Abstract
De hoge incidentie van de tumor recidief na resectie van metastatische lever laesies blijft een onopgelost probleem. Kleine tumorcel afzettingen, die niet detecteerbaar met routinematige klinische beeldvorming, kan worden gestimuleerd door groeifactoren na hepatische regeneratie leverresectie. Het is niet geheel duidelijk, maar welke factoren cruciaal voor tumorherval.
De gepresenteerde muismodel kan nuttig zijn om de mechanismen die een rol spelen bij de ontwikkeling van terugkerende kwaadaardige laesies te spelen na leverresectie verkennen. Het model combineert de eenvoudig te presteren en reproduceerbare technieken van gedefinieerde hoeveelheden leverweefsel verwijdering en tumor-inductie (door injectie) bij muizen. De dieren werden behandeld met een laparotomie, een 30% leverresectie, of 70% leverresectie. Alle dieren kregen vervolgens een tumorcel injectie in het resterende leverweefsel. Na twee weken van observatie, werden de levers en tumoren onderzocht op grootte en gewicht enonderzocht door immunohistochemie.
Na een 70% leverresectie werden de tumorvolume en gewicht aanzienlijk toegenomen in vergelijking met een laparotomie alleen (p <0,05). Bovendien, immunohistochemie (Ki67) vertoonden een verhoogde tumor proliferatiesnelheid in de resectie groep (p <0,05).
Deze bevindingen tonen de invloed van lever- regeneratie mechanismen op intrahepatische tumorgroei. In combinatie met methoden zoals histologische opwerking of RNA-analyse, kan de beschreven muismodel dienen als basis voor een grondig onderzoek van de verschillende factoren die betrokken zijn bij tumorgroei en metastatische ziekte herhaling binnen de lever. Een groot aantal variabelen zoals de lengte van postoperatieve waarneming de cellijn die voor injectie en het tijdstip van injectie en leverresectie bieden meerdere hoeken bij het verkennen van een specifieke vraag in verband met na hepatectomie metastasen. De beperkingen van deze procedure zijn de augangsnummer om de procedure op dieren, de toegang uit te voeren om een passende dierproeven faciliteit en de aankoop van bepaalde apparatuur.
Introduction
Colorectale kanker (CRC) is goed voor bijna 9% van alle kwaadaardige tumoren. Het is de derde meest voorkomende kanker, zowel in de Verenigde Staten en wereldwijd. Global sterftecijfers van CRC variëren van 300.000 tot meer dan 500.000 per jaar 1. Twintig procent van de patiënten last van levermetastasen na ontdekking van hun colorectale tumor. Resectabele uitzaaiingen worden doorgaans behandeld door een partiële leverresectie 2,3. Verbeterde operatietechnieken, multimodale nieuwe strategieën en nieuwe definities van resectabele metastasen maken de therapie van een partiële leverresectie mogelijk een toenemend aantal patiënten 4.
Herhaling van de secundaire lever maligniteiten, echter, is een uitdagende klinische sequalae in moderne gastro-intestinale chirurgie. Patiënten met CRC die resectie van leveruitzaaiingen onderging een kans hebben op het ontwikkelen van een nieuwe tumor in hun overblijfsel lever 5 30 tot 50%. Daarom is er behoefte aan verder onderzoek naar demechanismen betrokken bij herhaling van leveruitzaaiingen.
Een leverresectie van ongeveer 70% wordt normaal binnen een paar weken gecompenseerd door de resterende leverweefsel. Deze regeneratie omvat meerdere mechanismen, waaronder cytokinen zoals interleukine 6 (IL-6), tumornecrosefactor alfa (TNF-α), hepatocyt groeifactor (HGF), transformerende groeifactor beta (TGF-β), vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF ), matrix-metalloproteasen (MMP-2 en MMP-9) en CXC-chemokinen 6-11. Deze stoffen ondersteunen de lever regeneratie en kan ook verantwoordelijk zijn voor de hoge herhaling tarieven van primaire en secundaire lever maligniteiten worden door het induceren van de groei van kleine tumorcel deposito's in de resterende lever, die niet door de dagelijkse klinische beeldvorming worden gedetecteerd. Deze causaliteit niet is tot nu toe bewezen.
De volgende hypothese werd opgericht. Na een partiële leverresectie, de proliferatie factoren die verantwoordelijk zijn voor levender hypertrofie kan ook induceren van de groei van eerder onbekende tumorcellen in de lever. Een muis model werd ontworpen die de technieken van leverresectie en tumor inductie gecombineerd. Dertig athymische naakt-foxn1nu / nu-muizen werden verdeeld in drie groepen van tien dieren elk. Elk van hen werd behandeld met ofwel een laparotomie alleen (groep A), een 30% leverresectie (groep B) of 70% leverresectie (groep C). Dieren in alle groepen Vervolgens ontving een injectie van tumorcellen in een bepaalde resterende deel van de lever, slapende tumorcellen te simuleren. Dieren werden waargenomen gedurende twee weken en vervolgens geëvalueerd voor tumorgroei en de lever hypertrofie.
Het doel was een model dat kan worden gebruikt om te zoeken naar de moleculaire en pathogenetische factoren die een rol in de hepatectomie tumorvorming kunnen spelen maken. Deze methode kan nuttig zijn bij de beoordeling zijn: de oorsprong van endocriene factoren die betrokken zijn in leverregeneratie; de verantwoordelijke mechanismen voor het intrahepatische tumof groei na leverresectie; en de lever resectie volume nodig is voor intrahepatische tumorgroei inductie. De volgende methode is alleen uitgevoerd op dieren omdat ze beloven bijdragen aan het begrijpen van fundamentele biologische principes en de ontwikkeling van kennis die kan worden verwacht mens door betere behandelingsmogelijkheden profiteren. Ook de aanwezigheid in deze zaken mechanismen, moest in vivo worden onderzocht, zoals in vitro werkwijzen een realistische weergave van de menselijke pathologie niet kunnen bepalen.
Deze onderzoeken kunnen leiden tot de ontdekking van de relevante doelstellingen voor profylactische behandeling opties voor het verminderen van de tumor herhaling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De regering van het Midden-Franken in Beieren, Duitsland, verleende toestemming voor de beschreven procedures. Elke soortgelijke experimenten vereisen voorafgaande toestemming van de bevoegde autoriteiten.
Opmerking: De volgende handleiding kan worden gebruikt voor eerder besproken groepen A tot C. stappen die moeten worden weggelaten in groepen A en B zijn overeenkomstig gekenmerkt.
1. Voorbereidingen
- Trek handschoenen aan, plaats de polystyreen pad onder de microscoop, en de focus van de lens op het gebied iets boven het pad.
- Splits de steriele vel en plaats de helft over de polystyreen pad en de andere helft net ernaast.
- Steriliseer de chirurgische instrumenten en leg ze op een steriele blad naast het polystyreen pad.
- Plooi een grote paperclip om een boog te vormen. Draai hem ondersteboven en druk het in de polystyreen pad aan de bovenkant - net naast de plek waar het hoofd van het dier zal liggen.
- Het mondstuk van de verstuiver tussen de twee ledematens van de boog. (Figuur 7)
- Stel een warmtelamp ongeveer 40 cm van de plaats waar het hoofd van het dier komt te liggen. Controleer de warmte ter hoogte van het polystyreen blok niet meer dan 40 ° C.
- Bereid een aparte kooi voor geopereerde dieren.
- Bereid een bepaalde hoeveelheid en volume (maximaal 50 pl) van tumorcellen in een flexibele buis te slaan op ijs.
2. Anesthesie
- Plaats de muis in een plexiglas doos en beginnen anesthetische inductie bij hoge stroomsnelheid isofluraan (5% isofluraan bij een stroomsnelheid van 10 l / min).
- Na het doorlopen van de verschillende stadia van anesthesie, verwijdert de muis uit het vak plexiglas net na het stadium van agonaal ademhalen, die gemakkelijk door een drastische verlaging van de ademhalingsfrequentie (<20 / min) en diepe stoten schudden herkenbaar is getreden hele lichaam dier.
- Plaats snel het dier buik-up op de steriele laken bedekt polystyreen pad en ga verderventilatie op low-flow isofluraan door het invoegen van de snuit van de muis in het mondstuk om anesthesie te handhaven. Gebruik inspiratoire fractie van 1,8-2,2% bij een stroomsnelheid van ongeveer 1 l / min.
- Evalueer de diepte van de anesthesie tijdens de operatie door het berekenen van de ademhalingsfrequentie, die idealiter tussen 45 en 60 ademhalingen per minuut. Pas de inspiratoire isofluraan fractie daarvan als dit niet het geval.
Let op: Veranderingen in de ingeademde isofluraan fractie duurt ongeveer 60 seconden totdat ze van kracht worden. Vermijd het snel uitvoeren van drastische veranderingen. In plaats daarvan, aan te passen toepassing van de verdoving geleidelijk.
3. Bediening
- Ontsmet de borst en buik met een adequate ontsmettingsmiddel en daarna handschoenen te veranderen.
- Injecteer een op gewicht aangepaste volume van carprofen (5 mg / kg lichaamsgewicht) in de dij van het dier.
- Knijp de buikhuid met een tang te testen of de diepte van de anesthesie voldoende.
- ontleden voorzichtig het gebied rond de zwaardvormig om blootstellen van het omringende weefsel.
- Plaats een verblijf hechtdraad door de zwaardvormig (van binnen naar buiten) welke beide draden om de houder boven de dieren hoofd gebruik van de klem.
- Knijp de ledematen van de retractor samen en langzaam introduceren de "U" -vormige retractor tips langs interne buikwand van het dier.
Opmerking: Deze maatregelen blootstellen lever toegang tot de verschillende lobben vergemakkelijken. De identificatie van mediaan en linkse laterale kwab van de lever moet nu mogelijk. - Gebruik een zoutoplossing gedrenkte wattenstaafje en duw de mediaan kwab naar beneden. Ontleden de ventrale driekwart van de ligamentum falciforme, die nu zichtbaar oppervlak tussen de mediaan kwab en het membraan zal zijn.
- Nu, gebruik maken van twee-zoutoplossing gedrenkte wattenstaafjes om de mediaan te verschuivenkwab en de linker laterale kwab boven tegen het middenrif.
- Visualiseer de dun membraan tussen de linker laterale lob en de Spiegelse kwab en zorgvuldig ontleden.
Opmerking: Bij het uitvoeren van dit protocol voor dieren uit groep A, springen naar stap 3.18 op dit punt. - Plaats een grootte 4-0 ligatuur diagonaal langs de basis van de linker laterale kwab's.
- Vervolgens gebruikt de wattenstaafje de linker laterale lob terugkeren naar zijn oorspronkelijke positie.
- das voorzichtig de ligatuur zo dicht mogelijk bij de basis van de kwab's mogelijk en beoordelen op kleurverandering in de kwab om te testen op adequate wijze onderbroken bloedtoevoer.
- Resectie van de linker laterale kwab door het volgen van de lijn van de basis van de kwab's en noteer het gewicht van de resected kwab's.
Opmerking: Bij het uitvoeren van dit protocol voor dieren uit groep B, springen naar stap 3.18 op dit punt. - Plaats een tweede ligatuur tussen stronk de linker laterale kwab en de basis van de mediaan kwab's.
- Verplaats de mediaan kwab als well en bind de ligatuur. Nogmaals, beoordeel kleurverandering in de lob testen om adequaat onderbroken bloedtoevoer.
- Resectie de mediaan kwab en noteer het gewicht.
- Sluit de spuit 1 ml naar 30 G naald en vullen met de tumorcellen van de flexibele buis niet worden gekanteld de injectiespuit op elk moment.
- Gebruik het wattenstaafje naar de intestinale lussen links van het dier om de onderste rechter kwab bloot bewegen.
- Plaats de cel geladen injectiespuit in de "derde hand" apparaat bij een 30 ° hoek met de verticaal.
- Beweeg voorzichtig het apparaat naast de muis met de naald net boven de onderste juiste kwab.
- vooruit langzaam de spuit in de derde hand apparaat totdat de punt van de naald is in de lagere juiste kwab het middelste gedeelte.
- Injecteer het gehele volume in de kwab middengedeelte gedurende 30-45 sec.
- Comprimeer de injectieplaats gedurende ten minste drie minuten tot bloeden is gestopt.
- Sluit de fascia met een resorbeerbare 5-0 hechtdraad met behulp van één enkele knop knopen.
- Sluit de huid met 4-0, niet-resorbeerbare hechtdraad middels een knop knopen.
- Start ventileren met de muis op high flow zuurstof voor ongeveer 1 minuut.
4. Post-procedure op
- Plaats het dier in een warme omgeving (ongeveer 40 ° C) het volgende half uur voldoende herstel te garanderen.
- Vermengen drinkwater van het dier met 5 mg / ml metamizol gedurende 72 uur postoperatief.
- Controleer de integriteit van de hechtingen nauwkeurig ten minste drie dagen na de procedure.
5. waarnemingsperiode en euthanasie
- Meet het gewicht van het dier per dag voor een totaal van 14 dagen. Score hen met betrekking tot hun respectievelijk welzijn en beperkingen.
- Na 14 dagen, verdoven het dier volgende stappen 2.1 en 2.2 van het operatieve protocol eennd doorgaan met protocol instelling voor dierlijke euthanasie.
- Voer een mediane laparotomie zoals beschreven in stap 3.4. Om de toegang tot de buik te vergemakkelijken, verlengen cm caudaal incisie 1-1,5. Steek de retractor zoals in 3.7.
- Ontleden langs de rest van de falciform ligament en snijd de onderste vena cava net als verlaat de lever craniaal.
- Scheiden van de lever van het middenrif, door grijpen het membraan met de tang en bot ontleden in de ruimte tussen de lever en spieren.
- Til de gemobiliseerd leverweefsel van de retroperitoneum en ontleden het van de resterende structuren is nog steeds verbonden aan: retroperitoneale vetweefsel, de vena cava inferior en de poortader.
- Inspecteer de lever na extractie voor aanvullende weefsel valselijk zal bijdragen tot de werkelijke grootte en gewicht. Een geëxtraheerde lever en de tumor worden weergegeven in figuur 6.
- Ontleden de tumor van de inferior juiste kwab.
- Meten van de grootte en het gewicht van zowel de tumor en de lever parenchym.
- Behoud extra weefselmonsters van het peritoneum, lymfeklieren of andere organen, dat bij weefselanalyse
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In onze specifieke experiment, inclusief we 30 athymische naakt-foxn1nu / nu-muizen. Zij kregen een mediane laparotomie tumorcel injecties van 500.000 MC38 tumorcellen (opgelost in 50 pl zoutoplossing), en werden vervolgens behandeld met een 70% leverresectie, een 30% leverresectie, of geen verdere interventie.
Na 14 dagen, bijna volledige herstel van de lever na resterende 30% of 70% leverresecties (leverhypertrofie-index van 30% leverresectie fractie was 1,06 versus 0,8 van 70% leverresectie groep) waargenomen.
Na een laparotomie, het gemiddelde gewicht van intrahepatische tumoren was 332 mg (bereik: 10-608 mg). Het gemiddelde tumorgewicht van intrahepatische tumoren was 656 mg (range: 76-1,873 mg) na een 30% leverresectie vs. 961 mg (bereik: 189 Mg- 3030 mg) na een 70% leverresectie met p & #60; 0,05 (figuur 1). Na een 30% leverresectie, tumor volume was 950 mm 3 (range: 439-2,326 mm 3) vs. 1385 mm 3 (range: 411-2,366 mm 3) na een 70% leverresectie en 511 mm 3 (range: 87-1,693 mm 3) na een laparotomie alleen voor p <0,05 (figuur 2).
Weefselsecties uit het tumorweefsel genomen en geanalyseerd via KI-67 immunohistochemie. Cellen op de objectglaasjes werden geëvalueerd met betrekking tot hun proliferatiesnelheid. De gemiddelde proliferatiesnelheid van tumorcellen uit de groep laparotomie was 47% (traject: 39-56%) in vergelijking met 61% (traject: 51-69%) van dieren die een leverresectie van 70% (p <0,05) hadden ondergaan en 53% (bereik: 38-69%) van dieren die een lever resectie van 30% (p = 0,22), waaruit een verhoogde graad van celproliferatie in groepen die leverresectie ondergingen hadden ondergaan (figuur 3 - 5).
Figuur 1:. Gewicht Intrahepatische Tumoren Het diagram vergelijkt het gemiddelde tumorgewicht tussen groepen A, B en C na dissectie van de lever en de shows toegenomen gewicht in tumoren van groep B en C. Fout balken geven SEM. Klik hier om te bekijken grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2:. Hoeveelheid Intrahepatic tumoren De grafiek vergelijkt het gemiddelde tumorvolume bij groepen A, B en C na dissectie van de lever en shows grotere hoeveelheden in tumoren van groep B en C. foutbalken SEM. ank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: proliferatiesnelheid in tumoren van groep A. KI-67 Immunohistochemie van een dia van een tumor specimen uit groep A toont milde proliferatie van tumorcellen. Schaal bar = 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Proliferatie Rate in tumoren van Groep B. KI-67 Immunohistochemie van een dia van een tumor specimen uit groep B demonstreert gematigde proliferatie van tumorcellen. Schaal bar = 100 micrometer.krijgen = "_ blank"> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Proliferatie Rate in tumoren van Groep C. KI-67 Immunohistochemie van een dia van een tumor specimen uit groep C toont duidelijke proliferatie van tumorcellen. Schaal bar = 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Gehaald Lever / Tumor specimen uit groep B. Dit lever werd geëxtraheerd 14 dagen na het uitvoeren van een 30% leverresectie en gelijktijdige tumorcel injectie. Een grote tumor in de juiste onderkwab te zien, terwijl de rechter superieure, mediaan en caudatus kwabs zijn gegaan door significante hypertrofie.
* = Tumor in de lagere juiste kwab, SRL = superieure juiste kwab, ML = mediaan kwab, CL = Spiegelse kwab. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7:. OR Tabelinstelling Het polystyreen pad is bedekt met een steriele doek. Een gebogen geopend paperclip is in het kussen gedrukt aan de bovenzijde bovenop de beademingsbuis met mondstuk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eerdere experimenten uitvoeren van chirurgie in knaagdieren zijn in staat om bepaalde variabelen die als bronnen voor vertekening kunnen dienen identificeren. Met het oog op een betrouwbare en valide resultaten te verkrijgen, rekening houden met de volgende voorzorgsmaatregelen.
Routine pre-op vasten kan leiden tot lever steatose 12, die leverregeneratie 13,14 kunnen remmen. Het is daarom niet aanbevolen. De hoogste mitotische activiteit van hepatocyten varieert gedurende de dag 15. Indien mogelijk, voeren de procedures op een bepaald moment van de dag voor alle groepen. Murine leverregeneratie het meest effectief bij dieren 4-6 weken oud. Dieren ouder dan 10 maanden een significant verminderde regeneratievermogen 16. Gebruik muizen van hetzelfde ras, geslacht en leeftijd voor de experimenten om de kans op vertekening te minimaliseren. Werken in een steriele omgeving is in het algemeen belang in een open procedure als deze. Met name in immuungecompromitteerde organismen, zoals athymi c muizen gebruikt in de video, het risico van infectie, wat kan leiden tot voortijdige dood of vertekende resultaten, is hoog. Het nastreven van een drie-zone-installatie, bestaande uit een preparaat, een operatie en een herstel gebied is daarom geboden 17. Vanwege zijn diepe hepatotoxische effecten, wordt vaak gebruikt buprenorfine niet aanbevolen voor intra- of postoperatieve pijnstillende therapie 18,19. Gebruik maken van andere stoffen, zoals carprofen of metamizool om adequate pijnstilling te verschaffen. Aangezien metamizool is niet beschikbaar in een groot aantal landen, kan carprofen ook worden gebruikt voor pijnbestrijding na de ingreep. Voer een subcutane injectie van 5 mg / kg lichaamsgewicht eenmaal per dag gedurende drie dagen metamizool vervangen.
Postoperatief herstel wordt het best bereikt wanneer de herstellende muis wordt geplaatst in een warme omgeving met gemakkelijke toegang tot voedsel en water. Het is ideaal geïsoleerd van andere muizen 's nachts, om te voorkomen dat meer dominante dieren schaden meer kwetsbare 17.
jove_content "> Hoewel het protocol is zeer eenvoudig, er enkele kleine valkuilen te vermijden bij het uitvoeren van dit soort chirurgie in muizen. Ontleding van het ligamentum falciforme een structuur verbindt het ventrale aspect van de mediaan kwab de buikwand is essentieel bereiken passende soepelheid lever. Aangezien dit ligament uitgevouwen tot een gebied vlak bij het punt waar de onderste vena cava verlaat de lever craniaal is voorzichtigheid geboden om schade aan dit grote ader voorkomen. gemiddeld ontleden ongeveer driekwart van de zal leiden tot bevredigende mobilisatie en tegelijkertijd handhaven voldoende afstand tot het schip.Met behulp van de juiste hoeveelheid spanning wanneer ligeren een kwab met een ligatuur is een enorm belangrijke taak bij het uitvoeren van de resectie protocol. Ligatures met lucht knopen of slecht aangescherpt ligaturen kan leiden tot onvoldoende onderbroken bloedtoevoer, bloedingen, shock en de dood. Tegelijkertijd een attempt grondig te scherpen een ligatuur knoop kan resulteren in ligatuur breuk met bijbehorende schade aan de omliggende weefsels en organen. Een effectieve manier van beoordelen van ligatuur integriteit is de observatie van cyanotische kleurverandering binnen de geligeerde kwab. De juiste hechtmateriaal speelt ook een belangrijke rol. Gevlochten hechtingen hebben meer kans om weefsel te comprimeren, terwijl monofilamentous materialen in plaats zal ontleden door het zachte leverweefsel en veroorzaakt bloedingen.
Een andere belangrijke stap bij het verwijderen van de lever kwabben in muizen impliceert juiste positionering van ligaturen. Ligatie moet worden uitgevoerd loodrecht op de hoofdleiding vaartuigen die de lobben. Hoewel dit is vrij eenvoudig in de mediaan kwab, adequate resectie van de linker laterale kwab is een grotere uitdaging. De schepen voeren de lob in een ventro-caudale richting. Dientengevolge moet de ligatuur draad langs een denkbeeldige lijn geplaatst tussen de linker longe basis om de onderste rechter kwab van de liver.
Middendoor kwab echter resectie kan de inferior vena cava compromitteren. Omdat deze grote vat via het dorsale gedeelte van de nok draagt, niet gevoelig voor schade, wat kan leiden tot levernecrose. Bovendien, het binden van de ligatuur met te veel spanning op dit gebied, kan resulteren in membraanbreuksensor en / of pneumothorax.
Adequate behandeling van tumorcellen is ook belangrijk wanneer het proberen om vergelijkbare resultaten te verkrijgen. Hoewel de exacte celkweek technieken niet bedoeld om een deel van dit protocol, de behandeling van tumorcellen in de procedure is even belangrijk als perfecte voorbereiding vooraf. Bij het vullen van de injectiespuit met de tumorcellen, is het essentieel om rechtop te allen tijde. Grote kanteling van de spuit kan in tumorcellen hechten aan de wand spuiten, dus ertoe leiden dat de cellen op het moment van injectie. Alleen kleine kanteling gerechtvaardigd op het moment van injectie, teneinde de naald per invoegenloodrecht staat op het oppervlak van de onderste rechter kwab.
Bloeding en peritoneale metastasen kunnen optreden als gevolg van bloeden en olie die uit de prikplaats op het oppervlak van de lever. Derhalve lichte druk van de lob met een wattenstaafje gedurende drie minuten essentieel controle bloeden uit de lever parenchym en voorkomen tumorcel fluïdum lekt in het peritoneum.
Publicaties die procedure protocollen voor intra-abdominale operaties in knaagdieren bevatten zelden informatie over het type van abdominale sluiting. Toch is dit aspect is een andere mogelijke bron van complicaties. Zelfs bij adequate pijnbestrijding, zullen dieren proberen om de vreemde voorwerpen in hun buikwand te verwijderen. Gevolgen kunnen intra-abdominale infectie, een open buik, of zelfs de dood. Dit kan worden voorkomen door zowel het uitvoeren van één onderbroken st voor wondsluiting in plaats van een doorlopende draad en sluiten van de buikwand in twee lagen.
Vrouwelijke athymische naakt-foxn1nu / nu muizen (geleverd door Harlan Laboratories BV, Kreuzelweg 53, NL-5961 NM Horst) werden in dit experiment. De T-cel-deficiëntie dit ras is bekend om toestaat relatief onbeperkte tumorgroei en dus ideale omstandigheden voor tumor implantatie. Om de invloed van rangschikking gevechten tussen de dieren te minimaliseren werden slechts vrouwelijke dieren gebruikt. Voorlopige resultaten met behulp van verschillende stammen zoals C57BL / 6 inteeltmuizen ook gebleken significant, maar lager volume tumorgroei. Aldus kan de techniek waarschijnlijk praktisch in nog muizenstammen.
Toch is het gebruik van een verzwakt immuunsysteem organismen in deze instelling vereist speciale dier hygiënische voorzorgsmaatregelen, zoals ziekteverwekkers kunnen interfereren met de tumorgroei 20. Maatregelen zoals het gebruik van verklikkerdieren van de aanwezigheid van ziekteverwekkers 21 monitoren zoals uitgevoerd in de dierproeven faciliteit ons onderzoek vond plaats in kan helpfu zijnl bij het opsporen van mogelijke bronnen van vertekening.
Dit experiment gebruikt een muizen colorectale kanker cellijn genaamd MC38 (verkregen van het Institute of Clinical Chemistry aan de Medische Faculteit van Mannheim, Duitsland). 5 x 10 5 tumorcellen werden opgelost in 50 pi zoutoplossing. De concentratie werd bepaald in voorlopige experimenten, waarbij deze hoeveelheid werd geïdentificeerd als geschikt voor vaste tumorvorming binnen twee weken. Afhankelijk van de immunocompetentie van de dieren die in deze experimenten (zie bespreking hierboven), kan het heel goed mogelijk om humane colorectale kankercellen gebruiken en daardoor een xenograft te maken. Eerste tests uitgevoerd in athymische naakt-foxn1nu / nu-muizen met menselijke SW480 tumorcellen was in staat om succesvol te demonstreren tumorgroei in het overblijfsel lever na resectie. Vanwege de afmeting van murine lever, wordt aanbevolen alleen gebruik volumestromen tot 50 pi om complicaties te voorkomen. Een mogelijke verbetering op dit punt zouom tumorcellen label met luciferase. Afhankelijk van het probleem dat wordt onderzocht, kunnen interessante informatie ontstaan wanneer beter toezicht op tumorcelgroei en grootte mogelijk.
Alternatieve manieren van het ligeren van de lever lobben zijn de clipping-methode 22 of een clipping-hechten hybride techniek 23. Plaatsing van clipping inrichtingen kan echter het knippen methoden bemoeilijken. Adequaat uitgevoerd hechtdraad ligation blijft een eenvoudig te gebruiken techniek te leren en is zeer waarschijnlijk de meest kosteneffectieve manier van het verwijderen van een kwab in dit experiment zijn.
Omdat levende dieren gebruikt voor dit experiment vereist voorafgaande toestemming door de relevante autoriteiten. Afhankelijk van de regio, kan dit een kostbare en tijdrovende taak zijn. Zelfs na een officiële goedkeuring, dierproeven zijn veel minder toegankelijk dan onderzoeksmethoden, zoals celkweek testen of moleculaire methoden. Naast de infrastructuur van eenmoderne dierproeven faciliteit, speciale apparatuur heeft om het protocol uit te voeren om te wijzen. Bovendien moet een periode van twee tot vier weken worden gepland om deze techniek te beheersen. Dit protocol kan van toepassing zijn voor een breed scala van cellijnen in een groot aantal van de muis stammen. Maar met betrekking tot de mogelijke wijzigingen bovengenoemde niet elke cellijn worden bestudeerd in elk organisme.
Een van de belangrijkste doelstelling van onderzoekende studies met behulp van dit protocol wordt het complex growth factor systeem betrokken bij leverregeneratie en de precieze effecten op de lever maligniteit herhaling zijn. Om deze mogelijke correlaties afdoende te onderzoeken, is het essentieel voor dierproeven voeren, in tegenstelling tot verschillende moleculaire methoden of celkweek experimenten. Deze methoden veeleer moet worden gebruikt als een gratis middel van onderzoek. Hoewel verschillende leverresectie modellen 22-24 dusver gepubliceerd, deze procedurevoor het eerst uitvoert gelijktijdige injectie van tumorcellen in een gevestigde operatie.
Dit muismodel zien dat leverresectie bij muizen is een vrij eenvoudig, uitvoerbaar en gemakkelijk reproduceerbare wijze. regeneratie van de lever na kleine en grote resecties kon het weefselverlies door hypertrofie compenseren binnen twee weken. Muizen kunnen verwerken levervolume kortingen tot 70%.
Tumorcellen kunnen groeien in het overblijfsel lever en vaste tumoren kan worden vastgesteld. Tumorgroei en tumorcelproliferatie gecorreleerd met de hoeveelheid resected leverweefsel. Het proces van resectie leidt tot een activering van tumorgroei in de resterende lever, die werd uitgedrukt door een grotere tumoren gewichten en volumes. Deze grotere proliferatie kon worden aangetoond door immunohistochemie onderzoeken.
Het is algemeen bekend dat de hoeveelheid leverregeneratie factors vrijgegeven voor leverhypertrofie neemt toe met de omvang van de lever resectie 25,26. Daarom kan een verbinding tussen leverregeneratie factoren en tumorcelgroei bestaan. Dit is in overeenstemming met klinische waarnemingen waarbij uitgezaaide herhaling correleert met het aantal metastasen in de lever voorafgaand aan resectie. Levermetastasen die zichtbaar zijn op preoperatieve beeldvorming kan geven alleen het topje van de ijsberg terwijl meer, maar niet detecteerbaar tumorcel afzettingen kunnen aanwezig diagnose. Na leverresectie, hepatische regeneratie factoren stimuleren dan de groei van deze tumorcellen die uiteindelijk duidelijk worden wanneer terugkerende metastasen.
Hoewel de bovengenoemde correlatie is zeer waarschijnlijk het is tot nu toe niet bewezen. De invloed van de lever regeneratie mechanismen op intrahepatische tumor vooruitgang vergt daarom verder moleculaire analyses. Nauwkeurige instructies alsmede een illustratieve video maken een snelle goedkeuringvan de geïntroduceerde in deze video-techniek. Het kan dienen als basis voor verschillende soorten van studies over de hele wereld die proberen om de ontbrekende schakel in dit bekende keten van gebeurtenissen te ontdekken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Speciale bevestigingen naar Dr. Benjamin Motsch voor zijn hulp bij technische vragen. De auteurs willen ook graag Dr. Marcus Forschner en Birk Müller erkennen voor hun multimedia-ondersteuning, Erica Magelky voor haar redactionele expertise en Lisa Hornung, Dr. Roland Jurgons en Professor Stephan von Hörsten (allemaal uit de Franz-Penzoldt-Center, University of Erlangen) voor hun professionaliteit in dierlijke behandeling en zorg. Wij danken Professor Michael Neumaier aan het Instituut voor Klinische Chemie, Medische Faculteit Mannheim van de Universiteit van Heidelberg, Duitsland voor het verstrekken van MC38 tumorcellen.
Het huidige werk werd uitgevoerd in de nakoming van de voorwaarden voor het behalen van het diploma "Dr. med." aan de Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Operation Microscope | Zeiss | OPMI-1 FC S21 | |
| Induction Cage (Plexiglas Box) | UNO BV, Netherlands | 180000132 | |
| Flowmeter + Connection Kit | UNO BV, Netherlands | 180000008 | |
| UNO Vaporizer Sigma Delta | UNO BV, Netherlands | 180000002 | |
| Key Filler for Anesthetic | UNO BV, Netherlands | 180000010 | |
| Activated Charcoal Filter Adsorber | UNO BV, Netherlands | 180000140 | |
| Gas Exhaust Unit | UNO BV, Netherlands | 180000118 | |
| Face Mask for mouse | UNO BV, Netherlands | 180000065 | |
| Vaporizer Stand | UNO BV, Netherlands | 180000006 | |
| Heat lamp | Physitemp Instruments | HL-1 | |
| Styrofoam Pad | RAYHER | 30074000 | |
| Third Hand Tool | TOOLCRAFT | ZD-10F | |
| Precision Scales | Kern | EW 220-3NM | |
| Scales | Kern | EMB 500-1 | |
| Sliding Caliper | MIB | MIB 82026100 | |
| Microdissection forceps | Braun/Aesculap | BD195R | |
| Microdissection scissors | Braun/Aesculap | FD100R | |
| Microdissection needle holder | Braun/Aesculap | BM563R | |
| Retractor | Fine Science Tools (F.S.T.) | No. 17001-0 | Type: Bowmann |
| Clamp | Braun/Aesculap | BJ002R | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Expendable Items (NOTE: Quantities are per animal and procedure) |
|||
| Foliodrape sterile cover (45 cm x 75 cm) | Hartmann | 2775001 | |
| Sterile Cotton Swabs (2x) | Hartmann | 4700151 | Peha |
| Sterile fluid (0.9% NaCl) | Braun | 3570310 | PZN=04454809 |
| Disinfectant (Softasept - 250 ml) | Braun | 3887138 | PZN=0762008808505018 |
| 2 x 1 ml syringe (Injekt-F ) | Braun | 9166017V | |
| 26 G canula (Sterican) - for Carprofen injection | Braun | 4665457 | |
| 30 G canula (Sterican) - for Tumor injection | Braun | 4656300 | |
| Caprofen (=Rimadyl) | Pfizer | QM01AE91 | |
| Metamizole (= Novaminsulfon) | Ratiopharm | 16543.00.00 | |
| 4-0 Vicryl suture | Ethicon | J835G | |
| 5-0 Prolene suture | Ethicon | 8618G | |
| SafeLock Flex-Tube 1.5 ml | Eppendorf | 22363778 | |
| 4 x 4 Gauze Sponge | Kendall/Covidien | UPC: 728795135355 | ASIN: B005BFQTWM |
| Large paperclip | ACCO | A7072510G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| Female athymic nude-foxn1nu/nu | Harlan Laboratories B.V. | Code 069 |
References
- Haggar, F. A., Boushey, R. P. Colorectal cancer epidemiology: incidence, mortality, survival, and risk factors. Clin. Colon Rectal Surg. 22, 191-197 (2009).
- Fong, Y., et al. Liver resection for colorectal metastases. J. Clin. Oncol. 15, 938-946 (1997).
- Kato, T., et al. Therapeutic results for hepatic metastasis of colorectal cancer with special reference to effectiveness of hepatectomy: analysis of prognostic factors for 763 cases recorded at 18 institutions. Dis. Colon Rectum. 46, S22-S31 (2003).
- Poston, G. J., et al. OncoSurge: a strategy for improving resectability with curative intent in metastatic colorectal cancer. J. Clin. Oncol. 23, 7125-7134 (2005).
- Neumann, U. P., Seehofer, D., Neuhaus, P. The surgical treatment of hepatic metastases in colorectal carcinoma. Dtsch Arztebl Int. 107, 335-342 (2010).
- Alwayn, I. P., et al. A critical role for matrix metalloproteinases in liver regeneration. J. Surg. Res. 145, 192-198 (2008).
- Fausto, N., Campbell, J. S., Riehle, K. J. Liver regeneration. Hepatology. 43, S45-S53 (2006).
- Fujiyoshi, M., Ozaki, M. Molecular mechanisms of liver regeneration and protection for treatment of liver dysfunction and diseases. J. Hepatobiliary. Pancreat. Surg. 18, 13-22 (2011).
- Jin, X., et al. Paradoxical effects of short- and long-term interleukin-6 exposure on liver injury and repair. Hepatology. 43, 474-484 (2006).
- Nakamura, T., Sakai, K., Nakamura, T., Matsumoto, K. Hepatocyte growth factor twenty years on: Much more than a growth factor. J. Gastroenterol. Hepatol. 26, 188-202 (2011).
- Van Sweringen, H. L., et al. CXC chemokine signaling in the liver: impact on repair and regeneration. Hepatology. 54, 1445-1453 (2011).
- Heijboer, A. C., et al. Sixteen hours of fasting differentially affects hepatic and muscle insulin sensitivity in mice. J. Lipid Res. 46, 582-588 (2005).
- Yang, S. Q., Lin, H. Z., Mandal, A. K., Huang, J., Diehl, A. M. Disrupted signaling and inhibited regeneration in obese mice with fatty livers: implications for nonalcoholic fatty liver disease pathophysiology. Hepatology. 34, 694-706 (2001).
- Selzner, M., Clavien, P. A. Failure of regeneration of the steatotic rat liver: disruption at two different levels in the regeneration pathway. Hepatology. 31, 35-42 (2000).
- Matsuo, T., et al. Control mechanism of the circadian clock for timing of cell division in vivo. Science. 302, 255-259 (2003).
- Iakova, P., Awad, S. S., Timchenko, N. A. Aging reduces proliferative capacities of liver by switching pathways of C/EBPalpha growth arrest. Cell. 113, 495-506 (2003).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J Vis Exp. , (2011).
- Skoulis, N. P., James, R. C., Harbison, R. D., Roberts, S. M. Depression of hepatic glutathione by opioid analgesic drugs in mice. Toxicol. Appl. Pharmacol. 99, 139-147 (1989).
- Berson, A., et al. Mechanisms for experimental buprenorphine hepatotoxicity: major role of mitochondrial dysfunction versus metabolic activation. J. Hepatol. 34, 261-269 (2001).
- Baker, D. G. Natural pathogens of laboratory mice, rats, and rabbits and their effects on research. Clin. Microbiol. Rev. 11, 231-266 (1998).
- FELASA working group on revision of guidelines for health monitoring of rodents and rabbits. FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units. Lab. Anim. 48, 178-192 (2014).
- Nikfarjam, M., Malcontenti-Wilson, C., Fanartzis, M., Daruwalla, J., Christophi, C. A model of partial hepatectomy in mice. J. Invest. Surg. 17, 291-294 (2004).
- Hori, T., et al. Simple and reproducible hepatectomy in the mouse using the clip technique. World J. Gastroenterol. 18, 2767-2774 (2012).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nat. Protoc. 3, 1167-1170 (2008).
- Sowa, J. P., et al. Extent of liver resection modulates the activation of transcription factors and the production of cytokines involved in liver regeneration. World J. Gastroenterol. 14, 7093-7100 (2008).
- Bonninghoff, R., et al. Effect of different liver resection methods on liver damage and regeneration factors VEGF and FGF-2 in mice. Can. J. Surg. 55, 389-393 (2012).
