Abstract
A alta incidência de recorrência do tumor após a ressecção de lesões hepáticas metastáticas permanece um problema não resolvido. depósitos de células de tumor pequeno, que não são detectáveis por imagem clínica de rotina, pode ser estimulada por factores de regeneração hepáticas após a ressecção hepática. Não está inteiramente claro, no entanto, que fatores são cruciais para a recorrência do tumor.
O modelo de ratinho apresentada pode ser útil para explorar os mecanismos que desempenham um papel no desenvolvimento de lesões malignas recorrentes após a ressecção hepática. O modelo combina as técnicas fáceis de realizar e reprodutível de quantidades definidas de remoção de tecido do fígado e a indução de tumor (por injecção) em ratinhos. Os animais foram tratados com uma única laparotomia, uma ressecção hepática de 30%, ou de uma ressecção hepática de 70%. Todos os animais receberam, subsequentemente, uma injecção das células tumorais no tecido do fígado remanescente. Depois de duas semanas de observação, os fígados e os tumores foram avaliados quanto a tamanho e peso eexaminada por imuno-histoquímica.
Após a ressecção hepática de 70%, o volume do tumor e peso foram significativamente aumentados em comparação com uma laparotomia sozinhos (p <0,05). Adicionalmente, imuno-histoquímica (Ki67) mostrou um aumento na taxa de proliferação do tumor no grupo de ressecção (p <0,05).
Estes resultados demonstram a influência dos mecanismos de regeneração hepática no crescimento do tumor intra-hepática. Combinado com métodos como workup histológica ou análise de RNA, o modelo de rato descrito poderia servir como base para um exame atento dos diferentes fatores envolvidos no crescimento tumoral e recorrência da doença metastática no fígado. Um número considerável de variáveis, como o tempo de observação pós-operatória, a linha celular utilizada para injecção ou o tempo de injeção e ressecção hepática oferecer vários ângulos ao explorar uma questão específica no contexto de metástases pós-hepatectomia. As limitações deste procedimento são a aurização para realizar o procedimento em animais, o acesso a uma instalação de testes em animais adequados e aquisição de certos equipamentos.
Introduction
O câncer colorretal (CRC) é responsável por cerca de 9% de todos os tumores malignos. É o terceiro cancro mais comum, tanto os EUA e em todo o mundo. As taxas de mortalidade globais de gama CRC de 300.000 para mais de 500.000 por ano 1. Vinte por cento dos pacientes sofrem de metástases hepáticas após a descoberta do seu tumor colo-rectal. Metástases ressecáveis são normalmente tratados por um 2,3 parcial ressecção hepática. Técnicas cirúrgicas melhoradas, novas estratégias multimodais e novas definições de metástases ressecáveis tornar a terapia de uma ressecção parcial do fígado possível para um número crescente de pacientes 4.
Recorrência de tumores hepáticos secundários, no entanto, é uma seqüelas clínica desafiadora na cirurgia gastrointestinal moderna. Os pacientes com CRC submetidos à ressecção de metástases hepáticas têm uma chance de 30 a 50% de desenvolver um novo tumor em seu fígado remanescente 5. Portanto, há uma necessidade de mais pesquisas sobre omecanismos envolvidos na recorrência de metástases hepáticas.
A ressecção hepática de cerca de 70% é normalmente compensada dentro de algumas semanas por o tecido hepático remanescente. Esta regeneração envolve vários mecanismos, incluindo citocinas, como interleucina 6 (IL-6), factor de necrose tumoral alfa (TNF-α), factor de crescimento de hepatócitos (HGF), factor de crescimento transformante beta (TGF-β), factor de crescimento endotelial vascular (VEGF ), metaloproteases de matriz (MMP-2 e MMP-9) e CXC-quimiocinas 6-11. Estas substâncias apoiar a regeneração hepática e também pode ser responsável pelas altas taxas de recorrência de tumores malignos do fígado primário e secundário, induzindo o crescimento dos depósitos de células tumorais pequenas no fígado restante que não são detectados pela imagem latente clínica de rotina. Este causalidade não foi provado até agora.
A hipótese que se segue foi estabelecida. Após a ressecção parcial do fígado, os fatores de proliferação que são responsáveis por ao vivoR hipertrofia pode também induzir o crescimento de células de tumor previamente desconhecidas no fígado. Um modelo do rato foi projetado que combinou as técnicas de ressecção hepática e indução do tumor. Trinta ratinhos nu / nu-foxn1nu atímicos foram divididos em três grupos de dez animais cada. Cada uma delas foi tratada com qualquer uma laparotomia sozinho (Grupo A), a ressecção hepática 30% (Grupo B) ou a ressecção hepática de 70% (Grupo C). Os animais em todos os grupos subsequentemente receberam uma injecção de células de tumor numa parte restante definido do fígado, para simular células tumorais dormentes. Animais foram observados durante duas semanas e, em seguida, avaliada para o crescimento tumoral e hipertrofia do fígado.
O objectivo era criar um modelo que poderia ser utilizado para pesquisar factores moleculares e patogénicos que podem desempenhar um papel na formação de tumores após a hepatectomia. Este método pode ser útil na avaliação: a origem dos factores endócrinos envolvidas na regeneração do fígado; Os mecanismos responsáveis por tum intra-hepáticaou o crescimento após a ressecção hepática; e o volume ressecção hepática necessária para a indução do crescimento de tumores intra-hepática. O método a seguir só foi realizada em animais, porque eles prometem contribuir para a compreensão dos princípios biológicos fundamentais e para o desenvolvimento do conhecimento que pode ser esperado para beneficiar os seres humanos pela melhoria opções de tratamento. Devido aos mecanismos envolvidos nestes assuntos, que teve de ser examinada in vivo, como métodos in vitro podem não fornecer uma representação realista da patologia humana.
Estas investigações podem levar à descoberta de metas relevantes para as opções de tratamento profilático para diminuir a recorrência do tumor.
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Protocol
O governo de Franconia médio em Baviera, Alemanha, permissão para que os procedimentos descritos concedido. Quaisquer experimentos semelhantes requerem uma autorização prévia das autoridades competentes.
Nota: O seguinte manual pode ser usado para grupos previamente discutida de A a C. passos que têm de ser deixado de fora nos grupos A e B são marcadas em conformidade.
1. Preparações
- Colocar luvas, coloque a almofada de poliestireno sob o microscópio, eo foco da lente na área um pouco acima do teclado.
- Dividir a folha estéril e coloque metade sobre a almofada de poliestireno e a outra metade apenas próximo a ele.
- Esterilizar os instrumentos cirúrgicos e colocá-los em uma folha estéril ao lado do bloco de poliestireno.
- Solte um clipe de papel grande para formar um arco. Vire de cabeça para baixo e pressione-o no bloco de poliestireno na extremidade superior - mesmo ao lado, onde a cabeça do animal vou mentir.
- Colocar o bocal do vaporizador entre os dois membross do arco. (Figura 7)
- Configurar uma lâmpada de aquecimento de cerca de 40 cm do local onde a cabeça do animal vou mentir. Certifique-se o calor ao nível do bloco de poliestireno não exceda 40 ° C.
- Prepara-se uma gaiola separada para os animais operados.
- Prepara-se uma quantidade e volume definido (máximo de 50 ul) de células tumorais num tubo flexível e armazená-lo em gelo.
2. Anestesia
- Colocar o rato dentro de uma caixa de plexiglas e começar a indução da anestesia de isoflurano alto fluxo (5% de isoflurano a um caudal de 10 L / min).
- Depois de passar pelas diferentes fases da anestesia, remova o mouse na caixa de plexiglas logo depois que entrou na fase da respiração agonia, que pode ser facilmente reconhecido por uma diminuição drástica na taxa respiratória (<20 / min) e suspiros profundos apertando o o corpo inteiro do animal.
- colocar rapidamente o animal de barriga para cima sobre a cortina coberto almofada de poliestireno estéril e continuarde ventilação na isoflurano baixo fluxo, inserindo o focinho do rato no bocal para manter a anestesia. Usar uma fracção inspiratória de 1,8-2,2% a um caudal de cerca de 1 L / min.
- Avaliar a profundidade da anestesia durante a operação por meio do cálculo da frequência respiratória, que é de preferência entre 45 e 60 respirações por minuto. Adaptar a fração isoflurano inspiratória de acordo, se este não é o caso.
Nota: As alterações na fração isoflurano inspiratória levar cerca de 60 segundos até que se tornem eficaz. Evite realizar mudanças drásticas rapidamente. Em vez disso, modificar a aplicação do anestésico gradualmente.
3. Operação
- Desinfectar o tórax e abdômen com um desinfectante adequado e trocar as luvas depois.
- Injectar um volume adaptado de peso de carprofeno (5 mg / kg de peso corporal) na coxa do animal.
- Aperte suavemente a pele abdominal com uma pinça para testar se a profundidade da anestesia é adequada.
- Cuidadosamente dissecar a área em torno do xifóide ao expô-la a partir do tecido circundante.
- Colocar uma estadia de sutura através da xifóide (de dentro para fora) e anexar as duas threads ao retentor acima dos animais cabeça, usando a braçadeira.
- Comprima membros do afastador juntos e lentamente introduzir o "U" dicas afastador -shaped ao longo da parede abdominal interna do animal.
Nota: Estas medidas expor o fígado para facilitar o acesso aos diferentes lobos. A identificação de lobo lateral mediano e esquerdo do fígado deve agora ser possível. - Utilize um cotonete de algodão embebido em soro fisiológico e empurre o lobo médio para baixo. Dissecar as ventrais três quartos do ligamento falciforme, que será agora visível entre a superfície do lobo médio e do diafragma.
- Agora, use duas compressas de algodão embebido com solução salina para mudar a medianalóbulo esquerdo e lobo lateral para cima contra o diafragma.
- Visualizar a membrana fina entre o lobo lateral esquerdo e do lobo caudado e dissecá-lo com cuidado.
Nota: Ao executar este protocolo em animais do grupo A, salte para a etapa 3.18 neste momento. - Coloque uma ligadura tamanho 4-0 na diagonal ao longo da base do lobo lateral esquerdo.
- Em seguida, use o cotonete para devolver o lobo lateral esquerdo para sua posição original.
- Cuidadosamente amarrar a ligadura o mais próximo possível da base do lobo possível e avaliar a mudança de cor no lobo para testar o fornecimento de sangue adequadamente interrompido.
- Ressecção do lobo lateral esquerdo, seguindo a linha de base do lóbulo e observe o peso do lobo ressecado.
Nota: Ao executar este protocolo em animais do grupo B, pule para o passo 3.18 neste momento. - Coloque uma segunda ligadura entre coto do lobo lateral esquerdo e base do lobo mediano.
- Reposicionar o lobo mediano como well e amarrar a ligadura. Mais uma vez, para avaliar a alteração de cor no lobo a testar para fornecimento de sangue adequadamente interrompida.
- Ressecção do lobo mediano e anote o seu peso.
- Ligar a seringa de 1 ml para a agulha 30 G e preenchê-lo com as células do tumor a partir do tubo flexível sem inclinar a seringa, em qualquer momento.
- Use os cotonetes para mover as alças intestinais à esquerda do animal a fim de expor o lóbulo direito inferior.
- Inserir a seringa carregada de células para dentro do dispositivo "de terceira mão" em um ângulo de 30 ° com a vertical.
- Mova cuidadosamente o dispositivo ao lado do rato com a agulha logo acima do lóbulo direito inferior.
- Lentamente avanço a seringa dentro do dispositivo de terceira mão, até que a ponta da agulha se encontra na parte central do lóbulo direito inferior.
- Injectar o volume inteiro na parte central do lobo ao longo de um período de 30-45 segundos.
- Comprimir o local da injecção, durante pelo menos três minutos até a hemorragia parou.
- Feche a fáscia com um 5-0 sutura reabsorvível usando nós botão.
- Fechar a pele com uma sutura 4-0, não reabsorvível usando nós botão.
- Comece a ventilação do mouse no alto fluxo de oxigênio durante cerca de 1 min.
4. Pós-op procedimento
- Colocar o animal num ambiente aquecido (aproximadamente 40 ° C) durante a meia hora seguinte para assegurar a recuperação adequada.
- Admix água de beber do animal com 5 mg / ml de metamizol para pós-operatório de 72 h.
- Examinar a integridade das suturas de perto durante pelo menos três dias após o procedimento.
5. Período de Observação e Eutanásia
- Medir o peso do animal por dia, durante um total de 14 dias. Pontuação-los quanto ao seu bem-estar e limitações respectivamente.
- Após 14 dias, anestesiar o seguinte animais passos 2.1 e 2.2 do protocolo operatório umnd prosseguir com o protocolo da instituição para a eutanásia dos animais.
- Realizar uma laparotomia mediana como explicado no passo 3.4. Para facilitar o acesso ao abdômen, estender a incisão 1-1,5 cm caudalmente. Insira o afastador como apontado em 3,7.
- Dissecar ao longo do resto do ligamento falciforme e cortar a veia cava inferior do mesmo modo que sai do fígado cranialmente.
- Separa-se o fígado a partir do diafragma, o diafragma, agarrando com os fórceps e dissecando bruscamente para dentro do espaço entre o fígado e tecido muscular.
- Levante o tecido do fígado mobilizados fora do retroperitônio e dissecá-lo fora das estruturas remanescentes que ainda está ligado: tecido adiposo retroperitoneal, a veia cava inferior ea veia portal.
- Inspeccionar o fígado após a extracção para qualquer tecido adicional, que seria falsamente contribuir para o seu tamanho e o peso real. Um fígado e extraiu-se o seu tumor são apresentadas na Figura 6.
- Dissecar o tumor fora da inferior lóbulo direito.
- Medir o tamanho e o peso de ambos o tumor e o parênquima do fígado.
- Conservar amostras adicionais de tecidos do peritônio, linfonodos ou outros órgãos, conforme necessário para análise de tecido
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Representative Results
Em nosso experimento específico, que incluiu 30 ratos nude-foxn1nu / nu atímicos. Eles receberam uma laparotomia mediana, as injecções de células de tumor de 500.000 células tumorais MC38 (dissolvida em 50 ul de solução salina), e foram tratados subsequentemente quer com uma ressecção hepática de 70%, uma ressecção hepática de 30%, ou mais nenhuma intervenção.
Após 14 dias, a regeneração quase completa do fígado restante sequência de 30% ou 70% ressecções hepáticas (fígado hipertrofia-índice do grupo ressecção hepática de 30% foi de 1,06 em relação 0,8 entre o grupo ressecção hepática 70%) foi observada.
Depois de uma laparotomia único, o peso médio de tumores intra-hepáticas foi 332 mg (intervalo: 10-608 mg). O peso médio do tumor de tumores intra-hepáticas foi 656 mg (intervalo: 76-1,873 mg) depois de um 30% a ressecção hepática vs. 961 mg (intervalo: 189 mg-3030 mg), após uma ressecção hepática de 70% com p & #60; 0,05 (Figura 1). Após a ressecção hepática de 30%, do volume do tumor era de 950 mm3 (gama: 439-2,326 mm 3) vs 1,385 milímetro 3 (intervalo: 411-2,366 mm 3), após a ressecção hepática de 70%, e 511 milímetros 3 (intervalo: 87-1,693 mm 3) após uma laparotomia sozinho com p <0,05 (Figura 2).
As secções de tecido a partir do tecido tumoral foram recolhidas e analisadas através de KI-67 imuno-histoquímica. Células nas lâminas foram avaliados quanto à taxa de proliferação. A taxa média de proliferação de células de tumor do grupo de laparotomia foi de 47% (intervalo: 39-56%) em comparação com 61% (intervalo: 51-69%) a partir de animais que tinham sido submetidos a uma ressecção hepática de 70% (p <0,05) e 53% (intervalo: 38-69%) a partir de animais que tinham sido submetidos a uma ressecção hepática de 30% (p = 0,22), demonstrando um aumento da taxa de proliferação celular em grupos que foram submetidos a ressecção hepática (Figuras 3 - 5).
Figura 1:. Peso da intra-hepática Tumores O diagrama compara o peso médio do tumor entre os grupos A, B e C após a dissecação do fígado e mostra aumento de peso nos tumores do grupo B e C. As barras de erro representam SEM. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2:. Volume de Tumores intra-hepática O diagrama compara o volume médio do tumor entre os grupos A, B e C após a dissecação do fígado e mostra aumento do volume em tumores do grupo B e C. As barras de erro representam SEM. ank "> Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Taxa de proliferação de tumores do grupo A. KI-67 Imuno-histoquímica de uma corrediça a partir de um espécime de tumor do grupo A demonstra proliferação branda de células tumorais. Barra de escala = 100 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Taxa de proliferação de tumores de Grupo B. KI-67 Imuno-histoquímica de uma corrediça a partir de um espécime de tumor do grupo B demonstra moderada proliferação de células tumorais. Barra de escala = 100 pm.obter = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Proliferação Taxa em tumores do Grupo C. KI-67 Imuno-histoquímica de uma corrediça a partir de um espécime de tumor do grupo C demonstra proliferação acentuada de células tumorais. Barra de escala = 100 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Extraído espécime de fígado / tumor do grupo B. Esta foi extraída de fígado de 14 dias após a realização de uma ressecção hepática 30% e injecção de células tumorais simultânea. Um grande tumor no lobo inferior direito pode ser visto, enquanto o superior, mediana e caudado lobo direitos passaram por hipertrofia significativa.
* = Tumor no lobo direito inferior, SRL = superior de lobo direito, ML = lobo mediano, CL = caudado do lobo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7:. Ou a tabela de configuração O bloco de poliestireno é coberta por um pano estéril. Um clipe de papel aberto dobrada é pressionada no teclado na sua extremidade superior que cobre o tubo de respiração com o seu porta-voz. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Experimentos anteriores realizando a cirurgia em roedores foram capazes de identificar certas variáveis que poderiam servir como fontes de viés. A fim de obter resultados confiáveis e válidos, considere as seguintes precauções.
Rotina jejum pré-operatório pode levar a esteatose hepática 12, que pode inibir a regeneração do fígado 13,14. Portanto, não é recomendado. A maior actividade mitótica de hepatócitos varia ao longo do dia 15. Se possível, realizar os procedimentos em um determinado momento durante o dia para todos os grupos. a regeneração do fígado de murino é mais eficaz em animais de 4-6 semanas de idade. Animais com mais de 10 meses de idade têm uma diminuição significativa capacidade de regeneração 16. Use ratos da mesma raça, sexo e idade para os experimentos para minimizar a possibilidade de viés. Trabalhando em um ambiente estéril é geralmente importante num concurso público como este. Especialmente em organismos imunocomprometidos, como o athymi c ratinhos utilizados no vídeo, o risco de infecção, o que pode levar à morte prematura ou resultados enviesados, é alta. Prossecução de uma de três zonas-setup que consiste em uma preparação, uma cirurgia e uma área de recuperação, portanto, é justificada 17. Devido às suas profundas efeitos hepatotóxicos, buprenorfina comumente usado não é recomendado para terapia analgésica intra ou pós-operatória 18,19. Use outras substâncias como carprofeno ou dipirona para fornecer analgesia adequada. Desde dipirona não está disponível em muitos países, carprofeno também pode ser usado para o controle da dor após o procedimento. Executar uma injeção subcutânea de 5 mg / kg de peso corporal uma vez por dia durante três dias para substituir metamizol.
recuperação pós-operatória é melhor alcançada quando o mouse recuperação é colocado em um ambiente acolhedor, com fácil acesso à comida e água. O hotel está idealmente isolado de outros ratos durante a noite, para evitar que os animais dominantes de prejudicar os mais vulneráveis 17.
jove_content "> Embora o protocolo é muito simples, existem algumas desvantagens menores para evitar ao realizar este tipo de cirurgia em ratos. A dissecção do ligamento falciforme, uma estrutura de ligação do aspecto ventral do lobo mediano na parede abdominal, é essencial alcançar flexibilidade fígado apropriado. Como este ligamento expande-se para uma área muito perto do ponto onde a veia cava inferior deixa o fígado cranialmente, recomenda-se precaução, a fim de evitar danos a este grande veia. em média, dissecando-lo cerca de três quartos do forma a garantir o mobilização satisfatória e ao mesmo tempo manter uma distância adequada à embarcação.Usando a quantidade certa de tensão quando ligação de um lobo com uma ligadura é uma tarefa tremendamente importante quando se realiza o protocolo de ressecção. Ligaduras com nós ar ou ligaduras mal apertados podem levar a inadequadamente interrompido o fornecimento de sangue, hemorragia, choque e morte. Ao mesmo tempo, uma attempt para apertar completamente um nó ligadura pode resultar em ruptura da ligadura com danos associados ao tecido circundante e órgãos. Uma forma eficaz de avaliar a integridade de laqueação é a observação da alteração de cor dentro do lobo cianose ligado. Seleção do material de sutura correta também desempenha um papel importante. suturas entrelaçadas são mais propensos a comprimir o tecido, enquanto que os materiais monofilamentous irá em vez dissecar através do tecido do fígado macio e provoca hemorragia.
Outro passo importante ao remover lobos do fígado em ratinhos envolve o posicionamento correto de ligaduras. Ligadura deve ser realizada perpendicular aos principais navios que entram nos lobos. Enquanto isso é bastante simples no lobo médio, a ressecção adequada do lobo lateral esquerdo é mais desafiador. Seus vasos entrar no lóbulo numa direcção ventro-caudal. Como resultado, o fio ligadura deve ser colocada ao longo de uma linha imaginária entre a base investida esquerda para o lobo inferior direito do Liver.
No lobo mediano, no entanto, a ressecção possa comprometer a veia cava inferior. Porque este vaso principal atravessa a porção dorsal do lobo, é propenso a danos, o que pode levar a necrose do fígado. Além disso, amarrando a ligadura com muita tensão nesta área, pode resultar na ruptura do diafragma e / ou pneumotórax.
manejo adequado das células tumorais também é importante quando se tenta obter resultados comparáveis. Embora as técnicas de cultura de células exactas não são destinadas a ser parte deste protocolo, o tratamento de células tumorais dentro do procedimento é tão importante como perfeito preparação de antemão. Ao encher a seringa com as células tumorais, é vital para mantê-lo na posição vertical em todos os momentos. Grande inclinação da seringa pode resultar em células tumorais aderentes às paredes das seringas, por conseguinte, resultando em perda de células no momento da injecção. Apenas inclinação menor é garantido no momento da injecção, a fim de inserir a agulha percha perpendicularmente à superfície do lobo direito inferior.
Hemorragia e metástases peritoneais pode ocorrer como resultado de hemorragia e de derrame a partir do local de punção na superfície do fígado. Assim, por compressão gentil do lóbulo com um cotonete de algodão por um período de três minutos é essencial para controlar a hemorragia do parênquima hepático e evitar que o fluido de células tumorais vazando no peritoneu.
Publicações contendo protocolos de procedimento para as operações intra-abdominais em roedores raramente contêm informações sobre o tipo de fechamento abdominal. No entanto, este aspecto é outra possível fonte de complicações. Mesmo com o controle adequado da dor, os animais vão tentar remover os corpos estranhos em sua parede abdominal. Consequências podem ser a infecção intra-abdominal, um abdômen aberto ou até mesmo a morte. Isto pode ser impedido por ambos os pontos separados realizando individuais para fecho de feridas, em vez de uma sutura contínua e fecho da parede abdominal em duas camadas.
ratinhos nus-foxn1nu / nu atímicos fêmea (fornecidos por Harlan Laboratories BV, Kreuzelweg 53, NL-5961 NM Horst) foram utilizados nesta experiência. A deficiência de células T esta raça é conhecida por permite o crescimento do tumor relativamente irrestrito e condições, portanto, ideais para a implantação do tumor. A fim de minimizar a influência de classificação lutas entre os animais, foram utilizados apenas os animais do sexo feminino. Os resultados preliminares, utilizando diferentes estirpes, como os ratinhos C57BL / 6 ratinhos consanguíneos também demonstraram significativa, ainda um menor crescimento do tumor de volume. Assim, a técnica pode muito provavelmente ser praticável em ainda mais linhagens de camundongos.
No entanto, usando organismos imunocomprometidos neste cenário exige precauções especiais de higiene dos animais, como patógenos podem interferir com o crescimento tumoral 20. Medidas como a utilização de animais-sentinela para monitorar a presença de agentes patogênicos 21 como realizado nas instalações testes em animais nosso estudo teve lugar em pode ser helpful na detecção de possíveis fontes de viés.
Este experimento usou uma linha de células de câncer colorretal murino chamado MC38 (obtido a partir do Instituto de Química Clínica da Faculdade de Medicina de Mannheim, Alemanha). 5 x 10 5 células tumorais foram dissolvidos em 50 ul de solução salina. A concentração foi determinada em experiências preliminares, em que este valor foi identificado como ideal para a formação de tumores sólidos dentro de duas semanas. Dependendo da imunocompetência dos animais utilizados nestas experiências (ver discussão acima), que pode muito bem ser também possível a utilização de células de cancro colorrectal humano e, portanto, criar um xenoenxerto. Os testes iniciais realizados em nude-foxn1nu ratos atímicos / nu usando células tumorais SW480 humana foi capaz de demonstrar com sucesso o crescimento do tumor no fígado remanescente após a ressecção. Devido à dimensão de fígados de murino, recomenda-se a utilização apenas volumes até 50 ul para prevenir complicações. Um possível reforço neste pontoser para marcar células de tumor com a luciferase. Dependendo do problema que está sendo investigado, informações interessantes podem surgir quando um acompanhamento mais próximo do crescimento das células do tumor e tamanho é possível.
Formas alternativas de ligação de lobos do fígado incluem o método de corte 22 ou uma técnica híbrida de recorte-sutura 23. Posicionamento de recorte dispositivos, no entanto, pode tornar os métodos de recorte difícil. Adequadamente realizada ligadura continua a ser um fácil de aprender a técnica e é muito provável que seja a forma mais rentável de remoção de um lobo neste experimento.
Porque os animais vivos são usados nesta experiência, é necessária a permissão prévia das autoridades competentes. Dependendo da região, isto pode ser uma tarefa onerosa e demorada. Mesmo após a aprovação oficial, experiências com animais são muito menos acessível do que os métodos de pesquisa como o teste de cultura de células ou métodos moleculares. Além disso para a infra-estrutura de ummoderna instalação de testes em animais, equipamento especial tem que ser alocados de forma a executar o protocolo. Além disso, um período de duas a quatro semanas deve ser agendada para dominar esta técnica. Este protocolo pode aplicável para uma ampla gama de linhas celulares em um grande número de linhagens de camundongos. No entanto, no que diz respeito às possíveis modificações mencionadas acima, nem todas as linha celular pode ser estudado em cada organismo.
A principal alvo de estudos de investigação que utilizam este protocolo será o sistema de fator de crescimento complexo envolvido na regeneração hepática e seus efeitos exatos sobre recorrência malignidade fígado. A fim de investigar estes possíveis correlações de forma adequada, é essencial para a implementação de uma experiência com animais, em contraste com os métodos moleculares diferentes ou experiências de cultura de células. Estes métodos devem antes ser usado como meios complementares de investigação. Apesar de vários modelos de ressecção hepática diferentes foram publicados até agora 22-24, este procedimentopela primeira vez implementa injecção de células tumorais simultânea para uma operação bem estabelecida.
Este modelo do rato demonstra que a ressecção hepática em ratos é um método bastante simples, viável e facilmente reprodutível. a regeneração do fígado após ressecções menores e maiores foi capaz de compensar a perda de tecido por hipertrofia dentro de duas semanas. Os ratos podem lidar com reduções de volume do fígado de até 70%.
As células tumorais foram capazes de crescer no interior do fígado remanescente e pode ser estabelecida tumores sólidos. O crescimento do tumor e proliferação de células tumorais correlacionada com a quantidade de tecido do fígado ressecado. O processo de ligação a uma ressecção de activação do crescimento do tumor no fígado remanescente, que foi expressa, por maiores pesos e volumes tumorais. Este maior grau de proliferação poderia ser demonstrada por exames de imuno-histoquímica.
É bem conhecido que a quantidade de FAC regeneração hepáticatores lançado para hipertrofia do fígado aumenta com a extensão da ressecção hepática 25,26. Portanto, uma ligação entre factores de regeneração do fígado e crescimento de células tumorais podem existir. Isto está em concordância com as observações clínicas onde recidiva metastática se correlaciona com a quantidade de metástases no fígado antes da ressecção. metástases hepáticas que são visíveis na imagem pré-operatória pode refletir apenas a ponta do iceberg, enquanto mais, mas não depósitos de células tumorais detectáveis, pode estar presente no momento do diagnóstico. Após a ressecção hepática, factores de regeneração hepáticas podem então estimular o crescimento destas células de tumor, o que eventualmente se tornam evidentes, como metástases recorrentes.
Embora a correlação acima mencionado é muito provável, que não tenha sido até agora provado. A influência dos mecanismos de regeneração hepática sobre o progresso do tumor intra-hepática, portanto, requer mais análises moleculares. instruções precisas, bem como um vídeo ilustrativo permitir uma rápida adopçãoda técnica introduzida neste vídeo. Ela pode servir como uma base para diferentes tipos de estudos em todo o mundo que estão tentando descobrir o elo que falta nesta cadeia bem conhecida de eventos.
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Acknowledgments
agradecimentos especiais vão para o Dr. Benjamin Motsh por sua assistência em questões técnicas. Os autores também gostaria de reconhecer o Dr. Marcus Forschner e Birk Müller pelo seu apoio multimédia, Erica Magelky para sua perícia editorial e Lisa Hornung, Dr. Roland Jurgons e Professor Stephan von H�sten (todos do Franz-Penzoldt-Center, University of Erlangen) pelo seu profissionalismo no manuseio e cuidados com os animais. Agradecemos ao professor Michael Neumaier no Instituto de Química Clínica, Faculdade de Medicina Mannheim, da Universidade de Heidelberg, Alemanha por fornecer células tumorais MC38.
O presente trabalho foi realizado em cumprimento dos requisitos para a obtenção do grau "Dr. med." na Friedrich-Alexander-University Erlangen-Nürnberg (FAU).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Operation Microscope | Zeiss | OPMI-1 FC S21 | |
| Induction Cage (Plexiglas Box) | UNO BV, Netherlands | 180000132 | |
| Flowmeter + Connection Kit | UNO BV, Netherlands | 180000008 | |
| UNO Vaporizer Sigma Delta | UNO BV, Netherlands | 180000002 | |
| Key Filler for Anesthetic | UNO BV, Netherlands | 180000010 | |
| Activated Charcoal Filter Adsorber | UNO BV, Netherlands | 180000140 | |
| Gas Exhaust Unit | UNO BV, Netherlands | 180000118 | |
| Face Mask for mouse | UNO BV, Netherlands | 180000065 | |
| Vaporizer Stand | UNO BV, Netherlands | 180000006 | |
| Heat lamp | Physitemp Instruments | HL-1 | |
| Styrofoam Pad | RAYHER | 30074000 | |
| Third Hand Tool | TOOLCRAFT | ZD-10F | |
| Precision Scales | Kern | EW 220-3NM | |
| Scales | Kern | EMB 500-1 | |
| Sliding Caliper | MIB | MIB 82026100 | |
| Microdissection forceps | Braun/Aesculap | BD195R | |
| Microdissection scissors | Braun/Aesculap | FD100R | |
| Microdissection needle holder | Braun/Aesculap | BM563R | |
| Retractor | Fine Science Tools (F.S.T.) | No. 17001-0 | Type: Bowmann |
| Clamp | Braun/Aesculap | BJ002R | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Expendable Items (NOTE: Quantities are per animal and procedure) |
|||
| Foliodrape sterile cover (45 cm x 75 cm) | Hartmann | 2775001 | |
| Sterile Cotton Swabs (2x) | Hartmann | 4700151 | Peha |
| Sterile fluid (0.9% NaCl) | Braun | 3570310 | PZN=04454809 |
| Disinfectant (Softasept - 250 ml) | Braun | 3887138 | PZN=0762008808505018 |
| 2 x 1 ml syringe (Injekt-F ) | Braun | 9166017V | |
| 26 G canula (Sterican) - for Carprofen injection | Braun | 4665457 | |
| 30 G canula (Sterican) - for Tumor injection | Braun | 4656300 | |
| Caprofen (=Rimadyl) | Pfizer | QM01AE91 | |
| Metamizole (= Novaminsulfon) | Ratiopharm | 16543.00.00 | |
| 4-0 Vicryl suture | Ethicon | J835G | |
| 5-0 Prolene suture | Ethicon | 8618G | |
| SafeLock Flex-Tube 1.5 ml | Eppendorf | 22363778 | |
| 4 x 4 Gauze Sponge | Kendall/Covidien | UPC: 728795135355 | ASIN: B005BFQTWM |
| Large paperclip | ACCO | A7072510G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| Female athymic nude-foxn1nu/nu | Harlan Laboratories B.V. | Code 069 |
References
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