القياسات Autoradiographic من [ Published: July 18, 2016 doi: 10.3791/53947

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Andrew Chih Wei Huang*¹, Hsiang-Chin Lu*², Bai Chuang Shyu²

¹Department of Psychology, Fo Guang University, ²Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica

* These authors contributed equally

Introduction

وقد تبين السكتة الدماغية نزيف تحدث في أكثر من 8٪ من المرضى الذين يعانون من ألم الأعصاب، ويشار إلى ألم ما بعد السكتة الدماغية كما المركزي (CPSP). ^1-3 CPSP يمكن أن تنجم عن اختلال وظيفي الحسية الجسدية، وبالتالي إحداث فرط الحساسية وآلام جلدية. ⁴ ولكن ، لا تزال الآليات المرضية في جسم المريض من اختلال وظيفي الحسية الجسدية في CPSP غير مؤكدة. على سبيل المثال، وفقدان الأحاسيس الجسدية نتائج من إزالة التدفعات الواردة الخلايا العصبية في منطقة الدماغ النزفية. قد يكون سبب فرط التألم من فرط الاستثارية من الخلايا العصبية المركزية مسبب للألم أو إزالة التثبيط المركزي و ^{5 و 6} ولكن ركائز العصبية التي تشارك في الأعراض CPSP لا تزال مجهولة. وقد اقترحت بعض الدراسات أن قشرة الفص الجبهي ظهراني (dPFC)، منقاري الحزامية الأمامية القشرة (ACC)، اللوزة، الحصين، والرمادي المحيطة بالمسال (باغ)، منقاري النخاع بطني إنسي، وعلاقاتهم مع بعضهم البعض توسط معالجة مسبب للألم. ⁷ إضافيةعرضت لاي، سطي الفص الجبهي القشرة (mPFC) الدوائر -amygdala أن تشارك في إدراك الألم ذات الصلة. ⁸ بيانات حول الآليات الفيزيولوجية المرضية من CPSP هي متنوعة، وتفعيل ركائز العصبية في CPSP يحتاج إلى مزيد من التمحيص.

يستخدم ^[14 C] -Iodoantipyrine (IAP) امتصاص لمراقبة غير مباشرة تدفق الدم إلى المخ الإقليمي (rCBF)، على افتراض وجود علاقة بين نشاط الدماغ والبرازيلي. على الرغم من ^[14 C] -IAP لا يمكن تقييم نشاط الدماغ في الوقت الحقيقي، كما هو الحال مع التصوير بالرنين المغناطيسي الوظيفي (fMRI)، لديها العديد من المزايا. على سبيل المثال، ^[14 C] -IAP هو مناسبة لقياس بشكل عفوي تحدث أحداث الدماغ أثناء الحالات المرضية. ⁹ وعلاوة على ذلك، يتم قياس ^[14 C] امتصاص -IAP بدون تخدير. يكلف أيضا أقل من أساليب التصوير الأخرى، بما في ذلك الرنين المغناطيسي الوظيفي والتصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET). وقد اقترح ^[14 C] -IAP طريقة ليكون مناسبا لmeasurinز ألم عفوية (على سبيل المثال، CPSP) التي يسببها آفات النواة القاعدية البطنية (VB) من المهاد. ⁹

يصف هذا البروتوكول كيفية تنفيذ ^[14 C] -IAP طريقة لتقييم مشاركة ركائز العصبية من CPSP التي يسببها آفات VB من المهاد في نموذج حيواني. تقدم هذه التقنية وسيلة لتحديد الآليات المرضية التي تكمن وراء الأعراض CPSP على المستويات السلوكية والعصبية.

Protocol

تلقى بروتوكول في هذه الدراسة على موافقة من أكاديمية سينيكا المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة استخدام في تايوان.

1. الاستعدادات الحيوانية

1. الحصول على ذكور فئران سبراغ داولي (حوالي 300-400 غرام). الحفاظ على الفئران في غرفة مكيفة الهواء (21-22 درجة مئوية، الرطوبة 50٪) تحت 12 ساعة / 12 ساعة ضوء / دورة الظلام (أضواء على في 08:00) مع حرية الوصول إلى الغذاء والماء.

2. إجراء التجريبية

1. السماح لجميع من الفئران على التكيف مع البيئة في أقفاص وطنهم ل1 قبل أسبوع من التجارب. خلال التكيف، وأداء فون فراي والاختبارات أخمصي لإنشاء خطوط الأساس.
2. فون فراي اختبار
   1. وضع الفئران في الضميمة الاكريليك (30 سم × 30 سم × 80 سم) لمدة 30 دقيقة للسكن.
   2. الحصول على خيوط فون فراي (خيوط لا 11 - 20) التي لها نفس الطول ولكن بأقطار مختلفة لتوفير مجموعةقوات من 2-100 غرام.
   3. لتقييم عتبة انسحاب مخلب في hindpaw الفئران، استخدم خيوط فون فراي لتحفيز مركز hindpaws من خلال منفذ صافي مثل على لوحة اكريليك على فترات intertrial 5 دقائق. لتسجيل أقصى تطبيق الضغط، استخدام خيوط في ترتيب تصاعدي، من على ارتفاع منخفض، حتى يتم تسجيل أقصى تطبيق الضغط. ¹⁰
   4. عندما الفئران تبدي استجابة انسحاب مخلب إلى التحفيز، تسجيل عدد خيوط. تحديد استجابة الانسحاب في هذه المحاكمة وفقا لأدنى التحفيز.
   5. كرر نفس الإجراء على الفور، ليصبح المجموع ثلاث مرات متتالية في نفس الفئران. تحويل عدد خيوط في القوة المقابلة (في غرام) ومتوسط ​​القيم.
3. أخمصي اختبار
   1. وضع الفئران في صندوق زجاجي شفاف (مقسمة إلى أربعة إطارات، 80 سم × 30 سم × 15 سم) لمدة 30 دقيقة للسكن.
   2. استخدام الوقود النووي المشعشعاع rared لتحفيز مركز hindpaw من خلال لوحة من الزجاج. ضبط شدة ضوء الأشعة تحت الحمراء للحصول على متوسط ​​زمن استجابة انسحاب مخلب من حوالي 10 ثانية. إجراء محاكمة بالضغط على المفتاح الذي يتحول على مصدر ضوء الأشعة تحت الحمراء ويبدأ جهاز توقيت الحالة الصلبة الرقمي. التلاعب في مدة شعاع ضوء الأشعة تحت الحمراء.
   3. تسجيل مدة ضوء الأشعة تحت الحمراء عند الفئران تبدي استجابة انسحاب مخلب. يجب أن لا تتجاوز أطول مدة 20 ثانية في كل محاكمة لتجنب تلف الأنسجة. استخدام الفاصلة intertrial من 5 دقائق على الأقل لتجنب التحفيز على التوالي.
   4. كرر الاختبار مع ثلاث محاكمات لhindpaws الأيمن والأيسر، وحساب المتوسط ​​لكل hindpaw عن كل فأر.
4. جراحة الآفة كولاجيناز
   1. تخدير الفئران مع 4٪ الأيزوفلورين حتى فقدان استجابة أخمص القدمين قرصة والاستجابات الجسدية للتحدث المحفزات الجراحية. الحفاظ على التخدير مع 1،5-2٪ isoflurانو لمدة الجراحة.
   2. وضع الفئران في جهاز التجسيمي مع وسادة التدفئة بسيطة للحفاظ على درجة حرارة الجسم في 36،5-37،5 درجة مئوية. تطبيق كريم العين على العينين لمنع جفاف بينما تحت التخدير.
   3. حلق الفراء مع كليبرز الكهربائية تعقيمها، وجعل شق السلس (حوالي 2-2.5 سم) مع مشرط على طول خط الوسط من فروة الرأس. تنظيف البشرة والجمجمة بالتناوب مع اليود العناية الإلهية، و 75٪ من محلول الكحول لتعقيم. خلال المرحلة الجراحية، استخدام 75٪ من الكحول لتعقيم كافة الأجهزة والأدوات، وطاولة العمل للحفاظ على ظروف معقمة. وقبل ذلك، يجب تعقيم جميع المواد الجراحية في الأوتوكلاف بخار.
   4. استخدام القفازات وأدوات معقمة، وحفر حفرة صغيرة (مم 3) في الجمجمة بمثقاب كهربائي على VB (بما في ذلك بطني نواة خلفي إنسي مهادي [VPM] وبطني خلفية وحشية النواة المهادية [VPL]) من المهاد (3.0 -3.5 ملم الخلفي، 3،0-3،5 مم الوحشيإلى bregma، و5،5-5،8 مم عمق من سطح الجمجمة).
   5. Microinject 0.5 ميكرولتر من محلول ملحي أو 0.125 U من نوع 4 حل كولاجيناز في المجموعتين الضابطة والتجريبية، على التوالي.
   6. الحفاظ على إبرة الحقن في مكان لمدة 5 دقائق إضافية للسماح لنشر المخدرات.
   7. استخدام الاسمنت الأسنان لملء ثقب في الجمجمة، وخياطة الجرح. بعد خياطة الجرح، وتطبيق التخدير مسكن المحلية (ليدوكائين مرهم) على الجرح، وإعادتهم إلى أقفاص وطنهم.
   8. بعد الجراحة، منفردة إيواء الفئران في أقفاص بلاستيكية حتى أنها تحافظ على الاستلقاء القصية، ويبقى دافئا حتى تعافى من التخدير.
5. الاختبارات السلوكية بعد استعادة الجراحي
   1. بعد 7 أيام من التعافي من الجراحة، كرر الإجراءات في الأقسام 2.2 و 2.3 للمرحلة الاختبار. أداء الاختبارات السلوكية أكثر من 4 أسابيع في حين رصد الحالة الصحية والتنموية من الحيوانات.
   سبيل المثال، ووزن الجسم، وكمية التغذية، وحرية الحركة) بين المجموعتين الضابطة والتجريبية للمرحلة ما بعد الجراحة.
6. أداء قنية زرع مع PE-50 أنابيب
   1. تخدير الفئران مع 4٪ الأيزوفلورين، والحفاظ على درجة حرارة الجسم في 36،5-37،5 درجة مئوية مع وسادة التدفئة بسيطة.
   2. مع مشرط، وقطع اثنين من الثقوب (قطرها سم 2 لكل منهما) في خط الوسط من الجزء الظهري للالأمامية وتقاطع الجزء البطني من الكتف الأيسر وتجويف الصدري، على التوالي.
   3. فصل الجلد والعضلات مع زوج من مقص بين اثنين من الثقوب.
   4. قم بتوصيل أحد طرفي PE- 50 أنابيب (20 سم طول) إلى الوريد الوداجي الخارجي من خلال ثقب بطني. ربط نهاية طرفية من نفس PE- 50 أنابيب إلى حفرة ظهري، ويضعوا على الجلد.
   5. استخدام حقنة لحقن محلول ملحي في الوريد الوداجي للتحقق من أن أنابيب PE- 50عدم وجود عقبات.
   6. خياطة الفتحة، وحقن الفئران مع 6 ملغ / كغ الجنتاميسين (البريتونى).
   7. تدفق أنابيب كل يوم بعد الجراحة مع 0.3 مل من المياه المالحة 0.9٪، تليها 0.1 مل من المياه المالحة مع 20 U / مل الهيبارين.
7. اختبار السلوكي النهائي
   1. أسبوع واحد بعد الخطوة 2.6، كرر الخطوات من 2،2-2،3 للتأكد من أن السلوك غير مستقرة مقارنة مع الخطوة 2.5 بعد الشفاء الجراحي.
8. حقن المشع
   1. وضع الفئران في قفص للراحة 5-10 دقيقة للتكيف.
   2. باستخدام الخائن، ربط PE- 50 الأنابيب لمدة 1 مل الحقن. ملء حقنة واحدة مع محلول ملحي وملء الآخر مع ^[14 C] -IAP حل (125 μCi / كغ في حجم 0،3-0،5 مل).
   3. حقن مشعة في الوريد الوداجي الخارجي، واستبدال المحاقن مع حقنة أخرى مليئة كلوريد 3 M البوتاسيوم.
   4. عشر ثوان بعد ينج المشعection، وضخ 3 M كلوريد البوتاسيوم تحت جرعة زائدة من الأيزوفلورين، والتضحية الحيوانات وفقا للأساليب القتل الرحيم القياسية (أي الأيزوفلورين من المرذاذ لمدة 50 دقيقة) استنادا إلى المبادئ التوجيهية للأكاديمية سينيكا المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة استخدام في تايوان.
   5. بعد 1 دقيقة، فضح الجمجمة، وتقليم قبالة العضلات المتبقية. باستخدام رينجرز، قشر بعيدا السطح الظهري من الجمجمة من الدماغ. تقليم بعيدا جانبي الجمجمة باستخدام رينجرز. بعد ذلك، باستخدام ملعقة، وقطع بصيلات الشم وصلات عصبية على طول السطح البطني من الدماغ، وإزالة المخ.
   6. استخدام الأمثل درجة حرارة القطع (أكتوبر) مركب لتجميد الدماغ في الثلج الجاف وmethylbutane (حوالي -55 درجة مئوية). تخزين أنسجة المخ في الفريزر. ^{11، 12}
9. الدماغ التقطيع
   1. توجيه الأنسجة في مشراح، مع الدماغ المؤخر أسفل. استخدام ناظم البرد لشريحة الدماغ إلى 20 &# 181؛ أقسام م سميكة.
   2. وضع شرائح الدماغ على شرائح المجهر في ناظم البرد عند درجة حرارة -20 درجة مئوية، مع فاصل زمني 240 ميكرون بين كل شريحة.
   3. ضع الشرائح المجهر وخمس ورقات التصفية القياسية مع النشاط الإشعاعي متدرج إلى أشرطة تعرض لمدة 3 أيام في -20 درجة مئوية. وفقا لتسلسل شرائح الدماغ، وترتيب الشرائح المجهر من أعلى إلى أسفل. وأخيرا، ضع أوراق الترشيح في الجزء السفلي من الأشرطة ¹²
   4. إزالة الفوسفور الشاشة من أشرطة التعرض، واستخدام جهاز تصوير متغير وضع لقراءة الشاشة الفوسفور وتوليد الصور لإظهار ^[14 C] امتصاص -IAP لشرائح الدماغ.

تحليل 3. البيانات

1. بعد الخطوة 2.9.4، وضبط الصور باستخدام الخرائط الإحصائية البارامترية (SPM) وبرنامج ImageJ. إعادة جميع الصور باستخدام أقسام الاكليلية التسلسلية. على نحو سلس وتطبيع الصور وفقا لنموذج الدماغ إشارة الفئران.12، 13
2. لتقييم الكمية، وقياس المنطقة من الفائدة (ROI) من الصور الدماغ باستخدام برنامج ImageJ لتحديد كثافة إشارة بكسل، واستخدام البرامج الإحصائية لتحليل ^{12، 13}
3. للتحقيق في الاتصالات بين نوى الدماغ المختلفة، واستخدام MATLAB البرمجيات تحليل الارتباط لعرض نسبة النشاط الإشعاعي في مصفوفة الارتباط بين الأقاليم، ووضع تصور لالمصفوفات كما خرائط ملونة. وأخيرا، استخدام البرمجيات Pajek لتحليل الشبكة. ^{12، 13}
4. استخدام 2 × 5 تحليل مختلط في اتجاهين التباين (ANOVA)، مع مجموعة والأسابيع كعوامل، مقارنة بمدة تحمل الحرارة في اختبار أخمصي والقوة الميكانيكية في اختبار فون فراي في مجموعة صورية وCPSP في الأساس و أسابيع 1 - 5. استخدام اتجاهين 2 × 31 ANOVA لقياس نسبة النشاط الإشعاعي وفقا لمجموعة ومنطقة الدماغ. عند الاقتضاء، إجراء الفرق كبير وبصراحة توكي في (HSD) اللاحق الاختبارات. كالculate ارتباط بيرسون معاملات لتقييم العلاقات المتبادلة بين جميع مناطق المخ المحدد في الشام والجماعات CPSP.

Representative Results

الشكل 1A يصور الجدول الزمني التجريبي. تم تعيين الفئران إلى الشام والجماعات CPSP للاختبارات سلوكية (أي فون فراي اختبار وأخمصي اختبار). في اليوم الأول من التجربة بمثابة الأساس، وتكررت التجارب في الأسابيع 1 - تم تنفيذ 5. PE-50 قسطرة في الوريد الوداجي الخارجي في الاسبوع تم حقن الهيبارين 4. (20 U / مل، 0.1 مل / يوم) خلال 4 أسابيع و5. خمس دقائق بعد حقن الهيبارين، تم حقن ^[14 C] -IAP، وبعد 10 ثانية من جرعة زائدة من مخدر للتضحية. وبعد دقيقة واحدة، وقطع رأس الفئران، وأدلى شرائح الدماغ جزءا لا يتجزأ من أكتوبر. 1B الشكل يصور الفئران في جهاز جراحي التجسيمي، مواقع قنية زرع، وخريطة نسيجية للشرائح الدماغ على أساس الفئران أطلس الدماغ. ويوضح الشكل 1C الثقب الأيمن من حبل الوريد الخارجي باللون الأحمر، موقع PE- 50 الأنابيب، والإعداد التجريبية النهائية.

ويبين الشكل 2A شرائح الدماغ التي تعرضت في أشرطة. تم تحليل الفوسفور الشاشة باستخدام جهاز تصوير متغيرة واسطة. ثم تم تحليل العينات والبيانات القياسية لشرائح الدماغ. ويبين الشكل 2B منحنيات autoradiographic القياسية. تعرض اللوحة اليمنى العلاقة بين كثافة الصورة (بكسل / مم ²⁾ وتعول النشاط الإشعاعي في الدقيقة (CPM)، وبالتالي الرضوخ لمعادلة خطية توقع التالية: Y = 44.542X + 196.24. وتظهر اللوحة اليمنى أن القرار (بكسل / مم ²⁾ وقد تعزز بوصفها وقت التعرض زادت (بالأيام). وقد لوحظ القرار الأمثل في يوم 4.

ويبين الشكل 3A الإعداد التجريبية لاختبار أخمصي، الذي يقيم الألم الحراري. أظهرت مجموعة CPSP انخفاض ملحوظ في عتبة انسحاب مخلب P <0.05) ويبين الشكل 3B الإعداد التجريبية لاختبار فون فراي، الذي يقيم الألم الميكانيكية. أظهرت مجموعة CPSP انخفاض ملحوظ في القوة الميكانيكية (غيغاواط) في الأساس والأسابيع 1-5 (جميع ف <0.05).

ويبين الشكل 4A رويس في أطلس التشريحية. أظهر تحليل العائد على الاستثمار الذي تفعيل القشرة infralimbic (IL)، قشرة الحوف (ااا)، والحزامية منطقة القشرة 1 (CG1) كان أعلى بكثير في مجموعة CPSP في النصف الأيمن، مع استثناء من VB (الشكل 4B) .

لوحظت اختلافات في العلاقات المتبادلة بين الأقاليم من rCBF بين المجموعات CPSP والشام في النصف الأيمن (الشكل 4C). المصفوفة (فيشر Z-شارعatistics) من تم تحليل جميع المناطق باستخدام ارتباط بيرسون. الشكل 4C يظهر الاختلافات في الارتباطات بين الأقاليم للمشاركة ركائز العصبية في المجموعة CPSP. تم تحديد ركائز العصبية المرتبطة الألم عن طريق تحليل الاختلافات في الارتباطات بين الأقاليم من rCBF. الخطوط الحمراء في الشكل 4D تشير الارتباطات إيجابية كبيرة، وخطوط زرقاء تشير الارتباطات سلبية كبيرة.

الشكل 1. التجريبية الجدول الزمني للLesioning في بطني بصل نواة (VB) من المهاد للحث على البريد المركزي-السكتة الدماغية الألم (CPSP) وحقن ^[14 C] -IAP. (A) بطني الآفات النوى القاعدية للحث على CPSP للتقييمات السلوكية وحقن ^[14 C] -IAP لقياس تفعيل ركائز العصبية التي تشارك في CPSP(ب) موقع VB. (C) ^[14 C] -IAP الحقن. شريط مقياس = 1 مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تم الحصول على الشكل 2. منحنيات ستاندرد Autoradiographic. (A) عينة والمنحنيات القياسية لمرات التعرض والقرارات صورة مختلفة. (ب) منحنى قياسي من شدة صورة والاجتماع التحضيري للمؤتمر ومنحنى قياسي من وقت التعرض والقرار. الرجاء انقر هنا لعرض أكبر نسخة من هذا الرقم.

فايأجريت جوري 3. أخمصي اختبار (الحراري الألم) وفون فراي اختبار (ألم الميكانيكية) في المجموعات الشام وCPSP في الأساس وأسابيع 1 - 5. (A) الجرذان CPSP عرضت أدنى عتبة انسحاب مخلب في اختبار أخمصي ( أي أقل من التسامح الحرارة) مقارنة مع الفئران صورية، مشيرا إلى الألم الحراري أكبر. (الفئران ب) CPSP أظهرت أدنى عتبة انسحاب مخلب في اختبار فون فراي مقارنة مع الفئران صورية، يشير إلى زيادة الألم الميكانيكية. ووزارة شؤون المرأة، الخطأ المعياري للمتوسط. النجمة الخضراء (*) تشير إلى وجود فرق كبير مقارنة مع مجموعة صورية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4. تحليل العائد على الاستثمار والعلاقة بين انتر-Rإرتباطات egional بين ركائز العصبية المشاركة في CPSP. (A) تم تحديد مناطق الدماغ وتحليلها بواسطة صياغة النسبة. (ب) وكانت رويس في IL، ااا، CG1، وVB تختلف اختلافا كبيرا في النصف الأيمن. (C) تحليل من rCBF في مناطق الدماغ المحدد. (د) العلاقات المتبادلة بين الأقاليم بين مناطق الدماغ. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

في الاختبارات السلوكية، أظهرت مجموعة CPSP تخفيض عتبة انسحاب مخلب في اختبار الألم الحراري والقوة الميكانيكية في اختبار فون فراي في الأساس والأسابيع 1 - كانت 5. النتائج متسقة مع دراسة سابقة ¹⁴

يعتمد ^[14 C] -IAP الطريقة على كثافة بكسل للصور المخ للتحليل الكمي من شرائح الدماغ المختلفة. لتقييم البيانات في صور الدماغ، تم تعريف كثافة إشارة بكسل. في هذه الدراسة، تم تعريف إشارة الخلفية البيئية 25،811-46،979 الاجتماع التحضيري للمؤتمر. تم تعريف إشارة من ^[14 C] -IAP 0.001 رقة الترشيح μCi إلى 42 الاجتماع التحضيري للمؤتمر. وكانت قوة إشارة بكسل <0.001 μCi، بوصفه كثافة الخلفية. تم تحديد كثافة بكسل من خمس ورقات تصفية 0.001، 0.01، 0.1، و 10 μCi، بوصفه بكسل مقياس الرمادية لكل من الصور الدماغ. ^[14 C] أظهر النشاط الإشعاعي -IAP ا ف بارتباط ositive مع كثافة بكسل والنشاط الإشعاعي الاعتماد على مقياس لوغاريتمي. لذلك، يمكن أن يتبع الإجراء أعلاه لمعايرة ^[14 C] -IAP النشاط الإشعاعي إلى بكسل الكثافة.

عند تنفيذ ^[14 C] -IAP بروتوكول تجريبي، لا بد من النظر في بعض النقاط. على سبيل المثال، حبل الوريد الخارجي يمكن أن تصبح المحظورة، والمجربون بحاجة لضمان المباح من أنابيب PE- 50 مع الهيبارين كل يوم. بالإضافة إلى ذلك، وموقع من المواقع الآفة يمكن أحيانا في غير محله، مما أدى إلى أعراض CPSP nonsignificant. قبل الحقن، لا بد من تأكيد دقة مواقع الحقن والمواقع النسبية لbregma. ويجب أيضا أن تحدد زاوية وحجم كل حقنة بدقة.

تحتاج أيضا إلى النظر فيها القيود المفروضة على الصور الدماغ. يمكن أن تحدث تشوهات للصور الدماغ بعد فضح شرائح الدماغ في أشرطة إلى شاشة الفوسفور. الدماغ معهد العالم العربيتحتاج إلى تطبيع لأطلس الدماغ القياسية باستخدام برنامج تحليل الصور لتجنب التشوهات المحتملة في صور الدماغ غيس. وعلاوة على ذلك، يمكن للنظائر مختلفة يسفر عن نتائج مختلفة بسبب آلياتها المختلفة والعمل. على سبيل المثال، والأيض وآلية عمل ^[18 F] -fludeoxyglucose (FDG) تشبه إلى جلوكوز. ولذلك، فإن ^[18 F] عرضت صور -FDG لتكون مشابهة لمسار ايض الجلوكوز. بالإضافة إلى ذلك، نصف عمر ^[18 F] -FDG قصيرة. وبالتالي، فإنه يجب أن تكون مجتمعة مع الدائرة لتوليد الصور. ^[201 يرة تركية] هو مناسبة لتقييم عضلة القلب نضح تدفق الدم باستخدام انبعاث فوتون واحد التصوير المقطعي. ولذلك، اختيار النظائر مناسبة لتقييم الصور الدماغ هو المهم.

تطبيق ^[14 C] -IAP طريقة لتقييم نشاط المخ في CPSP أقل تكلفة من تقنيات رسم الخرائط الدماغ الأخرى (على سبيل المثال، PET والرنين المغناطيسي الوظيفي). تكان ^[14 C] -IAP الأسلوب هو مناسبة للتحدث بشكل عفوي الأحداث، ولكن لا يمكن أن تستخدم لرسم الخرائط الدماغ في الوقت الحقيقي. هذه الطريقة تختلف عن تقنيات رسم الخرائط الدماغ الأخرى، مثل الدائرة والرنين المغناطيسي الوظيفي. وعلاوة على ذلك، يمكن للالحالي بروتوكول -IAP ^[14 C] قياس التغيرات الطفيفة في rCBF في أي حالة مرضية.

يمكن استخدام ^[14 C] -IAP طريقة لاختبار مسارات الألم التقليدية، مثل الجهاز النخاعي (STT)، المهاد وسطي (MT) -ACC، والدوائر العصبية mPFC اللوزة. تفعيل كل من هذه المسارات يؤثر على الآخرين. وقد وردت تفاصيل تفعيل هذه الممرات في CPSP في ورقتنا السابقة. ¹²

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthetic:
Isoflurane	Halocarbon Products Corporation	NDC 12164-002-25	4%
Surgery
homeothermic blanket system	Harvard Apparatus	Model 50–7079	body temperature were maintained at 36.5 - 37.5 °C.
10 µl micro syringe	Hamilton	80008, Model 1701SN	injected with collagenase
polyethylene-50 tubing	Becton, Dickinson and Company	427411	catheterized into external jugular vein
1 c.c syringe	Terumo Medical Products	SS-01T	injected with 14C-IAP and saline.
saline (Sodium Chloride 0.9 gm)	Taiwan Biotech Co., LTD.	100-130-0201	To flush the tube
Drugs
type 4 collagenase	Sigma	C5138-500MG	0.125 U
Gentamicin	Sigma	G1264-250MG	6 mg/kg
Heparin	Sigma	H9399	20 U/ml; 0.1 ml/day
14C-iodoantipyrine (IAP)	PerkinElmer	NEC712	125 mCi/kg in 300 ml of 0.9% saline
Potassium chloride	Merck	1.04936.1000	3 M
Behavior system:
von Frey esthesiometer	Fabrication Enterprises, Inc.	Baseline Tactile Monofilaments 12-1666	mechanical hyperalgesia was assessed by measuring the withdrawal response to a mechanical stimulus
plantar test apparatus	IITC Life Science	IITC 390G Plantar Test	Thermal hyperalgesia was assessed by measuring the hind paw withdrawal latency in response to radiant heat.
Brain slice:
Optimal Cutting Temperature compound	Sakura Fintek Inc	4583	embedded the brain
dry ice			frozen in dry ice/methylbutane (approximately −55 °C)
methylbutane	Sigma	M32631-1L	frozen in dry ice/methylbutane (approximately −55 °C)
Cryostat	Leica Biosystems Nussloch GmbH, Germany	Leica CM1850	Coronal brain slice were sectioned on this machine.
Data analyze
exposure cassettes with a phosphor screen	Amersham Biosciences	20 cm x 25 cm	The slices were dried on glass slides and placed alongside five standard filter papers with graded radioactivity. All of the slides were exposed to the cassettes at −20 °C.
γ-counter	Beckman Coulter	Beckman LS 6500 Liquid Scintillation Counter	To measure the radioactivity count of the filter papers.
Typhoon 9410 Variable Mode Imager	GMI, Inc.	WS-S9410	To read  phosphor screen which was exposed by brain slice
Statistical Parametric Mapping (SPM)	Wellcome Centre for Neuroimaging	version 8	all of the brains were averaged to create the final brain template. To determine significant differences between the images in these two groups, the images were derived by subtracting the sham group from the CPSP group.
ImageJ	http://imagej.nih.gov/ij	version 1.46	Adjacent sections were aligned both manually and using Stack- Reg, an automated pixel-based registration algorithm in ImageJ software. All of the original three-dimensionally reconstructed brains were smoothed and normalized to the reference rat brain model.
Matlab	MathWorks	version 2009b	used Pearson correlation coefficients to examine the relationships between the CPSP and sham groups. An inter-regional correlation matrix was calculated across animals from each group.
Pajek	http://Pajek.imfm.si/	version 3.06	Graphical theoretical analysis was performed on networks defined by the above correlation matrices using Pajek software.