Abstract
L'alta incidenza di recidiva del tumore dopo resezione delle lesioni epatiche metastatiche rimane un problema irrisolto. depositi di cellule tumorali di piccole dimensioni, che non sono rilevabili dalla routine di imaging clinico, possono essere stimolati da fattori di rigenerazione epatica dopo resezione epatica. Non è del tutto chiaro, tuttavia, che i fattori sono cruciali per recidiva.
Il modello di topo presentata può essere utile per esplorare i meccanismi che svolgono un ruolo nello sviluppo delle lesioni maligne ricorrenti dopo resezione epatica. Il modello combina le tecniche semplici da eseguire e riproducibili di quantità definite di rimozione del tessuto epatico e tumori indotti (per iniezione) in topi. Gli animali sono stati trattati con una singola laparotomia, una resezione epatica 30%, o una resezione epatica 70%. Tutti gli animali seguito ricevuto l'iniezione di cellule tumorali nel tessuto epatico rimanente. Dopo due settimane di osservazione, i fegati ei tumori sono stati valutati per dimensioni e peso eesaminato da immunoistochimica.
Dopo una resezione epatica 70%, il volume del tumore e il peso sono stati significativamente aumentati rispetto alla sola una laparotomia (p <0.05). Inoltre, l'immunoistochimica (Ki67) ha mostrato un aumento del tasso di proliferazione del tumore nel gruppo di resezione (p <0.05).
Questi risultati dimostrano l'influenza dei meccanismi di rigenerazione epatica sulla crescita del tumore intraepatica. In combinazione con metodi come iter istologica o l'analisi di RNA, il modello di topo descritto potrebbe servire come base per un attento esame dei diversi fattori coinvolti nella crescita tumorale e recidiva di malattia metastatica nel fegato. Un considerevole numero di variabili come la lunghezza di osservazione postoperatoria, la linea cellulare utilizzata per iniezione o tempi di iniezione e resezione epatica offrono angoli multipli quando esplorare una domanda specifica nel quadro di metastasi post-epatectomia. I limiti di questa procedura è l'autorizzazione Per eseguire la procedura su animali, l'accesso ad un impianto di sperimentazione animale adeguato e l'acquisizione di alcune apparecchiature.
Introduction
Il cancro colorettale (CRC) rappresenta quasi il 9% di tutti i tumori maligni. E 'il terzo tumore più comune, sia negli Stati Uniti e in tutto il mondo. I tassi di mortalità a livello mondiale della gamma CRC da 300.000 a oltre 500.000 euro all'anno 1. Venti per cento dei pazienti che soffrono di metastasi epatiche al momento della scoperta del tumore del colon-retto. Metastasi resecabile sono normalmente trattati con un parziale di 2,3 resezione epatica. Tecniche chirurgiche migliorate, nuove strategie multimodali e nuove definizioni di metastasi resecabili rendono la terapia di una resezione parziale del fegato possibile per un numero crescente di pazienti 4.
Ricorrenza di neoplasie epatiche secondarie, tuttavia, è un sequalae clinica difficile in chirurgia gastrointestinale moderna. I pazienti con CRC sottoposti a resezione delle metastasi epatiche hanno una probabilità del 30 al 50% di sviluppare un nuovo tumore nel fegato residuo 5. Pertanto, vi è la necessità di ulteriori ricerche sullameccanismi coinvolti nella recidiva di metastasi epatiche.
Una resezione epatica di circa il 70% viene normalmente compensata entro poche settimane dal tessuto epatico rimanente. Questa rigenerazione coinvolge molteplici meccanismi, tra cui citochine, come l'interleuchina 6 (IL-6), fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α), il fattore di crescita degli epatociti (HGF), fattore di crescita trasformante beta (TGF-β), fattore di crescita vascolare endoteliale (VEGF ), metalloproteasi della matrice (MMP-2 e MMP-9) e CXC-chemochine 6-11. Queste sostanze sostengono la rigenerazione epatica e possono anche essere responsabile per gli alti tassi di recidiva di tumori maligni del fegato primari e secondari inducendo la crescita di piccoli depositi di cellule tumorali nel fegato residuo che non sono rilevati dalla routine di imaging clinico. Questa causalità non è stato dimostrato finora.
è stata istituita la seguente ipotesi. Dopo la resezione parziale del fegato, i fattori di proliferazione che sono responsabili in direttar ipertrofia può anche indurre la crescita di cellule tumorali precedentemente sconosciuti nel fegato. Un modello di topo creata che combina le tecniche di resezione epatica e tumori indotti. Trenta atimici nude-foxn1nu / topi nu sono stati divisi in tre gruppi di dieci animali ciascuno. Ciascuno di essi è stato trattato con da solo una laparotomia (Gruppo A), una resezione epatica 30% (gruppo B) o una resezione epatica 70% (gruppo C). Animali in tutti i gruppi successivamente ricevuto una iniezione di cellule tumorali in una parte rimanente definita del fegato, per simulare le cellule tumorali dormienti. Animali dove osservato per due settimane e poi valutati per la crescita del tumore e l'ipertrofia del fegato.
L'obiettivo era quello di creare un modello che potrebbe essere utilizzato per cercare i fattori molecolari e patogenetici che possono giocare un ruolo nella formazione del tumore post-epatectomia. Questo metodo può essere utile per valutare: l'origine dei fattori endocrini coinvolti nella rigenerazione del fegato; i meccanismi responsabili tum intraepaticao la crescita dopo la resezione del fegato; e il volume resezione epatica necessaria per intraepatica induzione crescita tumorale. Il metodo seguito è stata eseguita solo su animali perché promettono di contribuire alla comprensione dei principi biologici fondamentali e allo sviluppo di conoscenza che ci si può aspettare di beneficiare gli esseri umani da una migliore opzioni di trattamento. A causa dei meccanismi coinvolti in queste cose, doveva essere esaminato in vivo, come metodi in vitro non possono fornire una rappresentazione realistica della patologia umana.
Queste indagini potrebbero portare alla scoperta di obiettivi rilevanti per le opzioni di trattamento profilattico per diminuire recidiva del tumore.
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Protocol
Il governo della Media Franconia, in Baviera, in Germania, ha concesso l'autorizzazione per le procedure descritte. Eventuali esperimenti simili necessitano di preventiva autorizzazione da parte delle autorità competenti.
Nota: Il seguente manuale può essere usato per i gruppi discusso in precedenza da A a C. I passaggi che devono essere lasciati fuori nei gruppi A e B sono contrassegnati di conseguenza.
1. preparati
- Indossare guanti, posizionare il pad in polistirolo sotto il microscopio, e mettere a fuoco l'obiettivo sulla zona leggermente sopra il pad.
- Dividere il foglio di sterile e posto a metà sopra il pad in polistirolo e l'altra metà proprio accanto ad esso.
- Sterilizzare gli strumenti chirurgici e metterli su un foglio sterile, vicino al pad polistirolo.
- Raddrizzare una graffetta di grandi dimensioni in modo da formare un arco. Capovolgerlo e premere in il pad in polistirolo nella fascia alta - proprio accanto al punto in cui la testa dell'animale si troverà.
- Posizionare il boccaglio del vaporizzatore tra le due artos dell'arco. (Figura 7)
- Impostare una lampada di riscaldamento di circa 40 cm dal punto in cui la testa dell'animale si troverà. Assicurarsi che il calore a livello del pad polistirene non supera 40 ° C.
- Preparare una gabbia separata per animali operati.
- Preparare la quantità e volume definito (massimo 50 ml) di cellule tumorali in un tubo flessibile e memorizzarlo sul ghiaccio.
2. Anestesia
- Posizionare il mouse in una scatola plexiglas e cominciare induzione anestetica in alto isoflurano flusso (5% isoflurano ad un flusso di 10 L / min).
- Dopo aver attraversato le varie fasi di anestesia, togliere il mouse dalla casella plexiglas solo dopo che è entrato nella fase di respirazione agonico, che può essere facilmente riconoscibile da una drastica diminuzione della frequenza respiratoria (<20 / min) e sussulti profondi che agitano la intero corpo dell'animale.
- posizionare rapidamente l'animale a pancia in su sul telo coperto pad polistirene sterili e continuareventilazione isoflurano a basso flusso inserendo muso del topo nel boccaglio per mantenere l'anestesia. Utilizzare una frazione inspiratoria di 1,8-2,2% ad una portata di circa 1 L / min.
- Valutare la profondità di anestesia durante l'operazione calcolando la frequenza respiratoria, che è idealmente tra 45 e 60 respiri al minuto. Adattare la frazione isoflurano inspiratorio di conseguenza se questo non è il caso.
Nota: Le modifiche nella frazione isoflurano inspiratorio impiegano circa 60 secondi fino a quando diventano efficaci. Non effettuare cambiamenti drastici rapidamente. Invece, modificare la domanda del anestetico a poco a poco.
3. Funzionamento
- Disinfettare il torace e l'addome con un disinfettante adeguato e cambiare i guanti dopo.
- Iniettare un volume peso adattata del carprofen (5 mg / kg di peso corporeo) in coscia dell'animale.
- Delicatamente pizzicare la pelle addominale con una pinza per verificare se la profondità dell'anestesia è adeguata.
- sezionare con cura la zona intorno al xifoidea di esporlo dal tessuto circostante.
- Posizionare un soggiorno di sutura attraverso il xifoide (dall'interno verso l'esterno) e collegare entrambi i fili per il fermo di sopra degli animali testata utilizzando il morsetto.
- Pinch arti del divaricatore insieme e lentamente introdurre le punte riavvolgitore "U" lungo la parete addominale interna dell'animale.
Nota: Queste misure espongono il fegato per facilitare l'accesso ai vari lobi. L'identificazione di lobo laterale mediana e sinistra del fegato dovrebbe essere possibile. - Utilizzare un tampone di cotone imbevuta di soluzione salina e spingere delicatamente il lobo mediano verso il basso. Sezionare le ventrali tre quarti del legamento falciforme, che sarà visibile tra la superficie del lobo mediano e il diaframma.
- Ora, utilizzare due tamponi di cotone imbevuto di soluzione salina per spostare la medianalobo e lasciato lobo laterale verso l'alto contro il diaframma.
- Visualizza la membrana sottile tra il lobo laterale sinistro e il lobo caudato e con attenzione sezionarlo.
Nota: Quando si esegue questo protocollo sugli animali del gruppo A, saltare al punto 3.18, a questo punto. - Posizionare una legatura dimensioni 4-0 in diagonale lungo la base del lobo laterale sinistro.
- Quindi, utilizzare il tampone di cotone per restituire il lobo laterale di sinistra nella sua posizione originale.
- legare con attenzione la legatura più vicino alla base del lobo possibile e valutare per il cambiamento di colore nel lobo di prova per fornitura di sangue in modo adeguato interrotta.
- Resecare il lobo laterale sinistro seguendo la linea di base del lobo e annotare il peso del lobo resecato.
Nota: Quando si esegue questo protocollo sugli animali del gruppo B, saltare al passaggio 3,18 a questo punto. - Posizionare una seconda legatura tra il moncone del lobo laterale sinistro e la base del lobo mediano.
- Riposizionare il lobo mediano come well e legare la legatura. Anche in questo caso, la valutazione per il cambiamento di colore nel lobo di prova per fornitura di sangue in modo adeguato interrotta.
- Resecare il lobo mediano e annotare il suo peso.
- Collegare la siringa da 1 ml per l'ago 30 G e riempirlo con le cellule tumorali dal tubo flessibile senza inclinare la siringa in qualsiasi momento.
- Utilizzare i tamponi di cotone per spostare le anse intestinali a sinistra dell'animale al fine di esporre il lobo inferiore destro.
- Inserire la siringa cell-caricato nel dispositivo "terza mano" con un angolo di 30 ° rispetto alla verticale.
- muoversi con cautela il dispositivo accanto al mouse con l'ago appena sopra il lobo inferiore destro.
- Lentamente far avanzare la siringa all'interno del terzo dispositivo mano fino a quando la punta dell'ago è nella parte centrale del lobo inferiore destro.
- Iniettare l'intero volume nella parte centrale del lobo per un periodo di 30-45 sec.
- Comprimere il sito di iniezione per almeno tre minuti fino emorragia si è fermata.
- Chiudere la fascia con una riassorbibile 5-0 di sutura utilizzando singoli nodi pulsanti.
- Chiudere la pelle con una sutura 4-0, non riassorbibile con singoli nodi pulsanti.
- Avviare la ventilazione del mouse su di ossigeno ad alto flusso per circa 1 min.
4. Post-op procedura
- Posto l'animale in un ambiente caldo (circa 40 ° C) per la prossima mezz'ora per garantire un adeguato recupero.
- Admix acqua potabile degli animali con 5 mg / ml di metamizolo per 72 ore post-operatorio.
- Esaminare l'integrità delle suture attentamente per almeno tre giorni dopo la procedura.
5. Periodo di osservazione e l'eutanasia
- Misurare il peso dell'animale al giorno per un totale di 14 giorni. Punteggio loro per quanto riguarda la loro rispettivamente benessere e limitazioni.
- Dopo 14 giorni, anestetizzare il seguente animale passi 2.1 e 2.2 del protocollo operativo unND procedere con il protocollo di istituto per l'eutanasia degli animali.
- Eseguire una laparotomia mediana come spiegato al punto 3.4. Per facilitare l'accesso all'addome, estendere l'cm caudalmente un'incisione 1-1,5. Inserire il divaricatore come sottolineato in 3.7.
- Sezionare lungo il resto del legamento falciforme e tagliare la vena cava inferiore così come esce dalla cranialmente fegato.
- Separare il fegato dal diaframma, afferrando il diaframma con la pinza e bruscamente dissezione nello spazio tra fegato e tessuto muscolare.
- Sollevare il tessuto epatico mobilitato fuori retroperitoneo e sezionare fuori le restanti strutture che è ancora attaccato a: tessuto adiposo retroperitoneale, la vena cava inferiore e la vena porta.
- Controllare il fegato dopo l'estrazione per qualsiasi tessuto aggiuntivo, che falsamente contribuire alla sua dimensione e peso effettivo. Un fegato estratto e il suo tumore sono mostrati in Figura 6.
- Sezionare il tumore al largo della inferior lobo destro.
- Misurare le dimensioni e il peso sia del tumore e del parenchima epatico.
- Conservare campioni supplementari di tessuto dal peritoneo, linfonodi o ad altri organi come necessario per l'analisi dei tessuti
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Representative Results
Nel nostro esperimento specifico, abbiamo incluso 30 topi atimici nude-foxn1nu / nu. Hanno ricevuto una laparotomia mediana, iniezioni di cellule tumorali di 500.000 cellule tumorali MC38 (disciolti in 50 ml di soluzione fisiologica), e sono stati successivamente trattati con una resezione 70% del fegato, una resezione epatica 30%, o nessun ulteriore intervento.
Dopo 14 giorni, quasi completa rigenerazione del fegato residuo successivo 30% o 70% resezioni epatiche (fegato ipertrofia-indice del gruppo resezione epatica 30% era 1,06 contro 0,8 nel gruppo resezione epatica 70%) è stato osservato.
Dopo una singola laparotomia, il peso medio dei tumori intraepatici era 332 mg (range: 10-608 mg). Il peso del tumore media dei tumori intraepatici era 656 mg (range: 76-1,873 mg) dopo un 30% resezione epatica vs 961 mg (range: 189 Mg 3030 mg), dopo una resezione epatica il 70%, con p & #60; 0,05 (Figura 1). Dopo una resezione epatica del 30%, il volume del tumore è stata di 950 mm 3 (range: 439-2,326 mm 3) vs. 1385 millimetri 3 (range: 411-2,366 mm 3) dopo una resezione epatica 70%, 511 mm 3 (range: 87-1,693 mm 3) dopo una laparotomia solo con p <0,05 (Figura 2).
Le sezioni di tessuto dal tessuto tumorale sono stati prelevati e analizzati tramite KI-67 immunoistochimica. Le cellule sui vetrini sono stati valutati per quanto riguarda il loro tasso di proliferazione. Il tasso medio di proliferazione delle cellule tumorali del gruppo laparotomia è del 47% (range: 39-56%) rispetto al 61% (range: 51-69%) da animali che avevano subito una resezione epatica del 70% (p <0.05) e il 53% (range: 38-69%) da animali che avevano subito una resezione epatica del 30% (p = 0,22), dimostrando un aumento del tasso di proliferazione cellulare in gruppi che sottoposti a resezione epatica (figure 3 - 5).
Figura 1:. Peso di intraepatici Tumori Il diagramma confronta il peso medio del tumore tra i gruppi A, B e C dopo la dissezione dal fegato e spettacoli aumento di peso nei tumori del gruppo B e C. Le barre di errore rappresentano SEM. Cliccate qui per visualizzare un grande versione di questa figura.
Figura 2:. Volume di intraepatici Tumori Il diagramma confronta il volume medio del tumore tra i gruppi A, B e C dopo la dissezione dal fegato e spettacoli aumento dei volumi nei tumori del gruppo B e C. Le barre di errore rappresentano SEM. ank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: la proliferazione Tariffa in tumori da Gruppo A. KI-67 immunoistochimica di una diapositiva da un tumore esemplare del gruppo A dimostra la proliferazione delle cellule tumorali mite. Scala bar = 100 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: proliferazione Tariffa in tumori da Gruppo B. KI-67 immunoistochimica di una diapositiva da un tumore esemplare del gruppo B dimostra la proliferazione delle cellule tumorali moderata. Barra di scala = 100 micron.ottenere = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5: proliferazione Tariffa in tumori da Gruppo C. KI-67 immunoistochimica di una diapositiva da un tumore esemplare da gruppo C dimostra marcata proliferazione delle cellule tumorali. Scala bar = 100 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Estratto campione di fegato / tumore dal gruppo B. Questo il fegato è stato estratto 14 giorni dopo l'esecuzione di una resezione del fegato del 30% e l'iniezione delle cellule tumorali simultanea. Un grande tumore nel lobo inferiore destra può essere visto, mentre la destra superiore, mediana e lobo caudatos sono passati attraverso l'ipertrofia significativa.
* = Tumore nel lobo inferiore destro, SRL = lobo destro superiore, ML = lobo mediano, CL = lobo caudato. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 7:. OR Tabella Setup Il pad polistirolo viene coperto da un panno sterile. Una graffetta aperta piegata viene spinta nella pad alla sua estremità superiore sovrastante il tubo di respirazione con il suo portavoce. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
esperimenti precedenti eseguire un intervento chirurgico nei roditori sono stati in grado di identificare alcune variabili che potrebbero servire come fonti di bias. Al fine di ottenere risultati affidabili e validi, prendere in considerazione le seguenti precauzioni.
Routine pre-op il digiuno può portare a steatosi epatica 12, che può inibire la rigenerazione del fegato 13,14. Non è pertanto raccomandato. La più alta attività mitotica di epatociti varia durante il giorno 15. Se possibile, effettuare le procedure in un certo momento durante il giorno per tutti i gruppi. rigenerazione epatica Murine è più efficace in animali 4-6 settimane. Animali di età superiore a 10 mesi di età hanno una diminuita significativamente la capacità di rigenerazione 16. Utilizzare i topi della stessa razza, sesso ed età per gli esperimenti per ridurre al minimo il rischio di bias. Lavorando in un ambiente sterile è generalmente importante in una procedura aperta come questo. Soprattutto negli organismi immunocompromessi, come il athymi C di topo utilizzati nel video, il rischio di infezione, che possono portare alla morte prematura o risultati distorti, è alto. Praticando tre zone-setup composto da una preparazione, un ambulatorio e una zona di recupero è quindi garantito 17. Per i suoi effetti epatotossici profondi, buprenorfina comunemente usato non è raccomandato per intra o post-operatorio terapia antalgica 18,19. Utilizzare altre sostanze come carprofen o metamizolo per fornire un'adeguata analgesia. Poiché metamizolo non è disponibile in molti paesi, carprofen può anche essere utilizzato per il controllo del dolore dopo la procedura. Eseguire un iniezione sottocutanea di 5 mg / kg di peso corporeo una volta al giorno per tre giorni di tempo per sostituire metamizolo.
recupero post-operatorio si ottiene meglio quando il mouse recupero viene inserito in un ambiente caldo, con facile accesso al cibo e all'acqua. E 'idealmente isolato dagli altri topi durante la notte, per evitare che gli animali più dominante di danneggiare quelli più vulnerabili 17.
jove_content "> Anche se il protocollo è molto semplice, ci sono alcuni problemi minori da evitare quando si esegue questo tipo di chirurgia in topi. dissezione del legamento falciforme, una struttura di collegamento parte ventrale del lobo mediano alla parete addominale, è essenziale conseguire un'adeguata flessibilità fegato. Poiché questo legamento espande ad una zona molto vicina al punto in cui la vena cava inferiore lascia il fegato cranialmente, si richiede cautela per evitare danni a questo vena principale. in media, analizzarlo circa tre quarti della modo garantirà mobilitazione soddisfacente e allo stesso tempo mantenere la distanza adeguata alla nave.Utilizzando la giusta tensione quando legatura un lobo con una legatura è un'operazione estremamente importante quando si esegue il protocollo resezione. Legature con nodi d'aria o legature poco serrate possono portare a non adeguatamente interrotto apporto di sangue, emorragie, shock e morte. Allo stesso tempo, un attempt per stringere a fondo un nodo di legatura può provocare la rottura legatura con danni associati a tessuti e organi circostanti. Un modo efficace per valutare l'integrità legatura è l'osservazione del cambiamento di colore cianotico nel lobo legatura. Selezione del materiale di sutura corretta svolge anche un ruolo importante. suture intrecciate sono più propensi a comprimere i tessuti, mentre i materiali monofilamentous saranno piuttosto sezionare attraverso il tessuto epatico molli e provoca emorragie.
Un altro passo fondamentale nella rimozione lobi del fegato nei topi coinvolge corretto posizionamento di legature. Ligation dovrebbe essere eseguita perpendicolarmente ai principali vasi entrano lobi. Mentre questo è piuttosto semplice nel lobo mediano, adeguata la resezione del lobo laterale sinistro è più impegnativo. Le sue navi entrano il lobo in una direzione ventro-caudale. Come risultato, il filo di legatura deve essere posto lungo una linea immaginaria tra la base affondo sinistra al lobo inferiore destro della lIver.
In lobo mediano, tuttavia, la resezione può compromettere la vena cava inferiore. Poiché questo vaso principale attraversa la parte dorsale del lobo, è soggetto a danni, che può portare a necrosi epatica. Inoltre, legando la legatura con troppa tensione in questa zona, può provocare la rottura della membrana e / o pneumotorace.
gestione adeguata delle cellule tumorali è importante anche quando si cerca di ottenere risultati comparabili. Sebbene le esatte tecniche di coltura cellulare non sono destinate ad essere parte di questo protocollo, il trattamento delle cellule tumorali all'interno della procedura è importante quanto la perfetta preparazione in anticipo. Quando si riempie la siringa con le cellule tumorali, è di vitale importanza per tenerlo in posizione verticale. Maggiore inclinazione della siringa può provocare cellule tumorali aderenti alla parete siringhe, quindi con conseguente perdita di cellule al momento dell'iniezione. Solo inclinazione minore è garantito al momento della iniezione, al fine di inserire l'ago perperpendicolare alla superficie del lobo inferiore destro.
Emorragia e peritoneali metastasi possono verificarsi come risultato di sanguinamento e fuoriuscite dal sito di puntura sulla superficie del fegato. Quindi, lieve compressione del lobo con un batuffolo di cotone per un periodo di tre minuti è essenziale per controllare il sanguinamento dal parenchima epatico e prevenire fluido cellule tumorali fuoriuscita nel peritoneo.
Pubblicazioni contenenti i protocolli di procedura per le operazioni addominali nei roditori raramente contengono informazioni sul tipo di chiusura addominale. Tuttavia, questo aspetto è un'altra possibile fonte di complicazioni. Anche con un adeguato controllo del dolore, gli animali cercheranno di rimuovere i corpi estranei nella loro parete addominale. Le conseguenze possono essere infezioni intra-addominale, addome aperto o addirittura la morte. Ciò può essere evitato entrambi effettuano singoli punti interrotte per la chiusura della ferita invece di una sutura continua e la chiusura della parete addominale in due strati.
Female atimici topi nudi-foxn1nu / nu (fornito da Harlan Laboratories BV, Kreuzelweg 53, NL-5961 NM Horst) sono stati utilizzati in questo esperimento. Il deficit di cellule T questa razza è conosciuta per permette la crescita del tumore relativamente senza restrizioni e condizioni quindi ideale per l'impianto del tumore. Al fine di minimizzare l'influenza di classifica lotte tra gli animali, sono stati utilizzati solo animali femmine. I risultati preliminari utilizzando ceppi diversi, come i topi C57BL / 6 Inbred hanno anche dimostrato significativo, ma più bassa crescita del tumore del volume. Così, la tecnica può molto probabilmente essere praticabile in ancora di più ceppi di topi.
Tuttavia, utilizzando organismi immunocompromessi a questa impostazione richiede speciali precauzioni di igiene degli animali, come i patogeni possono interferire con la crescita del tumore 20. Misure come l'uso di animali sentinella per monitorare la presenza di agenti patogeni 21 come eseguito nella struttura sperimentazione animale il nostro studio ha avuto luogo a può essere helpful nel rilevare possibili fonti di bias.
Questo esperimento ha utilizzato un linea di cellule di cancro del colon-retto murino chiamata MC38 (ottenuto presso l'Istituto di Chimica Clinica presso la Facoltà di Medicina di Mannheim, Germania). 5 x 10 5 cellule tumorali sono stati sciolti in 50 ml di soluzione salina. La concentrazione è stata determinata in esperimenti preliminari, quando l'importo è stato identificato come ideale per la formazione di tumori solidi entro due settimane. A seconda della immunocompetenza degli animali utilizzati in questi esperimenti (vedi discussione di cui sopra), potrebbe benissimo essere anche possibile utilizzare cellule tumorali umane colorettale e quindi creare un xenotrapianto. I test iniziali eseguiti in atimici nude-foxn1nu / topi nu utilizzando cellule tumorali SW480 umana è stata in grado di dimostrare con successo la crescita del tumore nel fegato residuo dopo la resezione. A causa della dimensione di fegato di topo, si consiglia di soltando utilizzare fino a 50 ml per evitare complicazioni. Un eventuale potenziamento a questo punto sarebbeessere di etichettare le cellule tumorali con luciferasi. A seconda del problema che è in fase di studio, informazioni interessanti possono sorgere quando è possibile un più attento monitoraggio della crescita delle cellule tumorali e le dimensioni.
Modi alternativi di legatura lobi del fegato includono il metodo di ritaglio 22 o una tecnica ibrida ritaglio-sutura 23. Posizionamento dei dispositivi di clipping, tuttavia, può rendere i metodi di ritaglio difficile. Adeguatamente eseguito legatura sutura rimane un facile da imparare tecnica ed è molto probabile che sia il più modo efficace per rimuovere un lobo in questo esperimento.
Poiché gli animali vivi sono utilizzati in questo esperimento, esso richiede la preventiva autorizzazione da parte delle autorità competenti. A seconda della regione, questo può essere un compito costoso e richiede tempo. Anche dopo l'approvazione ufficiale, gli esperimenti sugli animali sono molto meno accessibili di metodi di ricerca come il test di coltura cellulare o metodi molecolari. Oltre all'infrastruttura di unmoderno impianto sperimentazione animale, attrezzature speciali deve essere assegnato per eseguire il protocollo. Inoltre, per un periodo di due-quattro settimane dovrebbe essere programmato per padroneggiare questa tecnica. Questo protocollo può applicabile per una vasta gamma di linee cellulari in un gran numero di ceppi di topi. Tuttavia, per quanto riguarda le possibili modifiche di cui sopra, non ogni linea cellulare può essere studiato in ogni organismo.
Un obiettivo principale degli studi di indagine che utilizzano questo protocollo sarà il complesso sistema del fattore di crescita coinvolti nella rigenerazione del fegato e dei suoi effetti esatti su tumori maligni del fegato recidiva. Per studiare questi possibili correlazioni adeguatamente, è essenziale attuare una sperimentazione animale, a differenza di metodi molecolari diversi o esperimenti di coltura cellulare. Questi metodi dovrebbero invece essere usati come mezzo di indagine gratuiti. Anche se diversi modelli resezione epatica diversi sono stati pubblicati finora 22-24, questa proceduraper la prima volta implementa iniezione delle cellule tumorali simultanea in un'operazione consolidata.
Questo modello di topo dimostra che la resezione epatica nei topi è un metodo abbastanza semplice, fattibile e facilmente riproducibile. la rigenerazione del fegato dopo resezioni minori e maggiori è stato in grado di compensare la perdita di tessuto da ipertrofia entro due settimane. I topi possono far fronte con una riduzione di volume del fegato fino al 70%.
Le cellule tumorali sono stati in grado di crescere all'interno del fegato residuo e tumori solidi possono essere stabilite. La crescita tumorale e la proliferazione delle cellule tumorali correlati con la quantità di tessuto epatico resecato. Il processo di piombo resezione ad una attivazione della crescita tumorale nel fegato residuo, che è stato espresso, da maggiori pesi tumorali e volumi. Questa maggiore grado di proliferazione può essere dimostrata dagli esami di immunoistochimica.
E 'noto che la quantità di epatica fac rigenerazionetori liberati per l'ipertrofia del fegato aumenta con l'estensione della resezione epatica 25,26. Pertanto, un legame tra i fattori di rigenerazione del fegato e la crescita delle cellule tumorali può esistere. Ciò è in accordo con osservazioni cliniche dove recidiva metastatica è correlata alla quantità di metastasi nel fegato prima della resezione. metastasi epatiche che sono visibili su immagini pre-operatoria possono riflettono solo la punta di un iceberg, mentre altre, non ancora depositi di cellule tumorali rilevabili, possono essere presenti al momento della diagnosi. Dopo resezione epatica, fattori di rigenerazione epatica possono quindi stimolare la crescita di queste cellule tumorali, che alla fine diventano evidenti come metastasi ricorrenti.
Sebbene la correlazione di cui sopra è molto probabile, non è stato dimostrato finora. L'influenza dei meccanismi di rigenerazione epatica sullo stato di avanzamento del tumore intraepatica richiede quindi ulteriori analisi molecolari. precise istruzioni, nonché un video di illustrativo consentono una rapida adozionedella tecnica introdotta in questo video. Può servire come base per diversi tipi di studi in tutto il mondo che stanno cercando di scoprire l'anello mancante in questa catena ben nota di eventi.
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Acknowledgments
riconoscimenti speciali vanno al Dr. Benjamin Motsch per la sua assistenza in questioni tecniche. Gli autori desiderano inoltre ringraziare il dottor Marcus Forschner e Birk Müller per il loro supporto multimediale, Erica Magelky per la sua esperienza editoriale e Lisa Hornung, Dr. Roland Jurgons e il professor Stephan von Hörsten (tutti dal Franz-Penzoldt-Center, Università di Erlangen) per la loro professionalità nella gestione e cura degli animali. Ringraziamo il professor Michael Neumaier presso l'Istituto di Chimica Clinica, Facoltà di Medicina di Mannheim dell'Università di Heidelberg, in Germania per la fornitura di cellule tumorali MC38.
Il presente lavoro è stato eseguito in adempimento dei requisiti per il conseguimento del titolo "Dr. med." al Friedrich-Alexander-Università di Erlangen-Norimberga (FAU).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Operation Microscope | Zeiss | OPMI-1 FC S21 | |
| Induction Cage (Plexiglas Box) | UNO BV, Netherlands | 180000132 | |
| Flowmeter + Connection Kit | UNO BV, Netherlands | 180000008 | |
| UNO Vaporizer Sigma Delta | UNO BV, Netherlands | 180000002 | |
| Key Filler for Anesthetic | UNO BV, Netherlands | 180000010 | |
| Activated Charcoal Filter Adsorber | UNO BV, Netherlands | 180000140 | |
| Gas Exhaust Unit | UNO BV, Netherlands | 180000118 | |
| Face Mask for mouse | UNO BV, Netherlands | 180000065 | |
| Vaporizer Stand | UNO BV, Netherlands | 180000006 | |
| Heat lamp | Physitemp Instruments | HL-1 | |
| Styrofoam Pad | RAYHER | 30074000 | |
| Third Hand Tool | TOOLCRAFT | ZD-10F | |
| Precision Scales | Kern | EW 220-3NM | |
| Scales | Kern | EMB 500-1 | |
| Sliding Caliper | MIB | MIB 82026100 | |
| Microdissection forceps | Braun/Aesculap | BD195R | |
| Microdissection scissors | Braun/Aesculap | FD100R | |
| Microdissection needle holder | Braun/Aesculap | BM563R | |
| Retractor | Fine Science Tools (F.S.T.) | No. 17001-0 | Type: Bowmann |
| Clamp | Braun/Aesculap | BJ002R | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Expendable Items (NOTE: Quantities are per animal and procedure) |
|||
| Foliodrape sterile cover (45 cm x 75 cm) | Hartmann | 2775001 | |
| Sterile Cotton Swabs (2x) | Hartmann | 4700151 | Peha |
| Sterile fluid (0.9% NaCl) | Braun | 3570310 | PZN=04454809 |
| Disinfectant (Softasept - 250 ml) | Braun | 3887138 | PZN=0762008808505018 |
| 2 x 1 ml syringe (Injekt-F ) | Braun | 9166017V | |
| 26 G canula (Sterican) - for Carprofen injection | Braun | 4665457 | |
| 30 G canula (Sterican) - for Tumor injection | Braun | 4656300 | |
| Caprofen (=Rimadyl) | Pfizer | QM01AE91 | |
| Metamizole (= Novaminsulfon) | Ratiopharm | 16543.00.00 | |
| 4-0 Vicryl suture | Ethicon | J835G | |
| 5-0 Prolene suture | Ethicon | 8618G | |
| SafeLock Flex-Tube 1.5 ml | Eppendorf | 22363778 | |
| 4 x 4 Gauze Sponge | Kendall/Covidien | UPC: 728795135355 | ASIN: B005BFQTWM |
| Large paperclip | ACCO | A7072510G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| Female athymic nude-foxn1nu/nu | Harlan Laboratories B.V. | Code 069 |
References
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