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Medicine

Intrahepatic ट्यूमर के विकास पर जिगर की लकीर का प्रभाव

Published: April 9, 2016 doi: 10.3791/53946

Abstract

मेटास्टेटिक जिगर घावों की लकीर के बाद ट्यूमर पुनरावृत्ति के उच्च घटना एक अनसुलझी समस्या बनी हुई है। छोटे ट्यूमर सेल जमा है, जो नियमित नैदानिक ​​इमेजिंग द्वारा detectable नहीं कर रहे हैं, जिगर लकीर के बाद यकृत उत्थान कारकों से प्रेरित किया जा सकता है। यह पूरी तरह से स्पष्ट नहीं है, तथापि, जो कारकों ट्यूमर पुनरावृत्ति के लिए महत्वपूर्ण हैं।

प्रस्तुत माउस मॉडल तंत्र है कि जिगर लकीर के बाद आवर्तक घातक घावों के विकास में एक भूमिका निभा का पता लगाने के लिए उपयोगी हो सकता है। मॉडल चूहों में जिगर ऊतक को हटाने और ट्यूमर प्रेरण (इंजेक्शन) के द्वारा परिभाषित मात्रा में आसान करने के लिए प्रदर्शन और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तकनीकों को जोड़ती है। जानवरों या तो एक भी laparotomy, एक 30% जिगर लकीर, या एक 70% जिगर लकीर के साथ इलाज किया गया। सभी जानवरों को बाद में शेष जिगर ऊतक में एक ट्यूमर सेल इंजेक्शन प्राप्त किया। अवलोकन के दो सप्ताह के बाद, यकृत और ट्यूमर के आकार और वजन और लिए मूल्यांकन किया गयाimmunohistochemistry द्वारा जांच की।

एक 70% जिगर लकीर के बाद, ट्यूमर की मात्रा और वजन काफी अकेला एक laparotomy (पी <0.05) की तुलना में बढ़ रहे थे। इसके अलावा, immunohistochemistry (Ki67) लकीर समूह में एक वृद्धि ट्यूमर प्रसार दर (पी <0.05) से पता चला।

इन निष्कर्षों intrahepatic ट्यूमर के विकास पर यकृत उत्थान तंत्र के प्रभाव प्रदर्शित करता है। ऊतकीय workup या आरएनए विश्लेषण जैसे तरीकों के साथ संयुक्त, वर्णित माउस मॉडल अलग ट्यूमर के विकास और जिगर के भीतर मेटास्टेटिक रोग की पुनरावृत्ति में शामिल घटकों के एक करीबी परीक्षा के लिए नींव के रूप में सेवा कर सकता है। पश्चात अवलोकन की लंबाई की तरह चर की एक काफी संख्या, सेल इंजेक्शन या इंजेक्शन और जिगर लकीर के समय के लिए इस्तेमाल लाइन जब पोस्ट-hepatectomy मेटास्टेसिस के संदर्भ में एक विशिष्ट प्रश्न की खोज कई कोण प्रदान करते हैं। इस प्रक्रिया की सीमाओं Au हैंthorization एक उपयुक्त पशु परीक्षण की सुविधा और कुछ उपकरणों के अधिग्रहण के लिए जानवरों पर प्रक्रिया, का उपयोग करने के लिए।

Introduction

कोलोरेक्टल कैंसर (सीआरसी) सभी घातक ट्यूमर के लगभग 9% के लिए खातों। यह दोनों अमेरिका में और दुनिया भर में तीसरे सबसे आम कैंसर है। 300,000 से सीआरसी सीमा से वैश्विक मृत्यु दर प्रति वर्ष 1 500,000 से अधिक करने के लिए। रोगियों के बीस प्रतिशत अपने कोलोरेक्टल ट्यूमर की खोज पर यकृत मेटास्टेसिस से पीड़ित हैं। जाने वाली बीमारी मेटास्टेसिस सामान्य रूप से एक आंशिक जिगर लकीर 2,3 द्वारा इलाज कर रहे हैं। सुधार शल्य चिकित्सा तकनीक, नए बहुविध रणनीतियों और जाने वाली बीमारी मेटास्टेसिस की नई परिभाषा एक आंशिक जिगर रोगियों 4 की बढ़ती संख्या के लिए संभव लकीर के चिकित्सा प्रस्तुत करना।

माध्यमिक यकृत कैंसर की पुनरावृत्ति, लेकिन, आधुनिक जठरांत्र सर्जरी में एक चुनौतीपूर्ण नैदानिक ​​sequalae है। जो जिगर metastases की लकीर कराना पड़ा सीआरसी के साथ मरीजों को अपने बचे हुए जिगर 5 में एक नया ट्यूमर विकसित होने का 30 से 50% मौका है। इसलिए, वहाँ पर आगे अनुसंधान के लिए एक की जरूरत हैजिगर metastases की पुनरावृत्ति में शामिल तंत्र।

के बारे में 70% की एक लकीर जिगर सामान्य रूप से शेष यकृत ऊतक द्वारा एक कुछ हफ्तों के भीतर मुआवजा दिया है। इस उत्थान इंटरल्युकिन 6 (आईएल -6), ट्यूमर परिगलन कारक अल्फा (TNF-α), hepatocyte वृद्धि कारक (HGF) की तरह साइटोकिन्स सहित कई तंत्र, बदलने वृद्धि कारक बीटा (TGF-β), संवहनी endothelial वृद्धि कारक शामिल है (वीईजीएफ़ ), मैट्रिक्स metalloproteases (एमएमपी 2 और एमएमपी 9) और CXC-Chemokines 6-11। इन पदार्थों यकृत उत्थान का समर्थन और भी शेष जिगर जो नियमित नैदानिक ​​इमेजिंग से नहीं पाया जाता है में छोटे ट्यूमर सेल जमा की वृद्धि उत्प्रेरण द्वारा प्राथमिक और माध्यमिक यकृत कैंसर के उच्च पुनरावृत्ति दर के लिए जिम्मेदार हो सकता है। इस करणीय अब तक साबित नहीं किया गया है।

निम्नलिखित परिकल्पना स्थापित किया गया था। आंशिक जिगर लकीर के बाद, प्रसार कारक है कि लाइव के लिए जिम्मेदार हैंआर अतिवृद्धि भी जिगर में पहले अनदेखा ट्यूमर कोशिकाओं के विकास को प्रेरित कर सकते हैं। एक माउस मॉडल डिजाइन किया गया था जो जिगर लकीर और ट्यूमर प्रेरण की तकनीक संयुक्त। तीस athymic नग्न-foxn1nu / परमाणु चूहों दस जानवरों प्रत्येक के तीन समूहों में विभाजित किया गया। उनमें से प्रत्येक या तो एक अकेले laparotomy (ग्रुप ए) के साथ इलाज किया गया था, एक 30% जिगर लकीर (ग्रुप बी) या एक 70% जिगर लकीर (ग्रुप सी)। सभी समूहों में पशु बाद में जिगर का एक निर्धारित शेष भाग में एक ट्यूमर सेल इंजेक्शन प्राप्त किया, निष्क्रिय ट्यूमर कोशिकाओं अनुकरण। पशु जहां दो सप्ताह के लिए मनाया और फिर ट्यूमर के विकास और जिगर अतिवृद्धि के लिए मूल्यांकन किया है।

उद्देश्य के लिए एक मॉडल है कि आणविक और विकारी कारक है कि पोस्ट-hepatectomy ट्यूमर गठन में एक भूमिका निभा सकते हैं के लिए खोज करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता बनाने के लिए किया गया था। इस विधि का आकलन करने में सहायक हो सकता है: जिगर उत्थान में शामिल अंत: स्रावी कारकों की उत्पत्ति; intrahepatic Tum के लिए जिम्मेदार तंत्रया जिगर लकीर के बाद विकास; और जिगर की लकीर मात्रा intrahepatic ट्यूमर के विकास को शामिल करने के लिए आवश्यक है। निम्न विधि केवल जानवरों पर प्रदर्शन किया गया है, क्योंकि वे मौलिक जैविक सिद्धांतों की समझ और ज्ञान का विकास है कि बेहतर इलाज के विकल्प द्वारा मनुष्य को लाभ की उम्मीद की जा सकती है करने के लिए योगदान करने के लिए वादा करता हूँ। इन मामलों में शामिल तंत्र के कारण, यह, विवो में जांच की जा करने के लिए इन विट्रो तरीकों मानव विकृति के लिए एक वास्तविक प्रतिनिधित्व प्रदान नहीं कर सकते हैं के रूप में था।

ये जांच ट्यूमर पुनरावृत्ति को कम करने के लिए रोगनिरोधी उपचार के विकल्प के लिए प्रासंगिक लक्ष्यों की खोज करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं।

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Protocol

बावरिया, जर्मनी में मध्य Franconia सरकार वर्णित प्रक्रियाओं के लिए अनुमति दे दी। किसी भी इसी तरह के प्रयोगों उपयुक्त प्राधिकारियों द्वारा पूर्व प्राधिकरण की आवश्यकता है।

नोट: निम्न मैनुअल सी कदम तदनुसार चिह्नित कर रहे हैं समूहों ए और बी में बाहर छोड़ा जा सकता है के माध्यम से पहले से चर्चा समूहों ए के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

1. तैयारी

  1. दस्ताने पर रखो, माइक्रोस्कोप के नीचे polystyrene पैड जगह है, और थोड़ा पैड ऊपर क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित लेंस।
  2. polystyrene पैड पर बाँझ चादर और जगह आधा और दूसरे आधे सिर्फ यह करने के लिए अगले विभाजित।
  3. शल्य चिकित्सा उपकरणों जीवाणुरहित और एक बाँझ चादर Polystyrene पैड करने के लिए अगले पर उन्हें जगह है।
  4. एक कट्टर फार्म के लिए एक बड़ी पेपर क्लिप विश्राम लेना। यह उल्टा मुड़ें और शीर्ष के अंत में polystyrene पैड में इसे प्रेस - बस, जहां पशु के सिर झूठ होगा करने के लिए अगले।
  5. vaporizer का मुखपत्र दो अंग के बीच की जगहमेहराब के एस। (चित्रा 7)
  6. जगह है जहां पशु के सिर झूठ होगा से 40 सेमी के बारे में एक हीटिंग दीपक सेट करें। polystyrene पैड का स्तर 40 डिग्री सेल्सियस से अधिक नहीं है पर यकीन है कि गर्मी बनाओ।
  7. संचालित जानवरों के लिए एक अलग पिंजरे तैयार करें।
  8. एक फ्लेक्स ट्यूब में एक निर्धारित मात्रा और मात्रा ट्यूमर कोशिकाओं के (50 μl की अधिकतम) तैयार है और बर्फ पर दुकान।

2. संज्ञाहरण

  1. माउस एक Plexiglas बॉक्स में रखें और (10 एल / मिनट की एक प्रवाह पर 5% isoflurane) उच्च प्रवाह isoflurane पर संवेदनाहारी प्रेरण शुरू करते हैं।
  2. संज्ञाहरण के विभिन्न चरणों के माध्यम से जाने के बाद, बस के बाद यह अंतकाल में साँस लेने का मंच है, जो आसानी से सांस की दर (<20 / मिनट) और गहरी हाँफना झटकों में भारी कमी से पहचाना जा सकता है में प्रवेश किया है Plexiglas बॉक्स के माउस को हटा दें जानवर के पूरे शरीर।
  3. जल्दी से बाँझ कपड़ा कवर polystyrene पैड पर जानवर के पेट के ऊपर डाल दिया है और जारी रखने के लिएमुखपत्र में माउस के थूथन डालने संज्ञाहरण बनाए रखने के द्वारा कम प्रवाह isoflurane पर वेंटिलेशन। के बारे में 1 एल / मिनट की एक प्रवाह में 1.8-2.2% की सांस खींचने का अंश का उपयोग करें।
  4. सांस की आवृत्ति है, जो प्रति मिनट 45 और 60 के बीच साँस आदर्श है की गणना के द्वारा आपरेशन के दौरान संज्ञाहरण की गहराई का मूल्यांकन। श्वसन isoflurane अंश तदनुसार अनुकूलन अगर यह मामला नहीं है।
    नोट: श्वसन isoflurane अंश में परिवर्तन के बारे में 60 सेकंड ले जब तक वे प्रभावी हो जाते हैं। तेजी से कठोर परिवर्तन से बाहर ले जाने से बचें। इसके बजाय, एनेस्थेटिक के आवेदन धीरे-धीरे संशोधित।

3. ऑपरेशन

  1. छाती और एक पर्याप्त कीटाणुनाशक के साथ पेट कीटाणुरहित और दस्ताने बाद में बदल जाते हैं।
  2. पशु की जांघ में Carprofen के एक वजन अनुकूलित मात्रा (5 मिलीग्राम / किग्रा वजन) इंजेक्षन।
  3. धीरे यदि संज्ञाहरण की गहराई पर्याप्त है परीक्षण करने के लिए एक संदंश के साथ पेट की त्वचा चुटकी।
  4. ध्यान से आसपास के ऊतकों से यह बेनकाब करने के लिए जिफाएडा के आसपास के क्षेत्र काटना।
  5. जिफाएडा (अंदर से बाहर करने) के माध्यम से एक रहने के सिवनी रखें और ऊपर जानवरों दबाना का उपयोग सिर अनुचर के लिए दोनों धागे देते हैं।
  6. प्रतिकर्षक के अंग एक साथ चुटकी और धीरे-धीरे 'यू' आकार का प्रतिकर्षक जानवर के आंतरिक पेट की दीवार के साथ सुझावों का परिचय।
    नोट: इन उपायों जिगर का पर्दाफाश अलग पालियों के लिए उपयोग की सुविधा के लिए। जिगर के मंझला और बाएं पार्श्व पालि की पहचान अब संभव होना चाहिए।
  7. एक खारा लथपथ कपास झाड़ू का प्रयोग करें और धीरे नीचे की ओर मंझला पालि धक्का। दात्राकार बंधन के उदर तीन तिमाहियों, जो अब मंझला पालि की सतह और डायाफ्राम के बीच दिखाई जाएगी काटना।
  8. अब, मंझला शिफ्ट करने दो खारा लथपथ कपास swabs का उपयोगपालि और ऊपर की तरफ डायाफ्राम के खिलाफ पार्श्व पालि छोड़ दिया है।
  9. बाएं पार्श्व पालि और पूंछवाला लोब के बीच पतली झिल्ली कल्पना और ध्यान से इसे काटना।
    नोट: जब समूह एक से जानवरों पर इस प्रोटोकॉल प्रदर्शन, इस बिंदु पर 3.18 कदम करने के लिए कूद।
  10. एक आकार 4-0 संयुक्ताक्षर तिरछे बाएं पार्श्व पालि के आधार के साथ रखें।
  11. अगले, कपास झाड़ू का उपयोग अपनी मूल स्थिति में बाएं पार्श्व पालि लौटने के लिए।
  12. ध्यान से संभव के रूप में पालि के आधार करने के लिए करीब के रूप में संयुक्ताक्षर टाई और पालि में रंग बदलने के लिए पर्याप्त रूप से आकलन बाधित रक्त की आपूर्ति के लिए परीक्षण करने के लिए।
  13. पालि के आधार की लाइन का पालन करते हुए बाएं पार्श्व पालि बांटना और resected पालि के वजन पर ध्यान दें।
    नोट: जब ग्रुप बी से जानवरों पर इस प्रोटोकॉल प्रदर्शन, इस बिंदु पर 3.18 कदम करने के लिए कूद।
  14. बाएं पार्श्व पालि के स्टंप और मंझला पालि के आधार के बीच एक दूसरे संयुक्ताक्षर रखें।
  15. w के रूप में मंझला पालि का स्थान बदलेंपक्ष और संयुक्ताक्षर टाई। फिर, पालि में रंग बदलने के लिए पर्याप्त रूप से आकलन बाधित रक्त की आपूर्ति के लिए परीक्षण करने के लिए।
  16. मंझला पालि बांटना और अपने वजन पर ध्यान दें।
  17. 30 जी सुई के लिए 1 मिलीलीटर सिरिंज कनेक्ट और किसी भी समय सिरिंज झुकने के बिना फ्लेक्स ट्यूब से ट्यूमर कोशिकाओं के साथ भरें।
  18. आदेश अवर सही पालि को बेनकाब करने में जानवर के बाईं ओर आंतों छोरों स्थानांतरित करने के लिए कपास swabs का प्रयोग करें।
  19. खड़ी करने के लिए एक 30 डिग्री के कोण पर 'तीसरे हाथ' डिवाइस में सेल से भरी हुई सिरिंज डालें।
  20. ध्यान से सिर्फ अवर सही पालि ऊपर सुई के साथ माउस के बगल में डिवाइस चाल है।
  21. धीरे धीरे तीसरे हाथ डिवाइस के भीतर सिरिंज अग्रिम जब तक सुई की नोक अवर सही पालि के मध्य भाग में है।
  22. 30-45 सेकंड की अवधि में पालि के मध्य भाग में पूरी मात्रा इंजेक्षन।
  23. कम से कम तीन मिनट के लिए इंजेक्शन साइट सेक जब तक खून बह रहा बंद कर दिया है। रहने के सिवनी और प्रतिकर्षक निकालें।
  24. एक resorbable 5-0 एकल बटन समुद्री मील का उपयोग कर सीवन के साथ प्रावरणी बंद करें।
  25. 4-0, गैर resorbable सीवन एक बटन समुद्री मील का उपयोग कर के साथ त्वचा को बंद करें।
  26. के बारे में 1 मिनट के लिए उच्च प्रवाह ऑक्सीजन पर माउस ventilating शुरू करो।

4. बाद सेशन प्रक्रिया

  1. पशु अगले आधे घंटे के लिए एक गर्म वातावरण (लगभग 40 डिग्री सेल्सियस) में रखें पर्याप्त वसूली सुनिश्चित करने के लिए।
  2. 5 मिलीग्राम / 72 घंटा पश्चात के लिए metamizole मिलीलीटर के साथ पशु के पीने के पानी मिश्रण करना।
  3. प्रक्रिया के बाद कम से कम तीन दिनों के लिए बारीकी से टांके की अखंडता की जांच करना।

5. प्रेक्षण अवधि और इच्छामृत्यु

  1. 14 दिनों की कुल के लिए दैनिक जानवर के वजन को मापने। उन्हें अपने क्रमश भलाई और सीमाओं के बारे में स्कोर।
  2. 14 दिनों के बाद, anesthetize पशु निम्नलिखित कदम 2.1 और ऑपरेटिव प्रोटोकॉल एक 2.2एन डी पशु इच्छामृत्यु के लिए संस्था के प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ें।
  3. के रूप में 3.4 कदम में समझाया एक मंझला laparotomy प्रदर्शन करना। पेट के लिए उपयोग की सुविधा के लिए, चीरा 1-1.5 सेमी दुमदारी का विस्तार। के रूप में 3.7 में बताया प्रतिकर्षक डालें।
  4. दात्राकार बंधन के बाकी के साथ काटना और अवर रग Cava बस के रूप में यह जिगर cranially बाहर निकालता काटा।
  5. जिगर अलग डायाफ्राम से, संदंश के साथ डायाफ्राम हथियाने और दो टूक जिगर और मांसपेशियों के ऊतकों के बीच अंतरिक्ष में विदारक द्वारा।
  6. retroperitoneum बंद जुटाए जिगर ऊतक लिफ्ट और इसे बंद काटना शेष संरचनाओं यह अभी से जुड़ा हुआ है: retroperitoneal वसायुक्त ऊतक, अवर रग Cava और पोर्टल नस।
  7. किसी भी अतिरिक्त ऊतक, जो झूठा अपने वास्तविक आकार और वजन में योगदान होगा के लिए निकासी के बाद जिगर का निरीक्षण किया। एक निकाले जिगर और उसके ट्यूमर चित्रा 6 में प्रदर्शित कर रहे हैं।
  8. inf बंद ट्यूमर काटनासही पालि erior।
  9. आकार और दोनों ट्यूमर और जिगर पैरेन्काइमा के वजन को मापने।
  10. पेरिटोनियम से अतिरिक्त ऊतक के नमूने, लिम्फ नोड्स या अन्य अंगों के संरक्षण के रूप में ऊतक विश्लेषण के लिए आवश्यक

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Representative Results

हमारे विशिष्ट प्रयोग में, हम 30 athymic नग्न-foxn1nu / परमाणु चूहों शामिल थे। वे एक मंझला laparotomy, 500,000 MC38 ट्यूमर कोशिकाओं (खारा के 50 μl में भंग) के ट्यूमर सेल इंजेक्शन प्राप्त किया, और बाद में या तो एक 70% जिगर लकीर, एक 30% जिगर लकीर, या आगे कोई हस्तक्षेप के साथ इलाज किया गया।

14 दिनों के बाद, शेष जिगर के लगभग पूर्ण उत्थान 30% या 70% जिगर resections निम्नलिखित (जिगर 30% जिगर लकीर समूह की अतिवृद्धि सूचकांक 1.06 बनाम 0.8 70% जिगर लकीर समूह से था) मनाया गया।

एक भी laparotomy के बाद, intrahepatic ट्यूमर का औसत वजन 332 मिलीग्राम (: 10-608 मिलीग्राम रेंज) था। पी & # के साथ एक 70% जिगर लकीर के बाद: (189 mg- 3030 मिलीग्राम रेंज) एक 30% जिगर लकीर बनाम 961 मिलीग्राम के बाद: (76-1,873 मिलीग्राम रेंज) intrahepatic ट्यूमर का मतलब ट्यूमर वजन 656 मिलीग्राम था60; 0.05 (चित्रा 1)। बनाम 1,385 मिमी 3 (रेंज: 411-2,366 3 मिमी): एक 30% जिगर लकीर के बाद, ट्यूमर मात्रा 950 मिमी 3 (439-2,326 मिमी 3 रेंज) था एक 70% जिगर लकीर के बाद, और 511 मिमी 3 (रेंज: 87-1,693 3 मिमी) पी <0.05 (चित्रा 2) के साथ अकेले एक laparotomy के बाद।

ट्यूमर के ऊतक से ऊतक वर्गों लिया और केआई 67 immunohistochemistry के माध्यम से विश्लेषण किया गया। स्लाइड पर कोशिकाओं उनके प्रसार दर के बारे में मूल्यांकन किया गया। 61% (रेंज: 51-69%) की तुलना में: laparotomy समूह से ट्यूमर कोशिकाओं के प्रसार औसत दर था 47% (39-56% रेंज) जानवरों से है कि 70% की एक लकीर जिगर (पी <0.05) आया था और 53% (रेंज: 38-69%) जानवरों से कि 30% (पी = 0.22) के एक जिगर लकीर, समूहों है कि जिगर लकीर कराना पड़ा में सेल प्रसार की वृद्धि दर का प्रदर्शन आया था (आंकड़े 3 - 5)।

आकृति 1
चित्रा 1:। Intrahepatic ट्यूमर का वजन आरेख जिगर से विच्छेदन के बाद समूह ए, बी और सी के बीच औसत ट्यूमर वजन तुलना और शो के समूह बी और सी त्रुटि सलाखों के ट्यूमर में वजन बढ़ प्रतिनिधित्व SEM। एक देखने के लिए यहाँ क्लिक करें यह आंकड़ा का बड़ा संस्करण।

चित्र 2
चित्रा 2:। Intrahepatic ट्यूमर की मात्रा आरेख जिगर से विच्छेदन के बाद समूह ए, बी और सी के बीच औसत ट्यूमर मात्रा तुलना और शो के समूह बी और सी त्रुटि सलाखों के ट्यूमर में वृद्धि की मात्रा में प्रतिनिधित्व SEM। ANK "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: ग्रुप ए KI-67 समूह एक से एक ट्यूमर नमूना से एक स्लाइड के Immunohistochemistry से ट्यूमर में प्रसार की दर ट्यूमर कोशिकाओं के हल्के प्रसार को दर्शाता है। स्केल बार = 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: ग्रुप बी KI-67 ग्रुप बी से एक ट्यूमर नमूना से एक स्लाइड के Immunohistochemistry से ट्यूमर में प्रसार की दर ट्यूमर कोशिकाओं के उदारवादी प्रसार को दर्शाता है। स्केल बार = 100 माइक्रोन।मिल = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: ग्रुप सी KI-67 ग्रुप सी से एक ट्यूमर नमूना से एक स्लाइड के Immunohistochemistry से ट्यूमर में प्रसार की दर ट्यूमर कोशिकाओं के रूप में चिह्नित प्रसार को दर्शाता है। स्केल बार = 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6: निकाले ग्रुप बी से जिगर / ट्यूमर नमूना यह जिगर एक 30% जिगर लकीर और एक साथ ट्यूमर सेल इंजेक्शन के प्रदर्शन के बाद 14 दिनों निकाला गया था। सही अवर लोब में एक बड़े ट्यूमर देखा जा सकता है, जबकि सही बेहतर, मंझला और पूंछवाला लोबएस महत्वपूर्ण अतिवृद्धि के माध्यम से चले गए हैं।
* = अवर सही पालि में ट्यूमर, SRL = बेहतर सही पालि, एमएल = मंझला पालि, सीएल = पूंछवाला लोब। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7
चित्रा 7:। या तालिका सेटअप polystyrene पैड एक बाँझ कपड़े से कवर किया जाता है। एक तुला खुला पेपर क्लिप इसके ऊपरी छोर अपने मुखपत्र के साथ श्वास नली overlying पर पैड में दबाया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

पिछले प्रयोगों कृन्तकों में सर्जरी प्रदर्शन कुछ चर कि पूर्वाग्रह के लिए स्रोत के रूप में सेवा कर सकता है की पहचान करने में सक्षम है। आदेश विश्वसनीय और वैध परिणाम प्राप्त करने के लिए, निम्न सावधानियों पर विचार करें।

नियमित पूर्व सेशन उपवास जिगर स्टीटोसिस 12 है, जो जिगर उत्थान 13,14 को बाधित कर सकते करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। इसलिए यह सिफारिश नहीं है। Hepatocytes के उच्चतम mitotic गतिविधि दिन 15 भर में बदलता है। यदि संभव हो तो, सभी समूहों के लिए दिन के दौरान एक निश्चित समय पर प्रक्रियाओं का संचालन। Murine जिगर उत्थान जानवरों 4-6 सप्ताह वर्ष में सबसे अधिक प्रभावी है। पशु उम्र के 10 महीने से अधिक पुराने एक काफी उत्थान क्षमता 16 कमी आई है। पूर्वाग्रह की संभावना को कम करने के प्रयोगों के लिए एक ही जाति, लिंग और उम्र के चूहों का प्रयोग करें। एक बाँझ वातावरण में काम कर रहे इस तरह एक खुली प्रक्रिया में आम तौर पर महत्वपूर्ण है। विशेष रूप से immunocompromised जीवों, athymi की तरह में ग चूहों वीडियो, संक्रमण का खतरा में प्रयोग किया जाता है, जो अकाल मृत्यु या पक्षपातपूर्ण परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, अधिक है। एक तैयारी, एक सर्जरी और एक वसूली क्षेत्र इसलिए 17 warranted है से मिलकर एक तीन जोन सेटअप का पीछा। अपनी गहन यकृतविषकारी प्रभाव के कारण, आमतौर पर इस्तेमाल किया buprenorphine अंतर या पश्चात एनाल्जेसिक चिकित्सा 18,19 के लिए अनुशंसित नहीं है। Carprofen या metamizole जैसे अन्य पदार्थों का उपयोग पर्याप्त analgesia प्रदान करने के लिए। चूंकि metamizole कई देशों में उपलब्ध नहीं है, Carprofen भी प्रक्रिया के बाद दर्द नियंत्रण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। तीन दिन metamizole स्थानापन्न करने के लिए एक बार दैनिक 5mg / किलो वजन का एक चमड़े के नीचे इंजेक्शन प्रदर्शन करना।

जब उबरने माउस भोजन और पानी के लिए आसान पहुँच के साथ एक गर्म वातावरण में रखा गया है पश्चात की वसूली के लिए सबसे अच्छा हासिल की है। यह आदर्श अन्य चूहों रात भर से अलग है, और अधिक कमजोर लोगों को 17 चोट से और अधिक प्रभावी जानवरों को रोकने के लिए।

jove_content "> हालांकि प्रोटोकॉल बहुत सीधा है, वहाँ कुछ मामूली नुकसान जब चूहों में शल्य चिकित्सा के इस तरह के प्रदर्शन से बचने के लिए कर रहे हैं। दात्राकार बंधन के विच्छेदन, एक संरचना पेट की दीवार को मंझला पालि के उदर पहलू जोड़ने, के लिए आवश्यक है , उचित जिगर लचीलापन हासिल करते हैं। इस बंधन एक क्षेत्र बहुत बिंदु है जहां अवर रग Cava जिगर cranially, सावधानी आदेश इस प्रमुख नस को होने वाले नुकसान को रोकने के लिए warranted है पत्ते को बंद करने के लिए फैलता है। औसत पर इसके बारे में के बारे में तीन तिमाहियों विदारक जिस तरह से संतोषजनक लामबंदी को सुनिश्चित करेगा और एक ही समय में पोत के लिए पर्याप्त दूरी बनाए रखें।

जब लकीर प्रोटोकॉल प्रदर्शन जब एक संयुक्ताक्षर के साथ एक पालि ligating तनाव की सही राशि का उपयोग एक काफी महत्वपूर्ण कार्य है। हवा समुद्री मील या खराब कड़ा संयुक्ताक्षर साथ संयुक्ताक्षर अपर्याप्त बाधित रक्त की आपूर्ति, नकसीर, सदमा और मौत का कारण हो सकते हैं। इसी समय, एक attemपीटी अच्छी तरह से एक संयुक्ताक्षर गाँठ कसने के लिए ऊतकों और अंगों के आसपास से जुड़े हुए नुकसान के साथ संयुक्ताक्षर टूटना में परिणाम हो सकता है। संयुक्ताक्षर अखंडता का आकलन करने का एक प्रभावी तरीका ligated पालि भीतर cyanotic रंग बदलने का अवलोकन है। सही सीवन सामग्री का चयन भी एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। लट टांके अधिक ऊतक सेक करने के लिए है, जबकि monofilamentous सामग्री बल्कि मुलायम जिगर ऊतक के माध्यम से काटना और रक्तस्राव का कारण बनता जाएगा संभावना है।

एक और महत्वपूर्ण कदम जब चूहों में जिगर पालियों हटाने संयुक्ताक्षर की सही स्थिति शामिल है। बंधाव मुख्य वाहिकाओं पालियों में प्रवेश करने के लिए खड़ा प्रदर्शन किया जाना चाहिए। जबकि इस बल्कि मंझला पालि में सीधा है, बाएं पार्श्व पालि की पर्याप्त लकीर अधिक चुनौतीपूर्ण है। अपने जहाजों एक ventro दुम दिशा में पालि दर्ज करें। नतीजतन, संयुक्ताक्षर धागा एल के अवर सही पालि के लिए छोड़ दिया झपट्टा आधार के बीच एक काल्पनिक रेखा के साथ रखा जाना चाहिएiver।

मंझला पालि में, हालांकि, लकीर अवर रग Cava समझौता हो सकता है। क्योंकि इस प्रमुख पोत पालि के पृष्ठीय भाग के माध्यम से चलाता है, यह क्षति है, जो जिगर नेक्रोसिस को जन्म दे सकती होने का खतरा है। इसके अलावा, इस क्षेत्र में बहुत अधिक तनाव के साथ संयुक्ताक्षर बांधने, डायाफ्राम टूटना और / या वातिलवक्ष में हो सकता है।

ट्यूमर कोशिकाओं की पर्याप्त हैंडलिंग भी महत्वपूर्ण है जब तुलनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए कोशिश कर रहा है। हालांकि सटीक सेल संस्कृति तकनीक इस प्रोटोकॉल का हिस्सा बनने के लिए नहीं बने हैं, प्रक्रिया के भीतर ट्यूमर कोशिकाओं की हैंडलिंग सही तैयारी पहले से रूप में महत्वपूर्ण है। जब ट्यूमर कोशिकाओं के साथ सिरिंज भरने, यह सब समय पर यह सीधा रखने के लिए महत्वपूर्ण है। सिरिंज के प्रमुख झुकने सीरिंज दीवार का पालन करने ट्यूमर कोशिकाओं में हो सकता है, इसलिए इंजेक्शन के समय पर कोशिकाओं के नुकसान में जिसके परिणामस्वरूप। केवल मामूली झुकाव आदेश के अनुसार सुई डालने के लिए इंजेक्शन के समय पर warranted है,अवर सही पालि की सतह के pendicular।

नकसीर और पेरिटोनियल मेटास्टेसिस खून बह रहा है और जिगर की सतह पर पंचर साइट से बहाव का एक परिणाम के रूप में हो सकता है। इसलिए, तीन मिनट की अवधि के लिए एक कपास झाड़ू से पालि की कोमल संपीड़न जिगर पैरेन्काइमा से खून बह रहा नियंत्रित करने और ट्यूमर कोशिका द्रव पेरिटोनियम में लीक को रोकने के लिए आवश्यक है।

मूषक में intraabdominal संचालन के लिए प्रक्रिया प्रोटोकॉल युक्त प्रकाशन शायद ही कभी पेट में बंद होने के प्रकार के बारे में जानकारी होती है। फिर भी, इस पहलू जटिलताओं का एक अन्य संभावित स्रोत है। यहाँ तक कि पर्याप्त दर्द नियंत्रण के साथ, जानवरों को उनके पेट की दीवार में विदेशी निकायों को दूर करने की कोशिश करेंगे। परिणाम intraabdominal संक्रमण, एक खुला पेट या मौत भी हो सकती है। यह घाव बंद के बजाय एक चल सीवन और दो परतों में पेट की दीवार को बंद करने के लिए दोनों के प्रदर्शन के एकल बाधित टांके से रोका जा सकता है।

महिला athymic नग्न-foxn1nu / परमाणु चूहों (Harlan प्रयोगशालाओं बी.वी., Kreuzelweg 53, नाथन-5961 समुद्री मील दूर होर्स्ट द्वारा प्रदान की) इस प्रयोग में इस्तेमाल किया गया। टी सेल की कमी इस नस्ल के लिए जाना जाता है अपेक्षाकृत अप्रतिबंधित ट्यूमर के विकास और ट्यूमर आरोपण के लिए इसलिए आदर्श स्थितियों की अनुमति देता है। आदेश में जानवरों के बीच रैंकिंग झगड़े के प्रभाव को कम करने के लिए, केवल मादा पशुओं इस्तेमाल किया गया। C57BL / 6 जन्मजात चूहों की तरह विभिन्न प्रकारों का उपयोग करते हुए प्रारंभिक परिणाम भी महत्वपूर्ण दिखाया गया है, अभी तक कम मात्रा ट्यूमर के विकास। इस प्रकार, तकनीक बहुत संभावना भी अधिक माउस उपभेदों में साध्य हो सकता है।

फिर भी, इस सेटिंग में immunocompromised जीवों का उपयोग कर, विशेष पशु स्वच्छता सावधानियों की आवश्यकता के रूप में रोगजनकों ट्यूमर के विकास को 20 के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं। प्रहरी पशुओं के उपयोग जैसे उपायों के रूप में पशु परीक्षण की सुविधा में प्रदर्शन रोगजनक एजेंटों 21 की उपस्थिति पर नजर रखने के लिए हमारे अध्ययन में जगह ले helpfu हो सकता है ले लियापूर्वाग्रह के संभावित स्रोतों का पता लगाने में एल।

इस प्रयोग से एक murine कोलोरेक्टल कैंसर कोशिका लाइन MC38 बुलाया (मैनहेम के मेडिकल संकाय, जर्मनी में नैदानिक ​​रसायन विज्ञान संस्थान से प्राप्त) का इस्तेमाल किया। 5 एक्स 10 5 ट्यूमर कोशिकाओं खारा के 50 μl में भंग कर रहे थे। एकाग्रता प्रारंभिक प्रयोगों, जहां इस राशि दो सप्ताह के भीतर ठोस ट्यूमर गठन के लिए आदर्श के रूप में पहचान की गई थी में निर्धारित किया गया था। इन प्रयोगों में इस्तेमाल जानवरों के immunocompetence पर निर्भर करता है (ऊपर चर्चा देखें), यह बहुत अच्छी तरह से भी संभव मानव कोलोरेक्टल कैंसर की कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए और इसलिए एक जेनोग्राफ्ट पैदा हो सकता है। athymic नग्न-foxn1nu / परमाणु मानव SW480 ट्यूमर कोशिकाओं का उपयोग चूहों में प्रदर्शन प्रारंभिक परीक्षण सफलतापूर्वक लकीर के बाद बचे हुए जिगर में ट्यूमर के विकास को प्रदर्शित करने में सक्षम था। murine यकृत के आयाम के कारण, यह जटिलताओं को रोकने के लिए 50 μl करने के लिए ही उपयोग संस्करणों के लिए सिफारिश की है। इस बिंदु पर एक संभव वृद्धि होगाluciferase के साथ ट्यूमर कोशिकाओं लेबल हो। समस्या यह है कि जांच की जा रही है पर निर्भर करता है, रोचक जानकारी उत्पन्न हो सकती है जब ट्यूमर कोशिकाओं के विकास और आकार के करीब निगरानी संभव है।

जिगर पालियों ligating के वैकल्पिक तरीकों कतरन विधि 22 या एक कतरन-suturing संकर तकनीक 23 में शामिल हैं। उपकरणों कतरन की स्थिति, तथापि, कतरन तरीकों मुश्किल प्रदान कर सकते हैं। पर्याप्त रूप से प्रदर्शन सिवनी बंधाव तकनीक को जानने के लिए एक आसान रहता है और बहुत ही इस प्रयोग में एक पालि को दूर करने के लिए सबसे अधिक लागत प्रभावी तरीका हो जाने की संभावना है।

जीवित पशुओं इस प्रयोग में इस्तेमाल किया जाता है, क्योंकि यह उचित अधिकारियों द्वारा पूर्व अनुमति की आवश्यकता है। इस क्षेत्र पर निर्भर करता है, यह एक महंगा है और समय लेने वाला काम हो सकता है। यहां तक ​​कि आधिकारिक मंजूरी के बाद, पशु प्रयोगों सेल संस्कृति परीक्षण या आणविक विधियों जैसे अनुसंधान विधियों की तुलना में अब तक कम पहुंच रहे हैं। एक के बुनियादी ढांचे के अलावाआधुनिक पशु परीक्षण की सुविधा, विशेष उपकरणों आदेश प्रोटोकॉल प्रदर्शन करने में आवंटित किया गया है। इसके अलावा, दो से चार सप्ताह की अवधि के लिए इस तकनीक में महारत हासिल करने के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए। इस प्रोटोकॉल माउस उपभेदों की एक बड़ी संख्या में सेल लाइनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागू हो सकता है। फिर भी, जैसा कि ऊपर उल्लेख संभावित संशोधनों के संबंध में नहीं, हर कोशिका लाइन हर जीव में अध्ययन किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल का उपयोग खोजी अध्ययन का एक मुख्य लक्ष्य जटिल वृद्धि कारक प्रणाली जिगर उत्थान और जिगर द्रोह पुनरावृत्ति पर उसका सही प्रभाव में शामिल होना होगा। आदेश में पर्याप्त रूप से इन संभव सहसंबंध की जांच करने के लिए यह एक जानवर प्रयोग को लागू करने के लिए, अलग अलग तरीकों आणविक या सेल संस्कृति प्रयोगों के विपरीत आवश्यक है। इन तरीकों के बजाय जांच के मानार्थ साधन के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए। हालांकि कई अलग अलग जिगर लकीर मॉडल अब तक 22-24 प्रकाशित किया गया है, इस प्रक्रियापहली बार के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित आपरेशन में एक साथ ट्यूमर सेल इंजेक्शन लागू करता है।

इस माउस मॉडल दर्शाता है कि चूहों में जिगर लकीर एक काफी सरल, व्यावहारिक और आसानी से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि है। छोटे और बड़े उच्छेदन के बाद जिगर के उत्थान के दो सप्ताह के भीतर अतिवृद्धि द्वारा ऊतकों को नुकसान की भरपाई करने में सक्षम था। चूहे अप करने के लिए 70% की जिगर की मात्रा में कटौती के साथ सामना कर सकते हैं।

ट्यूमर कोशिकाओं बचे हुए जिगर के अंदर विकसित करने में सक्षम थे और ठोस ट्यूमर की स्थापना की जा सकती है। ट्यूमर के विकास और ट्यूमर सेल प्रसार resected जिगर ऊतक की राशि के साथ सहसंबद्ध। शेष जिगर, जो व्यक्त की गई थी, अधिक से अधिक ट्यूमर वजन और मात्रा के भीतर ट्यूमर के विकास की एक सक्रियण के लिए लकीर नेतृत्व करने की प्रक्रिया। प्रसार की यह बड़ा डिग्री immunohistochemistry परीक्षाओं द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है।

यह अच्छी तरह से यकृत उत्थान कारकों की राशि है कि जाना जाता हैtors जिगर लकीर 25,26 की हद के साथ जिगर अतिवृद्धि वृद्धि के लिए जारी किया। इसलिए, जिगर उत्थान कारकों और ट्यूमर कोशिकाओं के विकास के बीच एक कड़ी मौजूद हो सकता है। यह जहां मेटास्टेटिक पुनरावृत्ति जिगर लकीर से पहले के भीतर मेटास्टेसिस की राशि के साथ संबद्ध नैदानिक ​​टिप्पणियों के साथ सामंजस्य में है। जिगर metastases कि पूर्व शल्य चिकित्सा इमेजिंग पर दिखाई दे रहे हैं सिर्फ हिमशैल के टिप को प्रतिबिंबित अधिक है, फिर भी नहीं पहचाने जाने ट्यूमर सेल जमा, निदान पर उपस्थित हो सकता है, जबकि सकता है। जिगर लकीर के बाद, यकृत उत्थान कारकों तो इन ट्यूमर कोशिकाओं है, जो अंततः आवर्तक मेटास्टेसिस के रूप में स्पष्ट हो के विकास को प्रोत्साहित कर सकते हैं।

हालांकि सह-संबंध से ऊपर उल्लेख बहुत संभावना है, यह अब तक साबित नहीं किया गया है। intrahepatic ट्यूमर प्रगति पर यकृत उत्थान तंत्र के प्रभाव इसलिए आगे आणविक विश्लेषण की आवश्यकता है। सटीक निर्देश के साथ ही एक उदाहरण वीडियो एक तेजी से गोद लेने की अनुमति देते हैंतकनीक के इस वीडियो में शुरू की। यह दुनिया भर के अध्ययन घटनाओं के इस प्रसिद्ध श्रृंखला में लापता कड़ी की खोज करने की कोशिश कर रहे हैं कि के विभिन्न प्रकार के लिए एक आधार के रूप में काम कर सकते हैं।

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Acknowledgments

विशेष स्वीकृतियां तकनीकी सवालों में उसकी सहायता के लिए डा बेंजामिन Motsch के पास जाओ। लेखकों को भी उनके मल्टीमीडिया समर्थन के लिए डॉ मार्कस Forschner और Birk मुलर स्वीकार करना चाहते हैं, उसके संपादकीय विशेषज्ञता के लिए एरिका Magelky और लिसा Hornung, डॉ रोलाण्ड Jurgons और प्रोफेसर स्टीफन वॉन Hörsten (सभी फ्रांज-Penzoldt केंद्र, विश्वविद्यालय से अरलैंगेन) जानवर से निपटने और देखभाल के क्षेत्र में उनके व्यावसायिकता के लिए। हम MC38 ट्यूमर कोशिकाओं को उपलब्ध कराने के लिए नैदानिक ​​रसायन विज्ञान संस्थान, हीडलबर्ग विश्वविद्यालय, जर्मनी के मेडिकल संकाय मैनहेम में प्रोफेसर माइकल Neumaier धन्यवाद।

वर्तमान कार्य की डिग्री प्राप्त करने के लिए आवश्यकताओं की पूर्ति में प्रदर्शन किया गया था "डॉ मेड।" फ्रेडरिक अलेक्जेंडर विश्वविद्यालय Erlangen-Nürnberg (एफएयू) पर।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Operation Microscope Zeiss OPMI-1 FC S21
Induction Cage (Plexiglas Box) UNO BV, Netherlands 180000132
Flowmeter + Connection Kit UNO BV, Netherlands 180000008
UNO Vaporizer Sigma Delta UNO BV, Netherlands 180000002
Key Filler for Anesthetic UNO BV, Netherlands 180000010
Activated Charcoal Filter Adsorber UNO BV, Netherlands 180000140
Gas Exhaust Unit UNO BV, Netherlands 180000118
Face Mask for mouse UNO BV, Netherlands 180000065
Vaporizer Stand UNO BV, Netherlands 180000006
Heat lamp Physitemp Instruments HL-1
Styrofoam Pad RAYHER 30074000 
Third Hand Tool TOOLCRAFT  ZD-10F
Precision Scales Kern EW 220-3NM
Scales  Kern EMB 500-1
Sliding Caliper MIB MIB 82026100
Microdissection forceps Braun/Aesculap BD195R
Microdissection scissors Braun/Aesculap FD100R
Microdissection needle holder Braun/Aesculap BM563R
Retractor Fine Science Tools (F.S.T.) No. 17001-0 Type: Bowmann
Clamp Braun/Aesculap BJ002R
Name Company Catalog Number Comments
Expendable Items
(NOTE: Quantities are per animal and procedure)
Foliodrape sterile cover (45 cm x 75 cm) Hartmann 2775001
Sterile Cotton Swabs (2x) Hartmann 4700151 Peha
Sterile fluid (0.9% NaCl) Braun 3570310 PZN=04454809
Disinfectant (Softasept - 250 ml) Braun 3887138 PZN=0762008808505018
2 x 1 ml syringe (Injekt-F ) Braun 9166017V
26 G canula (Sterican) - for Carprofen injection Braun 4665457
30 G canula (Sterican)  - for Tumor injection Braun 4656300
Caprofen (=Rimadyl) Pfizer QM01AE91
Metamizole (= Novaminsulfon) Ratiopharm 16543.00.00
4-0 Vicryl suture Ethicon J835G
5-0 Prolene suture Ethicon 8618G
SafeLock Flex-Tube 1.5 ml Eppendorf  22363778
4 x 4 Gauze Sponge Kendall/Covidien  UPC: 728795135355  ASIN: B005BFQTWM 
Large paperclip ACCO A7072510G
Name Company Catalog Number Comments
Animals
Female athymic nude-foxn1nu/nu Harlan Laboratories B.V. Code 069

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References

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चिकित्सा अंक 110 जिगर की लकीर ट्यूमर पुनरावृत्ति यकृत द्रोह माउस मॉडल यकृत वृद्धि कारक endothelial वृद्धि कारक ऊतक वृद्धि कारक immunohistochemistry
Intrahepatic ट्यूमर के विकास पर जिगर की लकीर का प्रभाव
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Brandt, H. H., Nißler, V.,More

Brandt, H. H., Nißler, V., Croner, R. S. The Influence of Liver Resection on Intrahepatic Tumor Growth. J. Vis. Exp. (110), e53946, doi:10.3791/53946 (2016).

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