Abstract
Den høye forekomsten av svulst tilbakefall etter reseksjon av metastatiske leverlesjoner er fortsatt et uløst problem. Små tumorcelle innskudd, som ikke oppdages ved rutinemessig klinisk bildebehandling, kan stimuleres av lever regenerering faktorer etter leverreseksjon. Det er ikke helt klart, men hvilke faktorer som er avgjørende for svulst tilbakefall.
Den presenterte mus modell kan være nyttig for å utforske de mekanismer som spiller en rolle i utviklingen av tilbakevendende maligne lesjoner etter leverreseksjon. Modellen kombinerer enkle å utføre og reproduserbare teknikker av definerte mengder levervev fjerning og tumor induksjon (ved injeksjon) i mus. Dyrene ble behandlet med enten en enkelt laparotomi, en 30% leverreseksjon, eller en 70% lever reseksjon. Alle dyrene mottok deretter en tumorcelle-injeksjon inn i den gjenværende levervevet. Etter to ukers observasjon, ble leveren og svulster evaluert med hensyn til størrelse og vekt ogundersøkt av immunhistokjemi.
Etter en 70% leverreseksjon, ble tumorvolumet og vekten betydelig økt sammenlignet med en laparotomi alene (p <0,05). I tillegg immunhistokjemi (Ki67) viste en økt tumor proliferasjonsrate i reseksjon gruppen (p <0,05).
Disse resultatene demonstrerer påvirkning av lever restitusjon mekanismer for intrahepatisk tumorvekst. Kombinert med metoder som histologisk opparbeiding eller RNA-analyse, kan den beskrevne musemodell tjene som grunnlag for en nærmere undersøkelse av ulike faktorer involvert i tumorvekst og metastatisk tilbakefall av sykdommen i leveren. Et betydelig antall variabler som lengden av postoperativ observasjon, cellelinje som brukes for injeksjon eller timingen av injeksjonen og leverreseksjon tilbyr flere vinkler når utforske et bestemt spørsmål i sammenheng med post-hepatectomy metastaser. Begrensningene for denne prosedyren er authorization å utføre prosedyren på dyr, tilgang til en passende dyreforsøk anlegg og kjøp av visse typer utstyr.
Introduction
Tykktarmskreft (CRC) står for nesten 9% av alle ondartede svulster. Det er den tredje vanligste kreftformen, både i USA og på verdensbasis. Global dødelighet fra CRC varierer fra 300.000 til over 500.000 per år 1. Tjue prosent av pasientene lider av levermetastaser etter oppdagelsen av deres tykktarms svulst. Resektable metastaser er normalt behandlet av en delvis leverreseksjon 2,3. Forbedret kirurgiske teknikker, nye multimodale strategier og nye definisjoner av resektable metastaser gjengi terapi av en delvis leverreseksjon mulig for et økende antall pasienter 4.
Tilbakefall av sekundære lever malignitet, derimot, er en utfordrende klinisk følgende hendelser i moderne gastrointestinal kirurgi. Pasienter med CRC som gjennomgikk reseksjon av levermetastaser har en 30-50% sjanse for å utvikle en ny svulst i deres rest lever fem. Det er derfor et behov for videre forskning påmekanismene som er involvert i tilbakefall av levermetastaser.
En lever reseksjon av omtrent 70% normalt kompenseres innen få uker etter den gjenværende levervev. Denne regenerering omfatter flere mekanismer, inkludert cytokiner som interleukin-6 (IL-6), tumornekrosefaktor alfa (TNF-α), hepatocytt-vekstfaktor (HGF), transformerende vekstfaktor beta (TGF-β), vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF ), matrix metalloproteaser (MMP-2 og MMP-9) og CXC-Kjemokiner 6-11. Disse stoffene støtter lever regenerering og kan også være ansvarlig for de høye tilbakefall av primære og sekundære lever maligniteter ved å fremkalle vekst av små tumorcelle innskudd i de resterende leveren som ikke oppdages ved rutinemessig klinisk imaging. Denne årsakssammenheng har ikke vært påvist så langt.
Den følgende hypotese ble etablert. Etter delvis leverreseksjon, spredning faktorer som er ansvarlig for liver hypertrofi kan også indusere vekst av tidligere ukjente tumorceller i leveren. En mus modell er designet som kombinert teknikker for leverreseksjon og tumor induksjon. Tretti atymiske nakne-foxn1nu / nu-mus ble delt i tre grupper på ti dyr i hver. Hver av dem ble behandlet med enten en laparotomi alene (gruppe A), en 30% leverseksjon (gruppe B), eller en 70% leverseksjon (gruppe C). Dyr i alle grupper mottok deretter en tumorcelle-injeksjon inn i en definert gjenværende del av leveren, for å simulere hvilende tumorceller. Dyr ble observert i to uker og deretter evalueres for tumorvekst og lever hypertrofi.
Målet var å skape en modell som kan brukes for å søke etter de molekylære og patogenetiske faktorer som kan spille en rolle i post-hepatectomy tumordannelse. Denne metoden kan være nyttig i vurderingen: opprinnelsen til endokrine faktorer involvert i leveren regenerasjon; de ansvarlige mekanismer for intrahepatisk tumeller vekst etter leverreseksjon; og leveren reseksjon volumet nødvendig for intrahepatisk tumorvekst induksjon. Følgende metode har kun blitt utført på dyr fordi de lover å bidra til forståelsen av grunnleggende biologiske prinsipper og til utvikling av kunnskap som kan forventes å dra mennesker ved bedre behandlingstilbud. På grunn av de involverte i disse forholdene mekanismene, måtte det bli undersøkt in vivo, som in vitro metoder ikke kan tilveiebringe en realistisk gjengivelse av den menneskelige patologi.
Disse undersøkelsene kan føre til oppdagelsen av relevante mål for forebyggende behandling for å redusere tumor tilbakefall.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Regjeringen i Middle Franconia i Bayern, Tyskland, gitt tillatelse til prosedyrene som er beskrevet. Eventuelle lignende eksperimenter krever forhåndsgodkjenning av vedkommende myndigheter.
Merk: Følgende manuelle kan brukes til tidligere diskutert grupper fra A til C. trinn som må bli tatt ut i gruppene A og B er merket tilsvarende.
1. Forberedelser
- Ta på hansker, plasser polystyren pute under mikroskop, og fokus linsen på området litt over puten.
- Splitte sterile plate og legg halvparten over polystyren pad og den andre halvparten bare ved siden av den.
- Sterilisere kirurgiske instrumenter og plassere dem på en steril ark ved siden av Polystyrene pad.
- Unbend en stor binders for å danne en bue. Snu den opp ned og trykk den inn i isopor pad på toppen slutten - bare ved siden av der dyrets hode vil ligge.
- Plasser munnstykket på fordamper mellom de to lems av buen. (Figur 7)
- Sett opp en varmelampe om 40 cm fra stedet hvor dyrets hode vil ligge. Pass på varmen på nivå med isoporputen ikke overstiger 40 ° C.
- Utarbeide en egen bur for opererte dyr.
- Forbered en definert mengde og volum (maksimalt 50 mikroliter) av tumorceller i en flex rør og lagre den på is.
2. Anestesi
- Plassere musen i en pleksiglassboks og begynne bedøvelse induksjon på høy strømnings isofluran (5% isofluran ved en strømningshastighet på 10 l / min).
- Etter å ha gått gjennom de ulike stadier av anestesi, fjerne musen fra pleksiglass boks like etter at det har kommet inn i fasen av døds pust, noe som lett kan bli gjenkjent av en drastisk reduksjon i lufthastighet (<20 / min) og dype gisp risting dyrets hele kroppen.
- Raskt plassere dyret buk-up på den sterile drapere dekket polystyren pad og fortsetteventilasjon på lav-flow isofluran ved å sette musens snute inn i munnstykket for å opprettholde anestesi. Bruke en inspiratoriske del av 1,8-2,2% ved en strømningshastighet på omtrent 1 l / min.
- Evaluere anestesidybden under operasjonen ved å beregne den respiratoriske frekvens, noe som er ideelt mellom 45 og 60 pust per minutt. Tilpass inspirasjons isofluran brøkdel tilsvarende hvis dette ikke er tilfelle.
Merk: Endringer i inspirasjons isofluran brøkdel ta ca 60 sekunder før de trer i kraft. Unngå utføring av drastiske endringer raskt. I stedet endre bedøvelse søknad gradvis.
3. Drift
- Desinfiser brystet og magen med en tilstrekkelig desinfeksjonsmiddel og bytte hansker etterpå.
- Injisere en vekt tilpasset volum av karprofen (5 mg / kg kroppsvekt) i dyrets lår.
- Forsiktig klemme magehuden med en tang for å teste om anestesidybden er tilstrekkelig.
- dissekere forsiktig området rundt xiphoid å avsløre den fra omkringliggende vev.
- Plasser et opphold sutur gjennom xiphoid (fra innsiden til utsiden) og fest begge trådene til holderen over dyrene hodet ved hjelp av klemmen.
- Klem retractor lemmer sammen og sakte introdusere "U" -formet retractor tips underveis dyrets indre bukveggen.
Merk: Disse tiltakene eksponere leveren for å lette tilgangen til de forskjellige fliker. Identifiseringen av leverens median og venstre lateral lapp skal nå være mulig. - Bruk en saltvann-gjennomvåt bomullsdott og skyv median lapp nedover. Skjær ventrale tre fjerdedeler av falciform ligament, som nå vil være synlig mellom median lapp overflate og mellomgulvet.
- Nå bruker to saltvann-gjennomvåt bomullspinner til å skifte medianlapp og venstre lateral lapp oppover mot mellomgulvet.
- Visualiser tynn membran mellom venstre lateral lapp og caudatus lapp og nøye dissekere den.
Merk: Når du utfører denne protokollen på dyr fra gruppe A, hopp til trinn 3.18 på dette punktet. - Plasser en størrelse 4-0 ligatur diagonalt langs venstre side lapp base.
- Deretter bruker bomullspinne for å returnere venstre lateral lapp til sin opprinnelige posisjon.
- tie nøye ligaturen så nær lapp base som mulig og vurdere for fargeforandring i den flik for å teste for adekvat blodtilførsel avbrytes.
- Resect venstre lateral lapp ved å følge linjen i lobe base og noter resected lapp vekt.
Merk: Når du utfører denne protokollen på dyrene fra gruppe B, hoppe til trinn 3.18 på dette punktet. - Sett en annen ligatur mellom venstre lateral lapp stump og median lapp base.
- Flytt median lapp som well og knytte ligatur. Igjen, vurdere for fargeendring i lapp for å teste for tilstrekkelig avbrutt blodtilførsel.
- Resect median lapp og legg merke til vekten.
- Koble 1 ml sprøyte til den 30 G nål og fylle det med tumorcellene fra fleksirøret uten å vippe sprøyten til enhver tid.
- Bruk bomullspinner for å flytte tarmsløyfer til dyrets venstre for å avdekke den underlegne høyre lapp.
- Sett celle-lastet sprøyte inn i den "tredje hånd" anordning ved en 30 ° vinkel i forhold til vertikalen.
- Flytt forsiktig enheten ved siden av mus med nålen like over dårligere høyre lapp.
- Sakte avansere sprøyten i tredje hånd enhet inntil nålen i spissen er i dårligere høyre lapp sentrum del.
- Injiser hele volumet til den flik sentrale del over en periode på 30-45 sek.
- Komprimer injeksjonsstedet i minst tre minutter før blødningen har stoppet.
- Lukk konseptet med en resorberbar 5-0 sutur med ett eneste knappe knop.
- Lukk huden med en 4-0, ikke-resorberbar sutur med ett eneste knappe knop.
- Begynn ventiler musen på high flow oksygen i ca 1 min.
4. Post-op prosedyre
- Plasser dyret inn i et varmt (ca. 40 ° C) for den neste halv time for å sikre tilstrekkelig utvinning.
- Blande dyrets drikkevann med 5 mg / ml av metamizol i 72 timer postoperativt.
- Undersøke integriteten av suturene nøye i minst tre dager etter inngrepet.
5. observasjonsperiode og Avliving
- Måle dyrets vekt daglig i totalt 14 dager. Resultat dem om deres respektive trivsel og begrensninger.
- Etter 14 dager, bedøve dyret følgende trinn 2.1 og 2.2 i den operative protokollen ennd fortsette med institusjonens protokoll for dyr aktiv dødshjelp.
- Utføre en median laparotomi som beskrevet i trinn 3.4. For å lette tilgangen til magen, forlenge snittet 1-1,5 cm caudally. Sett retractor som påpekt i 3.7.
- Skjær langs resten av falciform ligament og kutte vena cava inferior akkurat som de kommer ut leveren kranialt.
- Skill leveren fra mellomgulvet, ved å gripe membranen med pinsett og uten omsvøp dissekere inn i mellomrommet mellom lever og muskelvev.
- Løft mobiliserte leveren vev av retroperitoneum og dissekere den av de resterende strukturene det er fortsatt festet til: retroperitoneal fettvev, vena cava inferior og portvenen.
- Inspisere leveren etter ekstraksjonen for noen ekstra vev, noe feilaktig skulle bidra til dens faktiske størrelse og vekt. En uttrukket leveren og dens tumor er vist i figur 6.
- Dissekere svulsten utenfor inferior høyre lapp.
- Måle størrelsen og vekten av både tumor og lever parenchyma.
- Spar flere vevsprøver fra bukhinnen, lymfeknuter eller andre organer som er nødvendig for vev analyse
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I vår bestemte eksperiment inkluderte vi 30 atymiske nude-foxn1nu / nu mus. De mottok en median laparotomi, tumorcelle injeksjoner av 500000 MC38 tumorceller (oppløst i 50 ul saltvann), og ble deretter behandlet med enten en 70% leverreseksjon, en 30% leverreseksjon, eller ingen ytterligere inngrep.
Etter 14 dager, nesten fullstendig regenerering av den gjenværende lever følgende 30% eller 70% av lever resections (lever hypertrofi-indeks på 30% leverreseksjon gruppe var 1,06 versus 0,8 fra 70% leverreseksjon gruppe) ble observert.
Etter en enkelt laparotomi, den gjennomsnittlige vekten av intrahepatiske tumorer var 332 mg (område: 10-608 mg). Gjennomsnittlig tumorvekt intrahepatic svulster var 656 mg (område: 76-1,873 mg) etter en 30% leverreseksjon vs. 961 mg (område: 189 Mg- 3030 mg) etter en 70% leverreseksjon med p & #60 0,05 (figur 1). Etter en 30% leverreseksjon, tumorvolumet var 950 mm 3 (område: 439-2,326 mm 3) vs. 1385 mm 3 (område: 411-2,366 mm 3) etter en 70% leverreseksjon, og 511 mm 3 (område: 87-1,693 mm 3) etter en laparotomi alene med p <0,05 (figur 2).
Vevssnitt fra svulstvev ble tatt og analysert via KI-67 immunhistokjemi. Cellene på objektglassene ble undersøkt med hensyn til deres formeringshastigheten. Den gjennomsnittlige formeringshastigheten av tumorceller fra laparotomi gruppen var 47% (område: 39-56%) sammenlignet med 61% (område: 51-69%) fra dyr som hadde gjennomgått en lever reseksjon av 70% (p <0.05) og 53% (område: 38-69%) fra dyr som hadde gjennomgått en lever reseksjon av 30% (p = 0,22), noe som viser en økt forekomst av celleproliferasjon i grupper som gjennomgikk leverreseksjon (figur 3 - 5).
Figur 1:. Vekt av intrahepatisk Svulster Diagrammet sammenligner gjennomsnittlig tumorvekt mellom gruppene A, B og C etter disseksjon fra leveren og viser økt vekt på svulster i gruppe B og C. Feilfelt representerer SEM. Klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 2:. Volum av intrahepatisk Svulster Diagrammet sammenligner gjennomsnittlig tumorvolumet mellom gruppene A, B og C etter disseksjon fra leveren og viser økt volumer i svulster i gruppe B og C. Feilfelt representerer SEM. ank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: proliferasjonsrate i svulster fra gruppe A. KI-67 Immunohistochemistry av et lysbilde fra en svulst prøven fra gruppe A demonstrerer mild spredning av kreftceller. Scale bar = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: proliferasjonsrate i svulster fra Gruppe B. KI-67 Immunohistochemistry av et lysbilde fra en svulst prøven fra gruppe B viser moderat spredning av kreftceller. Scale bar = 100 mikrometer.få = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: proliferasjonsrate i svulster fra Gruppe C. KI-67 Immunohistochemistry av et lysbilde fra en svulst prøven fra gruppe C viser markert spredning av kreftceller. Scale bar = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Hentet Lever / Tumor prøven fra gruppe B. Denne leveren ble ekstrahert 14 dager etter å ha utført en 30% leverreseksjon og samtidig tumorcelle injeksjon. En stor svulst i den høyre nedre lapp kan sees, mens den høyre overlegen, median og caudatus lobes har gått gjennom betydelig hypertrofi.
* = Svulst i dårligere høyre lapp, SRL = overlegen høyre lapp, ML = median lapp, CL = caudatus lapp. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7:. OR Table Setup polystyren puten er dekket av en steril klut. En bøyd åpen binders presses inn i puten i sin øvre ende ligger over pusterøret med munnstykke. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tidligere eksperimenter som utfører operasjonen i gnagere har vært i stand til å identifisere visse variabler som kan tjene som kilder for skjevhet. For å få pålitelige og gyldige resultater, bør du vurdere følgende forholdsregler.
Rutinemessig pre-op faste kan føre til lever steatose 12, som kan hemme leveren regenerering 13,14. Det anbefales derfor ikke. Den høyeste mitotisk aktivitet av hepatocytter varierer i løpet av dagen 15. Hvis det er mulig, å gjennomføre fremgangsmåten på et bestemt tidspunkt i løpet av dagen for alle grupper. Murine leveren regenerering er mest effektiv i dyr, 4-6 uker gamle. Dyr som er eldre enn 10 måneders alder har en betydelig redusert regenerering kapasitet 16. Bruk mus av samme rase, kjønn og alder for eksperimenter for å minimere sjansen for bias. Å arbeide i et sterilt miljø er generelt viktig i en åpen prosedyre som dette. Spesielt i immunsupprimerte organismer, som athymi c-mus som benyttes i video, er risikoen for infeksjon som kan føre til for tidlig død eller forutinntatt resultater, er høy. Driver på med en tre-sone-oppsett som består av et preparat, en operasjon og en utvinning området er derfor garantert 17. På grunn av sin dype hepatotoksiske effekter, er ofte brukt buprenorfin ikke anbefalt for intra- eller postoperativ smertestillende behandling 18,19. Bruk andre stoffer som carprofen eller metamizol å gi adekvat smertelindring. Siden metamizol er ikke tilgjengelig i mange land, kan karprofen også anvendes for smertekontroll etter inngrepet. Utfør en subkutan injeksjon av 5 mg / kg kroppsvekt én gang daglig i tre dager for å erstatte metamizol.
Postoperativ utvinning er best oppnås når utvinne musen er plassert i et varmt miljø med lett tilgang til mat og vann. Det er ideelt isolert fra andre mus over natten, for å hindre mer dominerende dyr fra å skade mer sårbare 17.
jove_content "> Selv om protokollen er meget enkel, er det noen mindre fallgruver å unngå ved å utføre denne type kirurgi i mus. Disseksjon av den falciform ligament, en struktur som forbinder den ventrale del av median flik til bukveggen, er avgjørende for å oppnå en hensiktsmessig leveren fleksibilitet. Ettersom dette leddbånd utvides til et område like i nærheten av stedet der den nedre vena cava forlater leveren kranialt, utvises forsiktighet for å hindre skade på denne store vene. i gjennomsnitt, dissekere det om lag tre fjerdedeler av måte vil sikre tilfredsstillende mobilisering og samtidig opprettholde tilstrekkelig avstand til fartøyet.Ved hjelp av riktig mengde spenning når ligere en lapp med en ligatur er en enormt viktig oppgave når du utfører reseksjon protokollen. Ligaturer med luft knop eller dårlig strammet ligaturer kan føre til mangelfullt avbrutt blodtilførsel, blødning, sjokk og død. På samme tid, en attempt til grundig stramme en ligatur knute kan føre til ligatur brudd med tilhørende skade på omliggende vev og organer. En effektiv måte å vurdere ligatur integritet er observasjon av cyanotisk fargeendring innenfor ligert lapp. Velge riktig sutur materialet spiller også en viktig rolle. Flettet suturer er mer sannsynlig å komprimere vev, mens monofilamentous materialer vil heller dissekere gjennom myk leveren vev og forårsaker blødning.
Et annet kritisk punkt når du fjerner leverlappene hos mus involverer riktig plassering av ligaturer. Ligering bør gjennomføres vinkelrett på hovedfartøy som kommer inn i fliker. Selv om dette er ganske enkel i median lapp, er tilstrekkelig fjerning av den venstre sidefliken mer utfordrende. Sine skip gå inn lapp i en ventro-kaudal retning. Som et resultat må ligatur tråd bli plassert langs en tenkt linje mellom den venstre utfall basen til dårligere høyre flik av liver.
I median lobe, kan imidlertid reseksjon kompromittere den nedre vena cava. På grunn av dette store fartøyet går gjennom ryggpartiet til nesen, er det utsatt for skade, som kan føre til levernekrose. Videre binde ligaturen med for mye strekk på dette området, kan føre til membranbrudd og / eller pneumothorax.
Tilstrekkelig behandling av tumorceller er også viktig ved forsøk på å oppnå sammenlignbare resultater. Selv om den eksakte cellekulturteknikker ikke er ment å være en del av denne protokollen, er håndteringen av tumorceller i fremgangsmåten like viktig som perfekt forberedelse på forhånd. Når du fyller sprøyten med kreftceller, er det viktig å holde det oppreist hele tiden. Major vipping av sprøyten kan resultere i tumorceller fester seg til den sprøyter veggen, og derfor resulterer i tap av celler ved tidspunktet for injeksjonen. Bare mindre tilting er hjemlet ved injeksjon, for å sette nålen pervinkelrett på den nedre høyre lapp overflate.
Blødning og peritoneal metastaser kan oppstå som følge av blødning og søl fra stikkstedet på leveren overflate. Derfor er svak komprimering av lobe med en bomullspinne i en periode på tre minutter viktig å kontrollere blødning fra leveren parenchyma og forhindre tumorcelle fluid lekker inn i peritoneum.
Publikasjoner som inneholder prosedyreprotokoller for intraabdominal operasjoner i gnagere sjelden inneholde informasjon om hvilken type mage nedleggelse. Likevel er dette aspektet en annen mulig kilde for komplikasjoner. Selv med adekvat smertekontroll, vil dyrene prøve å fjerne fremmedlegemer i sin bukveggen. Konsekvensene kan være intraabdominal infeksjon, en åpen buk eller død. Dette kan forhindres ved å utføre begge enkelt avbrutte sting for sårlukking i stedet for å kjøre en sutur og lukking av bukveggen i to lag.
Hunn atymiske nakne-foxn1nu / nu-mus (levert av Harlan Laboratories BV, Kreuzelweg 53, NL-5961 NM Horst) ble anvendt i dette eksperimentet. T-celle mangel denne rasen er kjent for tillater forholdsvis ubegrenset tumorvekst og derfor ideelle forhold for tumor-implantasjon. For å minimalisere påvirkning av klassifisering kamper blant dyrene, ble det bare hunndyr anvendt. Foreløpige resultater ved hjelp av ulike stammer som de C57BL / 6 Innavlete Mus har også vist betydelig, men likevel lavere volum tumorvekst. Således kan teknikken meget sannsynlig være praktisk mulig i enda flere musestammer.
Likevel, ved hjelp av immunsupprimerte organismer i denne innstillingen krever spesielle dyrehygieneregler, som patogener kan forstyrre tumorvekst 20. Tiltak som bruk av sentinel dyr å overvåke tilstedeværelsen av smittestoffer 21 som utføres i dyreforsøk anlegget vårt studie fant sted i kan være helpful i å oppdage mulige kilder til skjevhet.
Dette eksperimentet brukte en murine tykktarmskreft cellelinje kalt MC38 (hentet fra Institutt for klinisk kjemi ved Det medisinske fakultet i Mannheim, Tyskland). 5 x 10 5-tumorceller ble oppløst i 50 pl saltløsning. Konsentrasjonen ble bestemt i gangsetting, hvor dette beløpet ble identifisert som ideell for solid tumordannelse innen to uker. Avhengig av immunkompetanse av dyrene som benyttes i disse forsøk (se diskusjon ovenfor), kan det meget vel også være mulig å anvende humane tykktarmskreftceller, og dermed skape en xenograft. Innledende testing utført i atymiske nude-foxn1nu / nu mus med humane SW480 tumorceller var i stand til å demonstrere tumorvekst blant de overlevende lever etter reseksjon. På grunn av dimensjonen av murine lever, anbefales det å kun bruke volumer opp til 50 pl for å forebygge komplikasjoner. En mulig forbedring på dette punktet villevære å merke tumorceller med luciferase. Avhengig av problemet som er under etterforskning, kan det oppstå interessante opplysninger når tettere oppfølging av tumorcellevekst og størrelse er mulig.
Alternative måter å ligere leverlappene inkluderer klipping metode 22 eller et utklipp-suturering hybrid teknikk 23. Posisjonering av klipping enheter, men kan gjengi klipping metoder vanskelig. Tilstrekkelig utført sutur ligation forblir en lett å lære teknikk og er svært sannsynlig å være den mest kostnadseffektive måten å fjerne en lapp i dette eksperimentet.
Fordi levende dyr blir brukt i dette eksperimentet, det krever tillatelse fra de rette myndigheter. Avhengig av regionen, kan dette være en kostbar og tidkrevende oppgave. Selv etter offisiell godkjenning, dyreforsøk er langt mindre tilgjengelig enn forskningsmetoder som cellekultur testing eller molekylære metoder. I tillegg til infrastrukturen i etmoderne dyreforsøk anlegg, spesialutstyr må fordeles for å utføre protokollen. Videre bør en periode på to til fire uker bli planlagt å mestre denne teknikk. Denne protokollen kan anvendbar for et bredt spekter av cellelinjer i et stort antall av musestammer. Likevel, med hensyn til de mulige modifikasjoner som er nevnt ovenfor, ikke hver cellelinje kan bli studert i hver organisme.
En hovedmålet for undersøkende studier med denne protokollen vil være komplekse vekstfaktor system involvert i leveren regenerering og dens eksakte effekter på leveren kreft tilbakefall. For å undersøke disse mulige korrelasjoner tilstrekkelig, er det viktig å gjennomføre et dyreforsøk, i motsetning til forskjellige molekylmetoder eller cellekultur eksperimenter. Disse metodene bør heller brukes som gratis hjelp av etterforskningen. Selv om flere forskjellige leverreseksjon modeller har blitt publisert så langt 22-24, denne prosedyrenfor første gang gjennomfører samtidig tumorcelle-injeksjon i en veletablert operasjon.
Denne musemodell viser at leveren reseksjon i mus er en forholdsvis enkel, er det mulig og lett reproduserbar metode. Leveren regenerering etter små og store reseksjoner var i stand til å kompensere vevstap av hypertrofi i løpet av to uker. Mus tåler levervolumreduksjoner på opp til 70%.
Tumorceller var i stand til å vokse innenfor den rest leveren og kan etableres faste tumorer. Tumorvekst og tumorcelle-proliferasjon korrelert med mengden av resected levervev. Prosessen med reseksjon fører til en aktivering av tumorvekst i den gjenværende leveren, som ble uttrykt, ved større tumor vekter og volumer. Denne større grad av spredning kan bli demonstrert ved immunhistokjemi undersøkelser.
Det er velkjent at mengden av hepatisk regenerering factorer frigitt for leveren hypertrofi øker med graden av lever reseksjon 25,26. Derfor kan en kobling mellom lever restitusjon faktorer og tumorcellevekst eksisterer. Dette er i overensstemmelse med kliniske observasjoner hvor metastatisk tilbakefall korrelerer med mengden av metastaser i leveren før reseksjon. Levermetastaser som er synlige på preoperativ avbildning kan bare reflektere toppen av isfjellet mens mer, men likevel ikke oppdages tumorcelle innskudd, kan være til stede ved diagnose. Etter reseksjon leveren, kan hepatiske restitusjon faktorer deretter stimulere veksten av disse tumorceller, noe som til slutt blir tydelig når tilbakevendende metastaser.
Selv om korrelasjonen er nevnt ovenfor er meget sannsynlig, har det ikke vist seg så langt. Påvirkningen av lever regenerering mekanismer på intrahepatisk svulst fremgang krever derfor ytterligere molekylære analyser. Presise instruksjoner samt en illustrerende video tillate en rask adopsjonav den teknikk som innføres i denne video. Det kan tjene som grunnlag for ulike typer studier rundt om i verden som prøver å oppdage missing link i denne velkjente kjede av hendelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Spesielle bekreftelser gå til Dr. Benjamin Motsch for hans hjelp i tekniske spørsmål. Forfatterne ønsker også å erkjenne Dr. Marcus FÖRSCHNER og Birk Müller for sin multimediestøtte, Erica Magelky for henne redaksjonell kompetanse og Lisa Hornung, Dr. Roland Jurgons og professor Stephan von Horsten (alle fra Franz-Penzoldt-Center, University of Erlangen) for deres profesjonalitet i dyr håndtering og omsorg. Vi takker professor Michael Neumaier ved Institutt for klinisk kjemi, Medisinsk fakultet Heim ved Universitetet i Heidelberg, Tyskland for å gi MC38 tumorceller.
Dette arbeidet ble utført i oppfyllelse av kravene for å få graden "Dr. med." ved Friedrich-Alexander-universitetet Erlangen-Nürnberg (FAU).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Operation Microscope | Zeiss | OPMI-1 FC S21 | |
| Induction Cage (Plexiglas Box) | UNO BV, Netherlands | 180000132 | |
| Flowmeter + Connection Kit | UNO BV, Netherlands | 180000008 | |
| UNO Vaporizer Sigma Delta | UNO BV, Netherlands | 180000002 | |
| Key Filler for Anesthetic | UNO BV, Netherlands | 180000010 | |
| Activated Charcoal Filter Adsorber | UNO BV, Netherlands | 180000140 | |
| Gas Exhaust Unit | UNO BV, Netherlands | 180000118 | |
| Face Mask for mouse | UNO BV, Netherlands | 180000065 | |
| Vaporizer Stand | UNO BV, Netherlands | 180000006 | |
| Heat lamp | Physitemp Instruments | HL-1 | |
| Styrofoam Pad | RAYHER | 30074000 | |
| Third Hand Tool | TOOLCRAFT | ZD-10F | |
| Precision Scales | Kern | EW 220-3NM | |
| Scales | Kern | EMB 500-1 | |
| Sliding Caliper | MIB | MIB 82026100 | |
| Microdissection forceps | Braun/Aesculap | BD195R | |
| Microdissection scissors | Braun/Aesculap | FD100R | |
| Microdissection needle holder | Braun/Aesculap | BM563R | |
| Retractor | Fine Science Tools (F.S.T.) | No. 17001-0 | Type: Bowmann |
| Clamp | Braun/Aesculap | BJ002R | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Expendable Items (NOTE: Quantities are per animal and procedure) |
|||
| Foliodrape sterile cover (45 cm x 75 cm) | Hartmann | 2775001 | |
| Sterile Cotton Swabs (2x) | Hartmann | 4700151 | Peha |
| Sterile fluid (0.9% NaCl) | Braun | 3570310 | PZN=04454809 |
| Disinfectant (Softasept - 250 ml) | Braun | 3887138 | PZN=0762008808505018 |
| 2 x 1 ml syringe (Injekt-F ) | Braun | 9166017V | |
| 26 G canula (Sterican) - for Carprofen injection | Braun | 4665457 | |
| 30 G canula (Sterican) - for Tumor injection | Braun | 4656300 | |
| Caprofen (=Rimadyl) | Pfizer | QM01AE91 | |
| Metamizole (= Novaminsulfon) | Ratiopharm | 16543.00.00 | |
| 4-0 Vicryl suture | Ethicon | J835G | |
| 5-0 Prolene suture | Ethicon | 8618G | |
| SafeLock Flex-Tube 1.5 ml | Eppendorf | 22363778 | |
| 4 x 4 Gauze Sponge | Kendall/Covidien | UPC: 728795135355 | ASIN: B005BFQTWM |
| Large paperclip | ACCO | A7072510G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| Female athymic nude-foxn1nu/nu | Harlan Laboratories B.V. | Code 069 |
References
- Haggar, F. A., Boushey, R. P. Colorectal cancer epidemiology: incidence, mortality, survival, and risk factors. Clin. Colon Rectal Surg. 22, 191-197 (2009).
- Fong, Y., et al. Liver resection for colorectal metastases. J. Clin. Oncol. 15, 938-946 (1997).
- Kato, T., et al. Therapeutic results for hepatic metastasis of colorectal cancer with special reference to effectiveness of hepatectomy: analysis of prognostic factors for 763 cases recorded at 18 institutions. Dis. Colon Rectum. 46, S22-S31 (2003).
- Poston, G. J., et al. OncoSurge: a strategy for improving resectability with curative intent in metastatic colorectal cancer. J. Clin. Oncol. 23, 7125-7134 (2005).
- Neumann, U. P., Seehofer, D., Neuhaus, P. The surgical treatment of hepatic metastases in colorectal carcinoma. Dtsch Arztebl Int. 107, 335-342 (2010).
- Alwayn, I. P., et al. A critical role for matrix metalloproteinases in liver regeneration. J. Surg. Res. 145, 192-198 (2008).
- Fausto, N., Campbell, J. S., Riehle, K. J. Liver regeneration. Hepatology. 43, S45-S53 (2006).
- Fujiyoshi, M., Ozaki, M. Molecular mechanisms of liver regeneration and protection for treatment of liver dysfunction and diseases. J. Hepatobiliary. Pancreat. Surg. 18, 13-22 (2011).
- Jin, X., et al. Paradoxical effects of short- and long-term interleukin-6 exposure on liver injury and repair. Hepatology. 43, 474-484 (2006).
- Nakamura, T., Sakai, K., Nakamura, T., Matsumoto, K. Hepatocyte growth factor twenty years on: Much more than a growth factor. J. Gastroenterol. Hepatol. 26, 188-202 (2011).
- Van Sweringen, H. L., et al. CXC chemokine signaling in the liver: impact on repair and regeneration. Hepatology. 54, 1445-1453 (2011).
- Heijboer, A. C., et al. Sixteen hours of fasting differentially affects hepatic and muscle insulin sensitivity in mice. J. Lipid Res. 46, 582-588 (2005).
- Yang, S. Q., Lin, H. Z., Mandal, A. K., Huang, J., Diehl, A. M. Disrupted signaling and inhibited regeneration in obese mice with fatty livers: implications for nonalcoholic fatty liver disease pathophysiology. Hepatology. 34, 694-706 (2001).
- Selzner, M., Clavien, P. A. Failure of regeneration of the steatotic rat liver: disruption at two different levels in the regeneration pathway. Hepatology. 31, 35-42 (2000).
- Matsuo, T., et al. Control mechanism of the circadian clock for timing of cell division in vivo. Science. 302, 255-259 (2003).
- Iakova, P., Awad, S. S., Timchenko, N. A. Aging reduces proliferative capacities of liver by switching pathways of C/EBPalpha growth arrest. Cell. 113, 495-506 (2003).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J Vis Exp. , (2011).
- Skoulis, N. P., James, R. C., Harbison, R. D., Roberts, S. M. Depression of hepatic glutathione by opioid analgesic drugs in mice. Toxicol. Appl. Pharmacol. 99, 139-147 (1989).
- Berson, A., et al. Mechanisms for experimental buprenorphine hepatotoxicity: major role of mitochondrial dysfunction versus metabolic activation. J. Hepatol. 34, 261-269 (2001).
- Baker, D. G. Natural pathogens of laboratory mice, rats, and rabbits and their effects on research. Clin. Microbiol. Rev. 11, 231-266 (1998).
- FELASA working group on revision of guidelines for health monitoring of rodents and rabbits. FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units. Lab. Anim. 48, 178-192 (2014).
- Nikfarjam, M., Malcontenti-Wilson, C., Fanartzis, M., Daruwalla, J., Christophi, C. A model of partial hepatectomy in mice. J. Invest. Surg. 17, 291-294 (2004).
- Hori, T., et al. Simple and reproducible hepatectomy in the mouse using the clip technique. World J. Gastroenterol. 18, 2767-2774 (2012).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nat. Protoc. 3, 1167-1170 (2008).
- Sowa, J. P., et al. Extent of liver resection modulates the activation of transcription factors and the production of cytokines involved in liver regeneration. World J. Gastroenterol. 14, 7093-7100 (2008).
- Bonninghoff, R., et al. Effect of different liver resection methods on liver damage and regeneration factors VEGF and FGF-2 in mice. Can. J. Surg. 55, 389-393 (2012).
