Abstract
Den høje forekomst af tumor tilbagefald efter resektion af metastatiske leverlæsioner fortsat et uløst problem. Små tumor celle indskud, som ikke kan påvises ved rutinemæssig klinisk billeddiagnostik, kan blive stimuleret af hepatiske regenerering faktorer efter leverresektion. Det er ikke helt klart, hvilke faktorer der er afgørende for tumor tilbagefald.
Den præsenterede musemodel kan være nyttigt at undersøge de mekanismer, der spiller en rolle i udviklingen af recidiverende maligne læsioner efter leverresektion. Modellen kombinerer de er lette at udføre og reproducerbare teknikker til definerede mængder af levervæv fjernelse og tumor induktion (ved injektion) i mus. Dyrene blev behandlet med enten en enkelt laparotomi, en 30% leverresektion, eller en 70% leverresektion. Alle dyr modtog efterfølgende en tumorcelle injektion i det resterende levervæv. Efter to ugers observation blev leverne og tumorer evalueret for størrelse og vægt ogundersøgt ved immunhistokemi.
Efter en 70% leverresektion, blev tumoren volumen og vægt signifikant forøget sammenlignet med en laparotomi alene (p <0,05). Derudover immunhistokemi (Ki67) viste en øget tumor proliferationshastighed i resektion (p <0,05).
Disse resultater viser indflydelsen af hepatiske regenerering mekanismer på intrahepatisk tumorvækst. Kombineret med metoder som histologisk oparbejdning eller RNA-analyse, kunne den beskrevne musemodel tjene som grundlag for en nærmere undersøgelse af forskellige faktorer involveret i tumorvækst og metastatisk sygdom tilbagefald i leveren. Et betydeligt antal variabler som længden af postoperativ observation, den cellelinje anvendes til injektion eller timingen af injektion og leverresektion tilbyder flere vinkler, når udforske et specifikt spørgsmål i forbindelse med post-hepatektomi metastaser. Begrænsningerne af denne procedure er authorization at udføre proceduren på dyr, adgang til et passende anlæg og erhvervelse af visse former for udstyr dyreforsøg.
Introduction
Colorectal cancer (CRC) tegner sig for næsten 9% af alle maligne tumorer. Det er den tredje mest almindelige kræftform, både i USA og på verdensplan. Globale dødelighed fra CRC spænder fra 300.000 til over 500.000 om året en. Tyve procent af patienterne lider af levermetastaser efter opdagelsen af deres kolorektal tumor. Resekterbare metastaser behandles normalt ved en delvis leverresektion 2,3. Forbedrede kirurgiske teknikker, nye multimodale strategier og nye definitioner af resekterbare metastaser gør terapien af en delvis leverresektion muligt for et stigende antal patienter 4.
Gentagelse af sekundære liver maligniteter, er imidlertid en udfordrende klinisk sequalae i moderne gastrointestinal kirurgi. Patienter med CRC, der gennemgik resektion af levermetastaser har en 30 til 50% chance for at udvikle en ny tumor i deres rest lever fem. Derfor er der behov for yderligere forskning påmekanismer involveret i en gentagelse af levermetastaser.
En leverresektion på omkring 70% er normalt kompenseres inden for et par uger af det resterende levervæv. Denne regenerering omfatter flere mekanismer, herunder cytokiner som interleukin 6 (IL-6), tumornekrosefaktor-alfa (TNF-α), hepatocytvækstfaktor (HGF), transformerende vækstfaktor beta (TGF-β), vaskulær endothelial vækstfaktor (VEGF ), matrix-metalloproteaser (MMP-2 og MMP-9) og CXC-Chemokiner 6-11. Disse stoffer understøtter hepatisk regenerering og kan også være ansvarlig for de høje tilbagefald satser af primære og sekundære lever maligniteter ved at inducere væksten af små tumor celle indskud i den resterende leveren, der ikke er opdaget af rutinemæssig klinisk billeddannelse. Denne kausalitet er ikke blevet bevist hidtil.
Følgende hypotese blev etableret. Efter partiel leverresektion, spredning faktorer, der er ansvarlige for levender hypertrofi kan også inducere væksten af hidtil uopdagede tumorceller i leveren. En musemodel er designet som kombinerede de teknikker til leverresektion og tumor induktion. Tredive athymiske nøgne-foxn1nu / nu mus blev inddelt i tre grupper på ti dyr i hver. Hver af dem blev behandlet med enten en laparotomi alene (gruppe A), en 30% leverresektion (gruppe B) eller en 70% leverresektion (gruppe C). Dyr i alle grupper modtog efterfølgende en tumorcelle injektion i en defineret resterende del af leveren, for at simulere hvilende tumorceller. Dyr, hvor observeret i to uger og derefter vurderet for tumorvækst og leverhypertrofi.
Målet var at skabe en model, der kunne anvendes til at søge efter de molekylære og patogenetiske faktorer, der kan spille en rolle i post-hepatektomi tumordannelse. Denne metode kan være nyttige i at vurdere: oprindelsen af endokrine faktorer involveret i lever regenerering; de ansvarlige mekanismer for intrahepatisk tumeller vækst efter leverresektion; og leverresektion volumen nødvendig for intrahepatisk tumorvækst induktion. Følgende metode er kun blevet udført på dyr, fordi de lover at bidrage til forståelsen af grundlæggende biologiske principper samt til udvikling af viden, der kan forventes at gavne mennesker ved forbedrede behandlingsmuligheder. På grund af de involverede i disse spørgsmål mekanismer, det skulle undersøges in vivo, som in vitro-metoder ikke kan give en realistisk gengivelse af den humane patologi.
Disse undersøgelser kan føre til opdagelsen af relevante mål til profylaktiske behandlingsmuligheder for faldende tumor tilbagefald.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Regeringen i Mittelfranken i Bayern, Tyskland, givet tilladelse til procedurerne beskrevet. Eventuelle lignende forsøg kræver forudgående tilladelse fra de relevante myndigheder.
Bemærk: Følgende vejledning kan bruges til tidligere diskuteret grupper A til C. Trin, der skal udelades i gruppe A og B er mærket i overensstemmelse hermed.
1. Forberedelser
- Tag handsker, placere polystyren puden under mikroskopet, og fokusere linsen på området lidt over puden.
- Split den sterile plader og sted halvdelen over polystyren puden og den anden halvdel lige ud for den.
- Sterilisere kirurgiske instrumenter og placere dem på et sterilt ark ved siden af Polystyren pad.
- Unbend en stor papirclips til at danne en bue. Vend det på hovedet og tryk den ind i polystyren puden i den øverste ende - lige ved siden af, hvor dyrets hoved vil ligge.
- Placer mundstykket på vaporizer mellem de to leds af buen. (Figur 7)
- Opsætning af en varmelampe ca. 40 cm fra det sted, hvor dyrets hoved vil ligge. Sørg for varme ved niveauet af polystyren puden ikke overstiger 40 ° C.
- Forbered en separat bur til betjente dyr.
- Forbered en defineret mængde og volumen (højst 50 pi) af tumorceller i et flex rør og gemme den på is.
2. Anæstesi
- Placer musen i en plexiglas kasse og begynde anæstesi induktion på høj strømning isofluran (5% isofluran ved en strømningshastighed på 10 l / min).
- Efter at have gået gennem de forskellige stadier af anæstesi, fjerne musen fra plexiglas kasse lige efter det er kommet ind i fase af agonal vejrtrækning, som let kan genkendes af en drastisk nedgang i respirationsfrekvens (<20 / min) og dybe gisp ryster den hele dyrets krop.
- Hurtigt sende dyret mave-op på det sterile afdækningsstykke dækket polystyren pad og fortsætteventilation på lav-flow isofluran ved at indsætte musens snude i mundstykket for at opretholde anæstesi. Brug en inspiratorisk del af 1,8-2,2% ved en strømningshastighed på ca. 1 l / min.
- Evaluere anæstesidybden under operationen ved at beregne den respiratoriske frekvens, som ideelt mellem 45 og 60 vejrtrækninger per minut. Tilpas inspiratoriske isofluran fraktion i overensstemmelse hermed, hvis dette ikke er tilfældet.
Bemærk: Ændringer i inspiratorisk isofluran fraktion tage omkring 60 sek, indtil de bliver effektive. Undgå at udføre drastiske ændringer hurtigt. I stedet ændre bedøvelsesmiddel ansøgning gradvist.
3. Betjening
- Desinficer brystet og maven med en passende desinfektionsmiddel og ændre handsker bagefter.
- Injicere en vægt-tilpassede mængde carprofen (5 mg / kg legemsvægt) i dyrets lår.
- Knib forsigtigt den abdominale hud med en pincet for at teste, om anæstesidybden er passende.
- dissekere omhyggeligt området omkring xiphoid at udsætte det fra det omgivende væv.
- Placer et ophold sutur gennem formet som et sværd (indefra og ud) og vedhæfte begge tråde til holderen over dyrene hoved med klemmen.
- Klem retraktoren lemmer sammen og langsomt introducere "U" -formede retractoren tips langs dyrets interne bugvæggen.
Bemærk: Disse foranstaltninger udsætte leveren at lette adgangen til de forskellige lapper. Identifikationen af leverens median og venstre laterale lap skulle det være muligt. - Brug en saltvand-gennemblødt vatpind og skub forsigtigt medianen lap nedad. Dissekere de ventrale tre fjerdedele af falciforme ligament, som nu vil være synlige mellem medianen lap overflade og mellemgulvet.
- Nu, bruge to saltvand gennemblødt vatpinde til at flytte medianenlap og venstre laterale lap opad mod membranen.
- Visualiser den tynde membran mellem venstre laterale lap og caudatus lap og omhyggeligt dissekere det.
Bemærk: Når du udfører denne protokol om dyr fra gruppe A, springe til trin 3.18 på dette punkt. - Placer en størrelse 4-0 ligatur diagonalt langs venstre laterale lap base.
- Dernæst bruge vatpind til at returnere den venstre laterale lap til sin oprindelige position.
- binde omhyggeligt ligaturen så tæt på lap base som muligt og vurdere for farveændring i lap til at teste for tilstrækkeligt afbrudt blodforsyning.
- Resektion venstre laterale lap ved at følge linjen i lap base og bemærk resekterede lap vægt.
Bemærk: Når du udfører denne protokol om dyr fra gruppe B, springe til trin 3.18 på dette punkt. - Placer en anden ligatur mellem venstre laterale lap s stump og median lap base.
- Flyt medianen lap som well og binde ligatur. Igen, det vurderes om farveændring i lap til at teste for tilstrækkeligt afbrudt blodforsyning.
- Resektion median lap og bemærk dens vægt.
- Tilslut 1 ml sprøjte til 30 G nål og fylde den med de tumorceller fra flex rør uden at vippe sprøjten til enhver tid.
- Brug vatpinde til at flytte de intestinale sløjfer til dyrets venstre for at blotlægge ringere højre lap.
- Indsæt celle-loaded sprøjte i den "tredje hånd" enhed ad 30 ° vinkel med lodret.
- Flyt forsigtigt enheden op til musen med nålen lige over den nedre højre lap.
- avancere langsomt sprøjten i den tredje hånd enheden, indtil nålens spids er i ringere højre lap centrum del.
- Injiceres ind i lap centrum del over en periode på 30-45 sek.
- Komprimere injektionsstedet i mindst tre minutter, indtil blødningen er stoppet.
- Luk fascia med en resorberbar 5-0 sutur hjælp enkelt knap knob.
- Luk huden med en 4-0, ikke-resorberbar sutur hjælp enkelt knap knob.
- Start ventilerende musen på højt flow ilt i ca. 1 min.
4. Post-op procedure
- Sende dyret til varme omgivelser (ca. 40 ° C) i den næste halve time for at sikre tilstrækkelig genopretning.
- Blande dyrets drikkevand med 5 mg / ml metamizol i 72 timer efter operation.
- Undersøge integriteten af suturerne nøje i mindst tre dage efter indgrebet.
5. Observation Periode og Eutanasi
- Mål dyrets vægt dagligt i i alt 14 dage. Score dem om deres trivsel og begrænsninger hhv.
- Efter 14 dage, bedøver dyret følgende trin 2.1 og 2.2 i det operative protokol ennd fortsætte med institutionens protokol for dyr eutanasi.
- Udfør en median laparotomi som forklaret i trin 3.4. For at lette adgangen til maven, forlænge snittet 1-1,5 cm kaudalt. Sæt retraktoren som påpeget i 3.7.
- Dissekere langs resten af falciforme ligament og sender en nedre vena cava lige når den forlader leveren kranialt.
- Adskil leveren fra membranen, ved at gribe mellemgulvet med pincet og ligeud dissekere ind i rummet mellem leveren og muskelvæv.
- Løft mobiliserede levervæv fra retroperitoneum og dissekere det fra de resterende strukturer er det stadig knyttet til: retroperitoneal fedtvæv, inferior vena cava og portalen vene.
- Undersøg leveren efter ekstraktion for yderligere væv, der fejlagtigt vil bidrage til dens faktiske størrelse og vægt. En ekstraheret lever og dets tumor vises i figur 6.
- Skær tumor fra inferior højre lap.
- Måle størrelsen og vægten af både tumoren og leverparenkym.
- Spare yderligere vævsprøver fra peritoneum, lymfeknuder eller andre organer som er nødvendig for væv analyse
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I vores specifikke eksperiment, vi medtaget 30 athymiske nøgne-foxn1nu / nu-mus. De modtog en median laparotomi, tumorcellelinier injektioner af 500.000 MC38-tumorceller (opløst i 50 pi saltvand), og blev efterfølgende behandlet med enten en 70% leverresektion, en 30% leverresektion, eller ikke yderligere indgriben.
Efter 14 dage, næsten fuldstændig regenerering af den resterende leveren efter 30% eller 70% lever resektioner (leverhypertrofi-indeks for den leverresektion gruppe 30% var 1,06 versus 0,8 fra leverresektion gruppe 70%) blev observeret.
Efter en enkelt laparotomi, den gennemsnitlige vægt af intrahepatiske tumorer var 332 mg (område: 10-608 mg). Den gennemsnitlige tumorvægt af intrahepatiske tumorer var 656 mg (interval: 76-1,873 mg) efter en 30% leverresektion vs. 961 mg (interval: 189 Mg- 3030 mg) efter en 70% leverresektion med p & #60; 0,05 (Figur 1). Efter en 30% leverresektion, tumor volumen var 950 mm 3 (interval: 439-2,326 mm 3) vs. 1385 mm 3 (interval: 411-2,366 mm 3) efter en 70% leverresektion, og 511 mm 3 (interval: 87-1,693 mm3) efter en laparotomi alene med p <0,05 (figur 2).
Vævssnit fra tumorvæv blev udtaget og analyseret via KI-67 immunhistokemi. Celler på objektglassene blev evalueret med hensyn til deres proliferationshastighed. Den gennemsnitlige proliferationshastighed af tumorceller fra laparotomi gruppen var 47% (interval: 39-56%) sammenlignet med 61% (interval: 51-69%) fra dyr, der havde undergået en leverresektion på 70% (p <0,05) og 53% (interval: 38 til 69%) fra dyr, der havde undergået en leverresektion på 30% (p = 0,22), hvilket viser en forøget hastighed af celleproliferation i grupper der undergik leverresektion (figur 3 - 5).
Figur 1:. Vægt af intrahepatisk tumorer Diagrammet sammenligner gennemsnitlige tumor vægt blandt grupperne A, B og C efter dissektion fra leveren og shows øget vægt i tumorer i gruppe B og C. Fejllinjer repræsenterer SEM. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2:. Volumen af intrahepatisk tumorer Diagrammet sammenligner det gennemsnitlige tumorvolumen blandt grupperne A, B og C efter dissektion fra leveren og shows øgede mængder i tumorer i gruppe B og C. Fejl søjler repræsenterer SEM. ank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Proliferation Rate i tumorer fra gruppe A. KI-67 Immunhistokemi af et dias fra en tumor eksemplar fra gruppe A demonstrerer mild spredning af tumorceller. Scale bar = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Proliferation Rate i tumorer fra gruppe B. KI-67 Immunhistokemi af et dias fra en tumor eksemplar fra gruppe B demonstrerer moderat spredning af tumorceller. Scale bar = 100 um.få = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Proliferation Rate i tumorer fra gruppe C. KI-67 Immunhistokemi af et dias fra en tumor eksemplar fra gruppe C viser markant spredning af tumorceller. Scale bar = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Udvundet Lever / Tumor eksemplar fra gruppe B. Denne leveren blev ekstraheret 14 dage efter at have udført en 30% leverresektion og samtidig tumorceller injektion. En stor tumor i den højre nedre lap kan ses, mens den højre overlegen, median og spiegelske laps har været igennem en betydelig hypertrofi.
* = Tumor i ringere højre lap, SRL = overlegen højre lap, ML = median lap, CL = spiegelske lap. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7:. ELLER Tabelopsætning Den polystyren pad er dækket af en steril klud. En bøjet åben papirclips presses ind i puden ved dens øvre ende overliggende vejrtrækning rør med dens mundstykke. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tidligere forsøg udfører kirurgi hos gnavere har været i stand til at identificere bestemte variabler, der kunne tjene som kilder til bias. For at opnå pålidelige og gyldige resultater, overveje følgende forholdsregler.
Rutinemæssig præ-op faste kan føre til lever steatosis 12, som kan inhibere leverregenerering 13,14. Det anbefales derfor ikke. Den højeste mitotiske aktivitet af hepatocytter varierer i løbet af dag 15. Hvis det er muligt, udføre procedurerne på et bestemt tidspunkt i løbet af dagen for alle grupper. Murin leverregenerering er mest effektive i dyr 4-6 uger gamle. Dyr ældre end 10 måneder har en signifikant nedsat regenerering kapacitet 16. Brug mus af samme race, køn og alder for eksperimenter for at minimere risikoen for bias. Arbejde i et sterilt miljø er generelt vigtigt i en åben procedure som denne. Især hos immunkompromitterede organismer, ligesom athymi c-mus, der anvendes i videoen, er risikoen for infektion, hvilket kan føre til for tidlig død eller skæve resultater, er høj. Forfølge en tre-zone-setup bestående af et præparat, en operation og et opsving område er derfor berettiget 17. På grund af sin dybe hepatotoksiske effekter, er almindeligt anvendt buprenorphin anbefales ikke til intra- eller postoperativ smertestillende terapi 18,19. Brug andre stoffer som carprofen eller metamizol at give tilstrækkelig analgesi. Da metamizol er ikke tilgængelig i mange lande, kan carprofen også bruges til smerte kontrol efter indgrebet. Udfør en subkutan injektion af 5 mg / kg legemsvægt en gang dagligt i tre dage for at erstatte metamizol.
Postoperativ opsving opnås bedst, når inddrive musen placeres i et varmt miljø med let adgang til mad og vand. Det er ideelt isoleret fra andre mus natten, for at forhindre mere dominerende dyr i at skade mere sårbare 17.
jove_content "> Selvom protokollen er meget ligetil, er der nogle mindre faldgruber at undgå, når du udfører denne form for kirurgi i mus. Dissektion af falciforme ligament, en struktur der forbinder den ventrale side af medianen lap til bugvæggen, er afgørende for opnå passende lever fleksibilitet. Da dette ligament ekspanderer til et område meget tæt på det punkt, hvor den nedre vena cava forlader leveren kranialt, udvises forsigtighed for at undgå skade på denne store vene. i gennemsnit dissekere det omkring tre fjerdedele af måde vil sikre tilfredsstillende mobilisering og samtidig opretholde tilstrækkelig afstand til beholderen.Brug den rigtige mængde spænding når ligere en lap med en ligatur er en uhyre vigtig opgave, når du udfører resektion protokollen. Ligaturer med luft knuder eller dårligt strammet ligaturer kan føre til utilstrækkeligt afbrudt blodforsyning, blødning, chok og død. Samtidig, en attempt til grundigt stramme en ligatur knude kan resultere i ligatur brud med tilhørende skader på omkringliggende væv og organer. En effektiv måde at vurdere ligatur integritet er observationen af cyanotiske farveændring inden for ligeret lap. Vælge den korrekte suturmateriale spiller også en vigtig rolle. Flettede suturer er mere tilbøjelige til at komprimere væv, hvorimod monofilamentous materialer snarere vil dissekere gennem det bløde levervæv og forårsager blødning.
En anden afgørende skridt, når du fjerner lever lapper hos mus involverer korrekt placering af ligaturer. Ligering bør udføres vinkelret på de vigtigste sejler ind i den lapper. Mens dette er temmelig ligetil i det midterste lap, passende resektion af den venstre laterale lap er mere udfordrende. Dens fartøjer ind i lap i en Ventro-caudale retning. Som følge heraf skal ligaturen tråd anbringes langs en imaginær linie mellem den venstre lunge base til den ringere højre lap af lIver.
I det midterste lap kan dog resektion kompromittere inferior vena cava. Fordi denne store fartøj løber gennem den dorsale del af lap, det er udsat for beskadigelse, som kan føre til lever- nekrose. Desuden binde ligatur med for meget spænding i dette område, kan resultere i mellemgulvet brud og / eller pneumothorax.
Tilstrækkelig håndtering af tumorceller er også vigtigt, når de forsøger at få sammenlignelige resultater. Selv om de nøjagtige celledyrkningsteknikker ikke er beregnet til at være en del af denne protokol, håndtering af tumorceller inden proceduren er så vigtig som perfekt forberedelse på forhånd. Når sprøjten fyldes med tumorcellerne, er det vigtigt at holde den oprejst på alle tidspunkter. Major vipning af sprøjten kan resultere i tumorceller klæber til sprøjter væg, derfor resulterer i tab af celler på tidspunktet for injektionen. Kun mindre vipning er berettiget på tidspunktet for indsprøjtning, for at indsætte nålen prvinkelret på den nedre højre lap overflade.
Blødning og peritoneale metastaser kan forekomme som et resultat af blødning og spild fra punkturstedet på leverens overflade. Derfor blid kompression af lap med en vatpind i en periode på tre minutter er afgørende for at styre blødning fra leverparenkym og forhindre tumorcelle det væsker i peritoneum.
Publikationer indeholder procedureprotokoller for intraabdominal operationer i gnavere sjældent indeholde oplysninger om den type af abdominal lukning. Men dette aspekt er en anden mulig kilde til komplikationer. Selv med tilstrækkelig smerte kontrol, vil dyrene forsøger at fjerne de fremmedlegemer i deres bugvæggen. Konsekvenser kan være intraabdominal infektion, et åbent abdomen eller død. Dette kan forhindres ved begge udfører enkelt afbrudte sømme til sårlukning i stedet for en kørende sutur og lukning bugvæggen i to lag.
Kvinde athymiske nøgne-foxn1nu / nu-mus (leveret af Harlan Laboratories BV, Kreuzelweg 53, NL-5961 NM Horst) blev anvendt i dette eksperiment. T-celle-mangel denne race er kendt for tillader forholdsvis ubegrænset tumorvækst og derfor ideelle betingelser for tumorimplantation. For at minimere indflydelsen af ranking slagsmål blandt dyrene, blev kun hundyr anvendes. Foreløbige resultater ved hjælp af forskellige stammer ligesom C57BL / 6 indavlede mus har også vist betydningsfulde, men lavere tumorvækst volumen. Således kan teknikken meget sandsynligt være gennemførlig i endnu flere musestammer.
Men ved hjælp af immunkompromitterede organismer i denne indstilling kræver særlige dyr hygiejniske forholdsregler, som patogener kan forstyrre tumorvækst 20. Foranstaltninger som brug af kontroldyr til overvågning af forekomsten af patogener 21 som udføres i dyreforsøg facilitet vores undersøgelse fandt sted i kan være helpful at opdage mulige kilder til bias.
Dette eksperiment brugt en muse kolorektal cancer cellelinje kaldet MC38 (opnået fra Institut for Klinisk kemi ved det medicinske fakultet i Mannheim, Tyskland). 5 x 10 5 tumorceller blev opløst i 50 pi af saltvand. Koncentrationen blev bestemt i indledende forsøg, hvor dette beløb blev identificeret som ideal for fast tumordannelse inden for to uger. Afhængigt af immunokompetence af de dyr, der anvendes i disse forsøg (se diskussionen ovenfor), kan det meget vel også være muligt at anvende humane kolorektal cancerceller og derfor skabe en xenograft. Indledende test udført i athymiske nøgen-foxn1nu / nu mus ved hjælp af humane SW480 tumorceller var i stand til at demonstrere tumorvækst i rest leveren efter resektion. På grund af den dimension af murine lever, anbefales det kun at bruge volumener op til 50 pi at forhindre komplikationer. En mulig forbedring på dette punkt villevære at mærke tumorcellerne med luciferase. Afhængigt af det problem, der bliver undersøgt, kan der opstå interessante oplysninger, når nøjere overvågning af tumorcellevækst og størrelse er mulig.
Alternative måder at ligere lever lapper omfatter klipning metode 22 eller en klipning-suturering hybrid-teknik 23. Placering af klipning enheder, dog kan gøre de klipning metoder vanskelig. Tilstrækkeligt udført sutur ligatur er stadig en let at lære teknikken og er meget sandsynligt, at være den mest omkostningseffektive måde at fjerne en lap i dette eksperiment.
Fordi levende dyr anvendes i dette forsøg, kræver forudgående tilladelse fra de relevante myndigheder. Afhængigt af regionen, kan dette være en dyr og tidskrævende opgave. Selv efter officiel godkendelse, dyreforsøg er langt mindre tilgængelige end forskningsmetoder som test cellekultur eller molekylære metoder. Foruden infrastrukturen i enmoderne dyreforsøg facilitet, særligt udstyr skal tildeles for at udføre protokollen. Endvidere bør en periode på to til fire uger være planlagt til at mestre denne teknik. Denne protokol kan anvendes i en lang række cellelinjer i et stort antal musestammer. Men med hensyn til de ovennævnte mulige modifikationer, ikke hver cellelinje kan undersøges i enhver organisme.
En vigtigste mål af undersøgelsesmetoder undersøgelser med anvendelse af denne protokol vil være det komplekse vækstfaktor-system er involveret i leveren regenerering og dens præcise effekter på leveren malignitet gentagelse. For at undersøge disse mulige korrelationer tilstrækkeligt, er det vigtigt at gennemføre et dyreforsøg, i modsætning til forskellige molekylære metoder eller cellekultur eksperimenter. Disse metoder snarere bør anvendes som gratis hjælp af undersøgelse. Selv om flere forskellige leverresektion modeller hidtil 22-24 er blevet offentliggjort, denne procedurefor første gang gennemfører samtidig tumorcelle injektion i en veletableret operation.
Denne musemodel viser, at leverresektion i mus er en forholdsvis enkel, gennemførlig og let reproducerbar metode. Leverens regeneration efter små og store resektioner var i stand til at kompensere vævstabet ved hypertrofi inden for to uger. Mus kan klare reduktioner på op til 70% lever volumen.
Tumorceller var i stand til at vokse inde i rest leveren og kan etableres faste tumorer. Tumorvækst og tumorcelleproliferation korreleret med mængden af resekterede levervæv. Processen med resektion fører til en aktivering af tumorvækst inden den tilbageværende lever, som blev udtrykt ved større tumorvægte og mængder. Denne større grad af spredning kunne påvises ved immunhistokemi eksaminer.
Det er velkendt, at mængden af hepatisk regenerering factorer frigivet til leveren hypertrofi stiger med omfanget af leverresektion 25,26. Derfor kan en forbindelse mellem leverregenerering faktorer og tumorcellevækst eksisterer. Dette er i konkordans med kliniske observationer, hvor metastatisk gentagelse korrelerer med mængden af metastaser i før resektion leveren. Levermetastaser, der er synlige på præoperativ billeddiagnostik kan kun afspejle toppen af isbjerget, mens flere, endnu ikke påviselig tumor celle indskud, kan være til stede på diagnosetidspunktet. Efter leverresektion, kan hepatiske restitution faktorer derefter stimulere væksten af disse tumorceller, som til sidst bliver tydelig efterhånden tilbagevendende metastaser.
Selv om den ovenfor nævnte korrelation er meget sandsynligt, er det ikke blevet bevist hidtil. Indflydelsen af hepatiske regenerering mekanismer på intrahepatisk tumor fremskridt kræver derfor yderligere molekylære analyser. Præcise instruktioner samt en illustrativ video tillade en hurtig vedtagelseaf teknikken indført i denne video. Det kan tjene som grundlag for forskellige former for undersøgelser rundt om i verden, der forsøger at opdage det manglende led i denne velkendte kæde af begivenheder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Særlige anerkendelser gå til Dr. Benjamin Motsch for hans hjælp i tekniske spørgsmål. Forfatterne vil også gerne anerkende Dr. Marcus Forschner og Birk Müller for deres multimedier, Erica Magelky for hendes redaktionelle ekspertise og Lisa Hornung, Dr. Roland Jurgons og professor Stephan von Hörsten (alle fra Franz-Penzoldt-Center, University of Erlangen) for deres professionalisme i håndtering af dyr og pleje. Vi takker professor Michael Neumaier på Institut for Klinisk Kemi, Medicinske Fakultet Mannheim ved universitetet i Heidelberg, Tyskland for at give MC38 tumorceller.
Den nuværende arbejde blev udført i opfyldelse af kravene til opnåelse af den grad "Dr. med." på Friedrich-Alexander-University Erlangen-Nürnberg (FAU).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Operation Microscope | Zeiss | OPMI-1 FC S21 | |
| Induction Cage (Plexiglas Box) | UNO BV, Netherlands | 180000132 | |
| Flowmeter + Connection Kit | UNO BV, Netherlands | 180000008 | |
| UNO Vaporizer Sigma Delta | UNO BV, Netherlands | 180000002 | |
| Key Filler for Anesthetic | UNO BV, Netherlands | 180000010 | |
| Activated Charcoal Filter Adsorber | UNO BV, Netherlands | 180000140 | |
| Gas Exhaust Unit | UNO BV, Netherlands | 180000118 | |
| Face Mask for mouse | UNO BV, Netherlands | 180000065 | |
| Vaporizer Stand | UNO BV, Netherlands | 180000006 | |
| Heat lamp | Physitemp Instruments | HL-1 | |
| Styrofoam Pad | RAYHER | 30074000 | |
| Third Hand Tool | TOOLCRAFT | ZD-10F | |
| Precision Scales | Kern | EW 220-3NM | |
| Scales | Kern | EMB 500-1 | |
| Sliding Caliper | MIB | MIB 82026100 | |
| Microdissection forceps | Braun/Aesculap | BD195R | |
| Microdissection scissors | Braun/Aesculap | FD100R | |
| Microdissection needle holder | Braun/Aesculap | BM563R | |
| Retractor | Fine Science Tools (F.S.T.) | No. 17001-0 | Type: Bowmann |
| Clamp | Braun/Aesculap | BJ002R | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Expendable Items (NOTE: Quantities are per animal and procedure) |
|||
| Foliodrape sterile cover (45 cm x 75 cm) | Hartmann | 2775001 | |
| Sterile Cotton Swabs (2x) | Hartmann | 4700151 | Peha |
| Sterile fluid (0.9% NaCl) | Braun | 3570310 | PZN=04454809 |
| Disinfectant (Softasept - 250 ml) | Braun | 3887138 | PZN=0762008808505018 |
| 2 x 1 ml syringe (Injekt-F ) | Braun | 9166017V | |
| 26 G canula (Sterican) - for Carprofen injection | Braun | 4665457 | |
| 30 G canula (Sterican) - for Tumor injection | Braun | 4656300 | |
| Caprofen (=Rimadyl) | Pfizer | QM01AE91 | |
| Metamizole (= Novaminsulfon) | Ratiopharm | 16543.00.00 | |
| 4-0 Vicryl suture | Ethicon | J835G | |
| 5-0 Prolene suture | Ethicon | 8618G | |
| SafeLock Flex-Tube 1.5 ml | Eppendorf | 22363778 | |
| 4 x 4 Gauze Sponge | Kendall/Covidien | UPC: 728795135355 | ASIN: B005BFQTWM |
| Large paperclip | ACCO | A7072510G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| Female athymic nude-foxn1nu/nu | Harlan Laboratories B.V. | Code 069 |
References
- Haggar, F. A., Boushey, R. P. Colorectal cancer epidemiology: incidence, mortality, survival, and risk factors. Clin. Colon Rectal Surg. 22, 191-197 (2009).
- Fong, Y., et al. Liver resection for colorectal metastases. J. Clin. Oncol. 15, 938-946 (1997).
- Kato, T., et al. Therapeutic results for hepatic metastasis of colorectal cancer with special reference to effectiveness of hepatectomy: analysis of prognostic factors for 763 cases recorded at 18 institutions. Dis. Colon Rectum. 46, S22-S31 (2003).
- Poston, G. J., et al. OncoSurge: a strategy for improving resectability with curative intent in metastatic colorectal cancer. J. Clin. Oncol. 23, 7125-7134 (2005).
- Neumann, U. P., Seehofer, D., Neuhaus, P. The surgical treatment of hepatic metastases in colorectal carcinoma. Dtsch Arztebl Int. 107, 335-342 (2010).
- Alwayn, I. P., et al. A critical role for matrix metalloproteinases in liver regeneration. J. Surg. Res. 145, 192-198 (2008).
- Fausto, N., Campbell, J. S., Riehle, K. J. Liver regeneration. Hepatology. 43, S45-S53 (2006).
- Fujiyoshi, M., Ozaki, M. Molecular mechanisms of liver regeneration and protection for treatment of liver dysfunction and diseases. J. Hepatobiliary. Pancreat. Surg. 18, 13-22 (2011).
- Jin, X., et al. Paradoxical effects of short- and long-term interleukin-6 exposure on liver injury and repair. Hepatology. 43, 474-484 (2006).
- Nakamura, T., Sakai, K., Nakamura, T., Matsumoto, K. Hepatocyte growth factor twenty years on: Much more than a growth factor. J. Gastroenterol. Hepatol. 26, 188-202 (2011).
- Van Sweringen, H. L., et al. CXC chemokine signaling in the liver: impact on repair and regeneration. Hepatology. 54, 1445-1453 (2011).
- Heijboer, A. C., et al. Sixteen hours of fasting differentially affects hepatic and muscle insulin sensitivity in mice. J. Lipid Res. 46, 582-588 (2005).
- Yang, S. Q., Lin, H. Z., Mandal, A. K., Huang, J., Diehl, A. M. Disrupted signaling and inhibited regeneration in obese mice with fatty livers: implications for nonalcoholic fatty liver disease pathophysiology. Hepatology. 34, 694-706 (2001).
- Selzner, M., Clavien, P. A. Failure of regeneration of the steatotic rat liver: disruption at two different levels in the regeneration pathway. Hepatology. 31, 35-42 (2000).
- Matsuo, T., et al. Control mechanism of the circadian clock for timing of cell division in vivo. Science. 302, 255-259 (2003).
- Iakova, P., Awad, S. S., Timchenko, N. A. Aging reduces proliferative capacities of liver by switching pathways of C/EBPalpha growth arrest. Cell. 113, 495-506 (2003).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J Vis Exp. , (2011).
- Skoulis, N. P., James, R. C., Harbison, R. D., Roberts, S. M. Depression of hepatic glutathione by opioid analgesic drugs in mice. Toxicol. Appl. Pharmacol. 99, 139-147 (1989).
- Berson, A., et al. Mechanisms for experimental buprenorphine hepatotoxicity: major role of mitochondrial dysfunction versus metabolic activation. J. Hepatol. 34, 261-269 (2001).
- Baker, D. G. Natural pathogens of laboratory mice, rats, and rabbits and their effects on research. Clin. Microbiol. Rev. 11, 231-266 (1998).
- FELASA working group on revision of guidelines for health monitoring of rodents and rabbits. FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units. Lab. Anim. 48, 178-192 (2014).
- Nikfarjam, M., Malcontenti-Wilson, C., Fanartzis, M., Daruwalla, J., Christophi, C. A model of partial hepatectomy in mice. J. Invest. Surg. 17, 291-294 (2004).
- Hori, T., et al. Simple and reproducible hepatectomy in the mouse using the clip technique. World J. Gastroenterol. 18, 2767-2774 (2012).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nat. Protoc. 3, 1167-1170 (2008).
- Sowa, J. P., et al. Extent of liver resection modulates the activation of transcription factors and the production of cytokines involved in liver regeneration. World J. Gastroenterol. 14, 7093-7100 (2008).
- Bonninghoff, R., et al. Effect of different liver resection methods on liver damage and regeneration factors VEGF and FGF-2 in mice. Can. J. Surg. 55, 389-393 (2012).
