Abstract
Die hohe Inzidenz von Rezidiven nach Resektion des metastasierten Leberläsionen bleibt ein ungelöstes Problem. Kleine Tumorzellablagerungen, die durch Routine der klinischen Bildgebung nicht nachweisbar sind, können durch eine Leberregenerationsfaktoren nach Leberresektion stimuliert werden. Es ist nicht ganz klar, aber welche Faktoren für ein Tumorrezidiv entscheidend sind.
Die dargestellte Maus-Modell kann nützlich sein, um die Mechanismen zu erforschen, die eine Rolle bei der Entwicklung von rezidivierenden malignen Läsionen nach Leberresektion spielen. Das Modell kombiniert die einfach zu führen und reproduzierbare Techniken von definierten Mengen von Lebergewebeentfernung und Tumorinduktion (durch Injektion) bei Mäusen. Die Tiere wurden entweder mit einer einzelnen Laparotomie, einer 30% Leberresektion oder einer 70% igen Leberresektion behandelt. Alle Tiere erhielten anschließend eine Injektion der Tumorzellen in die verbleibende Lebergewebe. Nach zwei Wochen der Beobachtung wurden die Lebern und Tumoren für die Größe und das Gewicht bewertet unddurch Immunhistochemie untersucht.
Nach einer 70% igen Leberresektion wurden das Tumorvolumen und Gewicht deutlich erhöht im Vergleich zu einer Laparotomie allein (p <0,05). Zusätzlich Immunhistochemie (Ki67) zeigten eine erhöhte Tumorproliferationsrate in der Resektion-Gruppe (p <0,05).
Diese Ergebnisse zeigen den Einfluss von Leberregenerationsmechanismen auf intrahepatischen Tumorwachstum. In Kombination mit Methoden wie histologische Aufarbeitung oder RNA-Analyse konnte das beschriebene Mausmodell für eine genaue Untersuchung verschiedener Faktoren als Grundlage dienen bei Tumorwachstum und Metastasierung Rezidiv innerhalb der Leber beteiligt. Eine beträchtliche Anzahl von Variablen wie die Länge der postoperativen Beobachtung, die Zelllinie für die Injektion oder der Zeitpunkt der Einspritzung und Leberresektion bieten mehrere Winkel verwendet wird, wenn eine bestimmte Frage im Rahmen der Post-Hepatektomie Metastasen zu entdecken. Die Grenzen dieses Verfahrens sind die aumächtigung das Verfahren an Tieren, den Zugang zu einem geeigneten Tierversuchsanlage und Erwerb bestimmter Ausrüstung durchzuführen.
Introduction
Das kolorektale Karzinom (CRC) einen Anteil von knapp 9% aller bösartigen Tumoren. Es ist die dritthäufigste Krebserkrankung, sowohl in den USA als auch weltweit. Globale Mortalitätsraten von CRC - Bereich von 300.000 bis über 500.000 pro Jahr 1. Zwanzig Prozent der Patienten leiden an Lebermetastasen nach Entdeckung ihrer kolorektalen Tumor. Resektablen Metastasen werden in der Regel durch eine Leberteilresektion 2,3 behandelt. Verbesserte chirurgische Techniken, neue Strategien multimodal und neue Definitionen von resectable Metastasen machen die Therapie einer partiellen Leberresektion möglich , für eine zunehmende Anzahl von Patienten 4.
Wiederauftreten von sekundären Lebermalignomen, jedoch ist eine anspruchsvolle klinische Folgeerkrankungen in modernen gastrointestinalen Chirurgie. Patienten mit CRC , die Resektion von Lebermetastasen unterzogen haben eine 30 bis 50% ige Chance, einen neuen Tumor in ihrer Überbleibsel Leber 5 zu entwickeln. Daher besteht ein Bedarf für weitere Forschung über diein Wiederholung von Lebermetastasen Mechanismen.
Eine Leberresektion von ca. 70% wird in der Regel innerhalb weniger Wochen durch die verbleibende Lebergewebe ausgeglichen. Diese Regeneration umfasst mehrere Mechanismen, einschließlich Zytokine wie Interleukin 6 (IL-6), Tumornekrosefaktor alpha (TNF-α), Hepatozyten-Wachstumsfaktor (HGF), transformierenden Wachstumsfaktor beta (TGF-β), den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF ), Matrix - Metalloproteasen (MMP-2 und MMP-9) und CXC-Chemokine 6-11. Diese Substanzen unterstützen Leberregeneration und kann auch für die hohe Rezidivrate von primären und sekundären Leber Malignitäten durch Induzieren des Wachstums von kleinen Tumorzellablagerungen in den verbleibenden Leber verantwortlich sein, die durch routinemßige klinische Bildgebung nicht erkannt werden. Diese Kausalitäts wurde bisher nicht bewiesen.
Die folgende Hypothese wurde gegründet. Nach Leberteilresektion sind die Proliferation Faktoren, die für Live verantwortlichr Hypertrophie kann auch das Wachstum von Tumorzellen zuvor unentdeckte in der Leber induzieren. Ein Maus-Modell wurde entwickelt, welche die Techniken der Leberresektion und Tumorinduktion kombiniert. Thirty athymischen Nackt-foxn1nu / nu-Mäuse wurden in drei Gruppen von zehn Tieren jeweils geteilt. Jeder von ihnen wurde behandelt mit entweder einer Laparotomie allein (Gruppe A), eine 30% Leberresektion (Gruppe B) oder einer 70% Leberresektion (Gruppe C). Tiere in allen Gruppen erhielten anschließend eine Injektion der Tumorzellen in einen definierten verbleibenden Teil der Leber, ruhenden Tumorzellen zu simulieren. Tiere, wo für zwei Wochen beobachtet und dann für das Tumorwachstum und Leberhypertrophie ausgewertet.
Ziel war es, ein Modell zu erstellen, die verwendet werden könnten, für die molekulare und pathogenetische Faktoren zu suchen, die eine Rolle in der Post-Hepatektomie Tumorbildung spielen kann. Diese Methode kann hilfreich sein bei der Beurteilung: die Herkunft der endokrinen Faktoren bei der Leberregeneration beteiligt; die verantwortlichen Mechanismen für die intra-Tumoder das Wachstum nach Leberresektion; und die Leberresektion notwendige Volumen für intrahepatischen Tumorwachstum Induktion. Das folgende Verfahren wurde nur an Tieren durchgeführt worden, weil sie zum Verständnis der grundlegenden biologischen Prinzipien und zur Entwicklung von Wissen beizutragen versprechen, die erwartet werden kann, den Menschen durch eine verbesserte Behandlungsmöglichkeiten zu profitieren. Aufgrund der in diesen Angelegenheiten Mechanismen, hatte es in vivo untersucht werden, wie es in vitro Methoden nicht eine realistische Darstellung der menschlichen Pathologie liefern.
Diese Untersuchungen können zur Verringerung der Tumorrezidiv zur Entdeckung der relevanten Ziele für die prophylaktische Behandlungsmöglichkeiten führen.
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Protocol
Die Regierung von Mittelfranken in Bayern, Deutschland, die Erlaubnis für die beschriebenen Verfahren. Etwaige ähnliche Experimente bedürfen der vorherigen Genehmigung durch die zuständigen Behörden.
Hinweis: Die folgende Anleitung kann für die zuvor diskutierten Gruppen A bis C Schritte verwendet werden, die in den Gruppen A und B werden weggelassen haben, sind entsprechend gekennzeichnet.
1. Vorbereitungen
- Setzen Sie auf Handschuhe, legen Sie die Polystyrol-Pad unter dem Mikroskop, und konzentrieren sich die Linse auf dem Gebiet leicht über dem Pad.
- Teilen Sie die sterile Folie und Stelle über die Hälfte der Polystyrol-Pad und die andere Hälfte nur daneben.
- Sterilisieren der chirurgischen Instrumente und legen sie auf ein steriles Blatt neben dem Polystyrol-Pad.
- Unbend eine große Büroklammer einen Bogen zu bilden. Drehen Sie sie auf den Kopf und drücken Sie sie in die Polystyrol-Pad am oberen Ende - direkt neben dem Kopf des Tieres liegen.
- Platzieren Sie das Mundstück des Verdampfers zwischen den beiden Schenkels des Bogens. (Figur 7)
- Legen Sie eine Wärmelampe ca. 40 cm von der Stelle, wo der Kopf des Tieres liegen. Achten Sie darauf, die Wärme auf der Ebene des Polystyrol Pad nicht über 40 ° C.
- Bereiten Sie einen separaten Käfig für operierten Tieren.
- Bereiten einer definierten Menge und Volumen (maximal 50 & mgr; l) von Tumorzellen in einem Flexrohr und lagern es auf Eis.
2. Anesthesia
- Platzieren Sie die Maus in eine Plexiglas-Box und beginnen Narkoseeinleitung auf hohe Durchfluss Isofluran (5% Isofluran bei einem Durchfluss von 10 l / min).
- Nachdem man durch die verschiedenen Phasen der Anästhesie, entfernen Sie die Maus aus dem Plexiglas-Box nur, nachdem sie die Bühne der agonal Atmung eingetreten ist, die leicht durch eine drastische Abnahme der Atemfrequenz erkannt werden können (<20 / min) und tief Keuchen das Schütteln Tier am ganzen Körper.
- Schnell Legen Sie das Tier dem Bauch nach oben auf dem sterilen Polystyrol-Pad Tuch bedeckt und weiterhinLüftung auf Low-Flow-Isofluran mit der Maus die Schnauze in das Mundstück Anästhesie aufrechtzuerhalten einlegen. Verwenden einen inspiratorischen Anteil von 1,8-2,2% bei einem Fluss von etwa 1 l / min.
- Auswerten der Narkosetiefe während des Betriebs durch die Atemfrequenz berechnet wird, die zwischen 45 und 60 Atemzügen pro min ideal ist. Passen Sie die Inspirations Isofluran Fraktion entsprechend, wenn dies nicht der Fall ist.
Hinweis: Änderungen in der Inspirations Isofluran Fraktion etwa 60 Sekunden dauern, bis sie wirksam werden. Vermeiden Sie schnell drastische Veränderungen durchzuführen. Stattdessen ändern die nach und nach der Narkose Anwendung.
3. Bedienung
- Desinfizieren Sie die Brust und Bauch mit einer ausreichenden Desinfektionsmittel und Handschuhe danach ändern.
- Injizieren einer gewichts angepasst Volumen von Carprofen (5 mg / kg Körpergewicht) in den Oberschenkel des Tieres.
- kneifen Sie vorsichtig die Bauchhaut mit einer Zange zu testen, ob die Narkosetiefe ausreichend ist.
- sezieren vorsichtig den Bereich um den xiphoid es aus dem umgebenden Gewebe zu belichten.
- Platzieren Sie einen Aufenthalt Faden durch die xiphoid (von innen nach außen) und befestigen Sie beide Fäden an dem Halter über die Tiere die Klemmkopf verwenden.
- Klemmen Sie die Glieder des Aufroller zusammen und langsam einzuführen, um die "U" -förmigen Aufroller Spitzen entlang der inneren Bauchdecke des Tieres.
Anmerkung: Diese Maßnahmen die Leber freizulegen Zugang zu den verschiedenen Keulen zu erleichtern. Die Identifizierung der Leber des Median und linken Seitenlappen sollte nun möglich sein. - Verwenden Sie eine Kochsalzlösung getränkten Wattestäbchen und sanft den Mittellappen nach unten drücken. Präparieren der ventralen drei Viertel des falciform Band, die nun zwischen den Mittellappen Oberfläche und der Membran sichtbar.
- Verwenden Sie nun zwei Kochsalzlösung getränkten Wattestäbchen den Median zu verschiebenLappen und Seitenlappen nach oben gegen die Membran nach links.
- Visualisieren Sie die dünne Membran zwischen dem linken Seitenlappen und Lobus caudatus und sorgfältig sezieren.
Hinweis: Wenn Sie dieses Protokoll Durchführung an Tieren aus der Gruppe A, springen diesem Punkt zu Schritt 3.18 an. - Legen Sie eine Größe 4-0 Ligatur diagonal entlang der linken Seiten Basis des Lappens.
- Als nächstes wird das Wattestäbchen mit der linken Seitenlappen in seine ursprüngliche Position zurückzukehren.
- binden Sie vorsichtig die Ligatur so nah an der Basis des Lappens wie möglich und zu bewerten, in dem Lappen für Farbwechsel für ausreichend unterbrochen Blutversorgung zu testen.
- Resezieren den Seitenlappen links, indem Sie die Linie der Basis des Lappens und das Gewicht des resezierten Lappens.
Hinweis: Wenn Sie dieses Protokoll Durchführung an Tieren aus der Gruppe B, springen diesem Punkt zu Schritt 3.18 an. - Legen Sie eine zweite Ligatur zwischen der linken Seiten Stumpf des Lappens und die Basis der Mittellappen.
- Positionieren Sie die Mittellappen als well und die Ligatur binden. Auch hier beurteilen in der Lappen für Farbwechsel für ausreichend unterbrochen Blutversorgung zu testen.
- Resezieren die Mittellappen und beachten Sie dessen Gewicht.
- Schließen Sie die 1-ml-Spritze an die 30 G-Nadel und füllen Sie es mit den Tumorzellen aus dem Flexrohr ohne die Spritze jederzeit kippen.
- Verwenden Sie die Wattestäbchen die Darmschlingen an den Tier links zu bewegen, um den unteren rechten Lappen zu belichten.
- Legen Sie die Zelle belasteten Spritze in die "dritte Hand" Gerät bei einem Winkel von 30 ° zur Vertikalen.
- Bewegen Sie das Gerät vorsichtig mit der Nadel knapp über der unteren rechten Lappen auf die Maus nächsten.
- vorrücken langsam die Spritze in der dritten Handgerät, bis die Spitze der Nadel im unteren rechten Lappen der Mittelteil ist.
- Spritzen Sie das gesamte Volumen in das Mittelteil über einen Zeitraum von 30 bis 45 sec des Lappens.
- Komprimieren Sie die Injektionsstelle für mindestens drei Minuten, bis Blutung gestoppt hat.
- Schließen Sie die Blende mit einem resorbierbaren Naht 5-0 einzigen Knopf Knoten erreicht werden.
- Schließen Sie die Haut mit einem 4-0, nicht resorbierbaren Naht einzigen Knopf Knoten verwenden.
- Beginnen Sie mit der Maus auf hoher Strömungs Sauerstoff für etwa 1 min beatmet wird.
4. Post-op Verfahren
- Legen Sie das Tier in eine warme Umgebung (ca. 40 ° C) für die nächste halbe Stunde, um eine ausreichende Erholung sicherzustellen.
- Beizumischen das Trinkwasser des Tieres mit 5 mg / ml Metamizol für 72 Stunden postoperativ.
- Prüfen, um die Integrität der Naht eng für mindestens drei Tage nach dem Eingriff.
5. Beobachtungsperiode und Euthanasie
- Messen Sie das Gewicht des Tieres täglich für insgesamt 14 Tage. Ergebnis sie in Bezug auf ihr Wohlbefinden und die Grenzen sind.
- Nach 14 Tagen betäuben das Tier folgende 2.1 und 2.2 des operativen Protokoll ein Schrittend fahren Sie mit Institution Protokoll zur Einschläferung.
- Führen Sie eine mittlere Laparotomie wie in Schritt 3.4 beschrieben. Um den Zugriff auf den Bauch zu erleichtern, erweitern den Einschnitt 1-1,5 cm kaudal. Setzen Sie den Aufroller wie in 3.7 aufgezeigt.
- Sezieren entlang dem Rest des falciform Band und schneiden Sie die untere Hohlvene genauso wie es die Leber kranial austritt.
- Trenne die Leber von der Membran durch die Membran mit der Zange greifen und stumpf Sezieren in den Raum zwischen der Leber und Muskelgewebe.
- Heben Sie die mobilisierte Lebergewebe aus der retroperitoneum und sezieren sie die übrigen Strukturen aus es noch angebracht ist: retroperitonealen Fettgewebe, die untere Hohlvene und die Pfortader.
- Überprüfen Sie die Leber nach der Extraktion für zusätzliche Gewebe, das auf seine tatsächliche Größe und Gewicht falsch beitragen würde. Eine extrahierte Leber und ihrer Tumor sind in Abbildung 6 dargestellt.
- Präparieren Sie den Tumor aus der inferior rechten Lappen.
- Messen Sie die Größe und das Gewicht sowohl des Tumors und Leberparenchym.
- Konservieren zusätzliche Gewebeproben aus dem Peritoneum, Lymphknoten oder anderen Organen wie für Gewebeanalyse benötigten
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Representative Results
In unserem speziellen Experiment, enthalten wir 30 athymischen Nackt-foxn1nu / nu Mäusen. Sie erhielten eine mittlere Laparotomie, Tumorzellinjektionen von 500.000 MC38 Tumorzellen (gelöst in 50 ul Kochsalzlösung), und wurden anschließend entweder mit einer 70% igen Leberresektion, einer 30% igen Leberresektion oder ohne weiteren Eingriff behandelt.
Nach 14 Tagen fast vollständige Regeneration der verbleibenden Leber nach 30% oder 70% Leberresektionen (Leberhypertrophie-Index der Gruppe Leberresektion 30% betrug 1,06 im Vergleich zu 0,8 aus der 70% Gruppe Leberresektion) beobachtet wurde.
Nach einer einzigen Laparotomie betrug das durchschnittliche Gewicht von intrahepatischen Tumoren 332 mg (Bereich: 10-608 mg). Das mittlere Tumorgewicht von intrahepatischen Tumoren war 656 mg (Bereich: 76-1,873 mg) nach einer 30% igen Leberresektion vs. 961 mg (Bereich: 189 mg- 3030 mg) nach einer 70% igen Leberresektion mit p & #60; 0,05 (Abbildung 1). Nach einer 30% igen Leberresektion, war das Tumorvolumen 950 mm 3 (Bereich: 439-2,326 mm 3) gegenüber 1385 mm 3 (Bereich: 411-2,366 mm 3) nach einer 70% igen Leberresektion und 511 mm 3 (Bereich: 87-1,693 mm 3) nach einer Laparotomie allein mit p <0.05 (Abbildung 2).
Gewebeschnitte aus dem Tumorgewebe wurden mittels KI-67 Immunhistochemie entnommen und analysiert. Die Zellen auf den Objektträger wurden in Bezug auf ihre Proliferationsrate bewertet. Die durchschnittliche Proliferationsrate von Tumorzellen aus der Laparotomie-Gruppe betrug 47% (Bereich: 39-56%) im Vergleich zu 61% (Bereich: 51-69%) von Tieren, die eine Leber-Resektion von 70% (p <0,05) unterzogen hatten und 53% (Bereich: 38-69%) von Tieren, die eine Leber - Resektion von 30% (p = 0,22) unterzogen hatten, eine erhöhte Rate der Zellproliferation in Gruppen zeigen , die Leber Resektion (Figuren 3 - 5).
Abb . 1: Gewicht von Intrahepatische Tumoren Das Diagramm vergleicht die durchschnittliche Tumorgewicht zwischen den Gruppen A, B und C nach der Sektion aus der Leber und zeigt erhöhte Gewicht in Tumoren der Gruppe B und C. Die Fehlerbalken SEM dar. Bitte klicken Sie hier anzuschauen größere Version der Figur.
Abbildung 2:. Volumen Intrahepatische Tumoren Das Diagramm vergleicht die durchschnittliche Tumorvolumen zwischen den Gruppen A, B und C nach der Sektion aus der Leber und zeigt erhöhte Mengen in Tumoren der Gruppe B und C. Die Fehlerbalken SEM darstellen. ank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Proliferationsrate in Tumoren , die aus der Gruppe A KI-67 Immunhistochemie einer Folie aus einer Tumorprobe aus der Gruppe A zeigt leichte Proliferation von Tumorzellen. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
4 Abbildung: Proliferationsrate in Tumoren , die aus der Gruppe B. KI-67 Immunhistochemie einer Folie aus einer Tumorprobe aus der Gruppe B zeigt mäßige Proliferation von Tumorzellen. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m.erhalten = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
5 Figur: Proliferationsrate in Tumoren , die aus der Gruppe C KI-67 Immunhistochemie einer Folie aus einer Tumorprobe aus der Gruppe C deutliche Proliferation von Tumorzellen zeigt. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6: Heraus Leber / Tumorprobe aus der Gruppe B wurde Leber 14 Tage extrahiert nach 30% Leberresektion und gleichzeitige Injektion der Tumorzellen durchgeführt wird . Ein großer Tumor im rechten Unterlappen zu sehen, während die rechte überlegen, Median und Lobus caudatus werdens haben durch signifikante Hypertrophie gegangen.
* = Tumor in der unteren rechten Lappen, SRL = superior rechten Lappen, ML = Mittellappen, CL = Lobus caudatus. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 7:. OP - Tisch - Setup Das Polystyrol - Pad wird von einem sterilen Tuch bedeckt. Eine aufgebogene Büroklammer in das Kissen an seinem oberen Ende über dem Atemschlauch mit seinem Mundstück gepresst. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Frühere Experimente an Nagetieren Durchführung von Operationen konnten bestimmte Variablen zu identifizieren, die als Quellen für Bias dienen könnte. Um eine zuverlässige und gültige Ergebnisse zu erhalten, sollten Sie die folgenden Vorsichtsmaßnahmen.
Routine präoperativen Fasten kann zu Leber Steatose 12, führen die Leberregeneration 13,14 hemmen kann. Es wird deshalb nicht empfohlen. Die höchste mitotische Aktivität der Hepatozyten variiert im Laufe des Tages 15. Wenn möglich, führen die Verfahren zu einem bestimmten Zeitpunkt während des Tages für alle Gruppen. Murine Leberregeneration ist am wirkungsvollsten bei Tieren 4-6 Wochen alt. Tiere älter als 10 Monate alt haben eine deutlich Regenerationskapazität 16 verringert. Verwenden Mäuse der gleichen Rasse, Geschlecht und Alter für die Experimente die Möglichkeit der Voreingenommenheit zu minimieren. in einer sterilen Umgebung zu arbeiten, ist in einem offenen Verfahren, wie dies in der Regel wichtig. Vor allem bei immungeschwächten Organismen, wie die athymi c-Mäuse in dem Video, das Risiko einer Infektion verwendet, die zu einem vorzeitigen Tod oder verzerrten Ergebnissen führen können, ist hoch. Verfolgen eine Drei-Zonen-Aufbau einer Zubereitung aus, eine Operation und eine Recovery - Bereich daher 17 gerechtfertigt ist. Aufgrund seiner tiefen hepatotoxische Effekte, wird häufig verwendet , Buprenorphin nicht für intra- oder postoperativen Schmerztherapie 18,19 empfohlen. Verwenden Sie andere Substanzen wie Carprofen oder Metamizol ausreichende Analgesie zu liefern. Da Metamizol in vielen Ländern nicht verfügbar ist, Carprofen auch zur Schmerzkontrolle nach dem Verfahren verwendet werden können. Durchführen einer subkutanen Injektion von 5 mg / kg Körpergewicht einmal täglich für drei Tage Metamizol zu substituieren.
Die postoperative Erholung wird am besten erreicht, wenn die Wiederherstellung der Maus in eine warme Umgebung mit einfachem Zugang zu Nahrung und Wasser gegeben wird. Es ist ideal über Nacht von anderen Mäusen isoliert, dominanter Tiere zu verhindern , dass mehr schutzbedürftigen 17 zu schädigen.
jove_content "> Obwohl das Protokoll sehr einfach ist, gibt es einige kleinere Fehler zu vermeiden, wenn diese Art von Operation in Mäusen durchgeführt wird. Dissection des Ligamentum falciforme, eine Struktur der ventralen Seite des mittleren Lappens mit der Bauchwand verbindet, ist wichtig, erreichen geeignete Leber Flexibilität. Da diese Band zu einem Bereich sehr nahe an dem Punkt erweitert, wo die untere Hohlvene kranial die Leber verlässt, ist Vorsicht gerechtfertigt, um Schäden an diesem großen Vene zu verhindern. im Durchschnitt Sezieren es etwa drei Viertel der Art und Weise zufriedenstellende Mobilisierung gewährleisten und zugleich ausreichend Abstand zum Schiff halten.Mit der richtigen Menge an Spannung, wenn eine Keule mit einer Ligatur Ligatur ist eine enorm wichtige Aufgabe bei der Resektion-Protokoll durchführen. Ligatures mit Luft Knoten oder schlecht angezogen Ligatur kann nicht ausreichend unterbrochen Blutversorgung, Blutungen, Schock und Tod führen. Zur gleichen Zeit wird ein attempt gründlich eine Ligatur Knoten festziehen kann, um das umliegende Gewebe und Organe in Ligatur Bruch mit damit verbundenen Schäden führen. Ein effektiver Weg, Ligatur Integrität der Beurteilung ist die Beobachtung von cyanotic Farbwechsel innerhalb der ligierten Lappen. Die Auswahl des richtigen Nahtmaterial spielt auch eine wichtige Rolle. Geflochtene Nähte sind eher Gewebe zu komprimieren, während monofilen Materialien eher durch das weiche Lebergewebe sezieren werden und verursacht Blutungen.
Ein weiterer wichtiger Schritt bei der Leberlappen bei Mäusen Entfernen beinhaltet die korrekte Positionierung der Ligatur. Ligierung sollte senkrecht Eingabe die Lappen zu den Hauptgefäßen durchgeführt werden. Während dies ziemlich einfach ist in der Mittellappen, eine angemessene Resektion des linken Seitenlappen ist eine größere Herausforderung. Seine Gefäße geben Sie den Lappen in einer ventro-kaudal. Als Ergebnis muss die Ligatur Faden entlang einer gedachten Linie zwischen der linken Longe Basis zur unteren rechten Lappen der l platziert werdenIver.
In dem Mittellappen jedoch beeinträchtigen kann Resektion der Vena cava inferior. Da diese großen Behälter der dorsalen Teil des Lappens durchläuft, ist es anfällig für Schäden, die zu Lebernekrose führen kann. Darüber hinaus die Ligatur mit zu viel Spannung in diesem Bereich zu binden, kann zu einer Membranbruch und / oder Pneumothorax.
Eine angemessene Behandlung von Tumorzellen ist auch wichtig, wenn vergleichbare Ergebnisse zu erzielen versuchen. Obwohl die genauen Zellkulturtechniken nicht Teil dieses Protokolls sein sollen, ist die Behandlung von Tumorzellen im Rahmen des Verfahrens ebenso wichtig wie eine perfekte Vorbereitung voraus. Wenn die Spritze mit den Tumorzellen füllt, ist es wichtig, sie zu jeder Zeit aufrecht zu halten. Haupt Verkippung der Spritze in Tumorzellen führen können, was zum Zeitpunkt der Injektion von Zellen in Verlust daher der Spritzen Wand haften. Nur geringe Verkippung wird zum Zeitpunkt der Einspritzung, um gerechtfertigt, um die Nadel pro einzufügenpendicular an der unteren Fläche des rechten Leberlappens.
Einblutung und Peritonealmetastasen können als Folge von Blutungen und Verschütten von der Einstichstelle auf der Leber Oberfläche auftreten. Daher sanfte Kompression des Lappens mit einem Wattestäbchen für einen Zeitraum von 3 Minuten ist wesentlich von dem Leberparenchym Blutung zu kontrollieren und Tumorzellflüssigkeit austritt in das Peritoneum verhindern.
Veröffentlichungen enthalten, Verfahren Protokolle für intraabdominellen Operationen bei Nagern selten Informationen über die Art der Bauchdeckenverschluss enthalten. Dennoch ist dieser Aspekt eine weitere mögliche Quelle von Komplikationen. Selbst mit einer entsprechenden Schmerzkontrolle, werden versuchen, Tiere, um die Fremdkörper in ihrer Bauchdecke zu entfernen. Die Folgen können intraabdominalen Infektion, eine offene Bauch oder sogar Tod. Dies kann durch die beiden Durchführen einzelne unterbrochene Stiche für den Wundverschluss statt einer fortlaufenden Naht und Schließen der Bauchwand in zwei Schichten verhindert werden.
Weibliche athymische Nackt-foxn1nu / nu-Mäuse (bereitgestellt von Harlan Laboratories BV, Kreuzelweg 53, NL-5961 NM Horst) wurden in diesem Experiment verwendet. Die T-Zell-Mangel diese Rasse für bekannt ist, ermöglicht es relativ unbeschränkten Tumorwachstum und somit ideale Voraussetzungen für die Tumorimplantation. Um den Einfluss von Rangkämpfen unter den Tieren zu minimieren, wurden nur weibliche Tiere verwendet. Vorläufige Ergebnisse verschiedener Stämme wie die C57BL / 6-Inzuchtmäusen verwendet haben auch signifikant gezeigt, noch geringeres Volumen Tumorwachstum. Somit kann die Technik sehr wahrscheinlich in noch Mausstämmen praktikabel kann.
Dennoch erfordert mit geschwächtem Immunsystem Organismen in dieser Einstellung besondere Tierhygienevorkehrungen, als Krankheitserreger mit Tumorwachstum 20 stören können. Maßnahmen wie die Verwendung von Sentineltieren 21 das Vorhandensein von Krankheitserregern zu überwachen , wie in der Tierversuchsanlage unserer Studie durchgeführt , fand nehmen in kann helpfu seinl bei der Aufdeckung von möglichen Fehlerquellen.
Dieses Experiment verwendet, um eine Maus-Linie kolorektalen Krebszelle genannt MC38 (vom Institut für Klinische Chemie an der Medizinischen Fakultät Mannheim erhalten, Deutschland). 5 x 10 5 Tumorzellen wurden in 50 ul Kochsalzlösung gelöst. Die Konzentration wurde in Vorversuchen ermittelt, wobei diese Menge als ideal für feste Tumorbildung innerhalb von zwei Wochen identifiziert wurde. In Abhängigkeit von der Immunkompetenz der in diesen Experimenten verwendeten Tiere (siehe Diskussion oben), kann es sehr gut sein, auch möglich, menschliche kolorektale Krebszellen zu verwenden und somit ein Xenotransplantat erstellen. Erste Tests durchgeführt, in athymischen Nackt-foxn1nu / nu Mäuse menschlichen SW480 Tumorzellen mit Hilfe konnte erfolgreich das Tumorwachstum in den übrigen Leber nach Resektion zeigen. Aufgrund der Dimension der murine Lebern wird nur bis zu Benutzung Mengen empfohlen, 50 ul Komplikationen zu verhindern. Eine mögliche Erweiterung an dieser Stelle würdesein, um Tumorzellen mit Luciferase etikettieren. Je nach Problem, das untersucht wird, kann interessante Informationen entstehen, wenn eine genauere Überwachung des Tumorzellwachstums und Größe möglich ist.
Alternative Formen der Leberlappen Ligieren gehören die Clipping - Verfahren 22 oder eine Clipping-Vernähen Hybridtechnik 23. Positionierung von Geräten Ausschnitt, jedoch können die Beschneidungsverfahren erschweren. Ausreichend durchgeführt Nahtligation bleibt eine einfache Technik zu erlernen und ist sehr wahrscheinlich die kostengünstigste Art und Weise des Entfernens eines Lappens in diesem Experiment.
Da lebende Tiere in diesem Experiment verwendet werden, bedarf es der vorherigen Zustimmung durch die zuständigen Behörden. Je nach Region, kann dies eine kostspielige und zeitraubende Aufgabe sein. Auch nach der offiziellen Zulassung, sind Tierversuche weit weniger zugänglich als Forschungsmethoden wie Zellkulturtests oder molekularen Methoden. Zusätzlich zu der Infrastruktur einesmoderne Tierversuchsanlage, spezielle Ausrüstung hat, um zugeteilt werden, das Protokoll zu führen. Darüber hinaus sollte ein Zeitraum von zwei bis vier Wochen geplant werden, um diese Technik zu meistern. Dieses Protokoll kann für eine Vielzahl von Zelllinien in einer großen Anzahl von Mausstämmen anwendbar. Noch mit Bezug auf die möglichen Modifikationen oben erwähnt, nicht jede Zelllinie kann in jedem Organismus untersucht werden.
Ein Hauptziel von den Untersuchungen unter Verwendung dieses Protokolls wird das komplexe Wachstumsfaktor-System bei der Leberregeneration und ihre genauen Auswirkungen auf die Lebermalignomen Wiederholung beteiligt sein. Um diese möglichen Korrelationen angemessen zu untersuchen, ist es wichtig, ein Tierexperiment im Gegensatz zu verschiedenen molekularen Methoden oder Zellkultur-Experimente zu implementieren. Diese Methoden sollten eher als kostenlose Untersuchungsmittel verwendet werden. Obwohl mehrere verschiedene Leberresektion Modelle bisher 22-24, veröffentlicht worden sind , dieses Verfahrenzum ersten Mal implementiert Injektions gleichzeitige Zelltumor in einem gut etablierten Betrieb.
Dieses Mausmodell zeigen, dass bei Mäusen Leberresektion eine ziemlich einfache, machbar ist und leicht reproduzierbares Verfahren. Die Regeneration der Leber nach kleinen und großen Resektionen konnte die Gewebeverlust durch Hypertrophie innerhalb von zwei Wochen zu kompensieren. Mäuse können mit Lebervolumen Reduzierungen von bis zu 70% fertig.
Die Tumorzellen waren in der Lage innerhalb der Rest der Leber zu wachsen und soliden Tumoren hergestellt werden kann. Tumorwachstum und Tumorzellproliferation mit der Menge des resezierten Lebergewebe korreliert. Der Prozess der Resektion führen zu einer Aktivierung von Tumorwachstum innerhalb der verbleibenden Leber, die durch eine höhere Tumorgewichte und Volumina ausgedrückt wurde. Diese höheren Grad der Proliferation konnte durch Immunhistochemie Untersuchungen nachgewiesen werden.
Es ist gut, daß die Menge der hepatischen Regeneration fac bekannttoren für Leberhypertrophie steigt mit dem Ausmaß der Leberresektion 25,26 freigegeben. Daher kann eine Verbindung zwischen Leberregenerationsfaktoren und Tumorzellwachstum gibt. Dies ist in Übereinstimmung mit klinischen Beobachtungen wo metastatic Rezidiv mit der Menge an Metastasen in der Leber vor der Resektion korreliert. Lebermetastasen, die nur sichtbar auf die präoperative Bildgebung spiegeln die Spitze des Eisbergs, während mehr, noch nicht nachweisbare Tumorzellablagerungen, bei der Diagnose vorhanden sein können. Nach Leberresektion kann Leberregenerationsfaktoren das Wachstum dieser Tumorzellen stimulieren dann, die schließlich als wiederkehrende Metastasen deutlich geworden.
Obwohl die oben erwähnte Korrelation sehr wahrscheinlich ist, hat es sich bisher nicht bewährt. Der Einfluss von Leberregenerationsmechanismen auf intrahepatischen Tumor Fortschritt erfordert daher weitere molekulare Analysen. Eine genaue Anleitung sowie ein anschauliches Video erlauben eine rasche Verabschiedungder Technik in diesem Video eingeführt. Es kann für verschiedene Arten von Studien auf der ganzen Welt als Grundlage dienen, die das fehlende Glied in dieser bekannten Kette von Ereignissen zu entdecken versuchen.
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Acknowledgments
Besondere Anerkennung gehen an Dr. Benjamin Motsch für seine Unterstützung in technischen Fragen. Die Autoren möchten sich auch Dr. Marcus Forschner und Birk Müller für ihre Multimedia-Unterstützung, Erica Magelky für ihre redaktionelle Kompetenz und Lisa Hornung, Dr. Roland Jurgons und Professor Stephan von Hörsten (alle aus dem Franz-Penzoldt-Center, Universität anerkennen Erlangen) für ihre Professionalität in der Tier Handhabung und Pflege. Wir danken Professor Michael Neumaier am Institut für Klinische Chemie, Medizinische Fakultät Mannheim der Universität Heidelberg, Deutschland für MC38 Tumorzellen bereitstellt.
Die vorliegende Arbeit wurde für den Erhalt der Grad in Erfüllung der Anforderungen durchgeführt ", so Dr. med." an der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Operation Microscope | Zeiss | OPMI-1 FC S21 | |
| Induction Cage (Plexiglas Box) | UNO BV, Netherlands | 180000132 | |
| Flowmeter + Connection Kit | UNO BV, Netherlands | 180000008 | |
| UNO Vaporizer Sigma Delta | UNO BV, Netherlands | 180000002 | |
| Key Filler for Anesthetic | UNO BV, Netherlands | 180000010 | |
| Activated Charcoal Filter Adsorber | UNO BV, Netherlands | 180000140 | |
| Gas Exhaust Unit | UNO BV, Netherlands | 180000118 | |
| Face Mask for mouse | UNO BV, Netherlands | 180000065 | |
| Vaporizer Stand | UNO BV, Netherlands | 180000006 | |
| Heat lamp | Physitemp Instruments | HL-1 | |
| Styrofoam Pad | RAYHER | 30074000 | |
| Third Hand Tool | TOOLCRAFT | ZD-10F | |
| Precision Scales | Kern | EW 220-3NM | |
| Scales | Kern | EMB 500-1 | |
| Sliding Caliper | MIB | MIB 82026100 | |
| Microdissection forceps | Braun/Aesculap | BD195R | |
| Microdissection scissors | Braun/Aesculap | FD100R | |
| Microdissection needle holder | Braun/Aesculap | BM563R | |
| Retractor | Fine Science Tools (F.S.T.) | No. 17001-0 | Type: Bowmann |
| Clamp | Braun/Aesculap | BJ002R | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Expendable Items (NOTE: Quantities are per animal and procedure) |
|||
| Foliodrape sterile cover (45 cm x 75 cm) | Hartmann | 2775001 | |
| Sterile Cotton Swabs (2x) | Hartmann | 4700151 | Peha |
| Sterile fluid (0.9% NaCl) | Braun | 3570310 | PZN=04454809 |
| Disinfectant (Softasept - 250 ml) | Braun | 3887138 | PZN=0762008808505018 |
| 2 x 1 ml syringe (Injekt-F ) | Braun | 9166017V | |
| 26 G canula (Sterican) - for Carprofen injection | Braun | 4665457 | |
| 30 G canula (Sterican) - for Tumor injection | Braun | 4656300 | |
| Caprofen (=Rimadyl) | Pfizer | QM01AE91 | |
| Metamizole (= Novaminsulfon) | Ratiopharm | 16543.00.00 | |
| 4-0 Vicryl suture | Ethicon | J835G | |
| 5-0 Prolene suture | Ethicon | 8618G | |
| SafeLock Flex-Tube 1.5 ml | Eppendorf | 22363778 | |
| 4 x 4 Gauze Sponge | Kendall/Covidien | UPC: 728795135355 | ASIN: B005BFQTWM |
| Large paperclip | ACCO | A7072510G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| Female athymic nude-foxn1nu/nu | Harlan Laboratories B.V. | Code 069 |
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