Abstract
השיעור הגבוה של הישנות הגידול לאחר כריתה של נגעים בכבד גרורתי נשאר בעיה לא פתורה. פיקדונות תאים סרטניים קטנים, אשר אינם יכולים לאתר הדמיה קלינית שיגרתית, עשויים להיות מגורה על ידי גורמי התחדשות כבדים לאחר כריתה כבדה. לא ברור לחלוטין, עם זאת, אשר גורם הם קריטיים עבור ישנות גידול.
מודל העכבר הציג עשויה להיות שימושי כדי לחקור את המנגנונים לשחק תפקיד בהתפתחות של נגעים ממאירים חוזרים לאחר כריתה כבדה. המודל משלב טכניקות הקלות לבצע לשחזור של כמויות מוגדרות של הסרת כבד רקמות אינדוקצית גידול (בזריקה) בעכברים. החיות טופלו או פיום בטן יחיד, כריתה כבדה 30%, או כריתה כבדה 70%. כל בעלי החיים אחרים-כך נתנו זריקת תאים סרטניים לתוך רקמת הכבד הנותרת. אחרי שבועיים של התבוננות, הכבדים וגידולים הוערכו על גודל ומשקלנבדק על ידי אימונוהיסטוכימיה.
לאחר כריתה כבדה 70%, היקף הגידול והמשקל הוגדלו באופן משמעותי לעומת פיום בטן בלבד (p <0.05). בנוסף, אימונוהיסטוכימיה (Ki67) הראתה קצב התפשטות גידול גדל בקבוצת הכריתה (p <0.05).
ממצאים אלה מעידים על השפעת מנגנוני התחדשות כבדות על צמיחת גידול intrahepatic. בשילוב עם שיטות כמו בדיקות היסטולוגית או ניתוח RNA, במודל העכבר תאר יכול לשמש יסוד להביא לבחינה מדוקדקת של גורמים שונים מעורבים צמיחת גידול וישן מחלה גרורתית בתוך הכבד. מספר לא מבוטל של משתנה כגון אורך תצפית לאחר ניתוח, הקו הסלולרי משמש להזרקה או העיתוי של הזרקת כריתה כבדה להציע מספר זוויות כאשר בוחן שאלה ספציפית בהקשר של גרורות שלאחר כריתה. המגבלות של הליך זה הן authorization לבצע את ההליך על בעלי חיים, גישה למתקן ניסויים בבעלי חיים מתאים ורכישת ציוד מסוים.
Introduction
סרטן המעי הגס (CRC) מהווה כמעט 9% מכלל הגידולים הממאירים. זהו סוג הסרטן הנפוץ ביותר השלישי, הן בארצות הברית ובעולם. שיעורי תמותה עולמיים מטווח CRC מ 300,000 מעל 500,000 בשנת 1. עשרים אחוזים מהחולים סובלים גרורות בכבד עם גילוי הגידול הגס שלהם. גרורות Resectable מטופלים בדרך כלל על ידי 2,3 כריתה כבדה חלקית. טכניקות כירורגיות משופרות, אסטרטגיות multimodal חדשות הגדרות חדשות של גרורות resectable להפוך את הטיפול של כריתה חלקית בכבד אפשרית עבור מספר גדל והולך של חולים 4.
ישנות ממאירויות בכבד משני, לעומת זאת, הוא sequalae קליני מאתגר בכירורגיה העיכול מודרנית. חולים עם CRC שעברו כריתה של גרורות בכבד יש סיכוי של 30 עד 50% לפתח גידול חדש שריד הכבד שלהם 5. לכן, יש צורך במחקר נוסף עלהמנגנונים המעורבים הישנות גרורות בכבד.
כריתה כבדה של כ -70% מפוצית בדרך כלל תוך מספר שבועות על ידי רקמת כבד הנותרת. התחדשות זו כרוכה מספר מנגנונים, כולל ציטוקינים כמו אינטרלאוקין 6 (IL-6), אלפא tumor necrosis factor (TNF-α), גורם הגדילה hepatocyte (HGF) והפכו בטא גורם הגדילה (TGF-β), גורם (vascular endothelial growth VEGF metalloproteases מטריקס,) (MMP-2 ו MMP-9) ו CXC-כמוקינים 6-11. חומרים אלה תומכים התחדשות כבדה ויכולים גם להיות אחראי על שיעורי הישנויות הגבוהים של ממאירויות כבדה ראשונית ומשנית ידי גרימת הצמיחה של פיקדונות תאים סרטניים קטנים בכבדה הנותרים אשר אינם מזוהות על ידי הדמיה קלינית שיגרתית. סיבתיות זה לא הוכחה עד כה.
ההשערה הבאה הוקמה. לאחר כריתה חלקית בכבד, גורמי ההתפשטות שאחראים חיוהיפרטרופיה r עלולה גם לגרום לצמיחת תאים סרטניים וטרם ראו בכבד. במודל של עכברי תוכנן אשר בשילוב הטכניקות של כריתה כבדה אינדוקצית גידול. שלושים עכברים athymic בעירום-foxn1nu / נו חולקו לשלוש קבוצות של עשר חיות כל. כל אחד מהם טופל או פיום בטן לבד (קבוצת א '), כריתה כבדה 30% (הקבוצה B) או כריתה כבדה 70% (קבוצת ג'). בעלי חיים בכל הקבוצות לאחר מכן קבלו זריקת תאים סרטניים לתוך חלק נותר מוגדר של הכבד, כדי לדמות תאים סרטניים רדומים. בעלי חיים שבו נצפו במשך שבועות ומוערכים אז לצמיחת גידול היפרטרופיה כבד.
המטרה הייתה ליצור מודל שיכול לשמש כדי לחפש את הגורמים המולקולריים pathogenetic שעשוי לשחק תפקיד היווצרות גידול שלאחר כריתה. שיטה זו עשויה להיות מועילה בהערכה: מקורם של גורמי האנדוקרינית מעורבים התחדשות כבדה; המנגנונים האחראים Tum intrahepaticאו צמיחה לאחר כריתה כבדה; ואת נפח כבד הכריתה הכרחי לזירוז צמיחת גידול intrahepatic. השיטה הבאה שבוצעה רק על בעלי חיים משום שהם מבטיחים לתרום להבנת עקרונות ביולוגיים בסיסיים להתפתחות ידע שניתן צפוי להניב הטבות לבני אדם על ידי אפשרויות טיפול טובות. בשל המנגנונים המעורבים בעניינים אלה, זה היה צריך להיבדק in vivo, כמו שיטות במבחנה לא יכולות לספק ייצוג ריאליסטי של הפתולוגיה האנושית.
חקירות אלה עשויות להוביל לגילוי של יעדים רלבנטיים עבור אפשרויות טיפול מניעתי להפחתת ישנות גידול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ממשלת תיכון פרנקוניה בבוואריה, גרמניה, התירה את קיום ההליכים המתוארים. כל ניסויים דומים דורשים אישור מראש על ידי הרשויות המתאימות.
הערה: המדריך הבא יכול לשמש עבור קבוצות דנו בעבר דרך ג שלב כי צריכות להישאר בחוץ קבוצות A ו- B מסומנים בהתאם.
1. הכנות
- לבש כפפות, למקם את כרית הקלקר מתחת למיקרוסקופ, ולמקד את העדשה על האזור מעט מעל למקלדת.
- פיצול גיליון סטרילי וחצי ומניחים על גבי משטח קלקר ואת החצי השני ממש ליד זה.
- לעקר את מכשירי ניתוח ומניחים אותם על גיליון סטרילי ליד כרית קלקר.
- נרגע מהדק נייר גדול כדי ליצור קשת. תהפוך אותו ולחץ אותו לתוך כרית הקלקר בקצה העליון - ממש ליד איפה הראש של החיה ישקר.
- מניח את שופרו של המאדה בין שני הגפייםים של קשת. (איור 7)
- הגדרת מנורת חימום על 40 סנטימטרים מהמקום בו את הראש של החיה ישקר. ודא חום ברמה של כרית קלקר אינו עולה על 40 מעלות צלזיוס.
- הכן בכלוב נפרד עבור חיות מופעלות.
- הכן כמות ונפח מוגדר (מקסימום של 50 μl) של תאים סרטניים בתוך צינור גמיש ולאחסן אותו על קרח.
2. הרדמה
- מניחים את העכבר לתוך תיבת פרספקס ולהתחיל אינדוקציה הרדמה על isoflurane זרימה גבוהה (isoflurane 5% בכל זרימת 10 L / min).
- לאחר עובר את השלבים השונים של הרדמה, להסיר את העכבר מתיבת פרספקס רק לאחר שהוא נכנס לשלב של נשימה והא לכסון שמאלית, אשר יכול בקלות להיות מוכר על ידי ירידה דרסטית קצב נשימה (<20 / min) ומתנשם עמוקים טלטול כל הגוף של החיה.
- במהירות למקם את בטנו כלפי מעלה חי על כרית קלקר סטרילי מכוסה וילון ולהמשיךאוורור על isoflurane זרימה נמוכה על ידי החדרת החוטם של העכבר לתוך הפומית כדי לשמור על הרדמה. השתמש חלק שאיפה של 1.8-2.2% ב זרימה של כ 1 ליטר / דקה.
- להעריך את עומק ההרדמה במהלך המבצע על ידי חישוב תדירות הנשימה, שהוא אידיאלי בין 45 ל -60 נשימות לדקה. להתאים את השבר isoflurane inspiratory בהתאם אם זה לא המקרה.
הערה: שינויים בשבריר isoflurane שאיפה לקחת כ -60 שניות עד שהם הופכים יעילים. להתחמק מביצוע שינויים דרסטיים במהירות. במקום זאת, לשנות את הבקשה של ההרדמה בהדרגה.
3. מבצע
- לחטא את החזה והבטן עם חומר חיטוי הולם ולשנות כפפות לאחר מכן.
- להזריק נפח מותאם-משקל של carprofen (5 מ"ג / ק"ג משקל גוף) לתוך הירך של החיה.
- בעדינות לצבוט את עור הבטן עם מלקחיים כדי לבדוק אם עומק ההרדמה הוא נאות.
- בזהירות לנתח את האזור סביב xiphoid לחשוף אותו מן הרקמה הסובבת.
- מניחים תפר ושהייה דרך xiphoid (מבפנים החוצה) ולצרף שני הנושאים אל שכר מעל החיות הראש באמצעות מהדק.
- לצבוט את איברי גופו של המפשק יחד ולאט לאט להציג את הטיפים המפשקים -shaped "U" לאורך דופן הבטן הפנימית של החיה.
הערה: צעדים אלה לחשוף את הכבד כדי להקל את גישת האונות השונות. זיהוי של האונה לרוחב החציון השמאלית של הכבד אמור להיות אפשרי. - השתמש מקלון צמר גפן מלוחים ספוג ודחף בעדינות את תנוך החציוני מטה. לנתח בשלושת הרבעונים הגחון של רצועה falciform, אשר כעת יהיה גלוי בין המשטח של האונה חציון הסרעפת.
- עכשיו, השתמש בשני צמר גפן ספוג מלוח להסיט את החציוןאונה והשאירה אונה לרוחב כלפי מעלה נגד הסרעפת.
- דמיינו את הקרום הדק בין האונה לרוחב שמאלה באונה caudate ובזהירות לנתח את זה.
הערה: בעת ביצוע בפרוטוקול זה על חיות מקבוצה A, לקפוץ לשלב 3.18 בנקודה זו. - מניחים ליגטורה גודל 4-0 באלכסון לאורך בסיס של האונה לרוחב שמאל.
- לאחר מכן, השתמש המקלון להחזיר את האונה לרוחב השמאלית למקומו המקורי.
- בזהירות לקשור את המיתר הכי קרוב לבסיס של האונה ככל האפשר ולהעריך לשינוי צבע באונה לבדוק לאספקת הדם קטע כראוי.
- לכרות את האונה לרוחב שהותירה בעקבות השורה של הבסיס של האונה ורשום את המשקל של האונה שנקטעה.
הערה: בעת ביצוע בפרוטוקול זה על חיות מקבוצה B, לקפוץ לשלב 3.18 בנקודה זו. - מניח ליגטורה שני בין הגדם של לרוחב האונה שמאלה לבסיס של אונת החציון.
- מיקום מחדש של אונת החציון כמו Well ולקשור את הקשר. שוב, להעריך לשינוי צבע באונה לבדוק לאספקת דם קטע כראוי.
- לכרות את האונה חציון ושים לב משקלו.
- חבר את מזרק 1 מ"ל על מחט 30 G ולמלא אותו עם תאים סרטניים מהצינור הגמיש ללא הטיית מזרק בכל עת.
- השתמש צמר גפן כדי להזיז את לולאות מעיים שמאלה של החיה על מנת לחשוף את האונה הימנית הנחה.
- הכנס את המזרק טעון התא לתוך המכשיר "יד שלישית" בזווית של 30 מעלות אל אנכי.
- בזהירות להזיז את המכשיר ליד העכבר עם המחט בדיוק מעל האונה הימנית הנחה.
- לאט לקדם את המזרק בתוך מכשיר היד השלישי עד הקצה של שהמחט נמצא בחלק של המרכז התקין האונה הנחה.
- להזריק את כל הנפח לתוך החלק המרכזי של האונה על פני תקופה של 30-45 שניות.
- לדחוס את הזריקה לשלוש דקות לפחות עד דימום הפסיק.
- סגור את fascia עם תפר resorbable 5-0 באמצעות קשרים כפתור אחת.
- סגור את העור עם תפר 4-0, שאינם resorbable באמצעות קשרים כפתור אחת.
- התחל אוורור העכבר על חמצן זרימה גבוה במשך כ 1 דקות.
4. פוסט- op הליך
- מניח את בעל החיים לתוך סביבה חמה (כ 40 מעלות צלזיוס) במשך מחצית השעה הבאה על מנת להבטיח התאוששות נאותה.
- Admix מי השתייה של החיה עם 5 מ"ג / מ"ל של דיפירון עבור לאחר הניתוח 72 שעות.
- בדוק את השלמות של התפרים מקרוב במשך לפחות שלושה ימים לאחר ההליך.
5. תצפית תקופה והמתת חסד
- מדוד את המשקל של החיה יומית עבור סכום כולל של 14 ימים. ציון אותם לגבי בהתאמה רווחת מגבלותיהם.
- לאחר 14 ימים, להרדים את החיה הבאה צעדי 2.1 ו -2.2 של פרוטוקול האופרטיביnd להמשיך עם הפרוטוקול של המוסד להמתת חסד של בעלי חיים.
- בצע laparotomy החציוני כמוסבר בשלב 3.4. כדי להקל את הגישה אל הבטן, להאריך את caudally ס"מ חתך 1-1.5. הכנס את מפשק כפי שמציינת 3.7.
- לנתח לאורך שאר רצועת falciform וחתך את הווריד הנבוב הנח רק עם יציאתו cranially הכבד.
- הפרד את הכבד מן הסרעפת, על ידי גרירה של הסרעפת עם מלקחיים לנתח בבוטות אל תוך החלל שבין הכבד ורקמות השריר.
- הרם את רקמת הכבד גייסה את retroperitoneum לנתח אותו המבנים הנותרים עדיין מחובר: רקמת שומן retroperitoneal, הווריד הנבוב הנח וריד השער.
- בדוק את הכבד לאחר חילוץ עבור כל רקמה נוספת, אשר תתרום באופן שקרי הגודל והמשקל בפועל. כבד חילוץ הגידול שלה מוצגים באיור 6.
- לנתח את הגידול את inferior אונה ימנית.
- מדוד את גודל ומשקל של שני גידול ואת parenchyma הכבד.
- לשמר דגימות רקמה נוספות הצפק, בלוטות הלימפה או לאיברים אחרים לפי הצורך עבור בדיקת רקמות
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בניסוי הספציפי שלנו, כללנו 30 עכברים athymic בעירום-foxn1nu / נו. הם קבלו פיום בטן החציוני, זריקות תאים סרטניים של 500,000 תאים סרטניים MC38 (מומסים 50 μl של תמיסת מלח), ולאחר מכן טופלו או כריתה כבדה 70%, כריתה כבדה 30%, או ללא התערבות נוספת.
לאחר 14 ימים, כמעט התחדשות מלאה של כבד הנותרים בא 30% או 70% כריתות כבדה (מדד היפרטרופיה כבד של קבוצת הכריתה כבדה 30% היה 1.06 לעומת 0.8 מקבוצת הכריתה כבדה 70%) נצפה.
לאחר פיום בטן יחיד, המשקל הממוצע של גידולי intrahepatic היה 332 מ"ג (טווח: 10-608 מ"ג). משקל הגידול הממוצע של גידולי intrahepatic היה 656 מ"ג (טווח: 76-1,873 מ"ג) לאחר לעומת כריתה כבדה 30% 961 מ"ג (טווח: 189 mg- 3030 מ"ג) לאחר כריתה כבדה 70% עם p & #60; 0.05 (איור 1). לאחר כריתה כבדה 30%, נפח גידול היה 950 מ"מ 3 (טווח: 439-2,326 מ"מ 3) לעומת 1,385 מ"מ 3 (טווח: 411-2,366 מ"מ 3) לאחר כריתה כבדה 70%, ו 511 מ"מ 3 (טווח: 87-1,693 מ"מ 3) לאחר פיום בטן לבד עם p <0.05 (איור 2).
קטעי רקמה מן רקמת הגידול נלקחו ונותחו באמצעות אימונוהיסטוכימיה KI-67. תאים בשקופיות הוערכו לגבי קצב ההתפשטות שלהם. שיעור ההתפשטות הממוצע של תאים סרטניים מקבוצת laparotomy היה 47% (טווח: 39-56%) לעומת 61% (טווח: 51-69%) מבעלי החיים שעברו כריתה כבדה של 70% (p <0.05) ו -53% (טווח: 38-69%) מבעלי החיים שעברו כריתה כבדה של 30% (p = 0.22), הוכחת שיעור מוגבר של שגשוג תאים בקבוצות שעברו כריתה כבדה (איורים 3 - 5).
איור 1:. משקל של גידולים intrahepatic התרשים משווה את משקל הגידול הממוצע בין קבוצות A, B ו- C לאחר דיסקציה מהכבד ומופעים גדל משקל בגידולים של מקבוצה B וברים שגיאה ג מייצגים SEM. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2:. נפח של גידולי intrahepatic התרשים משווה את נפח גידול הממוצע בין קבוצות A, B ו- C לאחר דיסקציה מהכבד ומופעים גדלו כרכים בגידולים של מהקבוצה B וברי שגיאת ג מייצגים SEM. ה' "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: הפצת נשק דרג בגידולים מקבוצת א KI-67 אימונוהיסטוכימיה של שקופית דגימת גידול מן מהקבוצה A מדגים התפשטות קלה של תאים סרטניים. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: הפצת נשק דרג בגידולים מקבוצת B. KI-67 אימונוהיסטוכימיה של שקופית דגימת גידול מהקבוצה B מדגים התפשטות מתונה של תאים סרטניים. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר.לקבל = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5: הפצת נשק דרג בגידולים מקבוצת ג KI-67 אימונוהיסטוכימיה של שקופית דגימת גידול מהקבוצה C מדגים התפשטות ניכרת של תאים סרטניים. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6: חילוץ כבד / דגימת גידול מקבוצת B. זה כבד הופקה 14 ימים לאחר ביצוע כריתה כבדה 30% הזרקת תאים סרטניים סימולטני. גידול גדול באונה הימנית הנחה ניתן לראות, בעוד האונה מעולה, חציון caudate התקינהs עבר היפרטרופיה משמעותית.
* = גידול באונה הימנית הנחה, SRL = אונה ימנית מעולה, ML = אונת חציון, אונת CL = caudate. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 7:. התקנה או שולחן משטח הקלקר מכוסה בד סטרילי. מהדק נייר כפוף פתוח נלחץ לתוך הכרית בקצה העליון שלה המכסה את צינור הנשימה עם השופר שלה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ניסויים קודמים לביצוע ניתוחים במכרסמים הצליחו לזהות משתנים מסוימים שיכול לשמש כמקורות משוא פנים. על מנת לקבל תוצאות מהימנות ותקפות, לשקול את אמצעי הזהירות הבאה.
צום טרום אופ שיגרתי יכול להוביל כבד steatosis 12, אשר עשוי לעכב התחדשות כבדה 13,14. לכן לא מומלץ. פעילות mitotic הגבוהה ביותר של hepatocytes משתנה במהלך היום 15. במידת האפשר, לבצע את הנהלים בזמן מסוים במשך היום לכל הקבוצות. ההתחדשות כבדה Murine היא יעילה ביותר בחי 4-6 שבועות. בעלי חיים מבוגרים מ -10 חודשים של גיל יש ירידת קיבולת התחדשות משמעותית 16. משתמשים בעכברים בני אותו גזע, מין וגיל עבור ניסויים כדי למזער את הסיכוי של משוא פנים. עבודה בסביבה סטרילית חשוב בדרך כלל בהליך פתוח כזה. במיוחד באורגניזמים מדוכאי חיסון, כמו athymi עכברי ג שנמצאים בשימוש בסרטון, את הסיכון לזיהום, דבר שעלול להוביל למוות מוקדם או תוצאות מוטות, הוא גבוה. רודף תלת אזור ההתקנה המורכבת של הכנה, ניתוח ואזור התאוששות ולכן היא מוצדקת 17. בשל תופעות hepatotoxic עמוקות, עצירות נפוצה אינה מומלצת לטיפול משכך כאבי תוך או לאחר ניתוח 18,19. להשתמש בחומרים אחרים כמו carprofen או דיפירון כדי לספק שיכוך כאבים הולמים. מאז דיפירון אינו זמין במדינות רבות, carprofen עשוי לשמש גם לשליטה בכאב לאחר ההליך. בצע הזרקה תת עורית של משקל גוף 5mg / kg פעם ביום למשך שלושה ימים להחליף דיפירון.
התאוששות לאחר ניתוח מושג בצורה הטובה ביותר כאשר העכבר מתאושש מושם לתוך סביבה חמה עם גישה נוחה מזון ומים. הוא ממוקם באופן מבודד מעכברים אחרים לילה, כדי למנוע חיות דומיננטיות יותר מפגיעה אלה פגיעים יותר 17.
jove_content "> אף על פי הפרוטוקול הוא מאוד פשוט, יש כמה מלכודות קטין להימנע בעת ביצוע סוג זה של ניתוח בעכברים. Dissection של רצועת falciform, מבנה חיבור היבט הגחון של אונת החציון אל דופן הבטן, חיוני להשיג גמישות כבד מתאימה. כמו רצועה זו מתרחבת שטח קרוב מאוד לנקודה שבה את הווריד הנבוב הנח עוזב את הכבד cranially, יש לנקוט זהירות כדי למנוע ניזק וריד מרכזי זה. בממוצע, לנתח אותו כשלושה רבעים הדרך תבטיח גיוס משביע רצון ובאותו הזמן לשמור על מרווח נאה לכלי השיט.באמצעות הסכום הנכון של מתח כאשר ligating אונה עם ליגטורה היא משימה חשובה מאוד בעת ביצוע בפרוטוקול הכריתה. ליגטורות עם קשרי אוויר או ליגטורות הדק גרוע יכולה להוביל אספקה, דימום דם שהופסק בשיעור מספיק, הלם ומוות. במקביל, גידול attempt להדק קשר ליגטורה ביסודיות עלול לגרום לקרע ליגטורה עם נזק הקשורים לרקמות ואיברים. דרך יעילה בהערכת שלמות ליגטורה היא התגלית של שינוי צבע בכחלון בתוך האונה ligated. בחירת חומר התפר הנכון גם משחקת תפקיד חשוב. תפרים קלועים נוטים יותר לדחוס רקמות, ואילו חומרי monofilamentous די יהיו לנתח דרך רקמת הכבד הרכה וגורמים לדימום.
עוד צעד קריטי בעת הסרת אונה של כבד בעכברים כרוך מיקום נכון של קשירות. קשירה צריכה להתבצע בניצב הכלי הראשי הזנת האונות. אמנם זה די פשוט באונה החציוני, כריתה נאותה של האונה לרוחב שנותר הוא יותר מאתגר. וכליו להיכנס האונה בכיוון ventro-הזנב. כתוצאה מכך, החוט ליגטורה יש להציב לאורך קו דמיוני בין בסיס הנגיחה שמאלה אל האונה הימנית הנחה של lIver.
באונה החציוני, לעומת זאת, כריתה עלולה לסכן את הווריד הנבוב הנח. בגלל כלי מרכזי זה עובר את החלק הגבי של האונה, הוא נוטה נזק, דבר שעלול להוביל נמק בכבד. יתר על כן, בקשירת הקשר עם מתח יותר מדי בתחום זה, עלול לגרום לקרע הסרעפת ו / או pneumothorax.
טיפול הולם של תאים סרטניים הוא גם חשוב כאשר מנסים להשיג תוצאות דומות. למרות טכניקות תרבית תאים המדויקות אינן אמורות להיות חלק של פרוטוקול זה, הטיפול של תאים סרטניים בתוך ההליך חשוב כמו הכנה מושלמת מראש. כאשר ממלאים את המזרק עם התאים הסרטניים, הוא חיוני, כדי לשמור על הזקוף זה בכל העת. הטית סרן של המזרק עלולה לגרום תאים סרטניים דבקות קיר המזרקים, ולכן תוצאה הוא אובדן של תאים בזמן ההזרקה. רק ההטיה קטין היא מוצדקת בעת ההזרקה, כדי להכניס את המחט לכלpendicular אל פני השטח של ימין האונה הנחה.
גרורות דימום הצפק עלולות להתרחש כתוצאת דימום השפיכה מהאתר לנקב על פני השטח של הכבד. לפיכך, דחיסה עדינה של האונה עם מקלון צמר גפן למשך תקופה של שלוש דקות חיונית לשליטה בדימום מן parenchyma הכבד ולמנוע תא נוזל גידול דולף אל תוך הצפק.
פרסומים המכילים פרוטוקולים נוהל פעולות intraabdominal במכרסמים לעתים רחוקות מכילים מידע על סוג של סגירת הבטן. עם זאת, ההיבט הזה הוא עוד מקור אפשרי של סיבוכים. אפילו עם שליטה בכאב נאותה, חיות תנסינה להוציא את הגופות זרות דופן הבטן שלהם. התוצאות אשר תהיינה זיהום intraabdominal, בטן פתוחה או אפילו מוות. זה ניתן למנוע על ידי שני תפרי קטע הבודדים הביצוע לסגירת פצע במקום תפר פועל וסגירת דופן הבטן בשתי שכבות.
נקבה athymic בעירום-foxn1nu / נו עכברים (המסופקים על ידי הרלן מעבדות BV, 53 Kreuzelweg, NL-5961 NM הורסט) שימשו בניסוי הזה. מחסור T-cell גזע זה ידוע מאפשר את התפתחות גידול מוגבלת יחסית ועל כן תנאים אידיאליים עבור השתלת גידול. על מנת למזער את ההשפעה של דירוג קרבות בין בעלי החיים, חיות נקבה יחידה שמשו. תוצאות ראשוניות באמצעות זנים שונים כמו עכברים טהורים C57BL / 6 הראו גם מהותית, אולם צמיחת הגידול בנפח נמוך. לכן, השיטה עשויה סבירה מאוד להיות מעשית זני עכבר עוד יותר.
עם זאת, באמצעות אורגניזמים מדוכאי חיסון בעת השימוש בהגדרה זו דורשת אמצעי זהירות היגיינה חיה מיוחדת, כמו פתוגנים עלול להפריע צמיחת הגידול 20. אמצעים כמו השימוש בבעלי חיים זקיף כדי לפקח על נוכחות של גורמים פתוגניים 21 כפי שבוצעה במתקן ניסויים בבעלי חיים במחקר שלנו לקח להתקיים יכול להיות helpful באיתור מקורות אפשריים של משוא פנים.
ניסוי זה משמש קו תאים סרטניים בעכברים גס בשם MC38 (שהתקבל מהמוסד לכימיה קלינית בפקולטה לרפואה של מנהיים, גרמניה). 5 x 10 5 תאים סרטניים התמוססו לתוך 50 μl של תמיסת מלח. הריכוז נקבע ניסויים ראשוניים, כשסכום זה זוהה אידיאלי להיווצרות גידולים מוצקה בתוך שבועות. בהתאם immunocompetence של בעלי החיים המשמשים בניסויים אלה (ראו דיון לעיל), זה בהחלט יכול להיות גם אפשרי להשתמש בתאי סרטן מעי גס אנושיים ולכן ליצור xenograft. בדיקה ראשונית שבוצעה בעכברי athymic בעירום-foxn1nu / נו תוך שימוש בתאים האנושי SW480 גידול הצליחה להוכיח את צמיחת גידול בהצלחה בכבד השריד לאחר כריתה. בשל הממד של כבדים בעכברים, מומלץ כרכי שימוש רק עד 50 μl על מנת למנוע סיבוכים. שיפור אפשרי בשלב זה היהלהיות לתייג תאים סרטניים עם בלוציפראז. בהתאם לבעיה כי נחקרת, מידע מעניין שעלולות להתעורר כאשר ניטור קפדני של צמיחת תאים סרטניים וגודל אפשרי.
דרכים חלופיות ligating אונות כבדות כוללות את שיטת גזיר 22 או טכניקה היברידית גזיר-תפירת 23. מיצוב של גזיר מכשירים, לעומת זאת, עלול להפוך את שיטות המסיכה קשות. קשירת תפר בצע כראוי נשארה קל ללמוד טכניקה והוא צפוי מאוד להיות הדרך היעילה ביותר מבחינת העלות של הסרת אונה בניסוי הזה.
בגלל בעלי חיים משמשים בניסוי זה, זה דורש אישור מראש על ידי הרשויות המתאימות. בהתאם לאזור, זה יכול להיות משימה יקרה זמן רב. גם לאחר אישור רשמי, ניסויים בבעלי חיים הם הרבה פחות נגיש מאשר שיטות מחקר כמו בדיקות תרבית תאים או שיטות מולקולריות. בנוסף לתשתית שלמתקן ניסויים בבעלי החיים מודרני, ציוד מיוחד צריך להיות יעוד על מנת לבצע את הפרוטוקול. יתר על כן, תקופה של שבועיים עד ארבעה שבועות צריך להיות מתוזמן לשלוט בטכניקה זו. פרוטוקול זה עשוי ישים עבור מגוון רחב של שורות תאים במספר רב של זני עכבר. עם זאת, ביחס השינויים האפשריים שהוזכרו לעיל, לא כל שורת תא עשויה להיחקר בכל אורגניזם.
מטרה עיקרית של מחקרי חקירה באמצעות פרוטוקול זה תהיה מערכת גורם גדילה המורכבת כרוכות התחדשות כבדה והשפעותיו המדויקות על הישנויות ממאירות בכבד. על מנת לחקור קורלציות אפשריות אלה כראוי, זה הכרחי כדי ליישם ניסוי בבעלי חיים, בניגוד לשיטות מולקולריות שונות או ניסויים בתרביות תאים. שיטות אלה יש להשתמש דווקא כאמצעי תשלום של חקירה. למרות מספר דגמי כריתה כבדה שונים פורסמו עד כה 22-24, הליך זהבפעם הראשונה מיישם הזרקת תאים סרטניים סימולטני פעולה מבוססת היטב.
במודל עכבר זה מוכיח כי כריתה כבדה בעכברים היא שיטה פשוטה למדי, ריאלית לשחזור בקלות. ההתחדשות של הכבד לאחר כריתה מתרה עשרה הצליחה לפצות על אובדן הרקמה על ידי היפרטרופיה בתוך שבועות. עכברים יכולים להתמודד עם ירידות נפח כבד של עד 70%.
ניתן להקים תאים סרטניים הצליחו לגדול בתוך הכבד שריד וגידולים מוצקים. צמיחת גידול שגשוג תאים בקורלציה עם כמות רקמת כבד שנקטעה. תהליך הובלת כריתה אל להפעלה של גידול גידול בכבד הנותרים, אשר באו לידי ביטוי, על ידי משקולות גידול גדולות ואמצעי אחסון. מידת ההתפשטות גדולה זה יכול לבוא לידי ביטוי על ידי בדיקות אימונוהיסטוכימיה.
עובדה ידועה היא כי כמות fac התחדשות הכבדtors שוחרר לעליות היפרטרופיה כבד עם ההיקף כבד הכריתה 25,26. לכן, קישור בין גורמי התחדשות כבדה צמיחת תאים סרטנית עשוי להתקיים. זהו הקונקורדנציה עם תצפיות קליניות שבו ישנות גרורתית בקורלציה עם הכמות גרורה בכבד לפני הכריתה. גרורות בכבד הנראים על הדמיה לפני הניתוח עלול רק לשקף את קצה הקרחון בעוד יותר, טרם פיקדונות תאים סרטניים לזיהוי, רשאי להיות נוכח בעת האבחנה. לאחר כריתה כבדה, גורמי התחדשות כבדים יכולים אז לעודד את הצמיחה של תאים הסרטניים אלה, אשר בסופו של הדבר להיות ברורים כמו גרורות חוזרות.
למרות המתאם הנ"ל סביר מאוד, זה לא הוכח עד כה. השפעת מנגנוני התחדשות כבדות על התקדמות גידול intrahepatic ולכן דורשת בניתוחים מולקולריים נוספים. הנחיות מדויקות וכן וידאו להמחשה לאפשר אימוץ מהירשל הטכניקה הציגה בסרט הזה. זה יכול להוות בסיס עבור סוגים שונים של מחקרים ברחבי העולם המנסים לגלות את החוליה החסרה בשרשרת ידועה זו של אירועים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
תודות מיוחדות ללכת לד"ר בנימין Motsch עזרתו שאלות טכניות. המחברים גם רוצים להכיר ד"ר מרקוס פרשנר ו בירק מולר עבור תמיכה במולטימדיה שלהם, אריקה Magelky עבור המומחיות שלה העריכה וליסה הורנונג, ד"ר רולנד Jurgons ופרופ סטפן פון Hörsten (כל מן פרנץ-Penzoldt-מרכז, אוניברסיטת Erlangen) על המקצועיות שלהם טיפול לטיפול בבעלי חיים. אנו מודים פרופ 'מיכאל Neumaier במכון לכימיה קלינית, מנהיים הפקולטה לרפואה של אוניברסיטת היידלברג, גרמניה למתן תאים סרטניים MC38.
העבודה הנוכחית בוצעה מילוי הדרישות לקבלת תואר "דוקטור לרפואה". על פרידריך אלכסנדר-אוניברסיטת ארלנגן-נירנברג (FAU).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Operation Microscope | Zeiss | OPMI-1 FC S21 | |
| Induction Cage (Plexiglas Box) | UNO BV, Netherlands | 180000132 | |
| Flowmeter + Connection Kit | UNO BV, Netherlands | 180000008 | |
| UNO Vaporizer Sigma Delta | UNO BV, Netherlands | 180000002 | |
| Key Filler for Anesthetic | UNO BV, Netherlands | 180000010 | |
| Activated Charcoal Filter Adsorber | UNO BV, Netherlands | 180000140 | |
| Gas Exhaust Unit | UNO BV, Netherlands | 180000118 | |
| Face Mask for mouse | UNO BV, Netherlands | 180000065 | |
| Vaporizer Stand | UNO BV, Netherlands | 180000006 | |
| Heat lamp | Physitemp Instruments | HL-1 | |
| Styrofoam Pad | RAYHER | 30074000 | |
| Third Hand Tool | TOOLCRAFT | ZD-10F | |
| Precision Scales | Kern | EW 220-3NM | |
| Scales | Kern | EMB 500-1 | |
| Sliding Caliper | MIB | MIB 82026100 | |
| Microdissection forceps | Braun/Aesculap | BD195R | |
| Microdissection scissors | Braun/Aesculap | FD100R | |
| Microdissection needle holder | Braun/Aesculap | BM563R | |
| Retractor | Fine Science Tools (F.S.T.) | No. 17001-0 | Type: Bowmann |
| Clamp | Braun/Aesculap | BJ002R | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Expendable Items (NOTE: Quantities are per animal and procedure) |
|||
| Foliodrape sterile cover (45 cm x 75 cm) | Hartmann | 2775001 | |
| Sterile Cotton Swabs (2x) | Hartmann | 4700151 | Peha |
| Sterile fluid (0.9% NaCl) | Braun | 3570310 | PZN=04454809 |
| Disinfectant (Softasept - 250 ml) | Braun | 3887138 | PZN=0762008808505018 |
| 2 x 1 ml syringe (Injekt-F ) | Braun | 9166017V | |
| 26 G canula (Sterican) - for Carprofen injection | Braun | 4665457 | |
| 30 G canula (Sterican) - for Tumor injection | Braun | 4656300 | |
| Caprofen (=Rimadyl) | Pfizer | QM01AE91 | |
| Metamizole (= Novaminsulfon) | Ratiopharm | 16543.00.00 | |
| 4-0 Vicryl suture | Ethicon | J835G | |
| 5-0 Prolene suture | Ethicon | 8618G | |
| SafeLock Flex-Tube 1.5 ml | Eppendorf | 22363778 | |
| 4 x 4 Gauze Sponge | Kendall/Covidien | UPC: 728795135355 | ASIN: B005BFQTWM |
| Large paperclip | ACCO | A7072510G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| Female athymic nude-foxn1nu/nu | Harlan Laboratories B.V. | Code 069 |
References
- Haggar, F. A., Boushey, R. P. Colorectal cancer epidemiology: incidence, mortality, survival, and risk factors. Clin. Colon Rectal Surg. 22, 191-197 (2009).
- Fong, Y., et al. Liver resection for colorectal metastases. J. Clin. Oncol. 15, 938-946 (1997).
- Kato, T., et al. Therapeutic results for hepatic metastasis of colorectal cancer with special reference to effectiveness of hepatectomy: analysis of prognostic factors for 763 cases recorded at 18 institutions. Dis. Colon Rectum. 46, S22-S31 (2003).
- Poston, G. J., et al. OncoSurge: a strategy for improving resectability with curative intent in metastatic colorectal cancer. J. Clin. Oncol. 23, 7125-7134 (2005).
- Neumann, U. P., Seehofer, D., Neuhaus, P. The surgical treatment of hepatic metastases in colorectal carcinoma. Dtsch Arztebl Int. 107, 335-342 (2010).
- Alwayn, I. P., et al. A critical role for matrix metalloproteinases in liver regeneration. J. Surg. Res. 145, 192-198 (2008).
- Fausto, N., Campbell, J. S., Riehle, K. J. Liver regeneration. Hepatology. 43, S45-S53 (2006).
- Fujiyoshi, M., Ozaki, M. Molecular mechanisms of liver regeneration and protection for treatment of liver dysfunction and diseases. J. Hepatobiliary. Pancreat. Surg. 18, 13-22 (2011).
- Jin, X., et al. Paradoxical effects of short- and long-term interleukin-6 exposure on liver injury and repair. Hepatology. 43, 474-484 (2006).
- Nakamura, T., Sakai, K., Nakamura, T., Matsumoto, K. Hepatocyte growth factor twenty years on: Much more than a growth factor. J. Gastroenterol. Hepatol. 26, 188-202 (2011).
- Van Sweringen, H. L., et al. CXC chemokine signaling in the liver: impact on repair and regeneration. Hepatology. 54, 1445-1453 (2011).
- Heijboer, A. C., et al. Sixteen hours of fasting differentially affects hepatic and muscle insulin sensitivity in mice. J. Lipid Res. 46, 582-588 (2005).
- Yang, S. Q., Lin, H. Z., Mandal, A. K., Huang, J., Diehl, A. M. Disrupted signaling and inhibited regeneration in obese mice with fatty livers: implications for nonalcoholic fatty liver disease pathophysiology. Hepatology. 34, 694-706 (2001).
- Selzner, M., Clavien, P. A. Failure of regeneration of the steatotic rat liver: disruption at two different levels in the regeneration pathway. Hepatology. 31, 35-42 (2000).
- Matsuo, T., et al. Control mechanism of the circadian clock for timing of cell division in vivo. Science. 302, 255-259 (2003).
- Iakova, P., Awad, S. S., Timchenko, N. A. Aging reduces proliferative capacities of liver by switching pathways of C/EBPalpha growth arrest. Cell. 113, 495-506 (2003).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J Vis Exp. , (2011).
- Skoulis, N. P., James, R. C., Harbison, R. D., Roberts, S. M. Depression of hepatic glutathione by opioid analgesic drugs in mice. Toxicol. Appl. Pharmacol. 99, 139-147 (1989).
- Berson, A., et al. Mechanisms for experimental buprenorphine hepatotoxicity: major role of mitochondrial dysfunction versus metabolic activation. J. Hepatol. 34, 261-269 (2001).
- Baker, D. G. Natural pathogens of laboratory mice, rats, and rabbits and their effects on research. Clin. Microbiol. Rev. 11, 231-266 (1998).
- FELASA working group on revision of guidelines for health monitoring of rodents and rabbits. FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units. Lab. Anim. 48, 178-192 (2014).
- Nikfarjam, M., Malcontenti-Wilson, C., Fanartzis, M., Daruwalla, J., Christophi, C. A model of partial hepatectomy in mice. J. Invest. Surg. 17, 291-294 (2004).
- Hori, T., et al. Simple and reproducible hepatectomy in the mouse using the clip technique. World J. Gastroenterol. 18, 2767-2774 (2012).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nat. Protoc. 3, 1167-1170 (2008).
- Sowa, J. P., et al. Extent of liver resection modulates the activation of transcription factors and the production of cytokines involved in liver regeneration. World J. Gastroenterol. 14, 7093-7100 (2008).
- Bonninghoff, R., et al. Effect of different liver resection methods on liver damage and regeneration factors VEGF and FGF-2 in mice. Can. J. Surg. 55, 389-393 (2012).
