Abstract
전이성 간 병변의 절제 후 종양 재발의 높은 발생률은 미해결 문제로 남아있다. 일상적인 임상 영상에 의해 검출하지 않은 작은 종양 세포 예금은, 간 절제술 후 간 재생 인자에 의해 자극 될 수있다. 이 요인은 종양 재발에 중요한있는, 그러나 완전히 명확하지 않다.
제시된 마우스 모델 간 절제술 후 재발 성 악성 병변의 발달에서 중요한 역할을하는 메커니즘을 탐구하는 데 유용 할 수있다. 이 모델은 생쥐의 간 조직 제거 및 (주사) 종양 유도의 정의 양의-수행하기 쉬운 재현 기술을 결합합니다. 동물은 단일 개복술, 30 %의 간 절제술, 또는 70 %의 간 절제술 중 처리 하였다. 모든 동물은이어서 나머지 간 조직으로 종양 세포 주입을 받았다. 관찰 2 주 후, 간 종양 크기와 중량을 평가 하였다면역 조직 화학에 의해 조사 하였다.
70 %의 간 절제술 후 종양 부피 및 중량을 크게 단독 개복술 (p <0.05)과 비교하여 증가 하였다. 또한, 면역 조직 화학 (사료된다)를 절제 군에서 증가 된 종양 증식률 (p <0.05).
이러한 결과는 간내 종양 성장 간 재생 메커니즘의 영향을 보여준다. 조직 학적 정밀 검사 또는 RNA 분석 등의 방법으로 결합 된 설명 마우스 모델은 간에서 종양 성장 및 전이 재발에 관여하는 다른 요인 규명을위한 기반이 될 수 있습니다. 포스트 간절 전이의 환경에서 특정 문제를 탐색 할 때 술 관찰의 길이와 같은 변수들의 상당수는 주사 또는 주입 및 간 절제술의 타이밍에 사용되는 세포주는 멀티 앵글을 제공한다. 이 절차의 제한은 프입니다thorization 적절한 동물 실험 시설 및 특정 장비의 취득에 동물 절차, 액세스를 수행 할 수 있습니다.
Introduction
대장 암 (CRC)은 모든 악성 종양의 약 9 %를 차지한다. 그것은 미국과 전 세계 두, 세 번째 가장 흔한 암이다. 30 만에서 CRC 범위에서 글로벌 사망률은 1 년 당 50 만 이상합니다. 환자의 20 %는 대장 종양의 발견에 간 전이 고통. 절제 전이는 일반적으로 부분 간 절제술의 2,3에 의해 처리된다. 개선 된 수술 기법, 새로운 복합 전략과 절제 전이의 새로운 정의는 환자 4의 증가에 대한 가능한 부분 간 절제술의 치료를 렌더링합니다.
보조 간 악성 종양의 재발은, 그러나, 현대 위장 수술에 도전 임상 적 후유증이다. 간 전이 절제술을 시행 CRC 환자는 자신의 남은 간 5에서 새로운 종양을 개발의 30 ~ 50 %의 확률. 따라서,에 대한 추가 연구가 요구된다간 전이의 재발에 관여하는 메커니즘.
약 70 %의 간 절제술은 일반적으로 나머지 간 조직에서 몇 주 내에 보상된다. 이 재생이 성장 인자 베타 (TGF-β), 혈관 내피 성장 인자 바뀌는 인터루킨 6 (IL-6), 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α), 간세포 성장 인자 (HGF) 등의 사이토 카인을 포함한 여러 메커니즘을 수반 (VEGF ) 매트릭스 메탈로 프로테아제 (MMP-2와 MMP-9) 및 CXC 케모카인-6-11. 이러한 물질은 간 재생을 지원하며, 또한 일상적인 임상 촬상에 의해 검출되지 않은 나머지 간 작은 종양 세포 침전물의 성장을 유도하여 주 및 보조 간 종양의 높은 재발률을 담당 할 수있다. 이 인과 관계는 지금까지 입증되지 않았습니다.
다음과 같은 가설이 설정되었다. 부분 간 절제술 후, 증식 인자 그 라이브에 대한 책임이 있습니다R 비대는 간에서 이전에 알려지지 않은 종양 세포의 증식을 유도 할 수있다. 마우스 모델의 간 절제술 종양 유도의 기술을 조합 한 설계되었다. 서른 무 흉선 누드 foxn1nu / 뉴 쥐 10 마리씩 세 군으로 나누었다. 이들을 각각 단독 개복술 (그룹 A) 중 하나를 처리하고, 30 %의 간 절제술 (그룹 B), 또는 70 %의 간 절제술 (그룹 C). 모든 그룹의 동물이어서 휴면 종양 세포를 시뮬레이션 간 정의 된 나머지 부분으로 종양 세포 주입을 받았다. 다음 2 주 동안 관찰과 동물은 종양의 성장과 간 비대을 평가.
목적은 사후 간절 종양 형성에 역할을 할 수있는 분자 병인 인자를 검색하는 데 사용될 수있는 모델을 생성 하였다. 이 방법을 평가하는데 유용 할 수 간 재생에 관련된 내분비 인자 원점; 간내 다치 대한 책임 메커니즘또는 간 절제술 후 성장; 간내 및 종양 성장의 유도에 필요한 간 절제술 볼륨. 그들은 근본적 생물학적 원리의 이해와 개선 된 치료법에 의해 인간에게 이익을 기대할 수있다 기술의 발전에 기여할 것을 약속 때문에 다음 메소드는 동물에서 수행되었다. 때문에 이러한 문제에 관여하는 메커니즘, 그것은 시험 관내 방법은 인간 병리의 현실적인 표현을 제공 할 수 있으므로 생체 내에서 검사했다.
이 연구는 종양의 재발을 감소시키기위한 예방 적 치료 옵션에 대한 관련 목표의 발견으로 이어질 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
바바리아, 독일의 미텔 프랑켄 현 정부는, 설명 된 절차에 대한 권한을 부여. 유사한 실험은 적절한 당국의 사전 승인이 필요합니다.
주 : 다음 매뉴얼 따라서 표시된 그룹 A와 그룹 B에서 남아있을 필요 C. 단계 이전에 논의 된 그룹 A를 위해 사용될 수있다.
1. 준비
- 장갑 착용 현미경 아래에있는 폴리스티렌 패드를 배치하고 약간 패드 위의 영역에 렌즈를 초점을 맞 춥니 다.
- 멸균 시트 및 장소의 절반 폴리스티렌 패드이고 그것을 바로 옆에 나머지 절반을 분할합니다.
- 수술기구를 소독하고, 폴리스티렌 패드 옆에 멸균 시트에 배치합니다.
- 아치를 형성하는 많은 클립을 똑 바르게. 바로 옆에 동물의 머리가 거짓말을 어디에 - 거꾸로 그것을 켜고 상단에있는 폴리스티렌 패드로 키를 누릅니다.
- 두 사지 사이 기화기의 마우스 피스를 배치아치의. (그림 7)
- 동물의 머리가 거짓말을 할 장소에서 40cm에 대한 가열 램프를 설정합니다. 40 ° C를 초과하지 않는 폴리스티렌 패드의 수준에서 반드시 열을 만든다.
- 운영 동물에 대한 별도의 케이지를 준비합니다.
- 플렉스 튜브에 종양 세포의 정의 된 양의 부피 (50 μL 최대)를 준비하고 얼음에 저장한다.
2. 마취
- 플렉시 글라스 상자에 마우스를 올려 놓고 (10 L / min의 유량에서 5 %의 이소 플루 란) 높은 흐름 이소 플루 란에 마취 유도를 시작합니다.
- 쉽게 호흡 (<20 / 분)과 악수 깊은 헐떡 거림의 급격한 감소에 의해 인식 될 수 agonal 호흡의 무대를 입력 한 직후 마취의 여러 단계를 통과 한 후, 유기 유리 상자에서 마우스를 제거 동물의 몸 전체.
- 신속하게 멸균 드레이프 덮여 폴리스티렌 패드 위에 동물의 배 위로를 놓고 계속마취를 유지하기 위해 마우스 피스에 마우스의 주둥이를 삽입하여 저 유량의 이소 플루 란에 환기. 약 1 L / min의 유량으로 1.8 ~ 2.2 %의 흡기 분획을 사용한다.
- 분당 45과 60 사이에 이상적이다 호흡 호흡 주파수를 계산함으로써 동작 동안 마취 깊이를 평가한다. 그렇지 않은 경우, 그에 따라 흡기 이소 플루 분획 적응.
참고 :이 발효 될 때까지 흡기 이소 플루 란 부분의 변화가 약 60 초 소요. 빠른 속도로 급격한 변화를 수행하지 마십시오. 대신에, 서서히 마취의 응용 프로그램을 수정합니다.
3. 작업
- 적절한 소독제와 가슴과 복부를 소독, 그 후 장갑을 변경합니다.
- 동물의 대퇴부에 카프로 펜의 중량 구성된 볼륨 (5 ㎎ / ㎏ 체중)를 주입한다.
- 조심스럽게 마취의 깊이가 충분한 경우 테스트하기 위해 집게로 복부 피부를 꼬집어.
- 조심스럽게 주위 조직에서 노출하는 칼 모양의 주위를 해부하다.
- (내부에서 외부로) 칼 모양을 통해 숙박 봉합을 놓고 동물 클램프를 사용하여 머리 위에 고정에 두 스레드를 연결합니다.
- 함께 트랙터의 사지를 꼬집어 천천히 동물의 내부 복부 벽을 따라 "U"모양의 트랙터 팁을 소개합니다.
주 :이 방법은 다른 돌출부에 대한 액세스를 용이하게하기 위해 간을 노출. 간장의 중앙과 왼쪽 측면 로브의 식별은 이제 수 있어야한다. - 식염수 적신 면봉을 사용하여 부드럽게 아래로 중간 엽 밀어 넣습니다. 이제 중간 엽의 표면과 진동판 사이에 볼 수 있습니다 낫 모양의 인대의 복부 4 분의 3, 해부.
- 이제 중간을 이동하는 두 식염수를 적신 면봉을 사용하여로브와 위쪽 다이어프램에 대해 측면 로브를 떠났습니다.
- 왼쪽 측면 로브와 미상 로브 사이의 얇은 막을 시각화하고 조심스럽게 해부.
참고 : A 군에서 동물이 프로토콜을 수행 할 때,이 시점에서 3.18 단계로 이동합니다. - 왼쪽 측면 로브의 기본을 따라 대각선 크기 4-0 합자를 놓습니다.
- 다음으로, 원래의 위치로 왼쪽 측면 로브를 반환 할 면봉을 사용합니다.
- 조심스럽게 가능한 한 로브의 기본에 가깝게 합자 넥타이 적절히 차단 혈액 공급을 테스트하기 위해 로브의 색상 변화를 평가합니다.
- 로브의베이스 라인을 따라 왼쪽 측면 엽을 절제하고 절제된 로브의 무게를 확인합니다.
참고 : 그룹 B에서 동물이 프로토콜을 수행 할 때,이 시점에서 3.18 단계로 이동합니다. - 왼쪽 측면 로브의 그루터기와 중간 엽의베이스 사이에 두 번째 합자를 놓습니다.
- w로 중간 엽의 위치를엘과 합자 넥타이. 또, 적절하게 차단 혈액 공급을 테스트하기 위해 로브의 색상 변화를 평가합니다.
- 중간 엽을 절제하고 그 무게를 확인합니다.
- 30 G 바늘로 1 ML의 주사기를 연결하고 언제든지 주사기를 기울 않고 플렉스 관에서 종양 세포로 채 웁니다.
- 열등한 우엽을 노출하기 위해 동물의 왼쪽에있는 장 루프를 이동하기 위해 면봉을 사용합니다.
- 수직에 30 ° 각도로 "제 손"장치에 셀이 장착 된 주사기를 삽입합니다.
- 조심스럽게 바로 열등한 우엽 위의 바늘로 마우스 옆에있는 장치를 이동합니다.
- 바늘의 끝이 열등한 우엽의 중심부가 될 때까지 천천히 제 손 장치 내에서 주사기를 진행합니다.
- 30-45 초에 걸쳐 로브의 중앙부로 전량 주입.
- 출혈이 중지 될 때까지 적어도 3 분 동안 주사 부위를 압축한다. 체류 봉합과 트랙터를 제거합니다.
- 하나의 버튼 매듭을 사용하여 흡수성 5-0 봉합과 근막을 닫습니다.
- 하나의 버튼 매듭을 사용하여 4-0, 비 흡수성 봉합사로 피부를 닫습니다.
- 약 1 분 동안 높은 흐름 산소에 마우스를 환기 시작합니다.
4. 수술 후 절차
- 적절한 복구를 보장하기 위해 다음 반 시간 동안 따뜻한 환경 (약 40 ° C)에 동물을 배치합니다.
- 72 시간의 수술에 대한 설피 린의 5 ㎎ / ㎖로 동물의 식수를 혼합하다.
- 시술 후 적어도 3 일에 대한 밀접하게 봉합의 무결성을 검사합니다.
5. 관측 기간과 안락사
- 14 일 총 매일 동물의 체중을 측정한다. 각각 자신의 복지 및 제한에 관한 그 점수.
- 후 14 일에, 동물 이하 2.1 및 동작 프로토콜 A의 단계 2.2 마취차 동물 안락사에 대한 기관의 프로토콜로 진행합니다.
- 단계 3.4에서 설명한 바와 같이 중간 개복술을 수행합니다. 복부에 접근을 용이하게하기 위해, 절개 1.5 cm의 미부를 연장한다. 3.7에서 지적한 바와 같이 트랙터를 삽입합니다.
- 낫 모양의 인대의 나머지 부분을 따라 해부하고 간 두개쪽으로를 종료하는 것처럼 하대 정맥을 잘라.
- 다이어프램에서, 포셉으로 다이어프램을 잡아 퉁명스럽게 간 및 근육 조직 사이의 공간으로 해부하여 간을 분리합니다.
- 복막 떨어져 동원 간 조직을 들어 여전히 부착되어 남아있는 구조를 해제 해부 : 복막 지방 조직의 하대 정맥과 문맥을.
- 거짓 실제 크기와 무게에 기여할 추가 조직에 대한 추출 후 간을 검사합니다. 추출 된 간 및 종양는 그림 6에 표시됩니다.
- inf를 해제 종양을 해부하다우엽을 erior.
- 종양 및 간 실질 양의 크기와 중량을 측정한다.
- 조직 분석을 위해 필요에 따라 추가 복막에서 조직 샘플, 림프절 또는 다른 장기 보존
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
우리의 특정 실험에서, 우리는 30 무 흉선 누드-foxn1nu / 뉴 쥐를 포함. 이들은 중간 개복술 (식염수 50 μL에 용해) 500,000 MC38 종양 세포의 종양 세포 주입을 수신하고,이어서 70 %의 간 절제술, 30 %의 간 절제술 또는 추가적인 개입 하나로 처리 하였다.
십사일 후, 나머지 간 거의 완전한 재생이 30 % 또는 70 % 간 절제술을 다음 관찰되었다 (30 % 간 절제술 그룹의 간 비대 색인은 70 % 간 절제술 그룹에서 0.8 대 1.06이었다).
하나의 개복술 후 간내 종양의 평균 무게는 332 밀리그램 (: 10-608 mg의 범위)이었다. P & #와 70 % 간 절제술 후 : 30 % 간 절제술 대 961 mg의 후 (189 MG-3030 mg의 범위) : (76-1,873 mg의 범위) 간내 종양의 평균 종양 무게는 656 mg을했다(60) 0.05 (그림 1). 대 1,385mm 세 (범위 : 411-2,366 mm 3) 30 %의 간 절제술 후 종양 체적 950 mm (3) (439-2,326 mm 세 범위)이었다 70 %의 간 절제술 후, 511 mm (3) (범위 : P <0.05 (그림 2)와 단독 개복술 후 87-1,693 mm 3).
종양 조직의 조직 절편 KI-67의 면역 조직 화학 염색을 통해 취하여 분석 하였다. 슬라이드에 세포는 증식 속도에 대한 평가 하였다. 61 % (범위 : 51~69%)에 비해 다음 개복 군에서 종양 세포의 평균 확산 속도가 47 % (39-56% 범위)이었다 70 %의 간 절제술 (p <0.05)을받은 동물로부터 및 53 % (범위 : 38-69%) 30 % (P = 0.22)의 간 절제술, 간 절제술을 시행 한 그룹에서 세포 증식의 증가 속도를 보여주는을받은 동물 (그림 3 - 5).
그림 1 :. 간내 종양의 무게는 그림은 간에서 절개 한 후 그룹 A, B와 C 사이의 평균 종양 무게를 비교하고, 쇼 그룹 B와 C의 오차 막대의 종양에 무게를 SEM을 나타냅니다 증가했다. 을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의 더 큰 버전.
그림 2 :. 간내 종양의 볼륨 그림은 간에서 절개 한 후 그룹 A, B와 C 사이의 평균 종양 부피를 비교 쇼는 SEM을 대표하는 그룹 B와 C의 오차 막대의 종양에서 볼륨을 증가했다. ANK ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : A 군에서 종양 표본에서 슬라이드의 그룹 A. KI-67 면역 조직에서 종양의 확산 속도가 종양 세포의 온화한 증식을 보여줍니다. 스케일 바 = 100 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 그룹 B에서 종양 표본에서 슬라이드의 그룹 B KI-67 면역 조직에서 종양의 확산 속도가 종양 세포의 적당한 증식을 보여줍니다. 스케일 바 = 100 μm의.= "_ 빈"을 얻을>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 그룹 C에서 종양 표본에서 슬라이드의 그룹 C. KI-67 면역 조직에서 종양의 확산 속도가 종양 세포의 현저한 증식을 보여줍니다. 스케일 바 = 100 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6 그룹 : B. 추출 간 / 종양 표본이 간 30 %의 간 절제술 동시 종양 세포 주입 후 14 일 실시 추출 하였다. 오른쪽 하부 엽에 큰 종양이 볼 수있는 권리 우수한, 중간 및 미상 로브 동안의 상당한 비대을 통해 갔다.
* = 하부 오른쪽 엽에 종양, SRL = 우수한 우엽, ML = 중간 엽, CL = 미상 로브. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 7 :. OR 표 설치는 폴리스티렌 패드 멸균 천으로 덮여있다. 구부러진 오픈 종이 클립은 마우스 피스와 함께 호흡 관을 덮는 그 상단에 패드에 가압된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
설치류에서 수술을 수행 이전 실험 바이어스를위한 소스로 봉사 할 수 있었다 특정 변수를 식별 할 수 있었다. 안전하고 유효한 결과를 얻기 위해, 다음과 같은주의 사항을 고려하십시오.
일상적인 사전 연산 금식 간 재생 (13, 14)를 억제 할 수 간 지방증 (12), 발생할 수 있습니다. 그것은 따라서 사용하지 않는 것이 좋습니다. 간세포의 가장 높은 유사 분열 활동은 하루 15에 걸쳐 변화한다. 가능한 경우, 모든 그룹에 대해 하루 동안 특정 시간에서의 절차를 수행. 쥐의 간 재생 4-6 주 된 동물에 가장 효과적이다. 연령 10 개월 이상 동물은 크게 재생 용량 (16)을 감소 있습니다. 편견의 가능성을 최소화하기 위해 실험 동일 인종, 성별과 연령의 쥐를 사용한다. 무균 환경에서 작업이 같은 개방 과정에서 일반적으로 중요하다. 특히 athymi 같은 면역 생물에 조기 사망 또는 편향된 결과를 초래할 수도있다 비디오 감염의 위험에 사용 c 마우스는 높다. 준비, 수술 때문에 17을 보증하는 복구 영역으로 구성된 세 존 설정을 추구. 인해 심각한 간독성 효과, 일반적으로 사용되는 프레 노르 핀은 인트라 또는 수술 후 진통제 치료 (18, 19)하지 않는 것이 좋습니다. 적절한 진통제를 제공하기 위해 카프로 펜 또는 설피 린과 같은 다른 물질을 사용합니다. 설피 린은 많은 국가에서 사용할 수 있기 때문에, 카프로 펜은 시술 후 통증 조절을 위해 사용될 수있다. 삼일은 설피 린을 대체하는 회 5 ㎎ / kg 체중의 피하 주사를 수행합니다.
회수 마우스가 음식과 물에 쉽게 접근 할 수있는 따뜻한 환경에 배치 될 때 수술 후 회복이 가장 잘 달성된다. 이상적으로 취약들 (17)을 손상시키지을 보이면서 동물을 방지하기 위해, 밤새 다른 마우스에서 격리됩니다.
프로토콜은 매우 간단하지만 jove_content ">, 마우스에서 수술의이 종류를 수행 할 때 피하기 위해 약간의 함정이있다. 낫 모양의 인대의 해부는, 복부 벽 중간 엽의 복부 측면을 연결하는 구조가 필수적이다 적절한 간 유연성을 달성한다.이 인대 대정맥을 두개쪽으로주의이 주요 혈관의 손상을 방지하기 위해서 보증 간 잎 지점에 매우 가까운 영역으로 확장있다. 평균의 3/4를 절개 방법은 양호 동원을 보장 함과 동시에, 용기에 충분한 거리를 유지한다.후방 교회 프로토콜을 수행 할 때 합자와 로브를 결찰 할 때 긴장의 적당한 양을 사용하는 것은 대단히 중요한 작업입니다. 공기 노트 또는 가난하게 조여 합자와 합자이 부적절하게 중단 혈액 공급, 출혈, 충격과 죽음으로 이어질 수 있습니다. 동시에, attem철저하게 합자 매듭을 강화하기 위해 태평양 표준시 조직과 기관을 주변에 관련된 손상 합자 파열 될 수 있습니다. 결찰 무결성을 평가하는 효과적인 방법은 결찰 로브 내에 청색증 색 변화 관찰된다. 정확한 봉합 재료를 선택하는 것도 중요한 역할을한다. 꼰 봉합 monofilamentous 물질이 아니라 부드러운 간 조직을 해부하고 출혈이 발생하는 반면, 조직을 압축 할 가능성이 높습니다.
또 다른 중요한 단계 쥐에서 간 엽을 제거 합자의 정확한 위치를 포함한다. 결찰 로브 들어가는 용기 본체에 수직으로 수행되어야한다. 이 중간 엽 다소 간단하지만, 왼쪽 측면 로브 적절한 절제 더 도전이다. 그 용기는 ventro - 꼬리 방향으로 로브를 입력합니다. 그 결과, 합자 스레드는 리터의 하부 오른쪽 엽에 왼쪽 런지베이스 사이에 가상 선을 따라 배치해야합니다이베.
중간 엽 그러나 절제는 하대 정맥을 손상시킬 수 있습니다. 이 주요 선박이 로브의 등 부분을 통해 실행되기 때문에, 그것은 간 괴사로 이어질 수 손상하는 경향이있다. 또한,이 지역에 너무 많은 긴장과 합자 매, 다이아 프램 파열 및 / 또는 기흉의 원인이 될 수 있습니다.
유사한 결과를 획득 할 때, 종양 세포의 적절한 처리가 중요하다. 정확한 세포 배양 기술이이 프로토콜의 일부가 의도하지 않지만, 절차 내에서 종양 세포의 처리는, 미리 준비 완벽만큼이나 중요하다. 종양 세포로 주사기를 충전 할 때, 모든 시간을 수직 유지하는 것이 중요하다. 주사기의 주요 틸팅 따라서 주입시 세포의 손실의 결과로, 주사기의 벽에 부착 된 종양 세포를 초래할 수있다. 사소한 경사는 당 니들을 삽입하기 위해, 주입시 보증하부 오른쪽 엽의 표면에 pendicular.
출혈 복막 전이는 간 표면의 천공 부위로부터 출혈 및 누출의 결과로서 발생할 수있다. 그러므로 세 개의 분 동안 면봉으로 로브 부드러운 압축 간 실질 출혈을 조절하고 복막 내로 누출되는 종양 세포의 유체를 방지하는 것이 필수적이다.
설치류 복강 작업 프로 시저 프로토콜을 포함하는 서적을 거의 폐쇄 복부의 유형에 대한 정보를 포함하지 않는다. 그러나, 이러한 측면은 합병증의 또 다른 가능한 소스입니다. 심지어 적절한 통증 조절과, 동물은 복부 벽에있는 이물질을 제거하려고합니다. 결과는 복강 내 감염, 오픈 복부 또는 사망 할 수있다. 이는 상처 봉합 대신 실행하는 봉합사 및 두 층의 복벽 폐쇄 모두 수행하는 하나의 바늘 중단함으로써 방지 될 수있다.
(할란 연구소 BV, Kreuzelweg 53, NL-5961 NM 호르스트에 의해 제공) 여성 무 흉선 누드-foxn1nu / 뉴 생쥐는이 실험에 사용 하였다. 이 품종 알려져 T 세포 결핍 비교적 제한 종양 성장 및 종양 이식에 이상적 조건을 허용한다. 동물 중에서 싸움 순위의 영향을 최소화하기 위해, 오직 암컷을 사용 하였다. C57BL / 6 근친 마우스 같은 다른 균주를 사용하여 예비 결과는 중요한 도시, 아직 낮은 볼륨 종양 성장했다. 따라서,이 기술은 매우 높다 더욱 마우스 균주에서 실용적 일 수있다.
병원균은 종양의 성장 (20)을 방해 할 수 있으므로 그러나,이 설정에 면역 생물을 사용하여, 특별한 동물 위생주의가 필요합니다. 동물 실험 시설에서 수행으로 감시 동물의 사용과 같은 조치 병원체 (21)의 존재를 모니터링하는 우리의 연구는 helpfu 될 수 있습니다에서 개최했다바이어스의 가능한 원인을 탐지 리터.
이 실험은 (만하임 의학부 독일 임상 화학 연구소로부터 구입) MC38라는 뮤린 대장 암 세포주를 사용 하였다. 5 × 105 개 종양 세포를 50 μL 식염수에 용해 하였다. 농도가이 양이 2 주 이내에 고형 종양 형성에 적합 식별 된 예비 실험에서 결정되었다. 이 실험에 사용 된 동물의 면역 능력에 따라 (상기 설명 참조), 매우 잘 인간 대장 암 세포를 사용하고, 따라서 이종 이식을 만들 수있을 것이다. 인간 SW480 종양 세포를 사용하여 무 흉선 누드 foxn1nu / 뉴 마우스에서 수행 초기 테스트가 성공적으로 절제 후 잔여 간에서 종양 성장을 설명 할 수 있었다. 때문에 쥐의 간의 차원, 합병증을 방지하기 위해 50 μL 만 사용 볼륨을 권장합니다. 이 시점에서 가능한 개선 것루시퍼 종양 세포를 라벨 할. 종양 세포의 성장과 크기 가까이 모니터링 가능한 경우 조사되는 문제에 따라서 흥미로운 정보가 발생할 수있다.
간 로브를 결찰의 다른 방법은 클리핑 방법 (22) 또는 클리핑-봉합 하이브리드 기술 (23)를 포함한다. 장치를 클리핑의 위치는, 그러나, 클리핑 방법이 어려운 렌더링 할 수 있습니다. 적절하게 수행 봉합 결찰은 기술을 배우는 쉬운 유지하고이 실험에서 로브를 제거하는 가장 비용 효율적인 방법이 될 가능성이 매우 높다.
살아있는 동물이 실험에 사용되기 때문에, 그것은 당국의 사전 허가를 받아야합니다. 지역에 따라, 이는 비용과 시간이 소요되는 작업 일 수있다. 심지어 공식 승인 후, 동물 실험은 세포 배양 검사 또는 분자 방법 등의 연구 방법보다 훨씬 적은 액세스 할 수 있습니다. (A)의 기반 구조에 더하여현대 동물 실험 설비, 특수 장비는 프로토콜을 수행하기 위해 할당되어야한다. 또한, 2 ~ 4 주 기간은이 기술을 마스터 할 예정되어야한다. 이 프로토콜은 마우스 균주 다수의 세포주의 넓은 범위에 적용 할 수있다. 그러나, 위에서 언급 한 수의 수정에 대해서가 아니라 모든 세포주는 모든 유기체에서 연구 될 수있다.
이 프로토콜을 이용하여 조사 연구의 주 목적은 간 재생 간 악성 종양의 재발에 미치는 정확한 영향에 관련된 복잡한 성장 인자 시스템 일 것이다. 적절히이 가능한 상관 관계를 조사하기 위해, 다른 방법 분자 또는 세포 배양 실험 달리, 동물 실험을 수행하는 것이 필수적이다. 이러한 방법은 오히려 조사의 무료 수단으로 사용되어야한다. 여러 간 절제 모델 지금까지 22-24 발표되었지만, 절차처음 잘 확립 동작으로 동시에 종양 세포 주입을 구현한다.
이 마우스 모델 생쥐의 간 절제술은 매우 간단 가능하고 쉽게 재현 할 방법 있음을 보여줍니다. 크고 작은 절제술 후 간의 재생은 2 주 이내에 비대에 의한 조직의 손실을 보상 할 수 있었다. 마우스는 70 %까지의 간 부피 감소에 대응할 수있다.
종양 세포가 잔류 간 내부 성장할 수 있었다 고형 종양이 확립 될 수있다. 종양 성장 및 종양 세포 증식 절제 간 조직의 양에 상관. 큰 종양 무게 및 부피로 표현 된 나머지 간 내 종양 성장의 활성화에 절제 리드 방법. 확산이 더 큰 정도를 면역 조직 화학 검사에 의해 설명 될 수있다.
이곳은 간 재생 FAC의 양 것으로 알려져TORS 간 절제술 25, 26의 정도와 간 비대 증가에 대해 발표했다. 따라서, 간 재생 인자 및 종양 세포의 성장 사이에 링크가 존재할 수있다. 전이성 재발 절제 전에 간 내 전이의 양에 상관 곳 임상 관찰과 일치이다. 더, 아직 검출 종양 세포 예금, 진단에 존재할 수있는 반면 수술 전 영상에서 볼 수 있습니다 간 전이는 빙산의 일각을 반영 할 수있다. 간 절제술 후 간 재생 인자는 결국 재발 전이으로 명백하게 될 이러한 종양 세포의 성장을 촉진 할 수있다.
상술 한 상관 관계가 매우 높다 있지만, 지금까지 검증되지 않았다. 간내 종양 진행에 간 재생 메커니즘의 영향은 따라서 더 분자 분석을 필요로한다. 정확한 지침과 예시 비디오는 신속하게 채택 할 수이 비디오에 소개 된 기술. 이 사건이 잘 알려진 체인에서 누락 된 링크를 발견하고자하는 전 세계 연구 다른 종류의 기초 역할을 할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
특별 감사는 기술적 인 질문에 그의 도움 박사 벤자민 Motsch로 이동합니다. 저자는 또한 멀티미디어 지원을 위해 박사 마커스 Forschner 및 BIRK 뮐러을 인정하고 싶습니다, 그녀의 편집 전문 지식에 대한 에리카 Magelky 리사 호르 눙 박사 롤랜드 Jurgons 모든 프란츠 - Penzoldt-센터, 대학 교수 스테판 폰 Hörsten ( 동물의 취급 및 관리에 자신의 전문성에 대한 에를 랑겐). 우리는 MC38 종양 세포를 제공하기위한 임상 화학 연구소, 하이델베르크, 독일 대학의 의학 교수 만하임 교수 마이클 Neumaier 감사합니다.
본 작품은 학위 취득에 대한 요구 사항의 이행을 수행 하였다 박사는 "의대를." 프리드리히 - 알렉산더 - 대학 에를 랑겐 - 뉘른베르크 (FAU)에서.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Operation Microscope | Zeiss | OPMI-1 FC S21 | |
| Induction Cage (Plexiglas Box) | UNO BV, Netherlands | 180000132 | |
| Flowmeter + Connection Kit | UNO BV, Netherlands | 180000008 | |
| UNO Vaporizer Sigma Delta | UNO BV, Netherlands | 180000002 | |
| Key Filler for Anesthetic | UNO BV, Netherlands | 180000010 | |
| Activated Charcoal Filter Adsorber | UNO BV, Netherlands | 180000140 | |
| Gas Exhaust Unit | UNO BV, Netherlands | 180000118 | |
| Face Mask for mouse | UNO BV, Netherlands | 180000065 | |
| Vaporizer Stand | UNO BV, Netherlands | 180000006 | |
| Heat lamp | Physitemp Instruments | HL-1 | |
| Styrofoam Pad | RAYHER | 30074000 | |
| Third Hand Tool | TOOLCRAFT | ZD-10F | |
| Precision Scales | Kern | EW 220-3NM | |
| Scales | Kern | EMB 500-1 | |
| Sliding Caliper | MIB | MIB 82026100 | |
| Microdissection forceps | Braun/Aesculap | BD195R | |
| Microdissection scissors | Braun/Aesculap | FD100R | |
| Microdissection needle holder | Braun/Aesculap | BM563R | |
| Retractor | Fine Science Tools (F.S.T.) | No. 17001-0 | Type: Bowmann |
| Clamp | Braun/Aesculap | BJ002R | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Expendable Items (NOTE: Quantities are per animal and procedure) |
|||
| Foliodrape sterile cover (45 cm x 75 cm) | Hartmann | 2775001 | |
| Sterile Cotton Swabs (2x) | Hartmann | 4700151 | Peha |
| Sterile fluid (0.9% NaCl) | Braun | 3570310 | PZN=04454809 |
| Disinfectant (Softasept - 250 ml) | Braun | 3887138 | PZN=0762008808505018 |
| 2 x 1 ml syringe (Injekt-F ) | Braun | 9166017V | |
| 26 G canula (Sterican) - for Carprofen injection | Braun | 4665457 | |
| 30 G canula (Sterican) - for Tumor injection | Braun | 4656300 | |
| Caprofen (=Rimadyl) | Pfizer | QM01AE91 | |
| Metamizole (= Novaminsulfon) | Ratiopharm | 16543.00.00 | |
| 4-0 Vicryl suture | Ethicon | J835G | |
| 5-0 Prolene suture | Ethicon | 8618G | |
| SafeLock Flex-Tube 1.5 ml | Eppendorf | 22363778 | |
| 4 x 4 Gauze Sponge | Kendall/Covidien | UPC: 728795135355 | ASIN: B005BFQTWM |
| Large paperclip | ACCO | A7072510G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| Female athymic nude-foxn1nu/nu | Harlan Laboratories B.V. | Code 069 |
References
- Haggar, F. A., Boushey, R. P. Colorectal cancer epidemiology: incidence, mortality, survival, and risk factors. Clin. Colon Rectal Surg. 22, 191-197 (2009).
- Fong, Y., et al. Liver resection for colorectal metastases. J. Clin. Oncol. 15, 938-946 (1997).
- Kato, T., et al. Therapeutic results for hepatic metastasis of colorectal cancer with special reference to effectiveness of hepatectomy: analysis of prognostic factors for 763 cases recorded at 18 institutions. Dis. Colon Rectum. 46, S22-S31 (2003).
- Poston, G. J., et al. OncoSurge: a strategy for improving resectability with curative intent in metastatic colorectal cancer. J. Clin. Oncol. 23, 7125-7134 (2005).
- Neumann, U. P., Seehofer, D., Neuhaus, P. The surgical treatment of hepatic metastases in colorectal carcinoma. Dtsch Arztebl Int. 107, 335-342 (2010).
- Alwayn, I. P., et al. A critical role for matrix metalloproteinases in liver regeneration. J. Surg. Res. 145, 192-198 (2008).
- Fausto, N., Campbell, J. S., Riehle, K. J. Liver regeneration. Hepatology. 43, S45-S53 (2006).
- Fujiyoshi, M., Ozaki, M. Molecular mechanisms of liver regeneration and protection for treatment of liver dysfunction and diseases. J. Hepatobiliary. Pancreat. Surg. 18, 13-22 (2011).
- Jin, X., et al. Paradoxical effects of short- and long-term interleukin-6 exposure on liver injury and repair. Hepatology. 43, 474-484 (2006).
- Nakamura, T., Sakai, K., Nakamura, T., Matsumoto, K. Hepatocyte growth factor twenty years on: Much more than a growth factor. J. Gastroenterol. Hepatol. 26, 188-202 (2011).
- Van Sweringen, H. L., et al. CXC chemokine signaling in the liver: impact on repair and regeneration. Hepatology. 54, 1445-1453 (2011).
- Heijboer, A. C., et al. Sixteen hours of fasting differentially affects hepatic and muscle insulin sensitivity in mice. J. Lipid Res. 46, 582-588 (2005).
- Yang, S. Q., Lin, H. Z., Mandal, A. K., Huang, J., Diehl, A. M. Disrupted signaling and inhibited regeneration in obese mice with fatty livers: implications for nonalcoholic fatty liver disease pathophysiology. Hepatology. 34, 694-706 (2001).
- Selzner, M., Clavien, P. A. Failure of regeneration of the steatotic rat liver: disruption at two different levels in the regeneration pathway. Hepatology. 31, 35-42 (2000).
- Matsuo, T., et al. Control mechanism of the circadian clock for timing of cell division in vivo. Science. 302, 255-259 (2003).
- Iakova, P., Awad, S. S., Timchenko, N. A. Aging reduces proliferative capacities of liver by switching pathways of C/EBPalpha growth arrest. Cell. 113, 495-506 (2003).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J Vis Exp. , (2011).
- Skoulis, N. P., James, R. C., Harbison, R. D., Roberts, S. M. Depression of hepatic glutathione by opioid analgesic drugs in mice. Toxicol. Appl. Pharmacol. 99, 139-147 (1989).
- Berson, A., et al. Mechanisms for experimental buprenorphine hepatotoxicity: major role of mitochondrial dysfunction versus metabolic activation. J. Hepatol. 34, 261-269 (2001).
- Baker, D. G. Natural pathogens of laboratory mice, rats, and rabbits and their effects on research. Clin. Microbiol. Rev. 11, 231-266 (1998).
- FELASA working group on revision of guidelines for health monitoring of rodents and rabbits. FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units. Lab. Anim. 48, 178-192 (2014).
- Nikfarjam, M., Malcontenti-Wilson, C., Fanartzis, M., Daruwalla, J., Christophi, C. A model of partial hepatectomy in mice. J. Invest. Surg. 17, 291-294 (2004).
- Hori, T., et al. Simple and reproducible hepatectomy in the mouse using the clip technique. World J. Gastroenterol. 18, 2767-2774 (2012).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nat. Protoc. 3, 1167-1170 (2008).
- Sowa, J. P., et al. Extent of liver resection modulates the activation of transcription factors and the production of cytokines involved in liver regeneration. World J. Gastroenterol. 14, 7093-7100 (2008).
- Bonninghoff, R., et al. Effect of different liver resection methods on liver damage and regeneration factors VEGF and FGF-2 in mice. Can. J. Surg. 55, 389-393 (2012).
