Summary
örnek olarak L-iksuloz üretimini kullanarak kofaktör rejenerasyonu ve geliştirilmiş yeniden kullanılabilirliği eş hareketsiz tam hücre Biyokatalizörler için protokol sundu. Kofaktör yenilenmesi işlevsel tamamlayıcı enzimleri ifade eden iki Escherichia coli suşları birleştirilmesi ile elde edilir; Bütün hücre gibi bir biyokatalizör hareketsizleştirme kalsiyum aljinat taneleri hücre kapsülleme ile elde edilir.
Abstract
Biz son zamanlarda gelişmiş üretim verimi ve sürekli sentezi için kofaktör rejenerasyonu ve biocatalyst immobilizasyon yeteneği ile, basit yeniden kullanılabilir ve birleştirilmiş tüm hücre biyokatalitik sistemi geliştirdik. Açıklanan bu belge, E. iki oluşan bu tür bir sistemin geliştirilmesi için deneysel prosedür işlevsel tamamlayıcı enzimleri ifade coli suşları. Birlikte, bu iki enzim Biyoreaksiyon ürün verimini artırmak için pahalı yardımcı faktörler rejenerasyonunu aracılık etmek için işbirliği içinde işlev görebilir. Buna ek olarak, kalsiyum aljinat taneleri içinde bütün hücrelerin kapsüllenmesi ile bağlanmış biyokatalitik sisteminin bir hareketsiz hale getirilerek sentezlenmesi için bir yöntem rapor edilmiştir. Bir örnek olarak, E. bağlanması ile L-arabinitolden L-ksiluloz geliştirilmiş biyosentezi bu enzimler, L-arabinitolden dehidrojenaz ve NADH oksidaz ifade coli hücreleri. uygun koşullar altında ve 150 arasında bir başlangıç konsantrasyonu kullanılarakmM L-arabinitolden, maksimal L-ksiluloz verim literatürde daha yüksek olduğu% 96 ulaştı. ücretsiz cep sistemi neredeyse tamamen katalitik aktivite kaybetti birleştiğinde tüm hücre biyokatalizi hareketsiz formu, ardışık yeniden kullanım 7 döngüsünden sonra ilk döngüsünde elde edilen verim% 65 koruyarak iyi operasyonel kararlılık göstermiştir. Bu nedenle, burada bildirilen yöntemler L-iksuloz sanayi üretimi yanı sıra, genel olarak kofaktör kullanımını gerektiren diğer katma değerli bileşikler iyileştirilmesine yardımcı olabilir iki strateji sağlar.
Introduction
3 - mikroorganizmalar kullanılarak indirgeyici tam hücreli biyotransformasyon ticari ve terapötik önemli biyomoleküllerin 1 kemo-enzimatik sentezi için yaygın bir yöntem haline gelmiştir. 7 - Bu izole edilmiş enzimlerin kullanımı üzerinde birçok avantajı, özellikle maliyet-yoğun aşağı arıtma süreçlerinin ortadan kaldırılması ve uzun ömürlü 4 gösteri sunuyor. Kofaktörler ürünün oluşumu için gerekli olan biyokatalitik yollar için, bütün-hücre sistemleri pahalı olmayan, elektron-verici ko-substrat 5,8,9 eklenerek in situ kofaktör rejenerasyonunda sağlama potansiyeli vardır. 13 - Ancak, bu kapasite nadir veya pahalı ko-yüzeylerde 10 stokiyometrik konsantrasyon gerektiren reaksiyonlar için azalır. Birlikte bütün hücrelerin zayıf yeniden kullanılabilirliği ile, bu bir ölçeklenebilir ve sürekli süreden kurulmasını engellemektedirction sistemi. Bu eş çarpana-bağımlı Biyotransformasyon bütün hücre sistemlerine Stratejik modifikasyonlar bahsedilen sınırlamalarını aşmak için gereklidir. Spesifik olarak, işbirliği içinde çalışır bütün hücre biyokatalizörlerin kombinasyonu belirgin barındıran enzimler 14 verimlilik ve stabilitesini arttırmak için gösterilmiştir. Genellikle ticari olarak ürünlerin büyük ölçekli üretimi sağlayarak için kritik olan bu faktörler, CO-hareketsizleştirici biyokatalitik mikroplar 15 ile daha da optimize edilebilir. Biz son zamanlarda L-ksiluloz üretimi 16 kofaktör rejenerasyonu ve biocatalyst immobilizasyon hem sağlayan basit ve yeniden tam hücreli biyokatalitik sistemi geliştirdik. Bu çalışmada, bu sistem geliştirilmiş biyotransformasyon üretim verimi ve biocatalyst yeniden kullanılabilirliği için bu iki strateji uygulayarak deneysel prosedürleri göstermek için bir örnek olarak kullanılmıştır.
L-ksilüloz bir cla aittirBiyolojik yararlı moleküllerin ss nadir şekerler atadı. Nadir şekerler doğada çok nadir meydana gelen eşsiz monosakkaritler veya şeker türevleri, ancak biyoaktif molekülleri 17,18 tanıma elemanları olarak önemli rol oynarlar. Onlar tatlandırıcılar, fonksiyonel gıdalar potansiyel terapötik 19 arasında değişen çeşitli uygulamalar var. L-ksiluloz birden α-glukozidaz potansiyel bir önleyicisi olarak kullanılabilir ve aynı zamanda, hepatit ve karaciğer sirozu 17,20 bir göstergesi olarak kullanılabilir. Bütün hücre sistemlerinde, L-ksiluloza ksilitol Yüksek verimlilik dönüşüm Pantoea daha önce bildirilmiştir 21,22, Alcaligenes SP ananatis. 701B 23 Bacillus pallidus Y25 24,25 ve Escherichia coli 26. E. E. coli, bununla birlikte, bunun nedeni daha yüksek 1 den bir başlangıç ksilitol konsantrasyonu potansiyel inhibitör etkileri, düşük (<67 mM) ksilitol konsantrasyonları 26 ile sadece elde edildiKsilitol-4-dehidrogenaz aktivitesinin 21,26 00 mM. Ksiluloz ve ksilitol arasında termodinamik denge güçlü ksilitol 25,27 oluşumunu teşvik ettiği gösterilmiştir. Buna ek olarak, ksiluloz verimi in situ kofaktör rejenerasyon sisteminde yokluğunda tedarik gereken pahalı kofaktör miktarı ile sınırlıdır. Birlikte, bu faktörler L-ksiluloz biyosentezi için sürdürülebilir sistemlere ölçekleme potansiyelini sınırlar.
Bu sınırlamaları aşmak ve L-ksiluloz biyotransformasyon verimi artırmak için, kofaktör yenilenme stratejisi birleştiğinde tüm hücre biyokatalitik sistemi kurarak ilk istihdam edildi. Spesifik olarak, L-Arabinitol 4-dehidrojenaz Hypocrea jecorina den (EC 1.1.1.12) (HjLAD), mantar, L-arabinoz katabolik yolunda bir enzim, L-ksiluloz 28,29 içine L-arabinitolden dönüşümünü katalize etmek için seçildi . Birçok biyosentetik enzimlerin gibi, büyük bir limitatioHjLAD n bu dönüşümü gerçekleştirmek için pahalı nikotinamid adenin dinükleotid kofaktör (NAD + NADH oksitlenmiş biçimi) stoikiometrik bir miktarda gerektirmesidir. Streptococcus pyogenes (SpNox) bulunan NADH oksidaz yüksek eş çarpana-yenilenmesi etkinliğini 30,31 göstermek için gösterilmiştir. SpNox, E. bu niteliğin yararlanan L-ksiluloz üretimi için HjLAD ifade coli hücreleri E. ile birlikte, NAD + rejenerasyonu için SpNox ifade coli hücreleri Şekil 1A'da gösterilen bağlanmış reaksiyon ile gösterilen L-ksiluloz üretimi artırmak için. Optimal koşullar ve 150 mM L-arabinitolden bir başlangıç konsantrasyonu kullanılarak altında, maksimum L-ksiluloz verimi çok daha verimli literatürde daha bu sistemin hale% 96 olmuştur.
Bütün hücre immobilizasyon stratejisi daha da birleştiğinde biocatalyt tekrar kullanılabilirliği arttırmak için bir sonraki istihdam edildiic sistemi. Bütün hücre hareketsizleştirme için yaygın olarak kullanılan yöntemler, katı matrisler, polimer ağları 32 çapraz bağlanma / sıkışması ve kapsülleme bağlantı adsorpsiyon / kovalent bulunmaktadır. Bu yaklaşımlar arasında, hücre immobilizasyon için en uygun yöntem kalsiyum aljinat boncuk kapsülleme olduğunu. Onların hafif jelleşme özellikleri, atıl sulu matris ve yüksek gözeneklilik kapsüllü biyolojik 33 fizyolojik özelliklerini ve işlevselliğini korumak yardımcı olur. Bu nedenle, bağlanan bir biyokatalizör sistemi E. her ikisini de içeren HjLAD ya SpNox barındıran E. coli hücreleri, 7 döngüsünden sonra birinci aşama dönüşüm verimi% 65 muhafaza .bir hareketsizleştirilmiş bir biyokatalizör sistemi iyi çalışma kararlılık göstermiştir, L-ksiluloz üretiminin çok döngüleri sağlamak için kalsiyum aljinat taneleri (Şekil 2) hareketsizleştirildi ardışık tekrar kullanımı, ücretsiz hücre sistemi neredeyse tamamen katalitik aktivite kaybetti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tüm hücre Biocatalysts Hazırlık
Not: Rekombinant E. pET28a- SpNox 31 ya da pET28a- HjLAD 28 barındıran E. coli hücreleri, bundan sonra, E. olarak adlandırılır E. coli SpNox E. E. coli HjLAD sırasıyla.
- E. tek bir koloni İnokülasyon 37 o C, 250 rpm'de coli Luria-Bertani (LB), kanamisin (50 ug / ml) ile takviye edilmiş ortam 3 ml HjLAD bir inkübatör çalkalama O inkübe / N.
- 1 ile kültür sulandırmak: / ml kanamisin ve 50 ug 37 o C'de inkübe içeren taze LB 200 ml, 100, 250 rpm OD kadar 600 ~ 0.6 ulaşır.
- Kültür ortamına 0.1 mM izopropil β-D-tiogalaktopiranosid (IPTG) ilave edilerek HjLAD proteini ifadesine sebep 16 o C, 16 saat boyunca 180 rpm'de inkübe edin.
- Alternatif olarak, 25 o C, 200 rp de indüksiyon gerçekleştirmekeğer L-ksiluloz biyosentezi 6 saat (aşağıda Adım 2) m aynı gün yapılır.
- Indüklenen E. hasat 4 O ° C'de 20 dakika boyunca 3200 x g'de santrifüj ile E. coli HjLAD hücreleri Süpernatantı atın ve hücre pelletini işlemek için 2. Adıma geçin.
- E. 1.4 - Buna paralel olarak, gerçekleştirmek 1.1 adımları E. coli SpNox.
2. biyosentezi Kavrama E. L-ksiluloz E. coli HjLAD E. Kofaktör Rejenerasyon için coli SpNox
- E. Hücre topakları yeniden süspanse E. coli HjLAD E. E. coli SpNox ayrı 5.0 g kuru hücre ağırlığı (gDCW) / L'lik bir hücre yoğunluğunda, 50 mM Tris-HCI tampon maddesi (pH 8.0) 'de.
Not: gDCW ve 600 nm'de (OD600) de ölçülen optik yoğunluğu arasında bir ilişki deney kolaylaştırmak için kurulmuş olabilir. kullanılan, formülBu protokol, 1 gDCW / L = 0.722 * OD 600 - Farklı spektrometre arasında değişebilir 0,0965. - 5.0 gDCW / L E. 600 ul karıştırın E. coli HjLAD, 5.0 gDCW / L E. 600 ul E. coli SpNox, 14 ml, 20 mM NAD +, 100 | il, ve 2 M, L-arabinitolden 150 ul, yuvarlak tabanlı tüpü ve 50 mM Tris-HCl, 550 ul ekleyerek 2 ml reaksiyon hacmi (pH 8.0) .
Not: iki tam hücre biyokatalizörlerinin miktarına göre oranı, ürünün sentezini artırmak için optimize edilebilir. Anlatılan sistemin, E. oranın E. coli SpNox E. E. coli HjLAD = 1: 1, L-ksiluloz biyosentez (Şekil 1B) için en uygun olduğu bulunmuştur. - 30 ° C, 8 saat 200 rpm'de Reaksiyon karışımı inkübe edin.
- 4 o C'de santrifüj sonra süpernatant toplayın 3.200 xg 10 dakika a içinnd aşağıda Adım 3'te açıklandığı gibi, L-ksiluloz üretimini ölçmek için devam edin.
L-ksiluloz ölçümü için 3. Renk Ölçümü Tahlili
- Aspire 1.5 ml tüp içine adım 2.4 toplanan reaksiyon süpernatant 100 ul.
- % 1.5 Sistein 50 ul,% 70 sülfürik asit, 900 ul, ve etanol içinde çözülmüş% 0.1 karbazol 50 ul ilave edin ve boru 3 kez ters yüz edilerek yavaşça karıştırın.
- 37 o C, 20 dakika boyunca 200 rpm'de, reaksiyon karışımı inkübe edin.
- Bir spektrofotometre kullanılarak 560 nm'de (A 560), reaksiyon karışımının, optik absorbansı ölçülür.
- A 560 okuma, 1 üzerinde ise reaksiyon karışımı sulandırmak.
Kalsiyum Aljinat Boncuk Rekombinant Tüm hücre Katalizörler 4. İmmobilizasyonu
- damıtılmış su, 100 ml 4 g sodyum alginat çözülür. s ekleyerek aljinat çözeltisi hazırlayınsu odium aljinat kümeleri oluşumunu önlemek için. Gerekirse karışımı ısıtın.
- 5.0 gDCW / L E. 600 ul ekle E. coli HjLAD ve 5.0 gDCW / L E. 600 ul E. coli SpNox 1.2 ml% 4 aljinat adımında 4.1 hazırlanan ve kabarcık oluşumunu önlemek için yumuşak pipetleme hücreleri ve aljinat karıştırın.
- Sürekli karıştırılarak 100 ml'lik bir beher içinde (CaCI2) çözeltisi, bir iğne ile bir şırınga içine aljinat / hücre süspansiyonu aspire ve 0.3 M kalsiyum klorür içine damla damla karışımı ekleyin.
Not: aljinat damlacıkları tamamen sular altında olması için aljinat boncuk oluşumu için kullanılan CaCl2 çözeltisinin hacmi yeterli olmalıdır. Buna ek olarak, şırınga iğnesi ve kalsiyum klorür çözeltisi yüzeyi arasındaki mesafe eşit küresel boncuklar oluşmasını sağlamak için en uygun aralıkta muhafaza edilmelidir. Optimum mesafe aralığı deneyi tespit edilebilirally ve iğne iç çapına bağlıdır. bir tahmin olarak, ~ 15 ± 5 cm'lik bir mesafenin 0.6 cm (iç çap) şırınga iğnesi için en uygun olduğu bulunmuştur. - Çapraz bağlama ve jel boncukları oluşumuna izin vermek için karıştırmadan oda sıcaklığında 3 saat - 2 CaCI2 çözeltisi boncuk bırakın.
- Dikkatli bir 50 ml'lik konik tüp içine CaCl2 çözeltisi dökerek boncuk bozmadan CaCl2 çözeltisi Durusu ve başka bir 50 ml konik tüp içine CaCl2 çözeltisi içinde kalan boncuk aktarın.
- CaCl2 aşırı ve enkapsüle hücreleri çıkarmak için, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 ml ile üç kez boncuk yıkama tamponu.
NOT: Herhangi bir aşamada, onları kopma böylece yapıyor gibi boncuk santrifüj yok. 5 dakika - çözeltiden boncuk ayırmak için, süspansiyon 3 rahatsız bekletin. boncuk dibinde yerleşmek ve yıkama tamponu dekante edilebilirBaşka bir kabın içine.- Kullanılan yıkama tamponu atmayın. Aşama 4.5 toplanan ikinci CaCI2 çözeltisi ile Tris-HCI yıkama tamponu (30 mi) havuz.
- Un-immobilize E. pelet bir araya getirilmiş CaCl2 ve Tris-HCl çözeltisi santrifüj ile coli hücreleri 20 dakika boyunca 3200 x g'de adım 4.6 toplanmıştır. Adım 2.1 'de açıklandığı gibi immobilizasyon etkinliğini belirlemek için, gDCW / L pelet enkapsüle hücrelerin yoğunluğunu hesaplamak.
- Bir tüp içine adım 4,6 yıkanmış boncuk aktarın. adımları 2.2 izleyin - 3.4 hücre pelet yerine yıkanmış boncuklar her kullanılarak L-ksiluloz biyosentezini değerlendirmek için.
L-ksiluloz Üretimi için İmmobilize 5. Stabilite Testi
- Aşama 4.8 boncuk toplayın ve (Kademe 4.6 de tarif edildiği gibi), santrifüj olmadan 50 mM Tris-HCI (pH 8.0) içinde 10 ml tampon ile iki kez yıkanır.
- tüm kullan3.4 - adım 2.2 de tarif edildiği gibi yıkanmıştır tanelerin reaksiyonu gerçekleştirmek için.
- Üretim döngüsü istenen sayıda 5.2 ve her döngüde reaksiyon süpernatant üretilen L-iksuloz miktarını ölçmek - Tekrar 5.1 adımları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kofaktör yeniden oluşmasını sağlar, L-ksiluloz sentezi E. ihtiva eden bir bağlanmış bütün hücre biyokatalitik sistemde gerçekleştirildiği E. coli HjLAD E. E. coli SpNox hücreleri. Çeşitli parametrelerin optimizasyonu sonra, bu sistemin yeniden kullanılabilirliği kalsiyum aljinat taneleri (Şekil 2) bunu hareketsiz arttırılmıştır.
Kavrama E. Kofaktör Yenilenme L-ksilüloz Üretimi E. coli HjLAD E. E. coli SpNox hücreleri.
L-ksiluloz halinde E. L-arabinitolden biyo dönüşümünü arttırmak için E. coli HjLAD E. E. coli SpNox hücreleri etkinleştirmek için birleştirildikofaktördür yenilenmesi. E. Protein ekspresyonu ve kofaktör durumunu farklılıkları hesaba katmak E. coli SpNox E. coli HjLAD hücreleri, çeşitli E. L-ksiluloz verim bir karşılaştırma çalışması E. coli SpNox -to- E. E. coli HjLAD oranları uygulandı. Şekil 1B 'de gösterildiği gibi, verim E. arttıkça E. coli SpNox -to- E. E. coli HjLAD oranı 0.13 yükselmiştir: 1 ila 1: 1 arasındadır. 1 ve 1.33: 1 oranları için elde edilen verimler 1 Bu birleşik sistem için eşdeğer ve maksimal edildi. Tüm diğer deneyler E ile gerçekleştirildi E. coli SpNox -to- E. 1 coli HjLAD oranı: 1 arasındadır. 150 mM L-arabinitolden bir başlangıç konsantrasyonunda, E. kullanımı ile başlayarak E. coli HjLAD biocatalyst yalnız 8 saat (doyma noktasından sonra 118 mM L-ksilüloz üretti% 79 (Şekil 1C) 'in bir ürününü temsil L-ksiluloz konsantrasyon) için. Buna karşılık, E. kullanımı E. coli HjLAD E. Bir 1 coli SpNox hücreleri: 1 oranında% 96 verim yükselir, 144 mM L-ksiluloz üretti.
Tüm hücre biyokatalizör İmmobilizasyonu optimizasyonu
kalsiyum aljinat tanelerinde biyokatalizörlerin immobilizasyonu bir biyoreaktörde fiziksel strese hücreleri korur hafif jel ortamının bir sonucu olarak, daha iyi canlılığı gibi birçok avantaj sunar. Bu aljinat taneleri özellikleri büyük ölçüde formülasyon ve işleme parametreleri 34 ile tespit edilir. Yukarıda tarif edilen bağlanmış bütün hücre-katalizör bir hareketsiz biçimde L-ksiluloz üretim verimini optimize etmek için, iki temel parametre, yani sodyum alginat konsantrasyon ve CaCl2 konsantrasyonu değerlendirilmiştir. Bunlarsırayla biocatalyst immobilizasyon verimi ve moleküler difüzyon etkileyen kalsiyum aljinat boncukları, bütünlüğünü ve sertlik belirleyen ana parametreleri.
Şekil 3A'da gösterildiği gibi, bir biyokatalizör hareketsizleştirme etkinliği 1 aralığında sodyum alginat konsantrasyonunun ise artan bir eğilim göstermiştir -% 3 (a / h). Immobilizasyon matris içinde kullanılan sodyum alginat konsantrasyonu% 1'den daha az olduğu zaman, elde edilen boncuk Çevre CaCI2 çözeltisi içine hücrelerin çoğu serbest nedeniyle düşük mekanik stabilite kırılgan ve kolay kırılan edildi (veriler gösterilmemiştir). % 2'den daha fazla, sodyum alginat konsantrasyonunu arttırarak sonra, elde edilen boncuk moleküler difüzyon 35 (Şekil 4) 'de sorunlara aşırı lider sertleştirilmiş. Biocatalyst immobilizat benzer bir eğilim CaCl2 konsantrasyonu saptanmış değişeniyon verim. Sodyum aljinat, sabit bir konsantrasyonu (ağırlık /% 2 h) ve 0.1 aralığında - 0.4 M CaCl2, düşük CaCI2 konsantrasyonu ile sonuçlanmıştır boncuk sertliği azalmış ve çevresindeki çözelti içine hücre sızmasını artmıştır. Bu, aljinat polimer zincirleri 36 (Şekil 3B) üzerinde guluronat blokları çapraz bağlanması için Ca + 2 iyonları sınırlı sayıda etmektir. Ancak, 0.3 M M 0.4 ila CaCl2 konsantrasyonunun artması sadece marjinal biocatalyst immobilizasyon verimliliğini artırdı. Yüksek olması nedeniyle immobilizasyon verimi (>% 90), CaCl2 konsantrasyonları ötesinde 0.4 M değerlendirilmemiştir. 0.1'in M CaCl2 konsantrasyonu kullanıldığı zaman, (veri gösterilmemiştir) lipas gibi biyokatalizatör ihtiva eden sodyum alginat damlacık CaCI2 çözeltisi içinde parçalandı ve hiçbir küresel taneler oluşturulmuştur.
en üst düzeye çıkarmak için,önemli ölçüde, kalsiyum aljinat taneleri moleküler difüzyon, sodyum aljinat ve CaCl2 konsantrasyonu yavaşlamadan biyokatalizör hareketsizleştirme etkinliği aşağıdaki geliştirilmiş L-ksiluloz üretim için optimize edildi. (W -% 3 / hac sodyum alginat ve 0,1-0,4 M CaCI2 1),% 2 optimal sodyum alginat konsantrasyonu, L-ksiluloz üretiminin maksimum verim elde etmek için gözlenmiştir (Şekil 4A hareketsizleştirme verimliliği aynı konsantrasyon aralığı kullanılarak ). Bu optimal konsantrasyon ötesinde, verim azalan bir eğilim göstermiştir. Bu, kalsiyum aljinat taneleri aşırı sertlik ile ilgili difüzyon sorunlara bağlı olarak, bekleniyordu. Benzer bir şekilde, uygun CaCI2 konsantrasyonu, 0.3 M (Şekil 4B) olduğu bulunmuştur. Şekil 3, optimum sodyum alginat konsantrasyonu (% 2) ve tanelerin oluşumuna izin CaCI2 konsantrasyonu (0.3 M) 'de gösterilen veri ile kombineUygun sertlik ve geçirgenlik minimal hücre kaçağı ve maksimal L-ksiluloz üretim verimini sağlayan kuruldu.
Hareketsizleştirilmiş biyokatalizör genel katalitik etkinliğini etkileyen bir başka faktör kapsüllenmiş hücre kültürü ağırlığıdır, dikkat edilmelidir. Bu azalma eğilimi 37 gösterir ötesinde optimal inokulum ağırlığı kadar hücre inokulum artan katalitik etkinlik artar. Bu düşüşün için olası bir açıklama kalsiyum aljinat boncukları boyunca moleküler difüzyon engelleyen ve sistemin katalitik verimini düşürür hücresel aşırı kalabalık vardır. Yukarıda optimize immobilizasyon koşulları kullanılarak, yüksek L-ksiluloz üretimi 3.75 hücre yükleme (gDCW) elde edilmiştir / L 16 (veriler gösterilmemiştir).
Için İmmobilize ve Serbest Tüm hücre biyokatalizi yeniden kullanılabilirliğiL-ksiluloz üretimi.
1 E.: 1 Kurulan optimize durumunu kullanarak E. coli SpNox ücretsiz% 96 daha yüksek bir verime göre E. coli HjLAD oranı,% 2 (ağ / hac) sodyum alginat, ve 0.3 M CaCl2, hareketsiz bağlanmış bütün hücre gibi bir biyokatalizör çıkış% 64 maksimal L-ksiluloz verimle birleştiğinde tam hücreli sistemi (Şekil 5 döngüsü 1). Not immobilize E. verimi E. coli HjLAD hücre başına (veriler gösterilmemiştir), hareketsiz kılınmış bağlanmış sisteminin yanı sıra serbest bir biyokatalizör sistemi (% 79, Şekil 1C) daha düşük, sadece% 32.5 idi. immobilizasyon difüzyon sınırlamaları alt tabakaya muhtemelen biyokatalizi aktivitesini azalttığı bilinmektedir, ancak immobilizasyon üzerine Biyokatalizör geliştirilmiş yeniden kullanım avantajı telafi gibi bu azalma bekleniyordu. Biyokatalizör istikrar üzerindeki bu etkisiŞekil 5'te gösterilen bir reaksiyon işlemine sürekli olarak serbest ve immobilize sistemleri tabi gözlenen L-ksiluloz verimle azalma eğilimine ile gösterdi. bilgilerini sistem verimi gösteren immobilize sistemin daha çok dik bir düşüş gösterdi bir sistemde enzim aktivitesinin daha hızlı bozulur. Sonuç olarak, her iki sistem birbirini izleyen yeniden kullanım 7 döngü sonunda üretim döngüsünde 2 için karşılaştırılabilir L-ksiluloz verim vardı, kapsüllü biyokatalistler kendi istikrarını muhafaza ve orijinal verim% 65 muhafaza ücretsiz bütün hücre iken sistem L-ksilüloz üretme kabiliyetini% 10'dan az korudu. Bu İmmobilize L-ksiluloz üretimi ve etkin bir şekilde yeniden kullanılabilir olduğunu gösterir fazla üretim işlemine önemli bir avantaj kazandıran çok-katalizör aktivitesinde azalma daha ağır basar immobilizasyon getirdiği gelişmiş yeniden kullanım ve kararlılık yararıücretsiz tam hücreli sistemi.
L-iksuloz ve Biyokatalitik Üretimi için 1. Coupled Tüm hücre Sistemi Şekil. (A) şematik E. içeren birleştiğinde tüm hücre sisteminde meydana gelen kofaktör rejenerasyon reaksiyonu gösteren sırasıyla HjLAD ya SpNox barındıran E. coli hücreleri. Farklı E ile L-ksiluloz verim (B) değişimi E. coli SpNox E. coli HjLAD oranları. (C), sadece E. oluşan bir bütün hücre biyokatalizör L-ksiluloz verim E. oluşan bir bağlı bütün hücre sistemi ile karşılaştırıldığında coli HjLAD E. coli HjLAD E. kofaktör rejenerasyona kabiliyetli coli SpNox hücreleri. gösterilen araziler temsil eden ortalama ve staÜç bağımsız deneyler ard sapması. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Aljinat Boncuk Kapsülleme aracılığıyla Tüm hücre biyokatalizi Şekil 2. İmmobilizasyonu. Kalsiyum klorür çözeltisine sodyum aljinat-hücre süspansiyonu damla damla ilave edilerek homojen büyüklükte Ca 2 + aljinat boncuk oluşumunu temsil şematik. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
İmmobilizasyonu Etkinliğinin Etkileyen Şekil 3. Parametreler Aljinat taneleri içinde Tüm hücre gibi bir biyokatalizör. (a) sodyum alginat bir fonksiyonu olarak immobilizasyon verimi (B), CaCl2 (M) konsantrasyonu (ağırlık / hacim%). Gösterilen araziler üç bağımsız deneyin ortalama ve standart sapmasını temsil eder. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
(A) sodyum alginat bir fonksiyonu olarak İmmobilize Coupled Tüm hücre gibi bir biyokatalizör L-ksiluloz Verim Şekil 4. Değerlendirme (B), CaCl2 (M) konsantrasyonu (ağırlık / hacim%). gösterilen grafikler, üç bağımsız deneyin ortalama ve standart sapmasını temsil eder.sıska "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Biocatalyst tekrar kullanılabilirliği. Immobilize ve serbest birleştiğinde tüm hücre Biyokatalizör yeniden kullanılması 7 ardışık döngüleri için L-ksiluloz üretim verimi Şekil 5. değerlendirilmesi sırasıyla koyu ve açık gri gösterilir. Gösterilen arsa, üç bağımsız deneyler ortalama ve standart sapmasını temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Son teknolojik gelişmeler biyoteknoloji sektöründe piyasa değeri kademeli artışa neden rekombinant Biotherapeutics ticarileştirilmesi bir dalgalanma sağlamıştır. Böyle bir gelişme ölçeklenebilir endüstriyel sistemlerin 38 kurulmasında büyük söz göstermiştir rekombinant mikroorganizmalar metabolik mühendislik, gelişi olduğunu. Çoğu usul olduğu gibi, genetik olarak mikroplar tarafından üretilen rekombinant biyomoleküllerin başarılı bir şekilde pazarlanmasını sistemi 39 üretim verimi üzerinde son derece bağlıdır. Bu biyokatalitik enzimlerin yönlendirilmiş evrim biocatalyst aktivitesini 3 geliştirmek amacıyla uygulamaya konmuştur "kaba kuvvet" genetik 39, hızlı gelişmesine yol açmıştır. Bununla birlikte, bu redoks yollar gibi belirli metabolik yolları için, sadece bir biyokatalizör iyileştirme oth önemli etkisi nedeniyle üretim tasarruflarda etkilemek için yeterli değildirBöyle pahalı kofaktör olarak er temel reaksiyon şartları. Ölçek-up bile gelişmiş Biyokatalizörler ile böyle bir sistemin, sadece üretim maliyetleri artırmak için görev yapacak. Bu nedenle, bir stratejik yöntemler kofaktör stoikiometrik oranları kapsayan biyoreaksiyonları ticarileştirilmesi için gereklidir. Buna ek olarak, bir biyokatalizör geri dönüşümlü bir bio-işleme ekonomik fizibilitesini geliştirmek için gereklidir. Hızlı kofaktör tüketimi ve bütün hücre biyokatalizi kötü kullanırlılık sınırlayıcı etkisini aşmak için, daha önce kofaktör rejenerasyonu ve istikrarlı yeniden kullanım 16 için hareketsiz, birleştiğinde tam hücreli biyokatalitik sistemi geliştirdik. Bu çalışmada açıklanan çift ve temsili sonuçları ile birlikte geliştirilmiş biyotransformasyon verim ve yeniden kullanım için iki tam hücreli Biyokatalizörler, ko-hareketsiz gerekli deneysel prosedürler vardır.
Önemli bir faktör, bütün hücre biocat bağlanması için dikkate alınması gerekenkatalizörler, sistemin tekrarlanabilirliği sağlamak için protein indüksiyon ve biyokatalitik ürün oluşumu için belirlenen şartlara üzerinde kesin bir kontrol korunmasıdır. İndüksiyon OD 600, indüksiyon süresi ve IPTG konsantrasyonu gibi parametreleri varyasyonlar partiden partiye varyasyonu en aza indirmek için kaçınılmalıdır. Buna ek olarak, hücre-hücre oranının yeniden değerlendirme farklı Biyotransformasyon için gereklidir. E. Not E. coli HjLAD E. 1 coli SpNox oranı: Bu çalışmada rapor edilen 1. Deneysel optimizasyon yerine teorik stoikiometrik oranı ile tespit edildi. Kalsiyum aljinat boncuk rekombinant tüm hücre biyokatalizi immobilizasyon için, boncuk sertliği ve hücrelerinin dağılımı ile ilgili yeknesaklığı sağlamak için birkaç kritik adımlar vardır. İlk olarak, aljinat çözeltisi, su içerisine yavaş yavaş ilave sodyum alginat hazırlanabilir gerekir, ve bunun tersi birlikte topaklanma bilmekYerel aljinat konsantrasyonuna ve bu şekilde çapraz bağlanma derecesini etkileyebilir ULD. Kapsüllenmiş hücreleri üzerinde kesilme baskısı indirebilmek hava kabarcığı oluşumunu önlemek için hücre-aljinat süspansiyonu tutarken İkinci olarak, yumuşak bir pipet kullanılması gereken etkin kütle transferini engelleyen ve hatta boncuk yüzer neden olabilir. kabarcıklar kaçmasına izin 30 dakika - durumda hava kabarcıkları hücre aljinat süspansiyon 20 rahatsız bekletin, süspansiyon sokulur. boncuk yaparken Üçüncü olarak, hücre-alginat süspansiyonu tekbiçimli boyut ve morfoloji açısından kalsiyum klorid çözeltisinin yeterli bir hacmi içine damla damla bir tarzda yavaş yavaş ve dikkatli bir şekilde ilave edilmelidir. Kalsiyum klorür eksik batık Boncuk hücre kaçak katkıda bulunabilir düzensiz şekil ve kötü sertliğe sahip olacak. Son olarak, kalan yıkama tampon reaksiyon hacminde değişkenliği önlemek için, Adım 4.8 boncuklar hafifçe filtre kağıdı ile lekelenen edilebilir (hava kuru değil).
E. bağlanması farklı bir strateji kullanır E. coli SpNox E. coli HjLAD hücre kültürleri, iki enzim arasındaki istenen oranı korunarak daha iyi bir kontrol sunar. Ek olarak, tek proteinler ifade eden hücreler, indirgenmiş protein yanlış katlanması ve artan protein ekspresyonu 40,41 yol açabilecek bu ko-eksprese eden birden fazla protein, daha az strese maruz kalmaktadır. Böylece, doğrudan tam hücreli bağlama önemli ölçüde ürün verimi ödün vermeden çok enzim katalitik süreçleri arabuluculuk yeteneğini sunar. Ribozom bağlama bölgeleri 44 employe olabilir gücü 42,43 ve iyileştirmeler değişen bakteriyel promotörlerin dikkatli seçimi Ancak oluşturulan stratejilerD ko-kültür ya da ko-sentezleme sistemleri, hedef enzim oranı üzerinde sınırlı kontrol hafifletmek için. Birçok immobilizasyon teknikler arasında, kapsülleme saflaştırılmış enzimler için daha uygun olan bu tür çapraz bağlama ve adsorpsiyon gibi alternatif yöntemler üzerinde bütün hücre biyokatalizör hareketsiz tutmak için birden fazla avantaj sunmaktadır. Hücrelerin kapsüllenmesi de ağar, çitosan, sakızlar, karragenan, jelatin gibi biyo çeşitli yapıldı ve biyokatalizörlerin tekrar kullanılabilirliği artırmak için 45 aljinat edilebilir. Bununla birlikte, kalsiyum aljinat kapsülleme immobilizasyon Etkinliği biyomolekülün üretimi 46,47 ile ilgili olarak etkili bir yaklaşım olduğu görülmüştür.
Bakteriyel tam hücre biyokatalizörlerin kullanılarak bir büyük sınırlama yabani tip E. heterolog proteinlerin translasyon sonrası modifikasyon için en az yeteneği E. coli 48. Bu ökaryotik Biyokatalizörler kullanımının başarılı w kısıtlarBu sistemi ithin. bu sınırlamayı aşmak için bir alternatif daha iyi ökaryotik translasyon sonrası makinelerle donatılmış maya gibi organizmaların kullanılması olabilir. Anlatılan sistemin diğer bir sınırlama geliştirilmiş yeniden kullanım için immobilizasyon kullanımı ile ilgilidir. 51 - İmmobilizasyon biyokatalizi kötü istikrarı karşı ve biyoproses 49 basitleştirerek cirolarının oranını artırmak için kullanılan ortak bir maliyet-etkin bir stratejidir. Kapsüllenmiş bütün hücre biyokatalizörlerin katalitik performansı etkileyen başlıca parametreler sodyum alginat konsantrasyonu, CaCl2 konsantrasyonu, hücre yükleme ve tortu boyutu bulunmaktadır. Parametreler birbirinden bağımsız olmadığını kabul etmek önemlidir. Bu şekilde, tek bir çalışma içinde tüm faktörlerin kapsamlı bir analizi, nedenle optimizasyonu için en önemli parametre seçmek gereklidir, çok zaman alıcıdır. Değerlendirilen ve burada sunulan etkileri vardıriki parametre, sodyum aljinat ve CaCl2 konsantrasyonu. Burada ayrıntılı olarak ele rağmen, daha önce 16 hareketsizleştirilmiş hücreler ağırlığına verim bağımlılığını karşılaştırılması, hücre yükleme optimize gerçekleştirdik. Literatürde de bağlı değişmiş aktarma özellikleri immobilize sisteminin artan yüzey alanından etkinliğini geliştirmek enzim kapsülleme artırarak veya substratların ve ürünlerin daha yaygın değiştirerek üretim veriminin ayarlayabileceğini boncuk büyüklüğü bu varyasyonu göstermektedir. söz konusu biyokatalitik reaksiyonlar bağlı olarak, alternatif bir kritik faktörler seçimi, optimal koşullar farklı bir dizi üretilmesine yol açabilecek, gerekli olabilir. ek parametreler için uygun koşulların oluşturulması için detaylı bir çalışma birleştiğinde tüm hücre sisteminin performansında daha da iyileştirilmesi için kapsamı sağlar.
Özet olarak, deney implemen raporL-iksuloz gelişmiş üretim gösteren kalsiyum aljinat boncuk hareketsiz bir birleştiğinde tüm hücre biyokatalitik sisteminin lama. Diğer kofaktör bağımlı biyokatalitik yollar, bir çok biyolojik olarak uygun moleküllerin yüksek verim sağlamak Farklı rekombinan enzimler ifade ile burada tarif edilen protokol kullanılarak elde edilebilir. Buna ek olarak, bu sistem, ürün 52 ve biyokimyasal oksijen talebi 53 mikrobiyal biyosensör olarak biyokatalitik üretimi dışında uygulamalar, tek-kaplı bir çoklu-enzim biyosentezi için ikiden fazla rekombinant biyokatalizör karşılamak için genişletilebilir. 56, biyoyakıt 57 için tüm hücre bioprocessing metal geri kazanımı için toprak bioaugmentation 58 ve biomining bitki büyüme promosyon - Bu sistemin sinerjik özellikten yararlanarak, simbiyotik mikrobiyal konsorsiyum kapsülleme gibi biyoremediasyon 54 gibi uygulamalar sayısız için kullanılabilir 59
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının beyan ederim. Kağıt aljinat taneleri immobilize bir birleştiğinde tüm hücre biyokatalitik sistemini oluşturmak için detaylı metodoloji raporlama amaçlamaktadır. Bilimsel yenilik Önceki bir çalışmada 16 bildirilmiştir.
Acknowledgments
Bu araştırma Eğitim, Bilim ve Teknoloji (NRF-2013R1A1A2012159 ve NRF-2013R1A1A2007561), Konkuk Üniversitesi Bakanlığı tarafından finanse Kore Ulusal Araştırma Vakfı (UÇK) ve Kimya Mühendisliği ve MCubed Bölümü ile Temel Bilimler Araştırma Programı tarafından desteklenen Michigan Üniversitesi'nde programı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB broth | Sigma Aldrich | L3022-6X1KG | |
| Kanamycin | Fisher | BP906-5 | |
| Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma Aldrich | I6758-10G | |
| Tris base | Fisher | BP1521 | |
| B-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate | Sigma Aldrich | N7004-1G | |
| L-Arabinitol | Sigma Aldrich | A3506-10G | |
| L-Cysteine | Sigma Aldrich | 168149 | |
| Sulfuric acid | Sigma Aldrich | 320501-500ML | |
| Carbazole | Sigma Aldrich | C5132 | |
| Ethanol | Fisher | BP2818-4 | |
| Sodium alginate | Sigma Aldrich | W201502 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | 223506-500G | |
| Excella E24 shaker incubator | New Brunswick Scientific | ||
| Cary 60 UV-Vis Spectrophotometer | Agilent Technologies | ||
| Centrifuge 5810R | Eppendrof | ||
| Beakers | Fisher | ||
| Syringe | Fisher | ||
| Needle | Fisher | ||
| Pioneer Analytical and Precision Weighing Balance | Ohaus |
References
- Carballeira, J. D., et al. Microbial cells as catalysts for stereoselective red-ox reactions. Biotech Adv. 27 (6), 686-714 (2009).
- Sun, B., Kantzow, C., Bresch, S., Castiglione, K., Weuster-Botz, D. Multi-enzymatic one-pot reduction of dehydrocholic acid to 12-keto-ursodeoxycholic acid with whole-cell biocatalysts. Biotechnol. Bioeng. 110 (1), 68-77 (2013).
- Smith, M. R., Khera, E., Wen, F. Engineering novel and improved biocatalysts by cell surface display. Ind. Eng. Chem. Res. 54 (16), 4021-4032 (2015).
- Wen, F., Sun, J., Zhao, H. Yeast surface display of trifunctional minicellulosomes for simultaneous saccharification and fermentation of cellulose to ethanol. Appl. Environ. Microbiol. 76 (4), 1251-1260 (2009).
- Siedler, S., Bringer, S., Bott, M. Increased NADPH availability in Escherichia coli: improvement of the product per glucose ratio in reductive whole-cell biotransformation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 92 (5), 929-937 (2011).
- Kim, C. S., Seo, J. H., Kang, D. G., Cha, H. J. Engineered whole-cell biocatalyst-based detoxification and detection of neurotoxic organophosphate compounds. Biotech Adv. 32 (3), 652-662 (2014).
- Tufvesson, P., Lima-ramos, J., Nordblad, M., Woodley, J. M. Guidelines and cost analysis for catalyst production in biocatalytic processes. Org. Process Res. Dev. 15 (1), 266-274 (2011).
- Mouri, T., Michizoe, J., Ichinose, H., Kamiya, N., Goto, M. A recombinant Escherichia coli whole cell biocatalyst harboring a cytochrome P450cam monooxygenase system coupled with enzymatic cofactor regeneration. Appl Microbiol Bioechnol. 72 (3), 514-520 (2006).
- Xiao, Z., et al. A novel whole-cell biocatalyst with NAD+ regeneration for production of chiral chemicals. PloS one. 5 (1), e8860 (2010).
- Zhao, H., van der Donk, W. A. Regeneration of cofactors for use in biocatalysis. Curr. Opin. Biotechnol. 14 (6), 583-589 (2003).
- Thomas, S. M., Dicosimo, R., Nagarajan, V. Biocatalysis: applications and potentials for the chemical industry. Trends Biotechnol. 20 (6), 238-242 (2002).
- Wang, Y., Li, L., Ma, C., Gao, C., Tao, F., Xu, P. Engineering of cofactor regeneration enhances (2S,3S)-2,3-butanediol production from diacetyl. Sci Rep. 3, 2643 (2013).
- Uppada, V., Bhaduri, S., Noronha, S. B. Cofactor regeneration - an important aspect of biocatalysis. Curr. Sci. India. 106 (7), 946-957 (2014).
- Fu, N., Peiris, P., Markham, J., Bavor, J. A novel co-culture process with Zymomonas mobilis and Pichia stipitis for efficient ethanol production on glucose/xylose mixtures. Enzyme Microb. Technol. 45 (3), 210-217 (2009).
- Chen, H. -Y., Guan, Y. -X., Yao, S. -J. A novel two-species whole-cell immobilization system composed of marine-derived fungi and its application in wastewater treatment. J. Chem. Technol. Biotechnol. 89 (11), 1733-1740 (2014).
- Gao, H., et al. Repeated production of L-xylulose by an immobilized whole-cell biocatalyst harboring L-arabinitol dehydrogenase coupled with an NAD+ regeneration system. Biochem. Eng. J. 96, 23-28 (2015).
- Beerens, K., Desmet, T., Soetaert, W. Enzymes for the biocatalytic production of rare sugars. J Ind Microbiol Biotechnol. 39 (6), 823-834 (2012).
- Poonperm, W., Takata, G., Izumori, K. Polyol conversion specificity of Bacillus pallidus. Biosci., Biotechnol., Biochem. 72 (1), 231-235 (2008).
- Leviiz, G., Zehner, L., Saunders, J., Beedle, J. Sugar substitutes: their energy values, bulk characteristics and potential health benefits. Am. J. Clin. Nutr. 62 (5), 1161S-1168S (1995).
- Zhang, Y. -W., Tiwari, M. K., Jeya, M., Lee, J. -K. Covalent immobilization of recombinant Rhizobium etli CFN42 xylitol dehydrogenase onto modified silica nanoparticles. Appl Microbiol Bioechnol. 90 (2), 499-507 (2011).
- Aarnikunnas, J. S., Pihlajaniemi, A., Palva, A., Leisola, M., Nyyssölä, A. Cloning and expression of a Xylitol-4-Dehydrogenase gene from Pantoea ananatis. Appl. Environ. Microbiol. 72 (1), 368-377 (2006).
- Doten, R. C., Mortlock, R. P. Production of D- and L-Xylulose by mutants of Klebsiella pneumoniae and Erwinia uredovora. Appl. Environ. Microbiol. 49 (1), 158-162 (1985).
- Khan, A. R., Tokunaga, H., Yoshida, K., Izumori, K. Conversion of Xylitol to L-Xylulose by Alcaligenes sp. 701B-cells. J. Ferment. Bioeng. 72 (6), 488-490 (1991).
- Poonperm, W., Takata, G., Morimoto, K., Granström, T. B., Izumori, K. Production of L-xylulose from xylitol by a newly isolated strain of Bacillus pallidus Y25 and characterization of its relevant enzyme xylitol dehydrogenase. Enzyme Microb. Technol. 40 (5), 1206-1212 (2007).
- Takata, G., Poonperm, W., Morimoto, K., Izumori, K. Cloning and overexpression of the xylitol dehydrogenase gene from Bacillus pallidus and its application to L-xylulose production. Biosci., Biotechnol., Biochem. 74 (9), 1807-1813 (2010).
- Usvalampi, A., Kiviharju, K., Leisola, M., Nyyssölä, A. Factors affecting the production of L-xylulose by resting cells of recombinant Escherichia coli. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 36 (10), 1323-1330 (2009).
- Rizzi, M., Harwart, K., Bui-Thananh, N. -A., Dellweg, H. A kinetic study of the NAD+-Xylitol-Dehydrogenase from the yeast Pichia stipitis. J. Ferment. Bioeng. 67 (1), 25-30 (1989).
- Pail, M., et al. The metabolic role and evolution of L-arabinitol 4-dehydrogenase of Hypocrea jecorina. Eur. J. Biochem. 271 (10), 1864-1872 (2004).
- Tiwari, M. K., et al. pH-rate profiles of L-arabinitol 4-dehydrogenase from Hypocrea jecorina and its application in L-xylulose production. Bioorg. Med. Chem. Lett. 24 (1), 173-176 (2014).
- Gao, H., et al. Role of surface residue 184 in the catalytic activity of NADH oxidase from Streptococcus pyogenes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 98 (16), 7081-7088 (2014).
- Gao, H., Tiwari, M. K., Kang, Y. C., Lee, J. -K. Characterization of H2O-forming NADH oxidase from Streptococcus pyogenes and its application in L-rare sugar production. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22 (5), 1931-1935 (2012).
- Roy, I., Gupta, M. N. Hydrolysis of starch by a mixture of glucoamylase and pullulanase entrapped individually in calcium alginate beads. Enzyme Microb. Technol. 34 (1), 26-32 (2004).
- Gombotz, W. R., Wee, S. F. Protein release from alginate matrices. Adv Drug Deliv Rev. 31 (3), 267-285 (1998).
- Smrdel, P., Bogataj, M., Mrhar, A. The influence of selected parameters on the size and shape of alginate beads prepared by ionotropic Gelation. Sci Pharm. 76 (1), 77-89 (2008).
- Idris, A., Wahidin, S. Effect of sodium alginate concentration, bead diameter, initial pH and temperature on lactic acid production from pineapple waste using immobilized Lactobacillus delbrueckii. Process Biochem. 41 (5), 1117-1123 (2006).
- Lee, K. Y., Mooney, D. J. Alginate: properties and biomedical applications. Prog. Polym. Sci. 37 (1), 106-126 (2012).
- Chen, X. -H., Wang, X. -T., et al. Immobilization of Acetobacter sp. CCTCC M209061 for efficient asymmetric reduction of ketones and biocatalyst recycling. Microb. Cell Fact. 11 (1), 119-131 (2012).
- Yadav, V. G., et al. The future of metabolic engineering and synthetic biology: Towards a systematic practice. Metab. Eng. 14 (3), 233-241 (2012).
- Demain, A. L. From natural products discovery to commercialization: a success story. J Ind Microbiol Biotechnol. 33 (7), 486-495 (2006).
- Baneyx, F., Mujacic, M. Recombinant protein folding and misfolding in Escherichia coli. Nature Biotechnol. 22 (11), 1399-1408 (2004).
- De Marco, A., Deuerling, E., Mogk, A., Tomoyasu, T., Bukau, B. Chaperone-based procedure to increase yields of soluble recombinant proteins produced in E. coli. BMC Biotechnol. 7, 32-40 (2007).
- Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72 (2), 211-222 (2006).
- Alper, H., Fischer, C., Neviogt, E., Stephanopoulos, G. Tuning genetic control through promoter engineering. PNAS. 103 (8), 12678-12683 (2006).
- Salis, H. M., Mirsky, E. A., Voigt, C. A. Automated design of synthetic ribosome binding sites to control protein expression. Nat. Biotechnol. 27 (10), 946-950 (2009).
- Riaz, Q. U., Masud, T. Recent trends and applications of encapsulating materials for probiotic stability. Crit Rev Food Sci Nutr. 53 (3), 231-244 (2013).
- Hossain, G. S., Li, J., et al. One-step biosynthesis of α-keto-γ-methylthiobutyric acid from L-methionine by an Escherichia coli whole-cell biocatalyst expressing an engineered L-amino acid deaminase from Proteus vulgaris. PloS one. 9 (12), e114291 (2014).
- Bhushan, B., Pal, A., Jain, V. Improved enzyme catalytic characteristics upon glutaraldehyde cross-linking of alginate entrapped xylanase Isolated from Aspergillus flavus MTCC 9390. Enzyme Res. (218704), (2015).
- Chen, R. Bacterial expression systems for recombinant protein production: E. coli and beyond. Biotech Adv. 30 (5), 1102-1107 (2012).
- Truppo, M. D., Hughes, G. Development of an improved immobilized CAL-B for the enzymatic resolution of a key intermediate to odanacatib. Org. Process Res. Dev. 15 (5), 1033-1035 (2011).
- Twala, B. V., Sewell, B. T., Jordaan, J. Immobilisation and characterisation of biocatalytic co-factor recycling enzymes, glucose dehydrogenase and NADH oxidase, on aldehyde functional ReSyn polymer microspheres. Enzyme Microb. Technol. 50 (6-7), 331-336 (2012).
- Wang, X. -T., et al. Biocatalytic anti-Prelog stereoselective reduction of ethyl acetoacetate catalyzed by whole cells of Acetobacter sp. CCTCC M209061. J. Biotechnol. 163 (3), 292-300 (2013).
- Rios-Solis, L., et al. Modelling and optimisation of the one-pot, multi-enzymatic synthesis of chiral amino-alcohols based on microscale kinetic parameter determination. Chem. Eng. Sci. 122, 360-372 (2015).
- Wang, B., Barahona, M., Buck, M. A modular cell-based biosensor using engineered genetic logic circuits to detect and integrate multiple environmental signals. Biosens Bioelectron. 40 (1), 368-376 (2013).
- Saratale, R. G., Saratale, G. D., Kalyani, D. C., Chang, J. S., Govindwar, S. P. Enhanced decolorization and biodegradation of textile azo dye Scarlet R by using developed microbial consortium-GR. Bioresour. Technol. 100 (9), 2493-2500 (2009).
- Malik, A. Metal bioremediation through growing cells. Environ. Int. 30 (2), 261-278 (2004).
- Bazot, S., Lebeau, T. Effect of immobilization of a bacterial consortium on diuron dissipation and community dynamics. Bioresour. Technol. 100 (18), 4257-4261 (2009).
- Brethauer, S., Studer, M. H. Consolidated bioprocessing of lignocellulose by a microbial consortium. Energy Environ Sci. 7 (4), 1446 (2014).
- Malusá, E., Sas-Paszt, L., Ciesielska, J. Technologies for beneficial microorganisms inocula used as biofertilizers. Sci World J. 2012 (491206), (2012).
- Brune, K. D., Bayer, T. S. Engineering microbial consortia to enhance biomining and bioremediation. Front Microbiol. 3 (203), (2012).
