Abstract
L'incidence élevée de récidive tumorale après résection des lésions hépatiques métastatiques reste un problème non résolu. les dépôts de cellules tumorales petites, qui ne sont pas détectables par imagerie clinique de routine, peuvent être stimulées par des facteurs de régénération hépatique après résection hépatique. Il est pas tout à fait clair, cependant, les facteurs qui sont cruciaux pour la récidive tumorale.
Le modèle de souris présenté peut être utile d'explorer les mécanismes qui jouent un rôle dans le développement des lésions malignes récurrentes après résection du foie. Le modèle combine les techniques simples à réaliser et reproductible de quantités définies d'enlèvement de tissus du foie et l'induction de la tumeur (par injection) chez la souris. Les animaux ont été traités soit avec une seule laparotomie, une résection du foie à 30%, ou une résection du foie à 70%. Tous les animaux ont ensuite reçu une injection de cellules tumorales dans le tissu du foie restant. Après deux semaines d'observation, les foies et les tumeurs ont été évaluées pour la taille et le poids etexaminée par immunohistochimie.
Après une résection du foie à 70%, le volume de la tumeur et le poids ont été significativement augmentés par rapport à une laparotomie seul (p <0,05). En outre, l'immunohistochimie (Ki67) a montré un taux de prolifération tumorale accrue dans le groupe de résection (p <0,05).
Ces résultats démontrent l'influence des mécanismes de régénération hépatique sur la croissance tumorale intrahépatique. Combiné avec des méthodes comme workup analyse histologique ou d'ARN, le modèle de souris décrit pourrait servir de base à un examen attentif des différents facteurs impliqués dans la croissance tumorale et la récurrence de la maladie métastatique dans le foie. Un nombre considérable de variables telles que la durée d'observation post-opératoire, la lignée cellulaire utilisée pour l'injection ou le moment de l'injection et la résection du foie offre de multiples angles lors de l'exploration d'une question spécifique dans le contexte des métastases post-hépatectomie. Les limites de cette procédure sont aurisation pour effectuer la procédure sur les animaux, l'accès à une installation et à l'acquisition de certains équipements tests sur les animaux appropriés.
Introduction
Le cancer colorectal (CRC) représente près de 9% de toutes les tumeurs malignes. Il est le troisième cancer le plus commun, à la fois aux États-Unis et dans le monde. Les taux de mortalité globaux de la gamme CRC de 300.000 à plus de 500.000 par an 1. Vingt pour cent des patients souffrent de métastases hépatiques lors de la découverte de leur tumeur colorectale. Métastases résécables sont normalement traités par une partielle 2,3 résection hépatique. L' amélioration des techniques chirurgicales, de nouvelles stratégies multimodales et de nouvelles définitions de métastases résécables rendent la thérapie d'une résection hépatique partielle possible pour un nombre croissant de patients 4.
Récurrence des tumeurs malignes du foie secondaires, cependant, est une clinique séquelles difficile dans la chirurgie gastro-intestinale moderne. Les patients atteints de CRC qui ont subi une résection des métastases hépatiques ont une chance de développer une nouvelle tumeur dans le foie reste 5 de 30 à 50%. Par conséquent, il est nécessaire de poursuivre les recherches sur lales mécanismes impliqués dans la récurrence des métastases hépatiques.
Une résection hépatique d'environ 70% est normalement compensée en quelques semaines par le tissu hépatique restant. Cette régénération implique plusieurs mécanismes, y compris des cytokines telles que l'interleukine 6 (IL-6), facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α), le facteur de croissance des hépatocytes (HGF), facteur de croissance transformant bêta (TGF-β), facteur de croissance vasculaire endothélial (VEGF ), les métalloprotéases de matrice (MMP-2 et MMP-9) et les chimiokines CXC 11/06. Ces substances soutiennent la régénération hépatique et peuvent également être responsables des taux élevés de récidive de tumeurs malignes du foie primaires et secondaires en induisant la croissance des petits dépôts de cellules tumorales dans le foie restant qui ne sont pas détectés par imagerie clinique de routine. Cette causalité n'a pas été prouvé jusqu'à présent.
L'hypothèse suivante a été établie. Après résection partielle du foie, les facteurs de prolifération qui sont responsables en directr hypertrophie peut également induire la croissance des cellules tumorales précédemment inconnues dans le foie. Un modèle de souris a été conçu, qui combine les techniques de résection du foie et l'induction de tumeurs. Trente souris athymiques nude-Foxn1nu / nu ont été divisés en trois groupes de dix animaux chacun. Chacun d'entre eux ont été traités avec soit une laparotomie seule (groupe A), une résection de 30% du foie (groupe B) ou à une résection du foie à 70% (groupe C). Les animaux dans tous les groupes a ensuite reçu une injection de cellules tumorales dans une partie restante définie du foie, pour simuler les cellules tumorales dormantes. Où les animaux observée pendant deux semaines et ont ensuite évalué la croissance des tumeurs et de l'hypertrophie du foie.
L'objectif était de créer un modèle qui pourrait être utilisé pour rechercher les facteurs moléculaires et pathogéniques qui peuvent jouer un rôle dans la formation de tumeurs post-hépatectomie. Cette méthode peut être utile pour évaluer: l'origine des facteurs endocriniens impliqués dans la régénération du foie; les mécanismes responsables de tum intrahépatiqueou la croissance après résection du foie; et le volume de la résection hépatique nécessaire pour intrahépatique induction de la croissance tumorale. La méthode suivante n'a été effectuée sur les animaux, car ils promettent de contribuer à la compréhension des principes biologiques fondamentaux et le développement des connaissances que l'on peut attendre de profiter aux humains par l'amélioration des options de traitement. En raison des mécanismes impliqués dans ces questions, il devait être examiné in vivo, que les méthodes in vitro peuvent ne pas fournir une représentation réaliste de la pathologie humaine.
Ces enquêtes peuvent conduire à la découverte des cibles pertinentes pour les options de traitement prophylactique pour diminuer la récidive tumorale.
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Protocol
Le gouvernement de la Moyenne-Franconie en Bavière, en Allemagne, l'autorisation pour les procédures décrites accordée. Les expériences similaires nécessitent une autorisation préalable par les autorités compétentes.
Remarque: Le manuel suivant peut être utilisé pour discuté précédemment groupes A à C. Les mesures qui doivent être laissés dans les groupes A et B sont marqués en conséquence.
1. Préparatifs
- Mettez des gants, placez le coussin de polystyrène sous le microscope, et concentrer la lentille sur la zone légèrement au-dessus du pavé.
- Diviser la feuille stérile et déposer la moitié sur le tampon de polystyrène et l'autre moitié juste à côté de lui.
- Stériliser les instruments chirurgicaux et les placer sur une feuille stérile à côté du pad de Polystyrène.
- Dépliez un grand trombone pour former un arc. Tournez à l'envers et l'enfoncer dans le tampon de polystyrène à l'extrémité supérieure - juste à côté de l'endroit où la tête de l'animal se situera.
- Placez l'embout buccal de l'évaporateur entre les deux membress de la voûte plantaire. (Figure 7)
- Mettre en place une lampe chauffante environ 40 cm de l'endroit où la tête de l'animal se situera. Assurez-vous que la chaleur au niveau de la plaquette de polystyrène ne dépasse pas 40 ° C.
- Préparer une cage séparée pour les animaux exploités.
- Préparer une quantité définie et le volume (maximum de 50 ul) de cellules tumorales dans un tube flexible et le stocker sur la glace.
2. Anesthésie
- Placez la souris dans une boîte de plexiglas et de commencer l'induction anesthésique sur isoflurane de débit élevé (5% d'isoflurane à un débit de 10 L / min).
- Après avoir parcouru les différentes étapes de l'anesthésie, retirez la souris dans la boîte de plexiglas juste après qu'il est entré dans le stade de la respiration agonique, qui peut être facilement reconnu par une diminution drastique de la fréquence respiratoire (<20 / min) et halètements profonds qui secouent le tout le corps de l'animal.
- Placez rapidement l'animal ventre-up sur le champ couvert pad stérile en polystyrène et continuerventilation sur isoflurane à faible débit en insérant le museau de la souris dans l'embout buccal pour maintenir l'anesthésie. Utiliser une fraction de 1,8 à 2,2% inspiratoire à un débit d'environ 1 L / min.
- Évaluer la profondeur de l'anesthésie pendant l'opération en calculant la fréquence respiratoire, qui est idéalement entre 45 et 60 respirations par minute. Adapter la fraction inspiratoire isoflurane en conséquence si ce n'est pas le cas.
Note: Les changements dans la fraction isoflurane inspiratoire prennent environ 60 secondes jusqu'à ce qu'ils deviennent efficaces. Éviter d'effectuer des changements drastiques rapidement. Au lieu de cela, de modifier l'application de l'anesthésie progressivement.
3. Fonctionnement
- Désinfecter la poitrine et l'abdomen avec un désinfectant adéquat et changer de gants après.
- Injecter un volume de poids adaptée carprofène (5 mg / kg de poids corporel) dans la cuisse de l'animal.
- Pincez doucement la peau abdominale avec une pince pour tester si la profondeur de l'anesthésie est adéquate.
- Disséquer soigneusement la zone autour du xiphoïde pour l'exposer à partir du tissu environnant.
- Placez un séjour de suture à travers le xiphoïde (de l'intérieur vers l'extérieur) et fixer les deux fils au dispositif de retenue au-dessus des animaux tête à l'aide de la pince.
- Pincez les membres de l'écarteur ensemble et introduire lentement les "U" des conseils d'écarteur en forme le long de la paroi abdominale interne de l'animal.
Note: Ces mesures exposent le foie afin de faciliter l'accès aux différents lobes. L'identification du lobe latéral médian et gauche du foie devrait maintenant être possible. - Utilisez un coton-tige imbibé de sérum physiologique et pousser doucement le lobe médian vers le bas. Disséquer les trois ventrales quarts du ligament falciforme, qui va maintenant être visible entre la surface du lobe médian et le diaphragme.
- Maintenant, utilisez deux tampons de coton imbibé de sérum physiologique pour décaler la médianelobe et à gauche lobe latéral vers le haut contre le diaphragme.
- Visualisez la membrane mince entre le lobe latéral gauche et le lobe caudé et de disséquer soigneusement.
Remarque: Lors de l'exécution de ce protocole sur les animaux du groupe A, sauter à l'étape 3.18 à ce stade. - Placez une ligature taille 4-0 en diagonale le long de la base du lobe latéral gauche.
- Ensuite, utilisez le coton-tige pour ramener le lobe latéral gauche à sa position initiale.
- attacher soigneusement la ligature aussi près de la base du lobe que possible et d'évaluer pour le changement de couleur dans le lobe pour tester l'approvisionnement en sang interrompu de manière adéquate.
- Réséquer le lobe latéral gauche en suivant la ligne de la base du lobe et notez le poids du lobe réséqué.
Remarque: Lors de l'exécution de ce protocole sur les animaux du groupe B, sauter à l'étape 3.18 à ce stade. - Placez une deuxième ligature entre le moignon du lobe latéral gauche et la base du lobe médian.
- Repositionner le lobe médian que well et attacher la ligature. Encore une fois, d'évaluer pour le changement de couleur dans le lobe pour tester l'approvisionnement en sang interrompu de manière adéquate.
- Réséquer le lobe médian et noter son poids.
- Connectez la seringue de 1 ml à l'aiguille de 30 G et le remplir avec les cellules tumorales du tube flexible sans incliner la seringue à tout moment.
- Utilisez les cotons-tiges pour déplacer les anses intestinales à la gauche de l'animal afin d'exposer le lobe inférieur droit.
- Insérer la seringue chargée de cellule dans le dispositif «troisième main» à un angle à la verticale de 30 °.
- Déplacez doucement l'appareil à côté de la souris avec l'aiguille juste au-dessus du lobe inférieur droit.
- Avancer lentement la seringue dans le troisième dispositif de main jusqu'à ce que la pointe de l'aiguille est dans le centre de la part du lobe inférieur droit.
- Injecter la totalité du volume dans le centre de la part du lobe sur une période de 30-45 sec.
- Comprimer le site d'injection pendant au moins trois minutes jusqu'à ce que le saignement a cessé.
- Fermez le fascia avec un 5-0 suture résorbable en utilisant des noeuds de boutons simples.
- Fermez la peau avec une suture 4-0, non résorbable en utilisant des noeuds de boutons simples.
- Commencez la ventilation de la souris sur l'oxygène à haut débit pendant environ 1 min.
4. Post-op procédure
- Placez l'animal dans un environnement chaud (environ 40 ° C) pour la prochaine demi-heure pour assurer une récupération adéquate.
- ADMIX l'eau potable de l'animal avec 5 mg / ml de metamizole pour 72 heures postopératoires.
- Examiner l'intégrité des sutures près pendant au moins trois jours après la procédure.
5. Période d'observation et l'euthanasie
- Mesurer le poids de l'animal par jour pendant un total de 14 jours. Note les concernant leur bien-être et les limites respectivement.
- Après 14 jours, anesthésier l'animal suivant les étapes 2.1 et 2.2 du protocole opératoire unend poursuivre le protocole de l'institution pour l'euthanasie des animaux.
- Effectuer une laparotomie médiane comme expliqué à l'étape 3.4. Pour faciliter l'accès à l'abdomen, étendre le cm caudale incision 1-1,5. Insérer l'écarteur comme indiqué dans 3.7.
- Disséquer le long du reste du ligament falciforme et couper la veine cave inférieure tout comme il sort de la crânialement du foie.
- Séparer le foie à partir du diaphragme, le diaphragme en le saisissant avec la pince à disséquer et sans ménagement dans l'espace entre le foie et le tissu musculaire.
- Soulevez le tissu hépatique mobilisé au large de la rétropéritoine et disséquer hors des structures restantes, il est encore attaché à: tissu adipeux rétropéritonéale, la veine cave inférieure et la veine porte.
- Inspectez le foie après l'extraction de tout tissu supplémentaire, ce qui contribuerait à tort à sa taille réelle et le poids. Un extrait de foie et de sa tumeur sont affichés sur la figure 6.
- Disséquer la tumeur hors inferior lobe droit.
- Mesurer la taille et le poids de la tumeur et à la fois dans le parenchyme hépatique.
- Conserver des échantillons supplémentaires de tissus provenant du péritoine, les ganglions lymphatiques ou d'autres organes nécessaires à l'analyse tissulaire
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Representative Results
Dans notre expérience spécifique, nous avons inclus 30 souris nude-Foxn1nu / nu athymiques. Ils ont reçu une laparotomie médiane, les injections de cellules tumorales de 500.000 cellules tumorales MC38 (dissous dans 50 ul de solution saline) et ont ensuite été traitées avec soit une résection de 70% de foie, une résection du foie à 30%, ou aucune autre intervention.
Au bout de 14 jours, une régénération pratiquement complète du foie restant suite à 70% résections hépatiques 30% (foie hypertrophie indice du groupe de résection du foie à 30% était de 1,06 contre 0,8 dans le groupe de résection du foie à 70%) a été observée.
Après une seule laparotomie, le poids moyen des tumeurs intrahépatique était de 332 mg (plage: 10-608 mg). Le poids moyen des tumeurs intra-hépatiques de la tumeur était de 656 mg (plage: 76-1,873 mg) après 30% résection hépatique vs 961 mg (plage: 189 mgs 3030 mg) après une résection hépatique de 70% avec p & #60 0,05 (figure 1). Après une résection hépatique de 30%, le volume de la tumeur était de 950 mm 3 (gamme: 439-2,326 mm 3) par rapport à 1385 mm 3 (gamme: 411-2,366 mm 3) après une résection du foie de 70%, et 511 mm 3 (gamme: 87-1,693 mm 3) après une laparotomie seule avec p <0,05 (figure 2).
Des sections de tissu à partir du tissu tumoral ont été prélevés et analysés par l'intermédiaire de KI-67 immunohistochimie. Les cellules sur les lames ont été évaluées quant à leur taux de prolifération. Le taux de prolifération moyen de cellules tumorales du groupe laparotomie était de 47% (intervalle: 39-56%) par rapport à 61% (intervalle: 51-69%) provenant d'animaux qui ont subi une résection hépatique de 70% (p <0,05) et 53% (intervalle: 38-69%) provenant d' animaux qui ont subi une résection hépatique de 30% (p = 0,22), ce qui démontre une augmentation du taux de la prolifération cellulaire dans les groupes qui ont subi une résection hépatique (figures 3 - 5).
Figure 1:. Poids de intrahépatiques Tumeurs Le diagramme compare le poids moyen de la tumeur dans les groupes A, B et C après dissection du foie et montre une augmentation du poids dans les tumeurs du groupe B et C. Les barres d'erreur représentent SEM. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une une plus grande version de ce chiffre.
Figure 2:. Volume de intrahépatiques Tumeurs Le diagramme compare le volume tumoral moyen entre les groupes A, B et C après dissection du foie et indique une augmentation des volumes dans les tumeurs du groupe B et C. Les barres d'erreur représentent SEM. ank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Taux de prolifération des tumeurs du groupe A. KI-67 immunohistochimique d'une diapositive à partir d' un échantillon de la tumeur du groupe A montre la prolifération bénigne de cellules tumorales. Barre d' échelle = 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Taux de prolifération des tumeurs du groupe B. KI-67 immunohistochimique d'une diapositive à partir d' un échantillon de la tumeur du groupe B montre une prolifération modérée des cellules tumorales. Barre d'échelle = 100 um.obtenir = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5: Taux de prolifération des tumeurs du groupe C. KI-67 immunohistochimique d'une diapositive à partir d' un échantillon de la tumeur du groupe C montre une prolifération marquée des cellules tumorales. Barre d' échelle = 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6: Extrait de foie / tumeur spécimen provenant du groupe B. Ce foie a été extraite 14 jours après l' exécution d' une résection du foie à 30% et l' injection de cellules tumorales simultanément. Une grosse tumeur dans le lobe inférieur droit peut être vu, alors que le supérieur, la médiane et caudé lobe droits sont passés par une hypertrophie significative.
* = Tumeur dans le lobe inférieur droit, SRL = lobe supérieur droit, ML = lobe médian, CL = caudé lobe. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 7:. OU Table Setup Le tampon de polystyrène est recouverte par un tissu stérile. A plié ouvert trombone est enfoncé dans le tampon à son extrémité supérieure recouvrant le tube de respiration avec son embouchure. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Des expériences antérieures effectuant la chirurgie chez les rongeurs ont été en mesure d'identifier certaines variables qui pourraient servir de sources de biais. Afin d'obtenir des résultats fiables et valides, prenez les précautions suivantes.
Routine pré-op jeûne peut conduire à une stéatose hépatique 12, qui peut inhiber la régénération du foie 13,14. Il est donc pas recommandé. La plus forte activité mitotique des hépatocytes varie tout au long de la journée 15. Si possible, effectuer les procédures à un certain moment pendant la journée pour tous les groupes. Murine régénération du foie est plus efficace chez les animaux âgés de 4-6 semaines. Les animaux âgés de plus de 10 mois d'âge ont une diminution significative des capacités de régénération 16. Utilisez la souris de la même race, le sexe et l'âge pour les expériences afin de minimiser le risque de biais. Travailler dans un environnement stérile est généralement important dans une procédure ouverte comme ça. Surtout dans les organismes immunodéprimés, comme le athymi souris c utilisées dans la vidéo, le risque d'infection, ce qui peut conduire à la mort prématurée ou des résultats biaisés, est élevé. Poursuivant trois-zone-setup constitué d'une préparation, une intervention chirurgicale et une zone de récupération est donc justifiée 17. En raison de ses effets hépatotoxiques profonds, buprénorphine couramment utilisé est pas recommandé pour le traitement analgésique intra- ou postopératoires 18,19. Utilisez d'autres substances comme carprofène ou metamizole pour fournir une analgésie suffisante. Depuis metamizole ne sont pas disponibles dans de nombreux pays, le carprofène peut également être utilisé pour le contrôle de la douleur après la procédure. Effectuer une injection sous-cutanée de 5 mg / kg de poids corporel une fois par jour pendant trois jours pour metamizole remplacer.
la récupération postopératoire est mieux réalisée lorsque la souris récupération est placé dans un environnement chaleureux avec un accès facile à la nourriture et de l'eau. Il est idéalement isolé des autres souris durant la nuit, pour empêcher les animaux les plus dominants de nuire les plus vulnérables 17.
jove_content "> Bien que le protocole est très simple, il y a quelques pièges mineurs à éviter lors de l'exécution de cette sorte de chirurgie chez les souris. Dissection du ligament falciforme, une structure reliant la face ventrale du lobe médian de la paroi abdominale, est essentielle pour parvenir à la flexibilité du foie appropriée. Comme ce ligament se développe dans une zone très proche du point où la veine cave inférieure laisse le foie céphalique, la prudence est justifiée afin d'éviter d'endommager cette veine majeure. en moyenne, disséquant environ trois quarts de la moyen assurera une mobilisation satisfaisante et en même temps de maintenir une distance adéquate de la cuve.En utilisant la bonne quantité de tension quand ligaturant un lobe avec une ligature est une tâche extrêmement importante lors de l'exécution du protocole de résection. Ligatures avec des nœuds d'air ou ligatures mal serrés peuvent conduire à mal interrompu l'approvisionnement en sang, l'hémorragie, le choc et la mort. Dans le même temps, un attempt pour serrer à fond un nœud de ligature peut entraîner la rupture avec ligature dommages associés aux tissus et organes environnants. Un moyen efficace d'évaluation de l'intégrité ligatures est l'observation du changement de couleur cyanosé dans le lobe ligaturé. Sélection du matériel de suture correcte joue également un rôle important. sutures tressées sont plus susceptibles de comprimer les tissus, tandis que les matériaux monofilamentaire seront plutôt disséquer à travers le tissu du foie doux et provoque une hémorragie.
Une autre étape critique lors de la suppression des lobes du foie chez la souris implique un positionnement correct de ligatures. Ligation doit être réalisée perpendiculairement aux principaux navires entrant dans les lobes. Bien que ce soit assez simple dans le lobe médian, la résection adéquate du lobe latéral gauche est plus difficile. Ses navires entrent dans le lobe dans une direction ventro-caudal. En conséquence, le fil de ligature doit être placé le long d'une ligne imaginaire entre le fond de fente gauche sur le lobe inférieur droit du liver.
Dans le lobe médian, cependant, une résection peut compromettre la veine cave inférieure. Étant donné que ce vaisseau principal passe par la partie dorsale du lobe, il est susceptible d'être endommagé, ce qui peut conduire à une nécrose du foie. En outre, lier la ligature avec trop de tension dans ce domaine, peut entraîner la rupture et / ou pneumothorax diaphragme.
la manipulation adéquate des cellules tumorales est également important lorsque vous essayez d'obtenir des résultats comparables. Bien que les techniques de culture cellulaire exactes ne sont pas destinés à faire partie de ce protocole, le traitement des cellules tumorales au sein de la procédure est aussi importante que la préparation parfaite au préalable. Lors du remplissage de la seringue avec les cellules tumorales, il est essentiel de le garder debout en tout temps. inclinaison importante de la seringue peut se traduire par des cellules tumorales qui adhèrent à la paroi de la seringue, entraînant donc une perte de cellules au moment de l'injection. Seule l'inclinaison mineure est justifiée au moment de l'injection, afin d'insérer l'aiguille parperpendiculaire à la surface du lobe inférieur droit.
Hémorragie et des métastases peritoneales peuvent survenir à la suite d'une hémorragie et de déversement à partir du site de ponction sur la surface du foie. Par conséquent, une compression légère du lobe avec un coton-tige pendant une période de trois minutes est indispensable de contrôler le saignement du parenchyme du foie et d'empêcher le fluide de cellules tumorales dans le péritoine des fuites.
Publications contenant des protocoles de procédure pour les opérations intra-abdominale chez les rongeurs contiennent rarement des informations sur le type de fermeture abdominale. Pourtant, cet aspect est une autre source possible de complications. Même avec un contrôle adéquat de la douleur, les animaux vont essayer d'enlever les corps étrangers dans leur paroi abdominale. Les conséquences peuvent être une infection intra-abdominale, un abdomen ouvert ou même la mort. Ceci peut être évité par les deux points de suture interrompues simples de la scène pour la fermeture de la plaie au lieu d'un fil de suture en cours d'exécution et de fermeture de la paroi abdominale en deux couches.
souris nude-Foxn1nu / nu athymiques Femme (fourni par Harlan Laboratories BV, Kreuzelweg 53, NL-5961 NM Horst) ont été utilisés dans cette expérience. Le déficit des cellules T cette race est connue pour permet la croissance de la tumeur relativement libre et donc des conditions idéales pour l'implantation de la tumeur. Afin de minimiser l'influence du classement des combats parmi les animaux, seules les femelles ont été utilisés. Des résultats préliminaires utilisant différentes souches comme les souris C57BL / 6 ont également montré consanguines significative, mais la croissance tumorale de plus faible volume. Ainsi, la technique peut très probablement être possible même dans plusieurs souches de souris.
Pourtant, l' utilisation d' organismes immunodéprimés dans ce cadre nécessite des précautions d'hygiène des animaux spéciaux, comme des agents pathogènes peuvent interférer avec la croissance tumorale 20. Des mesures telles que l'utilisation d'animaux sentinelles pour surveiller la présence d'agents pathogènes 21 telle que pratiquée dans l'installation d'essais sur les animaux de notre étude ont lieu en peut être helpful dans la détection de sources possibles de biais.
Cette expérience utilise une ligne colorectal murin des cellules cancéreuses appelé MC38 (obtenu à partir de l'Institut de chimie clinique à la Faculté de médecine de Mannheim, Allemagne). 5 x 10 cellules tumorales 5 ont été dissous dans 50 ul de solution saline. La concentration a été déterminée dans des expériences préliminaires, où ce montant a été identifié comme idéal pour la formation de tumeurs solides dans les deux semaines. Selon le immunocompétence des animaux utilisés dans ces expériences (voir la discussion ci-dessus), il pourrait être très bien également possible d'utiliser des cellules cancéreuses colorectales humaines et donc créer une xénogreffe. test initial effectué en nue-Foxn1nu souris nu / thymoprives en utilisant des cellules tumorales SW480 humaine a pu démontrer avec succès la croissance de la tumeur dans le foie restant après résection. En raison de la dimension de foies de souris, il est recommandé aux seuls volumes d'utilisation jusqu'à 50 pi pour prévenir les complications. Une amélioration possible à ce stade seraitsoit pour marquer les cellules tumorales avec la luciférase. Selon le problème qui est à l'étude, des informations intéressantes peuvent survenir lors de la surveillance étroite de la croissance des cellules tumorales et la taille sont possibles.
D' autres moyens de ligaturer lobes du foie comprennent la méthode de découpage 22 ou d' une technique hybride clipsage 23 suturer. Le positionnement des dispositifs d'écrêtage, cependant, peut rendre les méthodes de découpage difficile. Adéquatement effectué une ligature de suture reste facile à apprendre la technique et est très susceptible d'être le moyen le plus rentable d'éliminer un lobe dans cette expérience.
Parce que les animaux vivants sont utilisés dans cette expérience, il exige l'autorisation préalable par les autorités compétentes. En fonction de la région, ce qui peut être une tâche coûteuse et chronophage. Même après l'approbation officielle, l'expérimentation animale sont beaucoup moins accessibles que les méthodes de recherche, comme les tests de culture cellulaire ou des méthodes moléculaires. En plus de l'infrastructure d'uninstallation de l'expérimentation animale moderne, un équipement spécial doit être alloué afin d'effectuer le protocole. De plus, une période de deux à quatre semaines devrait être programmé pour maîtriser cette technique. Ce protocole peut applicable à un large éventail de lignées cellulaires dans un grand nombre de souches de souris. Or, en ce qui concerne les éventuelles modifications mentionnées ci-dessus, et non pas à chaque ligne de cellules peut être étudiée dans tous les organismes.
Un objectif principal des études d'investigation utilisant ce protocole sera le système de facteur de croissance complexe impliqué dans la régénération du foie et de ses effets exacts sur la malignité du foie récidive. Afin d'étudier de manière adéquate ces corrélations possibles, il est indispensable de mettre en oeuvre une expérimentation animale, contrairement aux procédés moléculaires différentes ou des expériences de culture cellulaire. Ces méthodes devraient plutôt être utilisés comme moyens complémentaires d'investigation. Bien que plusieurs modèles de résection hépatique différents ont été publiés jusqu'à présent 22-24, cette procédurepour la première fois met en oeuvre l'injection de cellules tumorales simultanément à une opération bien établie.
Ce modèle de souris montre que la résection du foie chez les souris est une méthode relativement simple, facilement réalisable et reproductible. La régénération du foie après résections mineures et majeures a été en mesure de compenser la perte de tissu par une hypertrophie dans les deux semaines. Les souris peuvent faire face à des réductions de volume du foie de jusqu'à 70%.
Les cellules tumorales sont capables de croître à l'intérieur du foie restant et les tumeurs solides peut être établie. La croissance tumorale et la prolifération des cellules tumorales en corrélation avec la quantité de tissu du foie réséqué. Le procédé de résection conduit à une activation de la croissance tumorale dans le foie restant, qui a été exprimée par le poids et les volumes des tumeurs plus importantes. Ce degré plus élevé de la prolifération a pu être démontré par des examens d'immunohistochimie.
Il est bien connu que la quantité de régénération hépatique facteurs libérés pour l' hypertrophie du foie augmente avec l'étendue de la résection du foie 25,26. Par conséquent, un lien entre les facteurs de régénération du foie et de la croissance des cellules tumorales peut exister. Ceci est en concordance avec les observations cliniques où la récurrence métastasique est en corrélation avec la quantité de métastases dans le foie avant la résection. métastases hépatiques qui sont visibles sur l'imagerie préopératoire ne peuvent refléter la pointe de l'iceberg en plus pas encore des dépôts, de cellules tumorales détectable, peuvent être présents au moment du diagnostic. Après une résection du foie, des facteurs de régénération du foie peuvent alors stimuler la croissance de ces cellules tumorales, qui finissent par devenir évident que les métastases récurrentes.
Bien que la corrélation mentionnée ci-dessus est très vraisemblable, il n'a pas été démontré jusqu'à présent. L'influence des mécanismes de régénération hépatique sur les progrès de la tumeur intrahépatique nécessite donc d'autres analyses moléculaires. Des instructions précises ainsi qu'une vidéo illustrative permettent une adoption rapidede la technique introduite dans cette vidéo. Il peut servir de base pour les différents types d'études dans le monde entier qui tentent de découvrir le chaînon manquant dans cette chaîne bien connue des événements.
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Acknowledgments
remerciements spéciaux vont à Dr. Benjamin Motsch pour son aide dans les questions techniques. Les auteurs aimeraient également remercier le Dr Marcus Forschner et Birk Müller pour leur prise en charge multimédia, Erica Magelky pour son expertise éditoriale et Lisa Hornung, le Dr Roland Jurgons et le Professeur Stephan von Hörsten (tous du Franz-Penzoldt-Center, Université de Erlangen) pour leur professionnalisme dans le traitement et les soins des animaux. Nous remercions le Professeur Michael Neumaier à l'Institut de chimie clinique, Faculté de médecine de Mannheim de l'Université de Heidelberg, en Allemagne pour fournir des cellules tumorales MC38.
Le présent travail a été réalisé dans le respect des exigences pour l'obtention du diplôme "Dr. med." au Friedrich-Alexander-Université Erlangen-Nuremberg (FAU).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Operation Microscope | Zeiss | OPMI-1 FC S21 | |
| Induction Cage (Plexiglas Box) | UNO BV, Netherlands | 180000132 | |
| Flowmeter + Connection Kit | UNO BV, Netherlands | 180000008 | |
| UNO Vaporizer Sigma Delta | UNO BV, Netherlands | 180000002 | |
| Key Filler for Anesthetic | UNO BV, Netherlands | 180000010 | |
| Activated Charcoal Filter Adsorber | UNO BV, Netherlands | 180000140 | |
| Gas Exhaust Unit | UNO BV, Netherlands | 180000118 | |
| Face Mask for mouse | UNO BV, Netherlands | 180000065 | |
| Vaporizer Stand | UNO BV, Netherlands | 180000006 | |
| Heat lamp | Physitemp Instruments | HL-1 | |
| Styrofoam Pad | RAYHER | 30074000 | |
| Third Hand Tool | TOOLCRAFT | ZD-10F | |
| Precision Scales | Kern | EW 220-3NM | |
| Scales | Kern | EMB 500-1 | |
| Sliding Caliper | MIB | MIB 82026100 | |
| Microdissection forceps | Braun/Aesculap | BD195R | |
| Microdissection scissors | Braun/Aesculap | FD100R | |
| Microdissection needle holder | Braun/Aesculap | BM563R | |
| Retractor | Fine Science Tools (F.S.T.) | No. 17001-0 | Type: Bowmann |
| Clamp | Braun/Aesculap | BJ002R | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Expendable Items (NOTE: Quantities are per animal and procedure) |
|||
| Foliodrape sterile cover (45 cm x 75 cm) | Hartmann | 2775001 | |
| Sterile Cotton Swabs (2x) | Hartmann | 4700151 | Peha |
| Sterile fluid (0.9% NaCl) | Braun | 3570310 | PZN=04454809 |
| Disinfectant (Softasept - 250 ml) | Braun | 3887138 | PZN=0762008808505018 |
| 2 x 1 ml syringe (Injekt-F ) | Braun | 9166017V | |
| 26 G canula (Sterican) - for Carprofen injection | Braun | 4665457 | |
| 30 G canula (Sterican) - for Tumor injection | Braun | 4656300 | |
| Caprofen (=Rimadyl) | Pfizer | QM01AE91 | |
| Metamizole (= Novaminsulfon) | Ratiopharm | 16543.00.00 | |
| 4-0 Vicryl suture | Ethicon | J835G | |
| 5-0 Prolene suture | Ethicon | 8618G | |
| SafeLock Flex-Tube 1.5 ml | Eppendorf | 22363778 | |
| 4 x 4 Gauze Sponge | Kendall/Covidien | UPC: 728795135355 | ASIN: B005BFQTWM |
| Large paperclip | ACCO | A7072510G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| Female athymic nude-foxn1nu/nu | Harlan Laboratories B.V. | Code 069 |
References
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