Abstract
Высокая частота рецидива опухоли после резекции метастатического поражения печени остается нерешенной проблемой. Малые опухолевых клеток отложения, которые не могут быть обнаружены с помощью обычной клинической визуализации, может быть стимулировано печеночных факторов регенерации после резекции печени. Это не совсем понятно, однако, какие факторы имеют решающее значение для рецидива опухоли.
Представленная модель мыши может оказаться полезным для изучения механизмов, которые играют определенную роль в развитии рецидивов злокачественных новообразований после резекции печени. Модель сочетает в себе простой в выполнять и воспроизводимые методы определенных количеств удаления ткани печени и индукции опухоли (путем инъекции) у мышей. Животных обрабатывали либо одной лапаротомии, 30% резекции печени, или 70% резекции печени. Все животные впоследствии получили инъекции опухолевых клеток в оставшейся ткани печени. После двух недель наблюдения, печень и опухоли оценивали по размеру и весу иисследовали с помощью иммуногистохимии.
После того, как 70% резекции печени, объем опухоли и вес были значительно увеличены по сравнению с одним лапаротомии (р <0,05). Кроме того, иммуногистохимии (Ki67) показали повышенную скорость пролиферации опухоли в группе иссечения (р <0,05).
Эти результаты демонстрируют влияние печеночных механизмов регенерации на рост внутрипеченочных опухоли. В сочетании с такими методами, как гистологического проработке или анализа РНК, описанная модель мыши могла бы служить основой для тщательного изучения различных факторов, участвующих в росте опухоли и рецидива метастатического заболевания в печени. Значительное число переменных, таких как продолжительность послеоперационного наблюдения, клеточная линия используется для инъекций или сроков инъекции и резекции печени предлагают несколько углов при изучении конкретного вопроса в контексте пост-ГЕПАТЭКТОМИИ метастазов. Ограничения этой процедуры являются а.е.thorization для выполнения процедуры на животных, доступ к соответствующему объекту испытаний на животных и приобретения определенного оборудования.
Introduction
Колоректальный рак (CRC) составляет почти 9% от всех злокачественных опухолей. Это является третьим наиболее распространенным видом рака, как в США, так и во всем мире. Глобальные показатели смертности от диапазона CRC от 300000 до более чем 500000 в год 1. Двадцать процентов пациентов страдают от метастазов в печени при обнаружении их колоректального опухоли. Резектабельные метастазы обычно обрабатывают с помощью частичной резекции печени 2,3. Усовершенствованные хирургические методы, новые мультимодальные стратегии и новые определения резектабельными метастазов оказывают терапию частичной резекции печени возможно для все большего числа пациентов 4.
Рецидив вторичных злокачественных опухолей печени, однако, является сложной клиническая sequalae в современной хирургии желудочно-кишечного тракта. Пациенты с КПР, перенесшие резекцию метастазов в печени имеют от 30 до 50% вероятность развития новой опухоли в их остатке печени 5. Таким образом, существует необходимость в проведении дальнейших исследований, посвященныхмеханизмы, участвующие в рецидива метастазов в печени.
Резекция печени около 70%, как правило, компенсируется в течение нескольких недель от оставшейся печеночной ткани. Эта регенерация включает в себя множество механизмов, в том числе цитокинов, таких как интерлейкин 6 (IL-6), фактора некроза опухоли альфа (TNF-альфа), фактор роста гепатоцитов (HGF), трансформирующий фактор роста бета (TGF-бета), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF ), матричные металлопротеиназы (ММР-2 и ММР-9) и СХС-хемокины 6-11. Эти вещества поддерживают регенерации печени и может также нести ответственность за высокий уровень повторяемости первичных и вторичных злокачественных опухолей печени путем стимулирования роста малых месторождений опухолевых клеток в оставшейся печени, которые не обнаруживаются рутинной клинической визуализации. Эта причинно-следственная связь не была доказана до сих пор.
Установлена следующая гипотеза. После частичной резекции печени, факторы распространения, которые несут ответственность за живоеR гипертрофия может также вызвать рост ранее неоткрытых опухолевых клеток в печени. Модель мыши была разработана, которая совместила техники резекции печени и индукции опухоли. Тридцать бестимусных голых-foxn1nu / Nu мыши были разделены на три группы по десять животных в каждой. Каждый из них обрабатывали только либо лапаротомии (группа А), 30% резекция печени (группа В) или 70% резекцию печени (группа С). Животные во всех группах впоследствии получили инъекции опухолевых клеток в определенной оставшейся части печени, чтобы имитировать покоящиеся клетки опухоли. Животные, где наблюдали в течение двух недель, а затем оценивали на предмет роста опухоли и гипертрофии печени.
Цель состояла в том, чтобы создать модель, которая может быть использована для поиска молекулярных и патогенетические факторы, которые могут играть определенную роль в формировании после гепатэктомии опухоли. Этот метод может быть полезным при оценке: происхождение эндокринных факторов, участвующих в регенерации печени; ответственные механизмы внутрипеченочного ТУМили рост после резекции печени; а объем резекцию печени необходимо для внутрипеченочного индукции опухолевого роста. Следующий метод только выполнялась на животных, потому что они обещают внести свой вклад в понимание фундаментальных биологических принципов и развитие знаний, которые можно ожидать в пользу людей от улучшенных вариантов лечения. Из - за механизмов , участвующих в этих вопросах, оно должно было быть рассмотрено в естественных условиях, так как методы в пробирке не может обеспечить реалистичное представление патологии человека.
Эти исследования могут привести к открытию соответствующих целевых задач для профилактических вариантов лечения для уменьшения рецидива опухоли.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Правительство Средней Франконии в Баварии, Германия, получила разрешение для процедур, описанных. Любые подобные эксперименты требуют предварительного разрешения соответствующих властей.
Примечание: Следующая Пособие может быть использовано для рассмотренных ранее групп А через C. Шаги, которые должны быть оставлены в группах А и В имеют соответствующую маркировку.
1. Подготовка
- Наденьте перчатки, поместите полистирола площадку под микроскопом, и сфокусировать объектив на область чуть выше площадку.
- Разделить стерильную простыню и место половину по сравнению с полистиролом площадку, а другая половина просто рядом с ним.
- Стерилизовать хирургических инструментов и поместите их на стерильную листе рядом с Полистирол площадку.
- Отогните большой скрепку, чтобы сформировать арку. Поверните его вверх дном и нажмите на него в полистирольной площадку на верхнем конце - только рядом, где голова животного будет лежать.
- Поместите мундштук испарителем между двумя конечностиs арки. (Рисунок 7)
- Настройка нагревательную лампу около 40 см от того места, где голова животного будет лежать. Убедитесь, что тепло на уровне полистирола площадки не превышает 40 ° C.
- Подготовьте отдельную клетку для оперированных животных.
- Готовят определенного количества и объема (максимум 50 мкл) опухолевых клеток в гибкую трубку и хранить ее на льду.
2. Анестезия
- Поместите мышь в коробку из плексигласа и начать обезболивающий индукции по высокой изофлюрана потока (5% изофлуран при расходе 10 л / мин).
- После прохождения через различные этапы анестезии, удалить мышь из коробки оргстекла только после того, как вошел в стадию предсмертной дыхания, которое может быть легко узнаваемый резким снижением частоты дыхания (<20 об / мин) и глубокими вздохами встряхивания все тело животного.
- Быстро поместить животное брюхом вверх на Салфетка стерильная покрыты полистирольной площадку и продолжитьвентиляция на изофлюрана низкопоточной, вставив морду мышки в мундштук для поддержания анестезии. Используйте инспираторную фракцию 1,8-2,2% при расходе около 1 л / мин.
- Оцените глубину анестезии во время операции путем вычисления частоту дыхания, которая в идеале от 45 до 60 вдохов в минуту. Адаптировать вдохе изофлуран фракции соответственно, если это не так.
Примечание: Изменения в вдохе изофлурановым фракции занимают около 60 сек, пока они не вступают в силу. Избегайте проведения кардинальных изменений быстро. Вместо этого необходимо изменить приложение анестетика постепенно.
3. Эксплуатация
- Лечить грудь и живот с адекватной дезинфицирующим и менять перчатки после этого.
- Подайте вес адаптированный объем карпрофена (5 мг / кг веса тела) в бедро животного.
- Осторожно зажать кожи живота с пинцетом, чтобы проверить, если глубина анестезии достаточна.
- Тщательно рассекать пространство вокруг мечевидного выставить его из окружающих тканей.
- Место пребывания шов через мечевидного (изнутри наружу) и прикрепить обе нити к держателю выше животных головки с помощью зажима.
- Pinch конечности втягивающего вместе и медленно ввести "U" -образные подсказки втягивающего устройства вдоль внутренней брюшной стенки животного.
Примечание: Эти меры обнажить печень, чтобы облегчить доступ к различным долек. Определение средней и левой боковой доли печени должны теперь быть возможным. - Используйте солевой раствор пропитанной ватный тампон и осторожно надавите медиану мочку вниз. Рассеките вентральной три четверти серповидной связки, которые теперь будут видны между поверхностью Медианная лопасть и диафрагмы.
- Теперь используйте два соленых пропитанной ватные тампоны, чтобы сдвинуть медианулопасть и левой боковой лопастью вверх к диафрагме.
- Визуализируйте тонкую мембрану между левой боковой доли и хвостатой доли и тщательно проанализируем его.
Примечание: При выполнении этого протокола на животных из группы А, переходите к пункту 3.18 в этой точке. - Поместите размер 4-0 лигатуры по диагонали вдоль основания левой боковой мочку в.
- Затем с помощью ватного тампона, чтобы вернуть левую боковую лопасть в исходное положение.
- Аккуратно связать лигатуры как можно ближе к основанию лепестка насколько возможно и оценить для изменения цвета в доле, чтобы проверить адекватно прерванной кровоснабжения.
- Резекцию левой боковой лепесток, следуя линии основания лепестка и отметить вес резецировали мочку в.
Примечание: При выполнении этого протокола на животных из группы В, переходите к пункту 3.18 в этой точке. - Поместите вторую лигатуру между культей левой боковой мочку и базы Медианная лопасть в.
- Переставьте Медианная лопасть как шELL и связать лигатуры. Опять же, оценки для изменения цвета в доле, чтобы проверить адекватно прерванной кровоснабжения.
- Резекцию медиану мочку и обратите внимание на его вес.
- Подключите 1 мл шприц с 30 G иглой и заполнить его с опухолевыми клетками из гибкой трубки, не наклоняя шприц в любое время.
- Используйте ватные тампоны для перемещения кишечных петель слева от животного, чтобы разоблачить нижнюю правую мочку.
- Вставьте сотовый загруженный шприц в "третьей стороне" устройства на углом 30 ° к вертикали.
- Тщательно перемещайте устройство рядом с мышью с иглой чуть выше нижней правой доле.
- Медленно шприц в течение третьего устройства вручную, пока кончик ушко не находится в центральной части низшая правой доле в.
- Вводят весь объем в центральной части мочки в течение 30-45 сек.
- Сжать место инъекции в течение по крайней мере трех минут, пока кровотечение не остановилось.
- Закройте лицевую панель с резорбируемой 5-0 швом с помощью нажатия одной клавиши узлов.
- Закройте кожу с 4-0, не рассасывающиеся нити с помощью нажатия одной клавиши узлов.
- Начало вентиляции мыши на высокой кислорода потока в течение примерно 1 мин.
4. Послеоперационное процедура
- Поместите животное в теплое помещение (около 40 ° С) в течение следующего получаса, чтобы обеспечить адекватное восстановление.
- Примешивать питьевую воду животного с 5 мг / мл метамизол в течение 72 ч в послеоперационном периоде.
- Проверьте целостность швов тесно в течение по крайней мере трех дней после процедуры.
5. Период наблюдения и Эвтаназия
- Мера веса животного ежедневно в течение в общей сложности 14 дней. Оценка их относительно их благосостояния и ограничений соответственно.
- Через 14 дней, обезболить животное следующие шаги 2.1 и 2.2 оперативного протокола аго продолжить с протоколом учреждения для эвтаназии животных.
- Выполнить средний лапаротомии как описано в шаге 3.4. Для облегчения доступа к брюшной полости, продлить см каудально Разрез 1-1.5. Вставьте втягивающим, как указано в 3.7.
- Dissect вдоль остальной части серповидной связки и разрезать нижнюю полую вену так же, как он выходит из краниальном печени.
- Отделите печень от диафрагмы, захватывая диафрагму с пинцетом и тупо рассечения в пространство между печени и мышечной ткани.
- Поднимите мобилизованы ткани печени от забрюшинного пространства и рассекают его оставшиеся структуры он все еще прикрепленные к: забрюшинной жировой ткани, нижней полой вены и воротной вены.
- Проверьте печень после экстракции для любой дополнительной ткани, которая будет ложно способствовать его фактического размера и веса. Извлеченный печени и ее опухоли показаны на рисунке 6.
- Рассеките опухоль от инфerior правой доли.
- Измерьте размер и вес как опухоли и паренхимы печени.
- Сбережение дополнительные образцы ткани из брюшины, лимфатические узлы или другие органы, которые необходимы для анализа ткани
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В нашем конкретном эксперименте, мы включили 30 бестимусных голых-foxn1nu / ню мышей. Они получили срединную лапаротомию, опухолевых клеток инъекции 500000 МС38 опухолевых клеток (растворенных в 50 мкл физиологического раствора), а затем обрабатывали либо 70% резекции печени, 30% резекции печени, или вообще без дальнейшего вмешательства.
Через 14 дней, почти полное восстановление оставшейся печени следующие 30% или 70% резекции печени (печень гипертрофия-индекс 30% группы резекции печени была 1,06 по сравнению с 0,8 из 70% группы резекция печени) наблюдалась.
После однократного лапаротомии, средний вес внутрипеченочных опухолей был 332 мг (диапазон: 10-608 мг). Средний вес опухоли внутрипеченочных опухолей был 656 мг (диапазон: 76-1,873 мг) после того, как 30% резекция печени по сравнению 961 мг (диапазон: 189 мг-3030 мг) после того, как 70% резекции печени с р & #60; 0,05 (рисунок 1). После того, как 30% резекции печени, объем опухоли 950 мм 3 (диапазон: 439-2,326 мм 3) по сравнению с 1385 мм 3 (диапазон: 411-2,366 мм 3) после 70% резекции печени, и 511 мм 3 (диапазон: 87-1,693 мм 3) после того, как только лапаротомии с р <0,05 (рис 2).
Тканевые срезы опухолевой ткани были взяты и проанализированы с помощью Ki-67 иммуногистохимии. Клетки на слайдах были оценены в отношении их скорости пролиферации. Средняя скорость пролиферации опухолевых клеток из группы лапаротомии составила 47% (диапазон: 39-56%) по сравнению с 61% (диапазон: 51-69%) от животных, подвергнутых резекцию печени на 70% (р <0,05) и 53% (диапазон: 38-69%) от животных , которые подверглись резекцию печени на 30% (р = 0,22), что показывает повышенную скорость пролиферации клеток в группах, перенесших резекцию печени (рис 3 - 5).
Рисунок 1:. Вес внутрипеченочных Опухоли Диаграмма сравнивает средний вес опухоли среди групп А, В и С после рассечения из печени и показывает увеличение веса в опухолях группы В и С. Столбики ошибок обозначают SEM. Пожалуйста , нажмите здесь для просмотра большая версия этой фигуры.
Рисунок 2:. Объем внутрипеченочных Опухоли Диаграмма сравнивает средний объем опухоли среди групп А, В и С после рассечения из печени и показано увеличение объемов в опухолях группы В и С. Планки погрешностей представляют SEM. апк "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Пролиферация Скорость в опухолях из группы А. Ki-67 Иммуногистохимия слайда из образца опухоли из группы А демонстрирует умеренное пролиферацию опухолевых клеток. Шкала бар = 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Пролиферация Скорость в опухолях из группы B. Ki-67 Иммуногистохимия слайда из образца опухоли из группы В демонстрирует умеренное пролиферацию опухолевых клеток. Шкала бар = 100 мкм.получить = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5: Пролиферация Скорость в опухолях из группы С. Ki-67 Иммуногистохимия слайда из образца опухоли из группы C демонстрирует заметное пролиферацию опухолевых клеток. Шкала бар = 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6: Извлеченные Печень / Опухолевые образец из группы B. Эта печень экстрагировали 14 дней после выполнения 30% резекции печени и инъекции опухолевых клеток одновременно. Большая опухоль в правой нижней доле можно видеть, в то время как правой верхней, средней и хвостатого долиs прошли значительной гипертрофией.
* = Опухоль в нижней правой доле, SRL = превосходит правый лопасть, ML = медианная лопасть, CL = хвостатое лопасть. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 7: ИЛИ Таблица установки Полистирол накладка покрыта стерильной салфеткой. Изогнутый открытой скрепки вдавливается в подушку на ее верхнем конце , покрывающей дыхательную трубку с его мундштука. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Предыдущие эксперименты, выполняющих операции у грызунов были в состоянии определить некоторые переменные, которые могли бы служить в качестве источников для смещения. Для того чтобы получить надежные и достоверные результаты, рассмотрим следующие меры предосторожности.
Рутинное до операции пост может привести к стеатоз печени 12, который может ингибировать регенерацию печени 13,14. Поэтому не рекомендуется. Самая высокая митотическую активность гепатоцитов изменяется в течение 15 -го дня. Если это возможно, проводить процедуры в определенное время в течение дня для всех групп. Мышиные регенерации печени является наиболее эффективным у животных 4-6 недель. Животные старше 10 - месячного возраста имеют значительное снижение способности к регенерации 16. Используйте мышей той же расы, пола и возраста для экспериментов, чтобы свести к минимуму вероятность смещения. Работа в стерильной среде, как правило, важно в открытой процедуре, как это. Особенно в иммунодефицитом организмов, как athymi C мышей, используемые в видео, риск инфекции, что может привести к преждевременной смерти или необъективных результатов, высока. Занимаясь три зоны-установку , состоящую из препарата, хирургии и области восстановления , поэтому оправданным 17. Благодаря своим глубоким гепатотоксических эффектов, обычно используется бупренорфин не рекомендуется для внутри- или послеоперационной обезболивающей терапии 18,19. Используйте другие вещества, такие как карпрофена или метамизол, чтобы обеспечить адекватное обезболивание. Так как метамизол не доступен во многих странах, карпрофен также могут быть использованы для контроля боли после процедуры. Выполните подкожную инъекцию 5 мг / кг массы тела один раз в день в течение трех дней, чтобы заменить метамизол.
Послеоперационного восстановления лучше всего достигается, когда восстановление мыши помещается в теплое помещение с легким доступом к пище и воде. Он идеально изолированы от других мышей на ночь, чтобы предотвратить более доминирующих животных от вреда более уязвимых из них 17.
jove_content "> Хотя протокол очень прост, есть некоторые незначительные ловушки, чтобы избежать при выполнении такого рода операции у мышей. Рассечение серповидной связки, структура соединения вентральной средней доли к брюшной стенке, имеет важное значение для добиться подходящей гибкости печени. Поскольку эта связка расширяется в область очень близко к точке, где нижняя полая вена покидает печень краниально, осторожность оправдана для того, чтобы предотвратить повреждение этой крупной вены. в среднем, рассекает его около трех четвертей от способ обеспечит удовлетворительную мобилизацию и в то же время поддерживать достаточное расстояние до судна.Используя правильное количество напряженности, когда лигирования лопасть с лигатурой является чрезвычайно важной задачей при выполнении протокола засечки. Лигатуры с воздушными узлами или плохо затянуты лигатур может привести к неадекватно прерванного кровоснабжения, кровоизлияния, шок и смерть. В то же время, attemPT тщательно затянуть узел лигатуры может привести к разрыву с лигатуры, связанной с повреждением окружающих тканей и органов. Эффективный способ оценки лигатуры целостности является наблюдение синюшный изменение цвета в пределах перевязанной доли. Выбор правильного шовного материала также играет важную роль. Плетеный шовный материал, скорее всего, сжимают ткани, в то время как monofilamentous материалы будут довольно рассекают через мягкую ткань печени и вызывает кровотечение.
Другим важным шагом при удалении долей печени у мышей включает в себя правильное позиционирование лигатур. Лигирование должны быть выполнены перпендикулярно основному сосудов, входящих мочки. Хотя это довольно просто в средней доле, адекватная резекция левого бокового лепестка является более сложной задачей. Его сосуды входят мочку в вентро-каудальном направлении. В результате лигатуру нить должна быть помещена вдоль воображаемой линии между левым основанием выпада к нижней правой доле лIver.
В средней доле, однако, может поставить под угрозу резекция нижней полой вены. Так как этот крупный сосуд проходит через спинную часть лепестка, он склонен к повреждению, что может привести к некрозу печени. Кроме того, связывая лигатуры с слишком много напряженности в этой области, может привести к разрыву диафрагмы и / или пневмоторакса.
Адекватные обработка опухолевых клеток также имеет важное значение при попытке получить сопоставимые результаты. Хотя точные методы культивирования клеток не предназначены, чтобы быть частью этого протокола, обработка опухолевых клеток в рамках процедуры столь же важна, как идеальная подготовка заранее. При заполнении шприца с опухолевыми клетками, жизненно важно, чтобы держать его в вертикальном положении во все времена. Основные опрокидывание шприца может привести к опухолевым клеткам, прилипших к шприцам стенке, поэтому приводит к потере клеток в момент инъекции. Лишь незначительное опрокидывание является оправданным в момент инъекции, для того, чтобы ввести иглу каждогоперпендикулярна поверхности уступает правой доле в.
Кровоизлияние и перитонеальные метастазы могут возникнуть в результате кровотечения и утечки из места прокола на поверхности печени. Следовательно, нежное сжатие лепестка с помощью ватного тампона в течение трех минут, имеет важное значение для контроля кровотечение из паренхимы печени и предотвращения опухолевых клеток протечки жидкости в брюшину.
Публикации, содержащие протоколы процедур для внутрибрюшных операций у грызунов редко содержат информацию о типе брюшной закрытия. Тем не менее, этот аспект является еще одним возможным источником осложнений. Даже при надлежащем контроле боли, животные будут пытаться удалить инородные тела в их брюшной стенки. Последствия могут быть внутрибрюшное инфекция, открытый живот или даже смерть. Это можно предотвратить, если оба выполняют одиночные прерывистыми швами для закрытия раны вместо запущенного швом и закрытия брюшной стенки в два слоя.
Женский бестимусных ню-foxn1nu / ню мышей (при условии, Харлан Laboratories BV, Kreuzelweg 53, NL-5961 Н.М. Horst) использовались в этом эксперименте. Дефицит Т-клеток эта порода известна позволяет рост относительно неограниченный опухоли и, следовательно, идеальные условия для имплантации опухоли. Для того чтобы минимизировать влияние ранжирования драк среди животных, использовались только самки животных. Предварительные результаты с использованием различных штаммов, как в C57BL / 6 мышей инбредных линий также показали значительный, но более низкий рост опухоли объем. Таким образом, этот метод может быть весьма вероятно, практически даже в большем количестве штаммов мыши.
Тем не менее, с помощью иммунодефицитом организмов в этой ситуации требует специальных мер предосторожности гигиены животных, а патогены могут помешать росту опухоли 20. Меры , такие , как использование контрольных животных , чтобы контролировать наличие патогенных агентов 21 , как осуществляется в испытательной виварии наше исследование проводилось проходить в может быть helpfuл в выявлении возможных источников предвзятости.
Этот эксперимент использовали мышиные колоректального линии раковых клеток под названием МС38 (полученный из Института клинической химии на медицинском факультете Мангейм, Германия). 5 × 10 5 опухолевых клеток растворяли в 50 мкл физиологического раствора. Концентрацию определяли в предварительных опытах, где эта величина была определена в качестве идеальной для формирования твердой опухоли в течение двух недель. В зависимости от иммунологической животных, используемых в этих экспериментах (обсуждение см выше), она вполне может быть также возможно использование клеток колоректального рака человека и, следовательно, создать ксенотрансплантата. Начальное тестирование выполняется в бестимусных ню-foxn1nu / Nu мышей с использованием человеческих опухолевых клеток SW480 удалось успешно продемонстрировать рост опухоли в печени остатка после резекции. Благодаря измерению мышиных печени, рекомендуется только объемы использования до 50 мкл, чтобы предотвратить развитие осложнений. Возможное повышение в этот момент будетбыть маркировать опухолевых клеток с люциферазы. В зависимости от проблемы, которая исследуется, интересная информация может возникнуть, когда более тщательный мониторинг роста клеток опухоли и размер возможно.
Альтернативные способы лигирования долей печени включают метод отсечения 22 или отсечение-сшивающий гибридную технику 23. Позиционирование отсечение устройств, тем не менее, могут оказывать методы секущие трудно. Достойно выполнена шовный лигирование остается легко узнать технику и очень вероятно, будет наиболее экономически эффективным способом удаления мочку в этом эксперименте.
Поскольку живые животные используются в этом эксперименте, он требует предварительного разрешения соответствующих властей. В зависимости от региона, это может быть дорогостоящим и трудоемкой задачей. Даже после официального утверждения, эксперименты на животных гораздо менее доступны, чем методы исследования, как испытания клеточной культуры или молекулярных методов. В дополнение к инфраструктурасовременное тестирование виварии, специальное оборудование должно быть выделено для выполнения протокола. Кроме того, на срок от двух до четырех недель должно быть запланировано освоить эту технику. Этот протокол может применяться для широкого спектра клеточных линий в большом количестве линий мышей. Тем не менее, в отношении возможных модификаций, упомянутых выше, не каждая линия клеток может быть изучен в каждом организме.
Основная цель исследований следственных, использующих этот протокол будет комплексная система фактор роста участвует в регенерации печени и ее точных эффектов на злокачественности печени рецидива. Для того чтобы исследовать эти возможные корреляции адекватно, необходимо осуществить эксперимент на животных, в отличие от различных молекулярных методов или экспериментов на клеточных культурах. Эти методы должны быть использованы, а также бесплатные средства исследования. Хотя несколько различных моделей резекция печени были опубликованы до сих пор 22-24, эта процедуравпервые реализует одновременную инъекцию опухолевых клеток в хорошо налаженной работе.
Эта модель мыши демонстрирует, что резекция печени у мышей является довольно простым, целесообразным и легко воспроизводимый метод. регенерации печени после мелких и крупных резекций был в состоянии компенсировать потерю ткани за счет гипертрофии в течение двух недель. Мыши могут справиться с сокращением объема печени до 70%.
Опухолевые клетки были способны расти в остатке печени и солидных опухолей может быть установлена. опухолевого роста и пролиферации опухолевых клеток коррелирует с количеством резецированным ткани печени. Процесс резекция приводит к активации роста опухоли в оставшейся печени, что выразилось, большей массы опухолей и объемов. Эта большая степень пролиферации может быть продемонстрирована с помощью иммуногистохимии экзаменов.
Хорошо известно, что количество печеночных FAC регенерацииторы выпустили для гипертрофии печени возрастает с увеличением степени резекции печени 25,26. Таким образом, связь между факторами регенерации печени и рост опухолевых клеток, может существовать. Это в соответствии с клиническими наблюдениями, где метастатический рецидив коррелирует с количеством метастазов в печени до начала резекции. Метастазы в печень, которые видны на предоперационной визуализации может отражать только верхушка айсберга, в то время как все больше, пока не обнаруживается опухолевых клеток отложения, могут присутствовать на момент постановки диагноза. После резекции печени, печеночной факторы регенерации могут затем стимулировать рост этих опухолевых клеток, которые в конечном счете станут очевидными в качестве рецидивирующих метастазов.
Хотя корреляция уже упоминалось выше, весьма вероятно, это не было доказано до сих пор. Влияние печеночных механизмов регенерации на прогресс внутрипеченочного опухоли, следовательно, требует дальнейшего молекулярного анализа. Точные инструкции, а также иллюстративный видео позволяют быстрое принятиетехники, введенной в этом видео. Он может служить в качестве основы для различных видов исследований по всему миру, которые пытаются обнаружить недостающее звено в этой известной цепи событий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Особая благодарность д-ру Бенджамину Motsch за его помощь в технических вопросах. Авторы также хотели бы отметить доктор Маркус Forschner и Бирк Мюллер за их поддержку мультимедиа, Erica Magelky за ее редакционной экспертизы и Лиза Хорнанг, доктор Роланд Jurgons и профессор Стефан фон Хорстен (все от Франца-Penzoldt-Центр, Университет Эрланген) за их профессионализм в обращении и ухода за животными. Мы благодарим профессора Майкла Neumaier в Институте клинической химии, медицинский факультет Мангейм университета Гейдельберг, Германия для обеспечения опухолевых клеток МС38.
Настоящая работа была выполнена в выполнении требований для получения степени "доктор мед." на Friedrich-Alexander-Эрланген-Нюрнбергского университета (FAU).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Operation Microscope | Zeiss | OPMI-1 FC S21 | |
| Induction Cage (Plexiglas Box) | UNO BV, Netherlands | 180000132 | |
| Flowmeter + Connection Kit | UNO BV, Netherlands | 180000008 | |
| UNO Vaporizer Sigma Delta | UNO BV, Netherlands | 180000002 | |
| Key Filler for Anesthetic | UNO BV, Netherlands | 180000010 | |
| Activated Charcoal Filter Adsorber | UNO BV, Netherlands | 180000140 | |
| Gas Exhaust Unit | UNO BV, Netherlands | 180000118 | |
| Face Mask for mouse | UNO BV, Netherlands | 180000065 | |
| Vaporizer Stand | UNO BV, Netherlands | 180000006 | |
| Heat lamp | Physitemp Instruments | HL-1 | |
| Styrofoam Pad | RAYHER | 30074000 | |
| Third Hand Tool | TOOLCRAFT | ZD-10F | |
| Precision Scales | Kern | EW 220-3NM | |
| Scales | Kern | EMB 500-1 | |
| Sliding Caliper | MIB | MIB 82026100 | |
| Microdissection forceps | Braun/Aesculap | BD195R | |
| Microdissection scissors | Braun/Aesculap | FD100R | |
| Microdissection needle holder | Braun/Aesculap | BM563R | |
| Retractor | Fine Science Tools (F.S.T.) | No. 17001-0 | Type: Bowmann |
| Clamp | Braun/Aesculap | BJ002R | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Expendable Items (NOTE: Quantities are per animal and procedure) |
|||
| Foliodrape sterile cover (45 cm x 75 cm) | Hartmann | 2775001 | |
| Sterile Cotton Swabs (2x) | Hartmann | 4700151 | Peha |
| Sterile fluid (0.9% NaCl) | Braun | 3570310 | PZN=04454809 |
| Disinfectant (Softasept - 250 ml) | Braun | 3887138 | PZN=0762008808505018 |
| 2 x 1 ml syringe (Injekt-F ) | Braun | 9166017V | |
| 26 G canula (Sterican) - for Carprofen injection | Braun | 4665457 | |
| 30 G canula (Sterican) - for Tumor injection | Braun | 4656300 | |
| Caprofen (=Rimadyl) | Pfizer | QM01AE91 | |
| Metamizole (= Novaminsulfon) | Ratiopharm | 16543.00.00 | |
| 4-0 Vicryl suture | Ethicon | J835G | |
| 5-0 Prolene suture | Ethicon | 8618G | |
| SafeLock Flex-Tube 1.5 ml | Eppendorf | 22363778 | |
| 4 x 4 Gauze Sponge | Kendall/Covidien | UPC: 728795135355 | ASIN: B005BFQTWM |
| Large paperclip | ACCO | A7072510G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| Female athymic nude-foxn1nu/nu | Harlan Laboratories B.V. | Code 069 |
References
- Haggar, F. A., Boushey, R. P. Colorectal cancer epidemiology: incidence, mortality, survival, and risk factors. Clin. Colon Rectal Surg. 22, 191-197 (2009).
- Fong, Y., et al. Liver resection for colorectal metastases. J. Clin. Oncol. 15, 938-946 (1997).
- Kato, T., et al. Therapeutic results for hepatic metastasis of colorectal cancer with special reference to effectiveness of hepatectomy: analysis of prognostic factors for 763 cases recorded at 18 institutions. Dis. Colon Rectum. 46, S22-S31 (2003).
- Poston, G. J., et al. OncoSurge: a strategy for improving resectability with curative intent in metastatic colorectal cancer. J. Clin. Oncol. 23, 7125-7134 (2005).
- Neumann, U. P., Seehofer, D., Neuhaus, P. The surgical treatment of hepatic metastases in colorectal carcinoma. Dtsch Arztebl Int. 107, 335-342 (2010).
- Alwayn, I. P., et al. A critical role for matrix metalloproteinases in liver regeneration. J. Surg. Res. 145, 192-198 (2008).
- Fausto, N., Campbell, J. S., Riehle, K. J. Liver regeneration. Hepatology. 43, S45-S53 (2006).
- Fujiyoshi, M., Ozaki, M. Molecular mechanisms of liver regeneration and protection for treatment of liver dysfunction and diseases. J. Hepatobiliary. Pancreat. Surg. 18, 13-22 (2011).
- Jin, X., et al. Paradoxical effects of short- and long-term interleukin-6 exposure on liver injury and repair. Hepatology. 43, 474-484 (2006).
- Nakamura, T., Sakai, K., Nakamura, T., Matsumoto, K. Hepatocyte growth factor twenty years on: Much more than a growth factor. J. Gastroenterol. Hepatol. 26, 188-202 (2011).
- Van Sweringen, H. L., et al. CXC chemokine signaling in the liver: impact on repair and regeneration. Hepatology. 54, 1445-1453 (2011).
- Heijboer, A. C., et al. Sixteen hours of fasting differentially affects hepatic and muscle insulin sensitivity in mice. J. Lipid Res. 46, 582-588 (2005).
- Yang, S. Q., Lin, H. Z., Mandal, A. K., Huang, J., Diehl, A. M. Disrupted signaling and inhibited regeneration in obese mice with fatty livers: implications for nonalcoholic fatty liver disease pathophysiology. Hepatology. 34, 694-706 (2001).
- Selzner, M., Clavien, P. A. Failure of regeneration of the steatotic rat liver: disruption at two different levels in the regeneration pathway. Hepatology. 31, 35-42 (2000).
- Matsuo, T., et al. Control mechanism of the circadian clock for timing of cell division in vivo. Science. 302, 255-259 (2003).
- Iakova, P., Awad, S. S., Timchenko, N. A. Aging reduces proliferative capacities of liver by switching pathways of C/EBPalpha growth arrest. Cell. 113, 495-506 (2003).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J Vis Exp. , (2011).
- Skoulis, N. P., James, R. C., Harbison, R. D., Roberts, S. M. Depression of hepatic glutathione by opioid analgesic drugs in mice. Toxicol. Appl. Pharmacol. 99, 139-147 (1989).
- Berson, A., et al. Mechanisms for experimental buprenorphine hepatotoxicity: major role of mitochondrial dysfunction versus metabolic activation. J. Hepatol. 34, 261-269 (2001).
- Baker, D. G. Natural pathogens of laboratory mice, rats, and rabbits and their effects on research. Clin. Microbiol. Rev. 11, 231-266 (1998).
- FELASA working group on revision of guidelines for health monitoring of rodents and rabbits. FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units. Lab. Anim. 48, 178-192 (2014).
- Nikfarjam, M., Malcontenti-Wilson, C., Fanartzis, M., Daruwalla, J., Christophi, C. A model of partial hepatectomy in mice. J. Invest. Surg. 17, 291-294 (2004).
- Hori, T., et al. Simple and reproducible hepatectomy in the mouse using the clip technique. World J. Gastroenterol. 18, 2767-2774 (2012).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nat. Protoc. 3, 1167-1170 (2008).
- Sowa, J. P., et al. Extent of liver resection modulates the activation of transcription factors and the production of cytokines involved in liver regeneration. World J. Gastroenterol. 14, 7093-7100 (2008).
- Bonninghoff, R., et al. Effect of different liver resection methods on liver damage and regeneration factors VEGF and FGF-2 in mice. Can. J. Surg. 55, 389-393 (2012).
