Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Оценка первичного нейрогенеза в Published: April 12, 2016 doi: 10.3791/53949
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1, 1
1The Healing Foundation Centre, Faculty of Life Sciences, University of Manchester, 2Department of Cell and Molecular Biology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 3Department of Craniofacial Development and Stem Cell Biology, Dental Institute, King's College London
* These authors contributed equally

Summary

Данная статья представляет собой удобный и быстрый способ для визуализации различных популяций клеток нейронов в центральной нервной системе Xenopus эмбрионов с использованием иммунофлуоресцентного окрашивания на участках.

Introduction

У позвоночных развитие центральной нервной системы включает в себя несколько отличительных еще последовательных этапов. Первым шагом является нейронная индукция, когда наивные эктодермальные клетки определяются по отношению к нейронной судьбы, а не эпидермальной судьбы. Несколько взаимосвязанных регуляторных механизмов вовлечены во время этой стадии в Xenopus и других модельных системах 1,2. Этот процесс в основном координируется секретируемых факторов , продуцируемых нижележащей мезодермы, таких как Chordin, башке и фоллистатина 3-7. После индукции нервной, подмножеством нервных клеток-предшественников выходят из клеточного цикла и начинают дифференцироваться в процесс называется первичным нейрогенеза. Не все нейрональные предшественники дифференцироваться в это время. Остальные нервные клетки-предшественники продолжают разрастаться, тем самым поддерживая пул стволовых клеток, необходимых для дальнейшего роста центральной нервной системы на протяжении развития и во взрослую жизнь.

Эти прoliferating нейронных клеток - предшественников , характеризуются их экспрессии SRY (пол определения область Y) -Box 3 (sox3) гена 8-11. Другая популяция клеток, которые выходят из клеточного цикла и совершить дифференцированной судьбы, определяются по экспрессии маркеров генов дифференцировки, тубулина, бета - 2B Класс IIb (tubb2b, N-ванна) и миелин транскрипционный фактор 1 (myt1) 12-14. Такие дифференцированные нервные клетки в конечном счете , приводят к различным категориям нейронов , включая, но не ограничиваясь этим, мотор, меж- и сенсорные нейроны , расположенные в различных областях в пределах нервной трубки 15-17.

Несмотря на значительные усилия были посвящены выявлению регуляторных механизмов, которые регулируют структурирование и судьбу определения событий в передней нейроэктодерме, меньше внимания было сделано по расследованию нейрогенные событий, которые происходят вслед заНачальный этап формирования рисунка. Действительно, передача сигнала, транскрипционные правила, а также пост-трансляционной модификации все вовлечены в этой поздней стадии, контролируя как временную , так и во время спецификации клонов нейрогенеза 18-20. Дальнейшие исследования этих механизмов требуется надежный способ легко визуализировать и различать различные популяции нервных клеток. Вышеупомянутый нейронных маркеров, в том числе, Sox3, Myt1, и N-ванна, может служить средством для идентификации этих различных клеточных популяций, обеспечивая тем самым необходимые основы для выявления основных механизмов нейрональной дифференцировки 21-23.

Хотя дифференциальная маркировка популяций нейронов клеток были продемонстрированы в других модельных организмах, относительно мало исследований использовал систему Xenopus в ее полноте в этой связи. Это происходит главным образом из-за скудности совместимых антител, которые надежно идентифицировать различные Neurпопуляции диагональных клеток в нервной трубки. Здесь мы опишем метод визуализации дифференцировку нейронов у ранних эмбрионов Xenopus с помощью иммунологического окрашивания, которая обеспечивает надежный и удобный подход для исследования первичного нейрогенеза в Xenopus. Этот протокол должен дать достаточное руководство для исследователей , заинтересованных в раннем развитии Xenopus центральной нервной системы между стадией 26 и стадии 45.

Protocol

Все эксперименты на животных были одобрены из Университета Манчестера Центра защиты животных и были охвачены лицензией Великобритании Project Home Office.

1. Сбор и фиксация Xenopus Эмбрионы

  1. Подготовка реагентов и материалов для экспериментов.
    1. Подготовка 10x Marc модифицированная Рингера (КМС) путем растворения 56,5 г NaCl в сверхчистой воде приблизительно 800 мл и при добавлении раствора в 1 М KCl, 1 М MgSO 4, 1 М CaCl 2 и 1 М HEPES , рН 7,4 , чтобы достигнуть конечной концентрации 20 мМ KCl, 10 мМ MgSO 4, 20 мМ CaCl 2, 50 мМ HEPES. Отрегулируйте рН до 7,4 10 М NaOH, а затем отрегулировать конечный объем до 1 л
    2. Стерилизуют раствор 10х MMR автоклавированием при 121 ° С в течение 20 мин на жидком цикла. При использовании, разбавляют DDH 2 O до 0.1x конечной концентрации и добавляют 20 мг / л гентамицин для ингибирования роста микроорганизмов.
    3. Сделать 10х раствор TBS смешиванием 24 г трис-HCl, 5,6 г Трис-базу, 88 г NaCl и растворением в примерно 900 мл сверхчистой воды. Окончательное решение будет иметь значение рН около 7,6. Устанавливают с помощью либо 10 М NaOH или концентрированной соляной кислоты для достижения конечного значения рН 7,6 и конечный объем до 1 л
    4. При использовании, сделать 1x TBS путем разбавления 1 часть 10х раствора TBS с 9 частями сверхчистой воды.
    5. Сделать 10x MEM соль путем растворения 209,2 г MOPS в приблизительно 800 мл сверхчистой воды и добавлением исходных растворов 0,5 М EGTA и 1 М MgSO 4 , чтобы достичь конечной концентрации 20 мМ EGTA, 10 мМ MgSO 4. Отрегулируйте рН до 7,4 10 М NaOH, а затем отрегулировать конечный объем до 1 л
    6. Стерилизовать раствор MEM соли в автоклаве при температуре 121 ° С в течение 20 мин на жидком цикле (раствор может желтеть на несколько месяцев хранения при комнатной температуре или после того, как оно было автоклавировать, но это изменение цвета не влияет на его использование ). Тем не менее, не следует использовать раствор после длительного хранения (более 6 месяцев).
    7. Сделать 1x MEMРешение ФА разбавлением 1 часть MEM соли, 1 часть 37% -ного формальдегида с 8-ми частей сверхчистой воды (об / об, стабильных при температуре 4 ° С в течение по крайней мере 1-2 недель).
    8. Подготовьте 4% параформальдегида в TBS (для последующего окрашивания с участием фаллоидина) путем растворения 4 г параформальдегида порошка в 100 мл раствора 1x TBS Раствор нагревают до 60 ° С и добавляют несколько капель 10 М NaOH, чтобы помочь растворения. Алиготе в 5-10 мл объема и замораживания -20 ° C. Не повторно замораживать раз размораживали.
      ВНИМАНИЕ: параформальдегид порошок является раздражителем и токсичен при вдыхании, при этом стадия взвешивания должна проводиться в вытяжном шкафу.
    9. Добавьте столько же стеклянные флаконы 4 мл с винтовой крышкой, предшествующих для сбора проб.
    10. Готовят 15% желатина / 15% сахарозы при заливке 20 мл 40% рыбьего желатина (предварительно нагревают на водяной бане 50 & deg; C) в центрифужную пробирку на 50 мл. Добавьте 8 г сахарозы и заполнить трубку к 50 мл линии с 1x TBS.
    11. Поместите желатиновый трубку на роторном смесителе или прокатном кроватьперемешать в течение ночи при комнатной температуре. Этот раствор желатина стабилен при температуре 4 ° С в течение 1 недели. Не используйте просроченный раствор и не замораживании-оттаивании.
  2. Подготовка и Fix X. Laevis или X. tropicalis Эмбрионы Выращенный до нужной стадии.
    1. Культура оплодотворенная X. Laevis или X. tropicalis эмбрионов в 0.1x MMR с гентамицином до желаемых этапов.
      Примечание: Как правило, сбор эмбрионов между этапами 23 и 40. Позже коллекция эмбрионов после стадии 40 возможно, особенно при наблюдении рост аксонов от спинного мозга, но имейте в виду, что дополнительное время проникновения желатина может потребоваться. Эмбрионы могут быть дикого типа, трансгенные, мутант, ингибитор обработанных, морфолино (MO) -injected, или электропорации 23,24.
    2. Собрать 20-50 эмбрионов в каждом флаконе 4 стекла мл, удалить как можно больше среды, насколько это возможно и заменить MEMFA.
      Примечание: Если последующее окрашивание включает фаллоидина, используют 4% параформальдегидавместо MEMFA, поскольку коммерческие решения поставки формальдегида обычно содержат до 10% метанола в качестве стабилизатора, который будет мешать фаллоидином окрашивания.
    3. Закрепить в течение ночи при 4 ° С или, если в срочном порядке, при комнатной температуре в течение 2 ч на роторном смесителе. Эмбрионы будут стабильными в растворе фиксации в течение по меньшей мере 1 недели при температуре 4 ° С.
    4. После фиксации, мыть эмбрионов, 3 раза в течение 20 мин с помощью 1x TBS с 0,05% Triton X-100. После последней промывки, удалить как можно больше TBS-Triton, как это возможно, и добавляют 3 мл 15% желатина / 15% сахарозы в каждый флакон.
    5. Поместите чаш на рольганга в течение ночи при комнатной температуре. Для эмбрионов старше стадии 40, используют по меньшей мере, 24 ч времени проникновения. После проникновения, немедленно перейти в раздел 2.2 на следующий день.

2. Монтаж и Cryosectioning из Xenopus Эмбрионы

  1. Подготовка реагентов и материалов для экспериментов.
    1. Возьмите одну коробку положительно CHARGе изд слайды, в идеале закрытой.
      Примечание: Если открыто, хранить слайды в сухом состоянии (например, сухом боксе) и использовать в течение 1 месяца, чтобы обеспечить статический заряд на слайдах поддерживается. Не используйте слайды с истекшим сроком годности, так как образцы будут падать во время иммунным окрашиванием.
    2. Предварительно охладить криостата камеры до -30 ° C. Установите параметры инструмента, как -35 ° C для микротома и толщины мкм раздела 12. Установите крышку толстую стеклянную пластину на сцену, и пусть криостат уравновешиваться в течение по крайней мере 30 минут до начала секции.
    3. Подготовить малярные для перемещения секций полос, держать внутри криостата камеры.
    4. Подготовьте карандаши для записи на слайдах, положить их при комнатной температуре.
    5. Надевайте перчатки во время cryosection. Не используйте голыми руками.
  2. Монтаж Xenopus зародыши
    1. Тщательно аспирата 5-10 эмбрионов из стакана флакона с помощью пластиковой или стеклянной пипетки без введения пузырьков воздуха. Перенос эмбрионов вк монтажной камере и наблюдать под стереоскоп. Заполните монтажную камеру с желатином раствором, чтобы обеспечить жесткость блока секции.
    2. Упорядочить эмбрионов в соответствии с фиг.1 с использованием пары тонкой кончик пинцетом. Отметьте ориентацию головок, рисуя стрелку на краю камеры с использованием криогенной-совместимый маркер. Для нескольких групп эмбрионов, запишите описание каждой группы на ободе соответствующей камеры, а также.
    3. Осторожно поместите камеру в горизонтальном положении в коробке пены наполовину заполненной сухим льдом и закройте крышку. Соблюдайте монтажную камеру замораживания через 5-10 мин. Процесс каждой камеры последовательно (т.е. поместить предыдущую камеру на сухой лед , прежде чем перейти к следующему) , так как это оставит достаточно времени для каждой камеры для замораживания и предотвращения сухого льда окно , чтобы стать переполненным.
      Примечание: Замороженные монтажные камеры не должны стоять горизонтально и могут быть сложены внутри коробки.
    4. Продолжайте cryosectioning или, если это необходимо, хранить замороженные образцы при -80 ° С в течение по крайней мере 1-2 недели без потери иммуногенности.
  3. Cryosection смонтированных Xenopus Эмбрионы
    1. Удалить замороженный блок выборки из камеры, нажав на нижнюю часть камеры, используя тупой палочкой (например, карандашом).
    2. Добавьте несколько капель ткани незамерзающей среды, (полиэтиленгликоль и поливиниловый спирт-содержащую среду) на удерживающей диск образца и смонтировать блок образца с передним концом эмбрионов указывает вверх (рисунок 2). Разрешить mounted- блок стоять внутри криостата камеры в течение примерно 1 мин или пока ткань незамерзающей среда становится непрозрачной.
    3. Немедленно установите удерживающую диск образец на микротома с нижней стороны блока образца, обращенной вверх. Срезать часть блока образца с помощью ножа, когда образец блока все еще относительно "мягкой", чтобы уменьшить длину каждой секции(При желании). Оставьте удерживающий диск образца на микротомом в течение по крайней мере 5 минут, чтобы ее температура достичь равновесия.
    4. Постепенно обрезать блок выборки вниз до главы головастиков видны сквозь полупрозрачное желатин. Чтобы увеличить скорость обрезки, применить более высокий (более толстый) настройки раздела толщины (например , 20-25 мкм) на этой стадии (например, включение опции "Trim") , но не слишком толстый , потому что образец блок может упасть от удерживающего диска образца , Обратите внимание на производительность криостата, например, остроте и угла лопасти на данном этапе, чтобы обеспечить генерирование длинной полосы последующих секций.
    5. После того , как головастик головки становятся видимыми, настроить параметры криостата вернуться к нормальной жизни (например , 10-12 мкм) и чистый как микротома и стадии с помощью кисти. Аккуратно сделайте 2-3 секции как испытание с использованием настройки колесо (не используйте моторизованный настройки), чтобы убедиться, что готовые кусочки могут образовывать улИПС, не дублируют друг друга или прилипать к лезвию.
    6. Продолжайте до тех пор, обрезки главы головастиков не почти обнажена (это, возможно, потребуется некоторый опыт, но достижимо). Кисть от дежурных секций на сцене и сбор образцов секций начнется.
    7. Сделайте примерно 10-15 секций, и пусть они образуют длинную полосу.
    8. Переверните толстую стеклянную пластину крышку в сторону и осторожно удалите полоску из лезвия с помощью краски тонкой кончик кисти и расположить его на сцене с длинной осью, параллельной лезвию.
    9. Выберите один положительно заряженный слайд при комнатной температуре, пометьте его с карандашом (который не будет смывается во время последующих обработок окрашивания), нажмите на нее быстро, но твердо на полосу с этикеткой, обращенной вниз и удалить слайд из криостата камеры. Если все сделано правильно, то полоса должна немедленно прилипает к положительно заряженным слайде (рис 3А).
    10. Повторите этот шаг, чтобы иметь 20-30 ломтики на каждой скользилие и расположены параллельно (фиг.3В). Этого достаточно , чтобы покрыть всю область мозга X. tropicalis эмбрионов и большинство из переднего и среднего мозга области X. Laevis эмбрионов.
    11. Высушите слайды в течение 10 мин, немедленно или, хранить слайды в коробке слайдов при -80 ° C в течение по крайней мере 3-6 месяцев без потери иммуногенности.

3. Иммунологическое разборные Xenopus Эмбрионы

  1. Подготовка реагентов и материалов для экспериментов.
    1. Готовят 0,05% ТБС-Triton X-100 путем добавления Тритон Х-100 в 1x TBS, чтобы достичь конечной концентрации 0,05%. Этот раствор стабилен при комнатной температуре в течение 3-4 дней. Не используйте просроченный раствор.
    2. Готовят 5% сыворотки термоинактивировали козы или 5% БСА в TBST в качестве блокирующего буфера. Во-первых, тепло-инактивировать коза / баранина сыворотки путем размещения приблизительно 20-30 мл сыворотки в водяной бане C 65 ° в течение 30-60 мин. Алиготе в 1,5 мл центрифугетрубы и заморозить в -20 ° C. Нет повторного инактивация не требуется при использовании.
    3. Развести инактивированной нагреванием сыворотки или БСА в TBST, чтобы достичь конечной концентрации 5% перед использованием.
    4. Подготовьте соответствующие первичные антитела в соответствии с разведениями в блокирующем буфере (например , 1: 500 против Sox3 10,25 / 1: 250 против Myt1 26 / анти-ацетилированный тубулина). Используйте приблизительно 100 мкл раствора антител на каждый слайд.
    5. Подготовить соответствующие флуоресцентные антитела (например , анти-мышь / кролик красный флуоресцентный краситель-конъюгированные антитела) в блокирующем буфере ( как правило , 1: 500).
    6. (Опционально) Добавить красный флуоресцентный краситель-конъюгированного фаллоидина (1: 500) во вторичную смесь антител для выявления актина сети.
    7. (По желанию) Добавить DAPI (0,5 мкг / мл конечной концентрации), во вторичную смесь антител для визуализации ядерной локализации.
    8. Возьмите анти-выцветанию монтажную среду из морозильника и разморозить в водяной бане при комнатной температуре.
  2. Иммунологическое
    1. Удалите замороженные слайды от -80 ° C и поместите их на листе бумаги полотенце внутри вытяжкой, по крайней мере, 1 час, чтобы устранить любые конденсированные капельки воды, а затем выпекать высушенных слайдов на C тепла блока 85-90 ° с ломтики лицевой стороной вверх в течение 15 мин, чтобы активировать механизм адгезии. И, наконец, позволяют слайды остыть до комнатной температуры (по крайней мере, 10 мин).
    2. Наполните сосуд для окрашивания с чистым ацетоном и инкубировать слайды в ацетоне в течение 10 мин для удаления рыбьего желатина. Если несколько слайдов должны быть обработаны, расположить их на стойку окрашивания. Высушите обработанные горками в течение 15 мин в вытяжкой. Не повторно использовать ацетон.
    3. Тщательно нарисовать кольцо вокруг образцов на слайде с помощью PAP пера, не касаясь образцов. Убедитесь в том, что кольцо замкнуты, в противном случае антитело раствор вытечет во время окрашивания. Полностью высушить PAP перо кольцо.
    4. Заполните другой сосуд для окрашивания с 1x TBS без Triton X-100. INSERт высохшего скользит в окрашивании банку и позволяют регидратации в течение не менее 1 ч. В то же время, подготовить блокирующий буфер путем разбавления либо инактивированной нагреванием сыворотки козы или бычий сывороточный альбумин до конечной концентрации 5% с помощью 1x TBS с 0,05% Triton X-100.
    5. Сделайте влажную коробку путем размещения 1-2 6-луночных внутри коробки еды щелчка замка и заполнить лунки на полпути сверхчистой водой. Удалить регидрировали слайды из окрашивания Сосуд и поместите их в горизонтальном направлении на 6-луночные планшеты (без закрывающей пластины).
    6. Осторожно добавьте 300-600 мкл блокирующего буфера внутри PAP кольца. Уплотнение мокрую коробку путем фиксации крышки в исходное положение и инкубировать при комнатной температуре в течение по меньшей мере 1 ч.
    7. Развести соответствующие первичные антитела в блокирующем буфере. Как правило, используют 100-150 мкл разбавленного раствора антитела на слайде. Если несколько слайдов обрабатываются, масштабировать до объема пропорционально.
    8. После блокировки, осторожно удалите блокирующий буфер из слайдов с помощью аспирации и быстро добавить рrimary раствор антитела для предотвращения сухого счета, затем запечатать мокрую коробку и инкубировать при температуре 4 ° С в течение ночи.
    9. На следующий день, удалить первичный раствор антител из слайдов путем аспирации. Промыть слайды, вставив в окрашивании банок, заполненных 1x TBS с 0,05% Triton X-100, в 3 раза, 15 мин каждый. В то же время, разбавленные соответствующие флуоресцентные вторичные антитела с блокирующим буфером (с или без DAPI или фаллоидином).
    10. Осторожно добавьте 100-150 мкл раствора вторичного антитела на слайдах. Поместите слайды внутри влажной коробки и запечатать крышку. Инкубируйте слайды в течение 1-2 ч при комнатной температуре.
    11. Промыть слайдов в окрашивании баночек, заполненных 1x TBS с 0,05% Triton X-100, в 3 раза, 15 мин каждый. В последней промывки, растопить анти-выцветанию монтажную среду в водяной бане C 50 ° в течение 10 мин при хранении при температуре -20 ° C. Охладить монтажной среды до комнатной температуры перед использованием.
    12. Добавьте примерно 20 мкл (одну каплю) из монтажной среды наслайд и применить большую крышку скольжения (по меньшей мере, 22 мм х 64 мм) по сравнению с образцами. Заметим, используя флуоресцентные или конфокальной микроскопии в течение 6 ч после монтажа.
      1. Если изображения не может быть сделано в тот же день, печать слайдов с помощью лака для ногтей и поместите их в мокрой коробке при 4 ° С в течение ночи.
        ПРИМЕЧАНИЕ: анти-выцветанию гистологическая среда постепенно окисляются через несколько дней (и превратить коричневатые), поэтому рекомендуется принимать изображения как можно скорее.

Representative Results

Представительные результаты показывают поперечные сечения стадии 30 Xenopus эмбрионов на разных уровнях, а именно, передний мозг, средний мозг, задний мозг и спинной мозг, окрашивали различными антителами (рисунок 4). Как уже упоминалось, Sox3 меченных нейрональной популяции клеток-предшественников определяет местоположение в непосредственной близости от просвета нервной трубки, в то время как MyT1 меченных дифференцированные первичные нейроны мигрируют наружу и расположены рядом с маргинальным слоем (базальной мембраны) нервной трубки. Анти-ацетил-тубулина этикетки аксоны в дифференцированных нейронов, которые могут наблюдаться в течение всей нервной трубки.

Побочное специфический ген нокдаун или избыточная экспрессия является широко используемый метод в области нейробиологии для оценки того, приводит к нарушению роста и дифференцировки нейрональных клеток модуляции экспрессии специфического гена (ов). В таких случаях, либо Morpholinos (MOS) или конструкт (ы) ДНК, несущий про Moter управляемый ген (ы) вводят в одну из двух бластомеров на двуклеточной этапе 23. В качестве альтернативы, они могут быть введены в желудочек головного мозга с последующим электропорация, что приведет к нокдаун или избыточная экспрессия желаемого гена (ов) 27. В обоих случаях последствия будут ограничены одной стороне эмбриона, что делает противоположную сторону эмбриона как необработанное внутреннего контроля.

После фиксации, секционирование и иммунное окрашивание, воздействие гена бросовой / сверхэкспрессии количественно путем подсчета и сравнения количества клеток различных популяций на обеих сторонах эмбриона. Накапливая эти данные из нескольких эмбрионов, статистический анализ может быть проведен. В наших репрезентативных результатов не возмущение не было сделано в эмбрионах. Примеры генов возмущения и их влияния на различные популяции нейронов клеток можно найти в ссылках 20,23.

т "ВОК: Keep-together.within-страница =" 1 "> Рисунок 1
Рисунок 1:. Эмбрион расположение и ориентация в сечении формы (А) Мультфильм изображение , показывающее монтажную сборку, обратите внимание , что лоток был помечен датой, стадии и ориентации эмбрионов. (B) Изображение , показывая естественный внешний вид монтажного узла. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рис . 2: Ориентация и положение желатина блока на удерживающей образец диска (A) Мультфильм изображение , показывающее сборку секции блока, обратите внимание , что эмбрионы находятся в положении «головы вверх» и желатин блок надежно закреплен ONto образца удерживающего диска в зависимости от ткани незамерзающей среды в основании (см Фигура 2В). (Б) изображение , показывающее естественный внешний вид секции узла блока, обратите внимание на накопление ткани незамерзающей среды между блоком желатина и образец удерживающего диска. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рис . 3: Непрерывный секционирования (A) Модель секции камеры. Холдинг диск образец должен быть повернут и закреплен на той позиции, что сторона эмбриона была обращена вверх. Через несколько (6-10) секций, длинная полоса непрерывных секций плитки аккуратно отделяется от лезвия (синий) с помощью тонкой кисти, а затем поворачивается на 90 ° на пластине держателя. Тогда комнатной температуры положительно заряженный слайдплотно прижимают к секции полосы лицевой стороной вниз и сразу же поднял до собранных готовых полос. (Б) Как правило, каждый слайд может разместиться 2 параллельные линии полос, как показано на рисунке. Не забывайте делать подробные записи на этикетке слайд с помощью карандаша. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4: Поперечное сечение ступени 30 X. Laevis головастиков и окрашивание в нервной ткани, 20Х. (А) Schematics , указывающие на относительные положения (передний мозг, средний мозг, задний мозг и спинной мозг) раздела плоскостей на Xenopus головастиков. (B) Соответствующие сечения окрашивали анти-Sox3 (красный), анти-ацетилированный-тубулина (Greeп) и DAPI (синий), показывающий относительное расположение нервных пулов стволовых клеток, а также нейрофиламентов внутри нервной трубки. (C) Соответствующие сечения окрашивали анти-MyT1 (красный) и DAPI (синий), показывающие относительное расположение дифференцированных первичных нейронов в пределах нервной трубки. Шкала бар = 20 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Discussion

Здесь мы показываем , удобный и эффективный способ визуализации первичного нейрогенеза в Xenopus эмбрионов. Этот метод позволяет производить оценку различных типов нейронных клеток, в том числе нейрональных стволовых клеток и дифференцированных первичных нейронах с использованием маркеров типоспецифические клеток.

Протокол, как правило, прочный с очень высоким уровнем воспроизводимости. Для получения эмбрионов , которые находятся на предварительно вылупления стадии (т.е. до стадии 28), мы рекомендуем вручную удалить желточной оболочки до фиксации , поскольку это позволяет эмбрионы полностью выпрямите перед тем фиксации. Это особенно важно при сборе эмбрионов на относительно ранней стадии (до вылупления), так как согнутые эмбрионы чрезвычайно трудно организовать в нужной ориентации внутри монтажной камеры. Мы не испытали потерю иммуногенности после MEMFA или PFA фиксации, следовательно, дополнительной стадии поискового антигена не является необходимым для этого протокола. Кроме того, этотиммунным процедура может быть проведена в образцах из хромогенного / Флуоресцентный в гибридизация. В таком случае рекомендуется, чтобы пропустить протеазы K этап обработки во время на месте протокол гибридизации. После того, как хромогенный / люминесцентная реакции субстрата, образцы могут быть смыты с TBS и заливали в растворе желатина рыбы подобным способом к MEMFA / PFA фиксированных образцов. Примеры Флаконы могут быть защищены от света, обернув флаконов в алюминиевой фольги, если флуоресцентная гибридизация будут отображены вместе с иммунофлуоресцентного окрашивания позже.

В некоторых случаях, эмбрионы могут сжиматься чрезмерно после проникновения желатина. Это, скорее всего, вызвано либо недостаточной фиксации или недостаточной экстракции TBS-тритон. Убедитесь, что эмбрионы были зафиксированы в PFA / MEMFA в течение по меньшей мере 2-3 ч, или предпочтительно в течение ночи при температуре 4 ° С. Если проблема не устранена, увеличьте время моющей TBS-Тритона до 3 в течение 1 ч.

Во время крио-Sectioнин, жесткость образца блока может изменяться в разные партии рыбьего желатина обладают различными свойствами. Эта проблема может быть частично компенсированы путем регулирования температуры микротома. Более низкая температура приведет к более "жесткой" образец блока, однако при чрезмерном низкой температуре образец блок становится четким и трудно раздел. Некоторые из тонкой настройки или практики (с использованием фиктивных блоков выборки без эмбрионов) перед каждым секционирования может быть полезным перед использованием на особо ценные образцы.

Часто встречающимся проблемой во время секционирования является тонкие секции иногда имеют тенденцию придерживаться на толстую стеклянную пластину, а не остаются плоскими на сцене стали. Это может быть особенно срыве, так как он постоянно прерывает непрерывный процесс секционирования. Такие случаи, как правило, вызваны одной из двух причин: секция камеры и (особенно) толщиной стеклянная пластина не достаточно холодно, или слишком статический заряд на машины и оperator, особенно в сухую погоду. Первый может быть решена путем поворота вниз температуру секции камеры и оставляя стеклянную пластину в течение дополнительного времени (возможно, в течение ночи); а вторые правильно заземлении криостат. Подключение к металлической поверхности криостата к металлической водопроводной или аналогичной системы воды трубки из металла может быть альтернативный способ освободить статические заряды. После каждого использования, толстая стеклянная пластина должна быть тщательно промывают неагрессивных моющих средств (например, жидкость для мытья посуды), промывать сверхчистой водой, опрыскивают чистым этанолом, и завернутый в полотенце бумаги для защиты поверхности и кромок от повреждений.

Антитела, перечисленные в протоколе, как правило, конкретными и мы редко сталкиваемся неспецифической адсорбции или высокий фоновый сигнал. Следует отметить, что, при использовании инактивированной нагреванием коза / баранина сыворотки в качестве блокирующего агента, чрезмерное тепло-инактивацию (в качестве визуализированы образованием рыхлого осадка в сыворотке) должнаследует избегать, поскольку это осадителем является весьма привлекательным для вторичных антител, и может вносить вклад в источник высокого фона.

Можно, а иногда и желательно, чтобы выполнить двойное окрашивание для визуализации различных популяций нервных клеток одновременно. Такое двойное окрашивание возможно и в целом дает удовлетворительные результаты при следующих комбинациях: Sox3 / N-ванна или Myt1 / N-ванна. Тем не менее, дважды окрашивание Sox3 и Myt1 осложняется тем фактом, что оба антитела оба из кроличьего происхождения. Мы проверили несколько антител прямые комплекты маркировки, однако не наблюдалось никаких удовлетворительных результатов (низкий сигнал-шум уровня), возможно, из-за отсутствия усиления сигнала от вторичных антител. Одним из возможных подходов , чтобы обойти эту проблему , было бы поднимать трансгенных линий в ооцитах Xenopus, как описано ниже.

Одним из основных ограничений этого протокола является то, что, в то время как этот протокол может достаточно диstinguish два основных пулов нервных клеток, а именно Sox3 экспрессирующих нейронные пул стволовых клеток и Myt1-выражающие дифференцированные нейроны, ему не хватает способности выявить различные субпопуляции дифференцированных нейронов. Такие субпопуляции, которые в том числе, но не ограничиваются ими, первичные моторные нейроны, интернейроны и сенсорные нейроны, как правило , характеризуются их дифференциально экспрессируется маркерных генов 28-30. Как уже упоминалось выше, последние достижения в развитии многоцветной гибридизация в сочетании с антителами на основе метода обнаружения иммунофлюоресценции в Xenopus эмбрионов в может заполнить пробел , чтобы выявить эти субпопуляции дифференцированных нейронов для потенциального расследования 31. В качестве альтернативы, как это было продемонстрировано в модели мышей, было бы также быть желательно , чтобы поднять более полный набор антител типа специфических клеток различать такие разные клеточные популяции в Xenopus.

этоСтоит также отметить , что, как дополнение к этому методу, последние достижения в области оптических изображений и анализа изображений, такие как многофотонной микроскопии, 3D - реконструкции и сегментации, также могут быть применены после того, как первоначальные оценки для достижения более комплексных наблюдений в Xenopus ооцитах, а также ранних эмбрионов, особенно при живой обстановке 32,33. Таким образом, для отслеживания пролиферации, дифференцировки и перемещение нейрональных клеток в живых животных, было бы желательно , чтобы создать один или более трансгенных линий , которые укрывают флуоресцентные белки движимый промотора типоспецифичной клеток , чтобы позволить живое наблюдение таких клеточных популяций в начале Xenopus эмбрионов. Создание X. Laevis линия с нейро-специфический β-тубулина промотор , запускающий tauGFP и его приложения обеспечили хороший пример 23,34. С полной последовательности промотора обоих sox3 и myt1 у позвоночных характеризуется 35-37, то шульд быть относительно легко установить дополнительные трансгенные линии в Xenopus , которые должны способствовать обширно как к сообществу Xenopus и более общей области первичного исследования нейрогенеза.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Мы благодарим профессора Майкла Klymkowsky в Университете Колорадо в Боулдере и профессор Нэнси Papalopulu в Университете Манчестера за любезно предоставленные анти-Sox3 и анти-Myt1 антител, соответственно. Мы благодарим членов лаборатории Papalopulu за их содержательные предложения в процессе разработки этого протокола. Эта работа была поддержана двумя Healing Foundation Studentships до SZ и JL, два гранта по проекту от врачебного фонда до SZ / EA и JL / ЕА соответственно, грант одной программы из Wellcome Trust в EA (WT082450MA), а также один грант Institutional стратегической поддержки от Wellcome Trust [097820 / Z / 11 / Z].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
gentamicin  Sigma-Aldrich G1397
Tris-HCl  Sigma-Aldrich T3253
Tris-base Sigma-Aldrich T1503
NaCl  Sigma-Aldrich S7653
KCl Sigma-Aldrich 746436
MgSO4 Sigma-Aldrich 746452
CaCl2 Sigma-Aldrich 793639
HEPES Sigma-Aldrich H3375
MOPS Sigma-Aldrich RDD003
EGTA Sigma-Aldrich E3889
37% formaldehyde  Sigma-Aldrich F8775
Gelatin from cold water fish skin Sigma-Aldrich G7765
Sucrose Sigma-Aldrich S7903
Base Mould Disposable 15 Mm x 15 Mm x 5 Mm Simport VWR EMB-200-015A
Base Mould Disposable 7 Mm x 7 Mm x 5 Mm Simport VWR EMB-200-010K
Superfrost Plus slides ThermoFisher 12-550-15
Tissue Freezing Medium (OCT) Leica  14020108926
Cryostat Leica  CM3050
Gloves
Dry Ice
Triton X-100  Sigma-Aldrich X100
 85-90 °C Heat block
PAP pen Sigma-Aldrich Z377821
Acetone, analytical grade
Staining jar with slide racks
Click-lock food box of appropriate size (has the capacity to hold 1-2 6-well plate inside)
anti-acetylated tubulin Sigma-Aldrich T7451
Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) Cell Signaling 4408
Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 555 Conjugate) Cell Signaling 4413
Alexa Fluor® 647 Phalloidin Cell Signaling 8940
DAPI Cell Signaling 4083
ProLong Gold Antifade Mountant Life Technologies P36930

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. De Robertis, E. M., Kuroda, H. Dorsal-ventral patterning and neural induction in Xenopus embryos. Annual Rev Cell Dev Biol. 20, 285-308 (2004).
  2. Wilson, S. W., Houart, C. Early steps in the development of the forebrain. Dev Cell. 6, 167-181 (2004).
  3. Hemmati-Brivanlou, A., Melton, D. Vertebrate embryonic cells will become nerve cells unless told otherwise. Cell. 88, 13-17 (1997).
  4. Hemmati-Brivanlou, A., Melton, D. A. Inhibition of activin receptor signaling promotes neuralization in Xenopus. Cell. 77, 273-281 (1994).
  5. Fainsod, A., et al. The dorsalizing and neural inducing gene follistatin is an antagonist of BMP-4. Mech Dev. 63, 39-50 (1997).
  6. Piccolo, S., Sasai, Y., Lu, B., De Robertis, E. M. Dorsoventral patterning in Xenopus: inhibition of ventral signals by direct binding of chordin to BMP-4. Cell. 86, 589-598 (1996).
  7. Zimmerman, L. B., De Jesus-Escobar, J. M., Harland, R. M. The Spemann organizer signal noggin binds and inactivates bone morphogenetic protein 4. Cell. 86, 599-606 (1996).
  8. Koyano, S., Ito, M., Takamatsu, N., Takiguchi, S., Shiba, T. The Xenopus Sox3 gene expressed in oocytes of early stages. Gene. 188, 101-107 (1997).
  9. Rogers, C. D., Harafuji, N., Archer, T., Cunningham, D. D., Casey, E. S. Xenopus Sox3 activates sox2 and geminin and indirectly represses Xvent2 expression to induce neural progenitor formation at the expense of non-neural ectodermal derivatives. Mech Dev. 126, 42-55 (2009).
  10. Zhang, C., Basta, T., Jensen, E. D., Klymkowsky, M. W. The beta-catenin/VegT-regulated early zygotic gene Xnr5 is a direct target of SOX3 regulation. Development. 130, 5609-5624 (2003).
  11. Penzel, R., Oschwald, R., Chen, Y., Tacke, L., Grunz, H. Characterization and early embryonic expression of a neural specific transcription factor xSOX3 in Xenopus laevis. Int J Dev Biol. 41, 667-677 (1997).
  12. Bellefroid, E. J., et al. X-MyT1, a Xenopus C2HC-type zinc finger protein with a regulatory function in neuronal differentiation. Cell. 87, 1191-1202 (1996).
  13. Moody, S. A., Miller, V., Spanos, A., Frankfurter, A. Developmental expression of a neuron-specific beta-tubulin in frog (Xenopus laevis): a marker for growing axons during the embryonic period. J Comp Neurol. 364, 219-230 (1996).
  14. Oschwald, R., Richter, K., Grunz, H. Localization of a nervous system-specific class II beta-tubulin gene in Xenopus laevis embryos by whole-mount in situ hybridization. Int J Dev Biol. 35, 399-405 (1991).
  15. Chitnis, A., Henrique, D., Lewis, J., Ish-Horowicz, D., Kintner, C. Primary neurogenesis in Xenopus embryos regulated by a homologue of the Drosophila neurogenic gene Delta. Nature. 375, 761-766 (1995).
  16. Roberts, A. Early functional organization of spinal neurons in developing lower vertebrates. Brain Res Bull. 53, 585-593 (2000).
  17. Hartenstein, V. Early neurogenesis in Xenopus: the spatio-temporal pattern of proliferation and cell lineages in the embryonic spinal cord. Neuron. 3, 399-411 (1989).
  18. Hirabayashi, Y., et al. The Wnt/beta-catenin pathway directs neuronal differentiation of cortical neural precursor cells. Development. 131, 2791-2801 (2004).
  19. Munji, R. N., Choe, Y., Li, G., Siegenthaler, J. A., Pleasure, S. J. Wnt signaling regulates neuronal differentiation of cortical intermediate progenitors. J Neurosci. 31, 1676-1687 (2011).
  20. Bonev, B., Stanley, P., Papalopulu, N. MicroRNA-9 Modulates Hes1 ultradian oscillations by forming a double-negative feedback loop. Cell Rep. 2, 10-18 (2012).
  21. Bonev, B., Pisco, A., Papalopulu, N. MicroRNA-9 reveals regional diversity of neural progenitors along the anterior-posterior axis. Dev Cell. 20, 19-32 (2011).
  22. Munoz, R., et al. Regeneration of Xenopus laevis spinal cord requires Sox2/3 expressing cells. Dev Biol. , (2015).
  23. Zhang, S., Li, J., Lea, R., Vleminckx, K., Amaya, E. Fezf2 promotes neuronal differentiation through localised activation of Wnt/beta-catenin signalling during forebrain development. Development. 141, 4794-4805 (2014).
  24. Zhang, S., Li, J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signalling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis. PloS one. 8, e79469 (2013).
  25. Wang, T. W., et al. Sox3 expression identifies neural progenitors in persistent neonatal and adult mouse forebrain germinative zones. J Comp Neurol. 497, 88-100 (2006).
  26. Sabherwal, N., et al. The apicobasal polarity kinase aPKC functions as a nuclear determinant and regulates cell proliferation and fate during Xenopus primary neurogenesis. Development. 136, 2767-2777 (2009).
  27. Falk, J., et al. Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus. BMC Dev Biol. 7, 107 (2007).
  28. Moreno, N., Retaux, S., Gonzalez, A. Spatio-temporal expression of Pax6 in Xenopus forebrain. Brain Res. 1239, 92-99 (2008).
  29. Kay, B. K., Shah, A. J., Halstead, W. E. Expression of the Ca2+-binding protein, parvalbumin, during embryonic development of the frog, Xenopus laevis. J Cell Biol. 104, 841-847 (1987).
  30. Park, B. Y., Hong, C. S., Weaver, J. R., Rosocha, E. M., Saint-Jeannet, J. P. Xaml1/Runx1 is required for the specification of Rohon-Beard sensory neurons in Xenopus. Dev Biol. 362, 65-75 (2012).
  31. Lea, R., Bonev, B., Dubaissi, E., Vize, P. D., Papalopulu, N. Multicolor fluorescent in situ mRNA hybridization (FISH) on whole mounts and sections. Methods Mol Biol. 917, 431-444 (2012).
  32. Canaria, C. A., Lansford, R. Advanced optical imaging in living embryos. Cell Mol Life Sci. 67, 3489-3497 (2010).
  33. Prouty, A. M., Wu, J., Lin, D. T., Camacho, P., Lechleiter, J. D. Multiphoton laser scanning microscopy as a tool for Xenopus oocyte research. Methods Mol Biol. 322, 87-101 (2006).
  34. Love, N. R., et al. pTransgenesis: a cross-species, modular transgenesis resource. Development. 138, 5451-5458 (2011).
  35. Kovacevic Grujicic, N., Mojsin, M., Krstic, A., Stevanovic, M. Functional characterization of the human SOX3 promoter: identification of transcription factors implicated in basal promoter activity. Gene. 344, 287-297 (2005).
  36. Wang, S., et al. Myt1 and Ngn3 form a feed-forward expression loop to promote endocrine islet cell differentiation. Dev Biol. 317, 531-540 (2008).
  37. Rogers, C. D., Archer, T. C., Cunningham, D. D., Grammer, T. C., Casey, E. M. Sox3 expression is maintained by FGF signaling and restricted to the neural plate by Vent proteins in the Xenopus embryo. Dev Biol. , 307-319 (2008).

Tags

Neuroscience выпуск 110, Развитие ЦНС иммунное дифференцировка нейронов первичный нейрогенез
Оценка первичного нейрогенеза в<em&gt; Xenopus</em&gt; Эмбрионы Использование Иммунологическое
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, S., Li, J., Lea, R., Amaya,… More

Zhang, S., Li, J., Lea, R., Amaya, E. Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining. J. Vis. Exp. (110), e53949, doi:10.3791/53949 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter