 밀리미터. 크실 로스 및 자일리톨 간의 열역학적 평형 강력 자일리톨 25, 27의 형성을 선호하는 것으로 나타났다. 또한, 크실 로스 수율 시츄 팩터 재생 시스템에서의 부재에 제공되어야하는 고가의 보조 인자의 양에 의해 제한된다. 함께, 이러한 요인 L 크실 로스 생합성 지속 시스템에 확장 가능성을 제한한다.
이러한 한계를 극복하고 L 크실 로스 생물 전환 수율을 향상시키기 위해, 보조 인자의 재생 전략은 결합 된 전체 세포 생 촉매 시스템을 확립함으로써 제를 사용 하였다. 구체적으로, L- 아라 비니 -4- 탈수소 Hypocrea의 jecorina 행 (EC 1.1.1.12) (HjLAD) 진균의 L-아라비 이화 경로의 효소, L-크실 로스 (28, 29)에 L-아라 비니의 전환을 촉진하기 위해 선택된 . 많은 생합성 효소와 같은 주요 limitatioHjLAD의 N은 상기 전환을 수행하기 위해 고가의 니코틴 아미드 아데닌 디 뉴클레오티드의 보조 인자 (NAD +, NADH의 산화 된 형태)의 화학량 론적 양을 필요로한다는 것이다. 연쇄상 구균 화농 (SpNox)에서 발견 된 NADH 산화 효소는 높은 보조 인자 - 재생 활동 (30, 31)를 표시하는 것으로 나타났다. SpNox, E.의이 속성을 활용 L 크실 로스의 제조 HjLAD를 발현하는 대장균 세포와 결합 된 E. NAD +의 재생에 SpNox 발현 대장균 세포는도 1a에 도시 된 커플 링 반응에 의해 도시 된 L 크실 로스 생산을 촉진한다. 최적의 조건 150 mM의 L-아라 비니의 초기 농도를 사용에서 최대 L 크실 로스 수익률은 훨씬 더 효율적으로 문헌에보고 된 것보다이 시스템을, 96 %에 달했다.
전 세포 고정화 전략은 상기 결합 biocatalyt의 재사용을 향상시키기 위해 다음의 이용했다IC 시스템. 전체 세포 고정화 일반적으로 사용되는 방법은 고체 매트릭스, 고분자 네트워크 (32)의 가교 / 함정 수사 및 캡슐에 연결 흡착 / 공유를 포함한다. 이러한 방법 중, 세포 고정화에 가장 적합한 방법은 칼슘 알기 네이트 비드에 캡슐화된다. 그들의 가벼운 겔화 특성, 불활성 수성 매트릭스와 높은 다공성 캡슐화 된 생물학적 (33)의 생리 학적 특성과 기능을 보존하는 데 도움이. 따라서, 결합 된 생 촉매 시스템은 E. 모두 포함 HjLAD 또는 SpNox 은닉 대장균 세포는 7 일주기 이후에 첫 번째 사이클의 전환 수율 65 %를 유지 국지적 고정화 생체 촉매 시스템이 잘 작동 안정성을 입증 L 크실 로스 생산의 다수의 사이클을 사용하는 칼슘, 알기 네이트 비드에 (도 2) 고정화 연속 재사용 자유 전지 시스템은 거의 그 촉매 활성을 잃고있다.
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Protocol
1. 전체 세포 생체 촉매의 제조
참고 : 재조합 E. pET28a- SpNox 31 pET28a- HjLAD 28 대장균 형질 세포 이하 E.라고도 대장균 SpNox 및 E. 대장균 HjLAD, 각각.
- E.의 단일 식민지의 예방 37 O C, 250 rpm에서 대장균 루리아 - 베르 타니 (LB) 카나마이신 (50 μg의 / ml)로 보충 매체의 3 ㎖에 HjLAD 및 보육 통 O에 품어 / N.
- 1 문화를 희석 : / ㎖ 카나마이신 50 μg의 37 O를 C 부화 포함 신선한 LB의 200ml에 100, 250 rpm으로 외경까지 600 ~ 0.6에 도달한다.
- 배양액에 0.1 mM의 이소 프로필 β-D- 티오 갈 락토 피 라노 시드 (IPTG)를 첨가하여 HjLAD 단백질 발현을 유도하고 16 O C, 16 시간 동안 180 rpm으로 배양한다.
- 또한, 25 O C, 200 RP에서 유도을 수행만약 L 생합성 크실 로스 6 HR (하기 단계 2)를위한 m 당일 행한다.
- 유도 E. 수확 4 오 ℃에서 20 분 동안 3,200 XG에 원심 분리하여 대장균 HjLAD 세포 뜨는을 취소하고 세포 펠렛을 처리하기 위해 2 단계로 진행합니다.
- E. 1.4 - 병렬로 수행은 1.1 단계 대장균 SpNox.
2. 생합성 커플 링 E.에 의해 L 크실 로스 대장균 HjLAD 및 E. 공동 인자의 재생에 대한 대장균 SpNox
- E.의 세포 펠렛을 재현 탁 대장균 HjLAD 및 E. 콜라이 SpNox 별도로 5.0 g 건조 세포 무게 (gDCW) / L의 세포 밀도로 50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.0)이다.
참고 gDCW 600 나노 미터 (OD 600)에서 측정 된 광학 밀도 사이의 상관 관계는, 실험을 용이하게 확립 할 수있다. 에 사용되는 수식이 프로토콜은 1 gDCW / L = 0.722 * OD 600 - 다른 분석기에 따라 다를 수 있습니다 0.0965. - 5.0 gDCW / L E. 600 μl를 혼합 대장균 HjLAD, 5.0 gDCW / L E. 600 μL 콜라이 SpNox, 14 mL의 20 mM의 NAD + 100 ㎕, 2 M의 L-아라 비니 150 μL 둥근 바닥 튜브 및 50 mM 트리스 - 염산 550 μL를 첨가하여이 용액에 반응 부피를 가지고 (PH 8.0) .
주 : 두 전체 세포 생 촉매의 양의 비는 제품의 생합성을 향상시키기 위해 최적화 될 수있다. 서술 된 시스템, E.의 비로 대장균 SpNox : E. 대장균 HjLAD 1 = 1이 L 크실 로스 생합성 (그림 1B)를위한 최적의 것으로 밝혀졌다. - 30의 C O 8 시간 동안 200 rpm에서 반응 혼합물을 인큐베이션.
- 4 O C에서 원심 분리 한 후 상등액을 수집 3,200 XG에 10 분 A에 대한차 아래 3 단계에 설명 된대로 L 크실 로스 생산을 정량화로 진행합니다.
L 크실 로스 정량 3. 비색 분석
- 기음 1.5 ML 튜브로 단계 2.4에서 수집 반응 상층 액 100 ㎕.
- 1.5 % 시스테인 50 μL, 70 % 황산을 900 ㎕의 에탄올에 용해 된 0.1 % 카바 졸 50 μl를 첨가하고, 튜브를 3 회 반전시켜 부드럽게 혼합한다.
- 입출력 37 C, 20 분 동안 200 rpm에서 반응 혼합물을 인큐베이션.
- 분광 광도계를 사용하여 560 나노 미터 (560)에서 반응 혼합물의 흡광도를 측정한다.
- 560는 A 기록이 1 이상이면, 반응 액을 희석한다.
칼슘 알긴산 비즈에서 재조합 전체 셀 촉매의 고정화 (4)
- 100 ml의 증류수에 4g의 알긴산 나트륨을 녹인다. 의를 추가하여 알긴산 용액을 제조물에 대한 비난의 알긴산은 덩어리의 형성을 방지 할 수 있습니다. 필요한 경우 혼합물을 가열한다.
- 5.0 gDCW / L E.의 600 μl를 추가 대장균 HjLAD 5.0 gDCW / L E. 600 μL 콜라이 SpNox 1.2 ml의 4 %의 알긴산 단계 4.1 제조 및 기포 형성을 방지하기 위해 부드럽게 피펫 팅하여 세포와 알긴산 섞는다.
- 연속 교반하면서 100 ㎖ 비이커에 (염화칼슘 2) 솔루션을 바늘을 이용하여 주사기에 알지네이트 / 세포 현탁액을 대기음 및 0.3 M 염화 칼슘에 적가 혼합물을 추가합니다.
주 : 알긴산 물방울이 완전히 잠길 수 있도록 알긴산 비드 형성을 위해 사용 CaCl2를 용액의 부피가 충분해야한다. 또한, 주사기 바늘과 염화칼슘 수용액의 표면 사이의 거리를 균일하게 구상 비드의 형성을 보장하기 위해 최적의 범위로 유지되어야한다. 거리의 최적 범위는 실험을 결정할 수있다아군과 바늘의 내부 직경에 따라 다르다. 예상 된 바와 같이, ~ 15 ± 5 cm의 거리가 0.6 cm (내경) 주사기 바늘에 대해 최적 인 것으로 밝혀졌다. - 가교 겔 비드를 형성 할 수 있도록 교반없이 실온에서 3 시간 - 2에 대한 염화칼슘 2 용액에 구슬을 둡니다.
- 조심스럽게 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 CaCl2를 용액을 부어 구슬을 방해하지 않고 CaCl2를 용액을 경사 분리하고, 또 다른 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 CaCl2를 용액에 남아있는 비드 옮긴다.
- CaCl2를 과도 캡슐화되지 않은 세포를 제거하기 위해 50 mM Tris-HCl (pH8.0)을 10 ㎖로 3 회 비드 버퍼 씻는다.
노트: 주어진 단계에서 그들을 파열 것이다 이렇게 같은 구슬을 원심 분리하지 않습니다. 5 분 - 솔루션에서 구슬을 분리하기 위해, 현탁액 3 그대로 방치한다. 비드 바닥에 침전되고 세척 완충액 경사 분리 될 수있다다른 용기에.- 사용 된 세척 버퍼를 버리지 마십시오. 단계 4.5에서 수집 CaCl2를 사용한 용액과 사용하는 트리스 -HCl의 세척 완충액 (30 ㎖)을 풀.
- 미 고정 E. 펠렛 풀링 된 CaCl2를 트리스 - 염산 용액을 원심 분리하여 대장균 세포는 20 분 동안 3200 × g으로 46 단계에서 수집. 단계 2.1에 기재된 바와 같이 고정화 효율을 결정하기 gDCW / L의 펠릿 캡슐화되지 않은 세포의 밀도를 계산한다.
- 튜브로 단계 4.6에서 세척 구슬을 전송합니다. 단계 2.2에 따라 - 3.4 세포 펠렛 대신에 세정 비드를 모두 사용하여 L 크실 로스 생합성을 평가.
L 크실 로스 생산을위한 고정화 생체 촉매 5. 안정성 분석
- 단계 4.8에서 비드를 수집한다 (단계 4.6에 기재된 바와 같이)를 원심 분리없이 50 mM 트리스 -HCl (pH 8.0) 완충액 10 ㎖로 두 번 세척 하였다.
- 모든 사용3.4 - 단계 2.2에 기재된 바와 같이 세정 비드의 반응을 수행한다.
- 생산 사이클의 원하는 수의 5.2 각 사이클에서, 반응 상층 액 제조 L 크실 로스의 양을 측정 - 반복 단계 5.1.
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Representative Results
보조 인자의 재생을 가능하게하기 위해, L 크실 로스 합성 E. 함유 결합 전체 세포 생 촉매 시스템 행했다 대장균 HjLAD 및 E. 대장균 SpNox 세포. 다양한 파라미터의 최적화에 따라,이 시스템의 재사용 칼슘 알기 네이트 비드에 (도 2)를 고정함으로써 개선되었다.
커플 링 E.에 의해 공동 인자 재생에 L 크실 로스 생산 대장균 HjLAD 및 E. 대장균 SpNox 세포.
, L 크실 로스로 E.를 L-아라 비니의 생물 전환을 향상 대장균 HjLAD 및 E. SpNox 대장균 세포를 활성화하기 위해 결합 된보조 인자 재생. E.의 단백질 발현 및 보조 인자 가용성의 차이를 설명하기 위해 대장균 SpNox 및 E. 대장균 HjLAD 세포, 다양한 E.에서 L 크실 로스 수율의 비교 연구 대장균 SpNox -to- E. 콜라이 HjLAD 비를 수행 하였다. 도 1b에 도시 된 바와 같이, 수율이 증가 E. 대장균 SpNox -to- E. 대장균 HjLAD는 비율은 0.13로 증가 : 1 1 : 1. 1, 1.33 : 1의 비율 득량 1이 연결된 시스템과 동등한 최대였다. 모든 추가 실험은 E.으로 수행 하였다 대장균 SpNox -to- E. (1)의 대장균 HjLAD 비율 : 1. 150 mM의 L-아라 비니의 초기 농도, E. 사용부터 대장균 HjLAD의 생 촉매는 단독으로 8 시간 (포화 시점 이후 118 MM의 L 크실 로스를 생산79 % (그림 1C)의 수율을 나타내는 L 크실 로스 농도)에 대한. 비하여 E. 사용 대장균 HjLAD 및 E. 1에서 대장균 SpNox 세포 : 1 비율은 96 %에 수율을 개선, 144 MM의 L 크실 로스를 생산했다.
전체 세포 생 촉매 고정화 최적화
칼슘, 알기 네이트 비드에 고정화 생체 촉매의 생물 반응기에서의 물리적 스트레스로부터 세포를 보호하는 중성 겔 환경의 결과로서 개선 된 가능성과 같은 많은 이점을 제공한다. 이러한 알긴산 비드의 특성은 주로 제제 및 가공 파라미터 (34)에 의해 결정된다. 상술 한 결합 전체 세포 생 촉매의 고정 된 형태로 L 크실 로스의 생산 수율을 최적화하기 위해, 두 가지 변수, 즉, 알긴산 나트륨 농도와 CaCl2를 농도를 평가 하였다. 이것들은차례로 생 촉매 고정화 효율 및 분자 확산에 영향을 미치는 칼슘, 알긴산 비드의 무결성 및 강성을 결정하는 주요 매개 변수.
도 3a에 도시 된 바와 같이, 생체 촉매 고정화 효율이 하나의 범위에서 알긴산 나트륨의 농도가 증가함에 따라 증가하는 경향을 입증 - 3 % (W / V). 고정화 매트릭스에 사용되는 알긴산 나트륨의 농도가 1 % 미만이었을 때, 그 결과 비드 주위 CaCl2를 용액에 세포의 대부분을 방출로 인해 낮은 기계적 안정성을 깨지기 쉽게 파손되었다 (데이터는 미도시). 이상 2 % 알긴산 나트륨의 농도가 증가하면, 생성 된 비드를 35 분 확산 (도 4)에 문제가 지나치게 경화 선도. 생 촉매의 immobilizat에서 유사한 경향은 염화칼슘이 농도 나왔고 변화이온 효율. 알긴산 나트륨의 고정 된 농도 (/ w 2 % V) 및 0.1 내지 - 0.4 M CaCl2를, 저급 CaCl2를 농도 결과 비드의 강성이 감소하고, 주위의 용액에 세포의 누설을 증가. 이는 알긴산 고분자 쇄 (36) (도 3b)에 guluronate 블록을 상호 연결하는 칼슘 이온의 제한된 가용성이다. 그러나, 0.3 M 내지 0.4 M의 CaCl2를 농도를 증가시키는 것은 단지 가장자리 생 촉매 고정화 효율을 향상시켰다. 때문에 높은 고정화 효율 (> 90 %)로, 염화칼슘 2 농도를 넘어 0.4 M 평가되지 않았습니다. 0.1 M의 CaCl2를 농도가 사용될 때, (데이터 미도시)를 생 촉매를 함유 알긴산 나트륨 액적의 CaCl2를 용액에 무너 더 구형 비드가 형성되지 않았다.
을 극대화 할상당히 칼슘 알긴산 비드의 분자 확산, 알긴산 나트륨 및 염화칼슘이 농도를 저하없이 생 촉매 고정화 효율이 향상 다음 L 크실 로스 생산 최적화 하였다. (- w 3 % / V 알긴산 나트륨 및 0.1-0.4 M CaCl2를 1), 2 %의 최적의 알긴산 나트륨의 농도가 L 크실 로스 생산의 최대 수율을 달성하기 위해 관찰 하였다 (도 4a 고정화 효율과 동일한 농도 범위를 사용하여 ). 이 최적의 농도를 넘어, 수율이 감소하는 경향을 보였다. 이것은 칼슘, 알긴산 비드의 과도한 강도와 연관된 확산의 문제로 인해, 예상되었다. 마찬가지로 최적의 CaCl2를 농도 0.3 M (도 4b) 인 것으로 밝혀졌다. 도 3은 최적의 알긴산 나트륨의 농도 (2 %)와 함께 비드의 형성을 허용 CaCl2를 농도 (0.3 M)에 도시 된 데이터와 결합적절한 강성과 투자율은 최소한의 세포 누출 및 최대 L 크실 로스 생산 수율을 가능하게 설립되었다.
생 촉매 고정화의 전반적인 촉매 효율에 영향을 미치는 또 다른 요인은 캡슐화 된 세포 배양의 중량 인 것을 주목해야한다. 이 감소하는 경향을 보여 37 넘어서는 최적 접종 중량까지 세포 접종 증가함에 따라 촉매의 효율성이 증가한다. 이 감소에 대한 가능한 설명은 칼슘, 알기 네이트 비드에 걸쳐 분자의 확산을 방해하고 시스템의 촉매 효율이 저하 셀룰러 과밀이다. 상기 최적의 고정 상태를 사용하여, 높은 L 크실 로스 생산 3.75의 셀 로딩 (gDCW) 얻었다 / L (16) (데이터는 보이지 않음).
의 고정화 및 무료 전체 세포 생체 촉매의 재사용L 크실 로스 생산.
E. 1 : 1의 확립 최적화 조건을 사용 E.에 대장균 SpNox 유리 96 %의 훨씬 더 높은 수율에 비해 대장균 HjLAD 비율 2 % (w / v)의 알긴산 나트륨, 0.3 M CaCl2를 상기 고정 결합 된 전체 세포 생 촉매 출력 64 %의 최대 L 크실 로스 수율 결합 된 전체 전지 시스템 (도 5의 1주기). 참고 고정 E.의 수율 콜라이 HjLAD 셀 단독 (데이터 미도시)에 고정 결합 된 시스템뿐만 아니라 자유 단일 생 촉매 시스템 (79 %,도 1C)보다 낮은 경우에만 32.5 %였다. 고정화가 확산 제한 기판 때문인 생체 촉매의 활성을 감소하는 것으로 알려져 있지만, 고정시 생 촉매의 재사용 성 향상의 장점에 의해 보상되었을이 감소 예상되었다. 생 촉매의 안정성이 효과는도 5에 도시 된 배치 반응 공정을 반복 자유로운 고정 시스템을 행하여 관찰 L 크실 로스 수율 감소 경향에 의해 입증 하였다. 유리 시스템 수율은을 나타내는 고정 된 시스템보다 훨씬 가파른 감소를 보였다 무료 시스템의 효소 활성의보다 신속한 손실. 그 결과, 두 시스템이 연속 재사용 7주기의 끝에서 생산 사이클 2의 필적 L 크실 로스 수율 있었다 캡슐화 생 촉매는 안정성을 유지하고 원래 수율 65 %로 유지 된 자유 전체 셀 동안 시스템 L 크실 로스를 생산하는 능력을 10 % 미만을 유지 하였다. 이 고정화 생체 촉매가 L 크실 로스의 제조 및 그 효과적으로 재사용 될 수 있다는 것을 보여 위에 제조 방법에 큰 이점을 부여까지 생 촉매의 활성이 감소 능가 고정화로 인한 개선 된 재사용과 안정성의 이점,자유 전체 전지 시스템.
L 크실 로스의 생 촉매 제조 1. 결합 전체 셀 시스템 도표. (A)은 E. 회로도를 포함하는 결합 된 전체 전지 시스템에서 발생하는 보조 인자 재생 반응을 도시 각각 HjLAD 또는 SpNox을 품고 대장균 세포. 다른 E.와 L 크실 로스의 수율로 (B) 변형 E.에 대장균 SpNox 대장균 HjLAD 비율. (C) 만 E. 구성된 전체 세포 생 촉매로부터 L 크실 로스 수율 E. 구성된 결합 전체 전지 시스템에 비해 대장균 HjLAD 대장균 HjLAD 및 E. 보조 인자 재생 할 수있는 대장균 SpNox 세포. 표시된 그래프가 나타내는 평균 역3 개의 독립적 인 실험의 ndard 편차. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
알긴산 구슬에 캡슐화를 통해 전체 세포 생체 촉매의 그림 2. 고정화. 염화칼슘 용액에 알긴산 나트륨 - 세포 현탁액을 적가하여 균일 한 크기의 칼슘 알지네이트 비드의 형성을 나타내는 회로도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
의 고정화의 효율성에 영향을 미치는 그림 3. 매개 변수 알긴산 비드의 전체 세포 생 촉매. (A) 알긴산 나트륨의 함수로서 고정화 효율이 (B) CaCl2를 (M)의 농도 (V / w %). 표시된 그래프는 3 개의 독립적 인 실험의 평균과 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
(A) 알긴산 나트륨의 함수로서 고정 된 결합 전체 세포 생 촉매로부터 L 크실 로스의 수율의 평가도 4 (B) CaCl2를 (M)의 농도 (/ V w %). 도시 된 그래프는 3 개의 독립적 인 실험의 평균치와 표준 편차를 나타낸다.여윈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
생 촉매 재사용. 고정 및 무료 결합 된 전체 세포 생 촉매의 재사용의 7 연속 사이클 L 크실 로스 생산의 수율 그림 5. 평가는 각각 어둡고 밝은 회색으로 표시됩니다. 도시 줄거리는 3 개의 독립적 인 실험의 평균과 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
최근 기술의 발전은 생명 공학 산업에서의 시장 가치의 점진적인 상승의 결과로, 재조합 biotherapeutics의 상용화에 서지을 사용할 수있다. 하나는 이러한 발전은 확장 성 산업 시스템 (38)을 구축에 큰 약속을 보여 주었다 재조합 미생물의 대사 공학의 출현이다. 대부분의 프로세스에서와 같이, 유전자 조작 된 미생물에 의해 생산 된 재조합 생 분자의 성공적인 상업화는 시스템 (39)의 제조 수율에 크게 의존한다. 이것은 생 촉매 효소 지향 진화 생 촉매 활성 셋을 향상시키기 위해 구현 된 "무차별"유전 (39)의 신속한 개발을 주도하고있다. 그러나, 레 독스 경로 특정 대사 경로에 대한 단순한 생체 촉매 개선 OTH의 큰 영향으로 인해 생산의 경제 화에 영향을 충분하지이러한 고가의 보조 인자로서 어 필수 반응 요구. 스케일 업에도 향상된 생 촉매와 같은 시스템, 단지 생산 비용을 증가시키는 역할을한다. 따라서, 추가적인 전략적 방법은 보조 인자의 화학 양 론적 비율을 포함 bioreactions의 상용화가 필요합니다. 또한, 생 촉매의 재활용은 또한 생물 공정의 경제성을 향상시키는 것이 필요하다. 빠른 보조 인자 소비와 전체 세포 생체 촉매의 가난한 재사용의 제한 효과를 극복하기 위해, 우리는 이전에 보조 인자 재생과 안정된 재사용 (16)에 대한 고정, 결합 된 전체 세포 생 촉매 시스템을 개발했다. 본 연구에서 설명하는 커플과 대표적인 결과와 함께 개선 된 생물 전환 수율 및 재사용에 대한 두 전체 세포 생체 촉매를 공동 고정에 필요한 실험 절차입니다.
중요한 요소는 전체 셀 biocat 결합이 고려 될alysts 시스템의 재현성을 보장하기 위해 단백질을 유도하는 생 촉매 생성물 형성에 대해 설정된 조건에 걸쳐 정확한 제어를 유지한다. 유도 OD (600), 유도 시간 및 IPTG 농도와 같은 변수의 변화는 뱃치 변화를 최소화하기 위해 피해야한다. 또한, 세포 간 비율 재평가 다른 생물 전환을 위해 요구된다. E.합니다 대장균 HjLAD : E. 하나의 대장균 SpNox 비율 : 본 연구에보고 한 실험적인 최적화가 아닌 이론적 인 화학 양론 비에 의해 결정 하였다. 알긴산 칼슘 구슬 재조합 전체 세포 생 촉매 고정화 비드 강성 세포의 분포에 대하여 균일 성을 보장하기 위해 몇 개의 중요한 단계가있다. 우선, 알지네이트 용액을 물에 서서히 첨가 알긴산 나트륨에 의해 제조되어야하고 있지 반대 공동 응집을 방지 할로컬 알긴산 농도 따라서 가교의 정도에 영향을 ULD. 캡슐화 된 세포에 전단 응력을 가하기 기포의 형성을 방지하기 위해 셀 알지네이트 현탁액을 취급 할 때, 둘째, 부드러운 피펫 채용되어야 효율적인 물질 전달을 방해하고 심지어 비드 부유시킬 수있다. 거품이 탈출 수 있도록 30 분 - 경우 기포는 세포 알지네이트 현탁액을 20 그대로 방치, 현탁액에 도입된다. 비드를 만들 때 셋째, 세포 - 알지네이트 현탁액은 균일 한 크기 및 형태에 대한 염화칼슘 용액에 충분한 양으로 적가 방식으로 천천히 조심스럽게 첨가되어야한다. 염화칼슘의 불완전 잠긴 구슬 전지 누출에 기여할 수있는 불규칙 형상 불량 강성을 가질 것이다. 마지막으로, 잔류 세척 완충액에서 반응 부피의 변동을 피하기 위해, 단계 480에서 비드 가볍게 여과지로 도말 수 (자연 건조되지 않음).
E. 결합의 다른 전략을 사용 대장균 SpNox 및 E. 콜라이 HjLAD 세포 배양은 두 효소 사이의 원하는 비율을 유지하는 더 나은 제어를 제공. 또한, 하나의 단백질을 발현하는 세포가 감소 단백질 미스 폴딩 및 증가 된 단백질 발현 40, 41으로 이어질 수있는 그 공동 표현하는 여러 단백질,보다 적은 스트레스를 받는다. 따라서, 직접 전체 세포 결합 크게 제품 수율의 저하없이 멀티 효소 촉매 공정을 중재하는 능력을 제공한다. 이러한 리보솜 결합 부위 (44)는 직원당 될 수있는 힘 42, 43 및 개선 변화와 세균 프로모터의 신중한 선택으로하지만, 설립 전략D 공동 배양하거나 공동 발현 시스템 대상 효소의 비율을 통해 제한된 컨트롤을 완화. 많은 고정화 기술 중, 캡슐은 정제 효소에 더 적합 이러한 가교 및 흡착 등의 다른 방법을 통해 전체 세포 생체 촉매를 고정하기위한 여러 장점을 제공합니다. 세포를 캡슐화는 한천, 키토산, 검, 카라기난, 젤라틴과 같은 생체 물질의 다양한 실행 및 생체 촉매의 재사용 성을 향상시키기 위해 45 알긴산 수있다. 그러나, 칼슘 알지네이트 캡슐 고정화 효율과 생체 분자 (46, 47)의 생산에 대한 가장 효과적인 방법으로 밝혀졌다.
전체 박테리아 세포의 생체 촉매를 이용하여 하나의 중요한 한계는 야생형 E.에서 이종 단백질의 번역 후 변형에 대한 최소한의 능력 대장균 48. 이 진핵 세포 생체 촉매의 성공적인 사용 w 제한이 시스템을 ithin. 이러한 한계를 극복하기위한 대안은 더 진핵 포스트 병진 장치가 장착되어 효모 등의 미생물의 이용 될 수있다. 상술 한 시스템의 다른 제한은 재사용을위한 개선 된 고정화의 사용에 관한 것이다. 51 - 고정화 생체 촉매의 열악한 안정성을 방해하고, 생물 공정 (49)을 단순화하여 회전율을 향상시키기 위해 사용되는 공통 비용 효율적인 전략이다. 캡슐화 된 전체 세포 생체 촉매의 촉매 성능에 영향을 미치는 주요 변수는 알긴산 나트륨 농도 CaCl2를 농도, 셀 로딩 및 비드 크기를 포함한다. 이들 매개 변수는 서로 독립적이지 것을 인식하는 것이 중요하다. 이와 같이, 하나의 연구 내의 모든 인자의 포괄적 분석 따라서, 최적화에 대한 가장 중요한 매개 변수를 선택할 필요가 매우 시간 소모적이다. 평가 여기에 제시하는 것은의 효과입니다두 개의 매개 변수, 알긴산 나트륨과 염화칼슘 2 농도. 여기에서 상세히 설명하지 않지만, 우리는 이전에 (16)을 고정화 세포의 중량 수율의 의존성을 비교하여 셀 로딩의 최적화를 실시했다. 문헌에보고는 또한 변경된 수송 특성에 고정화 된 시스템의 증가 된 표면 영역을 통한 활성을 향상 효소 밀봉을 증가시킴으로써 또는 기판 및 제품의 확산을 변경하여 생산 수율을 조절할 수 비드 크기의 변화를 나타낸다. 고려하는 생 촉매 반응에 따라 다른 중요한 요소의 선택은 최적의 조건의 다른 세트의 생성을 초래할 수있는, 요구 될 수있다. 추가 매개 변수에 대한 최적의 조건의 설립에 대한 상세한 연구는 결합 된 전체 전지 시스템의 성능면에서 더 개선 범위를 제공합니다.
요약하면, 우리는 실험적 implemen 신고L 크실 로스의 개선 된 제조를 나타내는 칼슘 알기 네이트 비드에 고정 결합 된 전체 세포 생 촉매 시스템의 테이션. 기타 보조 인자 의존적 생 촉매 경로 많은 생물학적으로 중요한 분자의 높은 수율을 용이 다른 재조합 효소를 발현하여 여기에 설명 된 프로토콜을 사용하여 얻을 수있다. 또한,이 시스템은 제품 (52)과 같은 생화학 적 산소 요구량 (53) 미생물 바이오 센서 등의 생 촉매 제조 이외의 응용 프로그램 중 하나 냄비 다중 효소 생합성 개 이상의 재조합 생 촉매를 수용하도록 확장 될 수있다. (56) 바이오 연료 (57)에 대한 전체 세포 생물 공정, 금속 복구를위한 토양 bioaugmentation 58 biomining에 의해 식물의 성장 촉진 -이 시스템의 시너지 효과 기능을 활용, 공생 미생물 컨소시엄의 캡슐은 생물학적 정화 (54)와 같은 응용 프로그램의 무수한 사용할 수 있습니다 59
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언합니다. 이 신문은 알긴산 비드에 고정화 결합 된 전체 세포 생 촉매 시스템을 생성하는 자세한 방법을보고하는 것을 목적으로한다. 과학 참신은 이전의 연구 (16)에보고되었다.
Acknowledgments
이 연구는 교육 과학 기술부 (NRF-2013R1A1A2012159 및 NRF-2013R1A1A2007561), 건국 대학교의 교육부에 의해 투자 한국 연구 재단 (NRF)과 화학 공학 및 MCubed의 부서를 통해 기초 과학 연구 프로그램에 의해 지원되었다 미시간 대학의 프로그램.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB broth | Sigma Aldrich | L3022-6X1KG | |
| Kanamycin | Fisher | BP906-5 | |
| Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma Aldrich | I6758-10G | |
| Tris base | Fisher | BP1521 | |
| B-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate | Sigma Aldrich | N7004-1G | |
| L-Arabinitol | Sigma Aldrich | A3506-10G | |
| L-Cysteine | Sigma Aldrich | 168149 | |
| Sulfuric acid | Sigma Aldrich | 320501-500ML | |
| Carbazole | Sigma Aldrich | C5132 | |
| Ethanol | Fisher | BP2818-4 | |
| Sodium alginate | Sigma Aldrich | W201502 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | 223506-500G | |
| Excella E24 shaker incubator | New Brunswick Scientific | ||
| Cary 60 UV-Vis Spectrophotometer | Agilent Technologies | ||
| Centrifuge 5810R | Eppendrof | ||
| Beakers | Fisher | ||
| Syringe | Fisher | ||
| Needle | Fisher | ||
| Pioneer Analytical and Precision Weighing Balance | Ohaus |
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