Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

הערכת Neurogenesis יסודי Published: April 12, 2016 doi: 10.3791/53949
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1, 1
1The Healing Foundation Centre, Faculty of Life Sciences, University of Manchester, 2Department of Cell and Molecular Biology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 3Department of Craniofacial Development and Stem Cell Biology, Dental Institute, King's College London
* These authors contributed equally

Summary

מאמר זה מציג שיטה נוחה ומהירה המאפשר הדמיה אוכלוסיות תאים עצביים שונים במערכת העצבים המרכזית של עוברי Xenopus באמצעות מכתים immunofluorescent על ​​הסעיפים.

Introduction

בבעלי חוליות, התפתחות מערכת העצבים המרכזית מורכבת מכמה שלבים ייחודיים עדיין רצופים. הצעד הראשון הוא אינדוקציה עצבית, כאשר תאי ectodermal נאיביים מפורטים כלפי גורל עצבי ולא גורל אפידרמיס. מספר מנגנוני ויסות מחוברים מעורבים בשלב זה ב Xenopus ומערכות מודל אחר 1,2. תהליך זה מתואם בעיקר על ידי גורמים מופרשים המיוצרים על ידי mesoderm הבסיסי, כגון chordin, שגולגולת, ו follistatin 3-7. לאחר אינדוקציה עצבית, קבוצת משנה של אבות עצביים לצאת ממעגל התא מתחיל להבחין בתהליך המכונה נוירוגנזה ראשוני. לא כל מבשרי נוירונים להבדיל בשלב זה. התאים העצביים מבשרי הנותרים ממשיכים להתרבות, ובכך לשמר את הברכה תא גזע הדרושים להמשך צמיחה של מערכת עצבים המרכזית ברחבי פיתוח לבגרות.

אלה יחסי ציבורoliferating תאים עצביים מבשר מאופיינים הביטוי שלהם של Sry (Y באזור בקביעת מין) -box 3 (sox3) גן 8-11. אוכלוסיית אחרים של תאים, אשר היציאה מחזור התא ומתחייבים גורל הבדיל, מזוהים על ידי הביטוי של סמנים גן בידול, טובולין, בטא 2B בכיתה IIb (tubb2b, N-גיגית) ו גורם שעתוק המיאלין 1 (myt1) 12-14. כזה תאים עצביים הבדיל בסופו של דבר להצמיח קטגוריות שונות של נוירונים כולל, אך לא רק, מנוע, הבין, ואת עצב סנסורי ממוקם באזורים נפרדים בתוך הצינור העצבי 15-17.

בעוד מאמצים משמעותיים הוקדשו לחשוף את מנגנוני ויסות ששולטים דפוסי גורל קביעת אירועי neuroectoderm הקדמי, פחות תשומת לב נעשה על בחקירת אירועי נוירוגנית המתרחשים בעקבותבשלב דפוסים ראשוני. ואכן, הולך אותות, תקנות תעתיק, כמו גם שינויים שלאחר translational מעורבים כולם בפעילות בשלב מאוחר זה, זה לשלוט מפרט עיתוי שושלת במהלך הנוירוגנזה 18-20. בדיקות נוספות לתוך המנגנונים האלה דורשות שיטה אמינה לדמיין בקלות להבחין אוכלוסיות שונות של תאים עצביים. הנ"ל סמנים עצביים, כולל, Sox3, Myt1, ו- N-האמבטיה, יכולה לספק אמצעי לזיהוי אוכלוסיות תאים שונים אלה, ובכך לספק את היסודות הדרושים חושף את המנגנון הבסיסי של בידול עצבי 21-23.

למרות תיוג הפרש של אוכלוסיות תאים עצביות הודגם באורגניזמים מודל שניים, מחקרים מעטים יחסית נצלו את מערכת Xenopus במלואם בעניין זה. זאת בעיקר בשל מחסור של נוגדנים תואמים באופן מהימן לזהות את neur השונהאוכלוסיות תאים onal בצינור העצבי. כאן, אנו מתארים שיטה המאפשר הדמיה והבחנה עצבית בעוברי Xenopus מוקדם באמצעות immunostaining, המספק גישה חזקה ונוחה לחקירת נוירוגנזה עיקרי Xenopus. פרוטוקול זה אמור לתת הדרכה מספקת לחוקרים המעוניינים בהתפתחות המוקדמת של מערכת העצבים המרכזית Xenopus בין שלב 26 ושלב 45.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים אושרו מאוניברסיטת מרכז צער בעלי חיים במנצ'סטר כוסו על ידי רישיון פרויקט משרד הפנים בבריטניה.

1. איסוף ו הקיבוע של עוברי Xenopus

  1. כן ריאגנטים וחומרים לניסויים.
    1. כן 10x האצבעות השונות של מארק (MMR) על ידי המסת 56.5 גרם של NaCl במי ultrapure כ 800 מיליליטר והוספת פתרונות מניות של 1 KCl M, 1 M MgSO 4, 1 M CaCl 2, ו 1 M HEPES pH 7.4 כדי להשיג ריכוז סופי של 20 מ"מ KCl, 10 מ"מ MgSO 4, 20 מ"מ CaCl 2, 50 HEPES מ"מ. התאם ל- pH 7.4 ב -10 M NaOH ואז להתאים את עוצמת הקול הסופי ל 1 ל
    2. לעקר את הפתרון 10x MMR ידי מעוקר ב 121 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות על מחזור נוזלי. עם השימוש, לדלל עם DDH 2 O ל 0.1x הריכוז הסופי ולהוסיף 20 מ"ג / L gentamycin כדי ומעכבים התפתחותם של חיידקים.
    3. הפוך 10x פתרון TBS על ידי ערבוב 24 גרם טריס-HCl, 5.6 גרם טריס-bASE, 88 גרם NaCl והמסה ב כ 900 מ"ל מים ultrapure. הפתרון הסופי יהיה בערך pH בסביבות 7.6. התאם עם או 10 M NaOH או מרוכז HCl להשיג pH הסופי של 7.6 ונפח סופי 1 ל
    4. עם השימוש, להפוך TBS 1x ידי דילול 1 חלק מהפתרון 10x TBS עם 9 חלקים של מים ultrapure.
    5. הפוך 10x MEM מלח על ידי המסת 209.2 מגבים גרם כ 800 מ"ל מים ultrapure והוספת פתרונות המניות של 0.5 M EGTA ו 1M MgSO 4 כדי להשיג ריכוז סופי של 20 מ"מ EGTA, 10 מ"מ MgSO 4. התאם ל- pH 7.4 ב -10 M NaOH ואז להתאים את עוצמת הקול הסופי ל 1 ל
    6. לעקר את הפתרון מלח MEM ידי מעוקר ב 121 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות על מחזור נוזלי (הפתרון עשוי להפוך צהוב בכמה חודשים של אחסון בטמפרטורת החדר או אחרי זה כבר autoclaved, אבל השינוי הזה בצבע אינו משפיע השימוש בו ). עם זאת, אין להשתמש הפתרון לאחר אחסון ממושך (יותר מ -6 חודשים).
    7. הפוך 1x MEMפתרון אנגלי על ידי דילול 1 חלק מלחי MEM, 1 חלק פורמלדהיד 37% עם 8 חלקים של מי ultrapure (V / V, יציבים ב 4 מעלות צלזיוס במשך 1-2 שבועות לפחות).
    8. כן paraformaldehyde 4% ב TBS (המכתים הבא המעורב phalloidin) על ידי המסת 4 גרם של אבקת paraformaldehyde ב 100 מיליליטר של חום פתרון 1x TBS הפתרון 60 ° C ולהוסיף כמה טיפות של 10 M NaOH כדי לסייע המסה. Aliquot בנפח ולהקפיא 5-10 מ"ל ב -20 ° C. אל תשתמשו שוב להקפיא פעם מופשרת.
      זהירות: אבקת Paraformaldehyde הוא חומר מגרה והוא רעיל אם נשאף, ובכך הצעד במשקל צריכה להתבצע במנדף.
    9. לייבל כמו רבים 4 צלוחיות זכוכית מ"ל עם פקקי הברגה לפני לדגום אוסף.
    10. הכן 15% ג'לטין / 15% סוכרוז על ידי שפיכת 20 מ"ל של 40% ג'לטין דגים (חום מראש באמבט מים 50 ° C) לתוך צינור צנטריפוגות 50 מ"ל. הוסף 8 גרם של סוכרוז למלא את הצינור לקו 50 מ"ל עם TBS 1x.
    11. מניח את צינור ג'לטין על מערבל סיבובי או מיטה מתגלגלתלערבב למשך הלילה בטמפרטורת החדר. פתרון ג'לטין זו יציבה ב 4 ° C. עבור 1 בשבוע. אין להשתמש פתרון פג ואל להקפיא להפשיר.
  2. הכן ולתקן X. laevis או X. מתורבתות עוברים tropicalis לשלבים רצויים.
    1. תרבות X. מופרה laevis או X. tropicalis עובר MMR 0.1x עם gentamycin עד לשלבים הרצויים.
      הערה: באופן כללי, לאסוף עובר בין שלבי 23 ו 40. אוסף מאוחר יותר של עוברת לאחר שלב 40 אפשרית, במיוחד כאשר התבוננות צמיחה אקסונלית מחוט השדרה, אך יש לזכור כי זמן חדירת ג'לטין נוסף שיידרש. עוברים יכול להיות wild-type, מהונדס, מוטציה, מעכב שטופלו, Morpholino (MO) -injected, או electroporated 23,24.
    2. אסוף 20-50 עוברים בכל בקבוקון זכוכית 4 מ"ל, להסיר בינוני ככל האפשר ולהחליף MEMFA.
      הערה: אם המכתים הבא כרוך phalloidin, השתמש 4% paraformaldehydeבמקום MEMFA מאז פתרונות פורמלדהיד מסחרי מסופק בדרך כלל מכילים מתנול עד 10% כמייצב יפריע מכתים phalloidin.
    3. תקן הלילה ב 4 מעלות צלזיוס או, אם דחיפות, בטמפרטורת חדר למשך 2 שעות על מערבל סיבובי. עוברים יהיה יציב בתמיסת קיבעון לשבוע 1 לפחות על 4 מעלות צלזיוס.
    4. לאחר קיבוע, לשטוף את העוברים 3 פעמים במשך 20 דקות באמצעות TBS 1x עם 0.05% Triton X-100. לאחר שטיפה של דבר, להסיר כמה שיותר TBS-טריטון ככל האפשר ולהוסיף 3 מ"ל של 15% ג'לטין / 15% סוכרוז לתוך בקבוקון אחד.
    5. מניחים את צלוחיות על מכבש למיטה הלילה בטמפרטורת החדר. עבור עוברי מבוגר שלב 40, השתמש לפחות 24 שעות של זמן חדיר. לאחר החדירה, יש לפנות מיד בסעיף 2.2 ביום הבא.

2. התקנת Cryosectioning של עוברי Xenopus

  1. כן ריאגנטים וחומרים לניסויים.
    1. קח תיבה אחת של חיובי chargאד מחליק, אידיאלי סגור.
      הערה: אם נפתח, לשמור את השקופיות במצב יבש (כגון תיבה יבשה) ולהשתמש תוך 1 חודש על מנת להבטיח את התשלום סטטי בשקופיות נשמר. אין להשתמש שקופיות פגו מאז דגימות תיפולנה במהלך immunostaining.
    2. טרום צמרמורת החדר cryostat ל -30 מעלות צלזיוס. הגדר את הפרמטרים המכשירים כמו -35 מעלות צלזיוס במשך microtome ו -12 עובי הסעיף מיקרומטר. התקן את צלחת הזכוכית המכסה העבה לבמה ולתת cryostat לאזן במשך 30 דקות לפחות לפני הסעיף מתחיל.
    3. הכינו מברשות ציור להעברת רצועות סעיף, לשמור בתוך חדר cryostat.
    4. הכן עפרונות לכתיבה על שקופיות, לשים אותם בטמפרטורת החדר.
    5. יש להשתמש בכפפות במהלך cryosection. אל תשתמש בידיים חשופות.
  2. הרכבה עוברת Xenopus
    1. בזהירות לשאוב 5-10 עוברים מתוך בקבוקון זכוכית בעזרת פיפטה פלסטיק או זכוכית ללא החדרת בועות אוויר. מעבירים את העובריםלתא הרכבה ולבחון תחת stereoscope. מלא את התא גובר עם פתרון ג'לטין כדי להבטיח את הנוקשות של גוש הסעיף.
    2. מסדרים את העוברים על פי איור 1 בעזרת זוג מלקחיים בסדר-קצה. סמן את נטיית ראשם באמצעות ציור חץ על שפת התא באמצעות סמן קריוגני תואם. לקבוצות של עוברים מרובים, רשום לעצמך את תיאורו של כל קבוצה על שפת התא המקביל גם כן.
    3. בזהירות את התא אופקי בתוך קופסא קצף חצי מלא עם קרח יבש ולסגור את המכסה. שים הקפאת התא גוברת 5-10 דקות. לעבד כל תא סדרתי (כלומר למקם את התא הקודם על קרח יבש לפני שתמשיך הבא) כמו זה ישאיר מספיק זמן לכל תא להקפיא ולמנוע את תיבת הקרח היבשה להפוך צפוף.
      הערה: תאי הרכבה קפוא לא צריכים לעמוד אופקי וניתן שנערמו בתוך הקופסה.
    4. המשך עם cryosectioning או, במידת הצורך, לשמור דגימות קפואות ב -80 מעלות צלזיוס במשך לפחות 1-2 בשבוע מבלי לאבד חיסוני.
  3. Cryosection של עוברים Xenopus רכוב
    1. הסר בלוק מדגם קפוא מהאולם על ידי לחיצה על החלק התחתון של החדר בעזרת מקל קהה (כגון עיפרון).
    2. להוסיף כמה טיפות של המדיום הקפאת רקמות, (מדיום גליקול ו פוליוויניל פוליאתילן אלכוהול המכיל) על גבי דיסק ההחזקה מדגם ואת הר לחסום מדגם עם הקצה הקדמי של עוברי מצביע (איור 2). אפשר לחסום mounted- לעמוד בתוך החדר cryostat עבור כ 1 דקות או עד בינוני הקפאת רקמות הופך אטום.
    3. מיד להתקין את הדיסק ההחזקה המדגם על microtome עם הצד התחתון של בלוק מדגם פונה כלפי מעלה. חתוך חלק לחסום מדגם באמצעות סכין כאשר לחסום מדגם עדיין יחסית "רך" כדי להפחית את משך הזמן של כל סעיף(אם רוצים). השאר את דיסק ההחזקה מדגם על microtome דקות לפחות 5 כדי לאפשר הטמפרטורה שלו כדי להגיע לשיווי משקל.
    4. בהדרגה לקצץ את לחסום המדגם למטה עד לראשי הראשנים גלויים דרך ג'לטין השקוף. כדי להגדיל זמירה מהירה, להחיל גבוהה (עבה) הגדרה של עובי סעיף (למשל 20-25 מיקרומטר) בשלב זה (כגון הפעלת האפשרות "לקצץ") אבל לא עבה מדי, כי לחסום מדגם יכול לנפול מדיסק ההחזקה המדגם . שים את הביצועים של cryostat, כגון חד ואת הזווית של הלהב בשלב זה כדי להבטיח את הדור של רצועה ארוכה של הסעיפים הבאים.
    5. ברגע ראשי הראשן להיות גלויים, ולהתאים את ההגדרות של cryostat לקדמותו (למשל 10-12 מיקרומטר) ונקי היא microtome ושלב בעזרת מברשת צבע. בעדינות להפוך 2-3 סעיפים כמו משפט באמצעות הגדרת הגה ביד (לא להשתמש בהגדרה הממונעת) לוודא כי פרוסות מוגמרות יכולות להיוצר strשב"ס, לא חופפים או דבק הלהב.
    6. המשך זמירה עד לראשי ראשנים נחשפים כמעט (עשוי צריך קצת ניסיון אבל השגה). לנער אותם סעיפי שריד על הבמה וגביית החלקים מדגמים תתחיל.
    7. הפוך כ 10-15 חלקים ולתת להם ליצור רצועה ארוכה.
    8. לוח מחיק ההצלחה מכסה זכוכית העבה הצידה בעדינות להסיר את הרצועה מהלהב באמצעות מברשת צבע עדין קצה ולסדר אותו על הבמה עם מקביל לציר ארוך אל הלהב.
    9. פיק חיובי אחד שקופיות טעונה בטמפרטורת החדר, לתייג אותו בעיפרון (אשר לא ניתן לשטוף במהלך טיפולי מכתים שלאחר מכן), לחץ עליו במהירות אך בתקיפות על רצועת כשהצד הנושא את התווית פונה כלפי מטה ולהסיר את השקופית מן החדר cryostat. אם נעשה בצורה נכונה, הרצועה צריכה מייד מקל לשקופית בעלי המטען החשמלי החיובי (איור 3 א).
    10. חזור על פעולה זו יש 20-30 פרוסה על כל החלקתידואר וסדר במקביל (איור 3B). זה מספיק כדי לכסות את האזור במוח כולו של X. עוברים tropicalis ורוב המוח הקדמי ואת המוח התיכון אזורים של X. laevis עוברים.
    11. האוויר יבש השקופיות במשך 10 דקות, יש לפנות מייד או, לאחסן את השקופיות בתיבת שקופיות ב -80 מעלות צלזיוס במשך לפחות 3-6 חודשים מבלי לאבד חיסוני.

3. Immunostaining של עוברים Xenopus מחולק

  1. כן ריאגנטים וחומרים לניסויים.
    1. הכן 0.05% TBS-טריטון X-100 על ידי הוספת טריטון X-100 לתוך TBS 1x כדי להשיג ריכוז סופי של 0.05%. פתרון זה הוא יציב בטמפ 'החדר למשך 3-4 ימים. אין להשתמש פתרון פג.
    2. הכן סרום עיזים 5% חום מומת או 5% BSA ב TBST כמו חסימת חיץ. ראשית, חום-להשבית את סרום עיזים / טלה על ידי הצבת כ 20-30 מ"ל של סרום באמבט מים C 65 מעלות במשך 30-60 דקות. Aliquot לתוך 1.5 מ"ל צנטריפוגותצינורות הקפאת -20 ° C. לא מחדש איון נדרש בעת שימוש.
    3. לדלל את סרום חום מומת או BSA ב TBST כדי להשיג ריכוז סופי של 5% לפני השימוש.
    4. הכן נוגדנים ראשוניים המתאימה בהתאם דילולים בחסימת המאגר (למשל 1: 500 נגד Sox3 10,25 / 1: 250 נגד Myt1 26 / אנטי acetylated טובולין). השתמש כ 100 μl של פתרון נוגדן על כל שקופית.
    5. כן נוגדני ניאון מתאימים (למשל אנטי עכבר / ארנב ניאון אדום נוגדני צבען מצומדות) בחסימת המאגר (בדרך כלל 1: 500).
    6. (אופציונלי) הוסף Phalloidin צבען מצומדות ניאון אדום (1: 500) לתוך תערובת נוגדנים משני לחשוף רשת אקטין.
    7. (אופציונאלי) הוסף DAPI (0.5 מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז סופי) לתוך תערובת נוגדנים משני לדמיין לוקליזציה גרעינית.
    8. קח את ההרכבה הבינונית אנטי לדעוך מהמקפיא להפשיר באמבט מים בטמפרטורת חדר.
  2. immunostaining
    1. הסר את השקופיות הקפואות מ -80 מעלות צלזיוס ומניח אותם על פיסת נייר מגבת בתוך ברדס אוורור לפחות 1 hr לחסל כל טיפות מים דחוסות, ואז לאפות את השקופיות היבשות על גוש חום C 85-90 מעלות עם פרוסות כלפי מעלה במשך 15 דקות כדי להפעיל את מנגנון ההדבקה. לבסוף, אפשר השקופיות להתקרר לטמפרטורת החדר (לפחות 10 דקות).
    2. מלאו את הצנצנת מכתים עם אצטון טהור דגירה את השקופיות אצטון במשך 10 דקות כדי להסיר ג'לטין דגים. אם שקופיות מרובות תטופלנה, לסדר אותם על מדף מכתים. האוויר יבש-שקופיות שטופלו במשך 15 דקות במנדף אוורור. אל תשתמש שוב אצטון.
    3. בזהירות לצייר טבעת סביב דגימות בשקופית באמצעות עט PAP בלי לגעת דגימות. ודא כי הטבעת הוא סגור בתוך עצמו, אחרת פתרון נוגדן יזרום החוצה במהלך מכתים. לגמרי לייבש את טבעת עט PAP.
    4. מלאו אחר צנצנת מכתימה עם TBS 1x ללא טריטון X-100. Insert השקופיות מיובשות לתוך הצנצנת המכתימה ולאפשר התייבשות במשך שעה 1 לפחות. בינתיים, להכין את החיץ חסימת ידי דילול או סרום עיזים חום מומת או BSA כדי ריכוז סופי 5% באמצעות TBS 1x עם 0.05% Triton X-100.
    5. להפוך את תיבה רטובה על ידי צבת 1-2 6-גם צלחות בתוך קופסא מזון קליק-סורג למלא את הבארות באמצע דרך עם מי ultrapure. הסר שקופיות rehydrated מצנצנת מכתים ולמקם אותם בצורה אופקית על 6 צלחות היטב (ללא מכסה צלחת).
    6. בזהירות להוסיף 300-600 μl של חיץ חסימה בתוך טבעת PAP. חותם את התיבה הרטובה על ידי נעילת המכסה למקומו דגירה בטמפרטורת חדר למשך לפחות שעה 1.
    7. לדלל את נוגדנים ראשוניים המתאים בחסימת המאגר. באופן כללי, לשימוש פתרון נוגדן 100-150 בדילול μl לכל שקופית. אם שקופיות מרובות מעובדים, סולם את הנפח יחסי.
    8. לאחר החסימה, בזהירות להסיר את חיץ החסימה מן השקופיות על ידי שאיפה ובמהירות להוסיף pפתרון נוגדן rimary למנוע-אאוט יבש, ואז לאטום את התיבה הרטובה דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    9. ביום הבא, להסיר את פתרון הנוגדן הראשוני מן השקופיות על ידי שאיפה. שטוף את השקופיות על ידי החדרה לצנצנות מכתימות מלאות TBS 1x עם 0.05% Triton X-100, 3 פעמים, 15 דקות כל אחד. בינתיים, לדלל את נוגדנים משני פלורסנט המתאים עם חסימת חיץ (עם או בלי DAPI או phalloidin).
    10. בזהירות להוסיף 100-150 μl של פתרון נוגדנים משני על השקופיות. מניח את השקופיות בתוך הקופסה הרטובה לאטום את המכסה. דגירה השקופיות במשך 1-2 שעות בטמפרטורת החדר.
    11. שטפו את השקופיות בצנצנות מכתים מלא 1x TBS עם 0.05% Triton X-100, 3 פעמים, 15 דקות כל אחד. בשעה שטיפה של דבר, להפשיר את הרכבה בינונית אנטי לדעוך באמבט מים C ° 50 במשך 10 דקות אם מאוחסן ב -20 ° C. לצנן את הרכבה בינונית לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
    12. להוסיף כ 20 μl (טיפה אחת) של הרכבה בינונית עלהשקופית וליישם תלוש כיסוי גדול (לפחות 22 מ"מ x 64 מ"מ) על הדגימות. שימו לב באמצעות ניאון או confocal בתוך הרכבה פוסט 6 שעות.
      1. אם הדמיה לא ניתן לעשות זאת באותו היום, לאטום שקופיות באמצעות לק ומניח אותם בתוך הקופסה הרטובה על 4 מעלות צלזיוס למשך לילה.
        הערה: ההרכבה הבינונית אנטי לדעוך יקבל מתחמצן בהדרגה לאחר מספר ימים (ולהפוך חום) ולכן מומלץ לקחת את התמונות בהקדם האפשרי.

Representative Results

תוצאות הנציגים להראות בחתכים של עובר שלב 30 Xenopus ברמות שונות, כלומר המוח הקדמי, המוח התיכון, למוח האחורי, וחוט שדרה, מוכתמות נוגדנים שונים (איור 4). כאמור, Sox3 שכותרתו אוכלוסיית תא אב עצבית מאתרת הקרבה של לומן של הצינור העצבי, בעוד MyT1 שכותרתו נוירונים עיקרי בדיל נודד החוצה ולאתר ליד השכבה השולית (lamina בסיס) של הצינור העצבי. Anti-אצטיל-טובולין תוויות אקסונים בנוירונים הבדיל, אשר ניתן לצפות בתוך הצינור העצבי כולו.

תופעות ספציפיות מציאת גן או ביטוי יתר היא שיטה בשימוש נרחב בנוירוביולוגיה להעריך האם מודולציה של ההתבטאות של גנים ספציפיים (ים) משבשת את הצמיחה והתבדלות של תאים עצביים. במקרים כאלה, גם Morpholinos (MOS) או DNA מבנה (ים) נושאת פרו moter מונחה גן (הים) מוזרק לתוך אחד משני בלסטומרים בשלב שני תאים 23. לחלופין, הם יכולים להיות מוזרקים לתוך חדר המוח ואחריו electroporation, אשר יגרום מציאה או ביטוי יתר של גן רצוי (ים) 27. בשני המקרים, את ההשפעות תוגבלנה צד אחד של העובר, מה שהופך את הצד הנגדי של העובר כפי בקרה פנימית מטופל.

לאחר קיבוע, חתך, ו immunostaining, ההשפעות של מציאת גן / יתר ביטוי הם לכמת באמצעות ספירת השוואת המספרים הסלולרי של אוכלוסיות שונות משני צדי עובר. על ידי צבירת נתונים אלה מכמה עובריים, ניתוח סטטיסטי יכול להתבצע. בתוצאות הנציג שלנו, לא הפרעות נעשו העוברים. דוגמאות של הפרעות גן והשפיע על אוכלוסיות תאים עצביות שונות ניתן למצוא הפניות 20,23.

t "FO: keep-together.within-page =" 1 "> איור 1
איור 1:. סדר עובר ואורינטצית העובש בסעיף (א) תיאור קריקטורה המראה את הרכבת ההרכבה, לציין את המגש סומן בתווית עם התאריך, במה, ואת הכיוון של עוברים. (ב) תמונה המציגה את המראה הטבעי של הרכבת ההרכבה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2:. האורינטציה ואת המיקום של גוש הג'לטין על דיסק ההחזקה המדגמת (א) תיאור קריקטורה המראה את הרכבת בלוק סעיף, לב עוברי נמצא בעמדת "ראש בראש" ואת גוש הג'לטין קבוע בחוזקה on כדי הדיסק ההחזקה מדגם ידי המדיום הקפאת רקמות בבסיס (ראה תרשים 2B). (ב) תמונה המציגה את המראה הטבעי של הרכבת בלוק הסעיף, לב ההצטברות של המדיום הקפאה רקמות בין גוש הג'לטין ודיסק ההחזקה המדגמת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3:. רציף חתך (א) דגם של תא סעיף. דיסק החזקת המדגם צריך לסובב וקבוע למצב שצד העובר הוא פונה כלפי מעלה. אחרי כמה (6-10) חלקים, הרצועה הארוכה של אריחי סעיף רציפים מופרד בעדינות מן הלהב (הכחול) בעזרת מברשת בסדר, ואז פונה 90 מעלות על הצלחת החזקה. ואז זמני בחדר טעון חיובי שקופיתצמוד בלחץ על רצועת הסעיף פונה כלפי מטה ומייד הרים עד רצועות מוגמרות שנאספו. (ב) בדרך כלל, כל שקופית יכולה להכיל 2 קווים מקבילים של רצועות, כפי שמוצג. זכור להכין תיעוד מפורט על התווית לשקופית באמצעות עיפרון. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: חתך של שלב 30 X. laevis ראשנים מכתימים הרקמה העצבית, 20X. (א) שרטוטים המציינים את מיקומם היחסי (מוח קדמי, מוח תיכון, למוח אחורי, וחוט שדרה) של מטוסים בפרק ראשני Xenopus. (ב) על סמך חתכים מקבילים מוכתם אנטי Sox3 (אדום), אנטי-acetylated טובולין (Green), ו DAPI (הכחול), המראה את המיקום היחסי של ברכות תאי גזע עצביות כמו גם neurofilaments בתוך הצינור העצבי. (C) מקביל בחתכים מוכתמים אנטי MyT1 (אדום) ו DAPI (כחול), המראים את המיקום היחסי של נוירונים עיקרי מובחן בתוך הצינור העצבי. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

כאן אנו מדגימים שיטה נוחה ויעילה המאפשרת הדמית נוירוגנזה עיקרית בעוברי Xenopus. שיטה זו מאפשרת הערכה של סוגים שונים של תאים עצביים, כולל תאי גזע עצביים ועל נוירונים העיקרי מובחן באמצעות סמנים סוג תא ספציפי.

הפרוטוקול הוא איתן בדרך כלל עם רמה גבוהה מאוד של שחזור. עבור עוברים נמצאים בשלבים טרום בקיעה (כלומר עד לשלב 28), אנו ידניים ממליצים להסיר את קרום vitelline לפני הקיבוע כמו זו מאפשרת עוברת כדי ליישר באופן מלא לפני הקיבעון. זה חשוב במיוחד בעת איסוף עוברים בשלבים מוקדמים יחסית (לפני הבקיעה), מאז עוברים כפוף קשה מאוד לארגן את הכיוון הרצוי בתוך החדר גובר. אנחנו לא חווינו אובדן של immunogenicity לאחר קיבוע MEMFA או PFA ומכאן צעד יחזור אנטיגן נוסף אינו הכרחי בפרוטוקול זה. בנוסף, זההליך immunostaining יכול להתבצע דגימות chromogenic / ניאון הכלאה באתרה. בתרחיש כזה, מומלץ לדלג על שלב הטיפול K פרוטאז במהלך הפרוטוקול הכלאה באתרו. לאחר תגובת מצע chromogenic / פלורסנט, דגימות ניתן לכבס עם TBS ו מוטבעות פתרון ג'לטין דגים בצורה דומה דגימות קבועות MEMFA / PFA. בקבוקונים לדוגמא יכולים להיות מוגנים מפני אור על ידי עטיפת הבקבוקונים בנייר אלומיניום אם ניאון הכלאה באתרו יהיה צלם יחד עם מכתים immunofluorescent מאוחר יותר.

במקרים מסוימים, עובר עלולים להתכווץ בצורה מוגזמת אחרי חדירת ג'לטין. זו נגרמת ככל הנראה על ידי אחד קיבעון מספיק או מיצוי TBS-טריטון מספיק. ודא כי עוברי תוקנו PFA / MEMFA לפחות 2-3 שעות או רצוי לילה ב 4 מעלות צלזיוס. אם הבעיה נמשכת, להגדיל את זמן הכביסה של TBS-טריטון 3 עבור שעה 1.

במהלך קריו-sectioנינג, הנוקשות של לחסום מדגם עשוי להשתנות כמו קבוצות שונות של ג'לטין דגים יש מאפיינים שונים. בעיה זו ניתן לפצות באופן חלקי על ידי התאמת הטמפרטורה של microtome. טמפרטורה נמוכה יותר תגרום גוש "קשה" מדגם אולם מתחת לטמפרטורה נמוכה מוגזמת בלוק הדגימה נעשה פריך וקשה סעיף. חלק כיוונון עדין או בפועל (באמצעות בלוקי מדגם מדומים ללא עוברי) לפני כל חתך עשויה להועיל לפני השימוש על במיוחד דגימות יקרות.

בעיה בדרך נתקלה במהלך החתך היא החלקים הדקים לפעמים נוטים להדביק על צלחת זכוכית העבה ולא להישאר שטוחים על במת הפלדה. זה יכול להיות במיוחד לשבש שכן הוא כל זמן קוטע את תהליך החתך הרציף. במקרים כאלה בדרך כלל נגרמים על ידי אחת משתי סיבות: תא הסעיף ו (בעיקר) צלחת הזכוכית העבה לא להיות קר מספיק, או מוגזם מטען סטטי על המכונית ואת operator, במיוחד במזג אוויר יבש. הראשון ניתן לפתור על ידי לכבות את הטמפרטורה של חדר הסעיף ולהשאיר צלחת הזכוכית בתוך תוספת זמן (אולי הלילה); ואת האחרון על ידי הארקת cryostat כראוי. חיבור משטח המתכת של cryostat לברז מתכת או מערכת צינורות מים דומה עשויה מתכת יכולה להיות דרך חלופית כדי לשחרר את המטענים סטטיים. לאחר כל שימוש, צלחת זכוכית עבה יש לשטוף היטב עם חומר ניקוי שאינו מאכל (כגון נוזל כלים), שטופים במים ultrapure, ריססו עם אתנול טהור, עטוף בנייר מגבת כדי להגן על פני השטח ואת הקצוות מפגיעה.

הנוגדנים המפורטים בפרוטוקול הם ספציפיים בדרך כלל רק לעתים נדירות אנו נתקלים ספיחה לא ספציפית או אות רקע גבוהה. יצוין כי, אם באמצעות מומת חום בסרום עיזים / טלה כסוכן חסימה,-איון חום מוגזם (כמו דמיינו כתוצאה מהיווצרותם של נמהר פלאפי בנסיוב) צריךלהימנע ככל נמהר זה מאוד אטרקטיבי כדי נוגדנים משני ועשוי לתרום מקור רקע גבוה.

זה אפשרי, ולפעמים רצוי, כדי לבצע מכתים כפול לדמיין אוכלוסיות שונות של תאים עצביים בו זמנית. כזה מכתים כפול אפשרי ובאופן כללי נותן תוצאות משביעות רצון עם השילובים הבאים: Sox3 / N-אמבט או Myt1 / N-אמבט. עם זאת, פעמים המכתימות של Sox3 ו Myt1 מסתבך בשל העובדה כי שני נוגדנים הם ממקור ארנב. בדקנו כמה ערכות תיוג ישירות נוגדנים, אולם לא נצפו תוצאות משביעות רצון (אות לרעש ברמה נמוכה), ככל הנראה בשל חוסר הגברת אות מ נוגדנים משני. גישה אפשרית אחת לעקוף בעיה זו תהיה להעלות קווים מהונדסים Xenopus, כמפורט להלן.

אחת המגבלות העיקריות של פרוטוקול זה הוא, כי בעוד פרוטוקול זה יכול מספיק distinguish שתי ברכות עיקריות של תאים עצביים, כלומר, ברכת תא גזע העצבית להביע Sox3 ואת נוירונים הבדילו להביע Myt1, היא חסרו את היכולת לחשוף תת-אוכלוסיות שונות של נוירונים בדיל. כזה תת אוכלוסיות, אשר כוללות, אך אינם מוגבלות, הנוירונים מוטוריים עיקריים, interneurons, ואת עצב סנסורי, בדרך כלל מאופיינים הגנים סמנו דיפרנציאלי הביע שלהם 28-30. כאמור, התקדמות בפיתוח ססגוניות הכלאה באתרו בשילוב עם שיטת זיהוי immunofluorescence מבוסס נוגדנים בעוברי Xenopus יכולה למלא את הפער לחשוף תת-אוכלוסיות אלו של נוירונים בדיל לחקירת פוטנציאל 31. לחלופין, כפי הודגם במודל עכברים, זה היה גם להיות רצוי להעלות מערך מקיף יותר של נוגדנים מסוג התא ספציפי להבחין אוכלוסיות תאים שונות כגון Xenopus.

זהגם ראוי להזכיר כי, כתוספת בשיטה זו, התקדמות הדמיה אופטיות ניתוח תמונה, כגון מיקרוסקופיה multiphoton, שחזור 3D, ופילוח, ניתן ליישם גם לאחר הערכות ראשוניות להשיג תצפיות מקיפות יותר של ביציות Xenopus וכן עוברי מוקדם, במיוחד תחת חיה הגדרת 32,33. לכן, כדי לעקוב אחר התפשטות, בידול, ותנועה של תאים עצביים בבעלי חיים, זה היה להיות רצוי להקים אחד או יותר קווים מהונדסים כי נמל חלבוני ניאון מונעים על ידי אמרגן סוג תא ספציפי כדי לאפשר תצפית חיים של אוכלוסיות תאים כאלה בתחילת Xenopus עוברי. הקמת X. laevis קו עם אמרגן נוירו-ספציפי β טובולין נהיגת tauGFP ושימושיה ספק דוגמא יפה 23,34. עם רצפי אמרגן מלאים הוא sox3 ו myt1 המאופיין בבעלי חוליות 35-37, זה shולד להיות יחסי קל להקים קווי מהונדס נוספים Xenopus שאמור לתרום בהרחבה לשתי קהילת Xenopus ושדה כללי יותר של מחקר נוירוגנזה העיקרי.

Disclosures

החוקרים אין לי מה לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים פרופ 'מיכאל Klymkowsky באוניברסיטת קולורדו בבולדר ופרופ' ננסי Papalopulu באוניברסיטת מנצ'סטר למתן חביב אנטי Sox3 ואנטי Myt1 נוגדנים, בהתאמה. אנו מודים לחברים במעבדת Papalopulu לקבלת הצעות תובנה שלהם בפיתוח פרוטוקול זה. עבודה זו נתמכה על ידי שני קרן ריפוי Studentships כדי SZ ו JL, שתי מלגות הפרויקט מטעם קרן ריפוי כדי SZ / EA ו JL / EA בהתאמה, מענק תוכנית אחת של קרן Wellcome כדי EA (WT082450MA), ומענק אחד אסטרטגית לתמיכה מוסדית מן קרן Wellcome [097,820 / Z / 11 / Z].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
gentamicin  Sigma-Aldrich G1397
Tris-HCl  Sigma-Aldrich T3253
Tris-base Sigma-Aldrich T1503
NaCl  Sigma-Aldrich S7653
KCl Sigma-Aldrich 746436
MgSO4 Sigma-Aldrich 746452
CaCl2 Sigma-Aldrich 793639
HEPES Sigma-Aldrich H3375
MOPS Sigma-Aldrich RDD003
EGTA Sigma-Aldrich E3889
37% formaldehyde  Sigma-Aldrich F8775
Gelatin from cold water fish skin Sigma-Aldrich G7765
Sucrose Sigma-Aldrich S7903
Base Mould Disposable 15 Mm x 15 Mm x 5 Mm Simport VWR EMB-200-015A
Base Mould Disposable 7 Mm x 7 Mm x 5 Mm Simport VWR EMB-200-010K
Superfrost Plus slides ThermoFisher 12-550-15
Tissue Freezing Medium (OCT) Leica  14020108926
Cryostat Leica  CM3050
Gloves
Dry Ice
Triton X-100  Sigma-Aldrich X100
 85-90 °C Heat block
PAP pen Sigma-Aldrich Z377821
Acetone, analytical grade
Staining jar with slide racks
Click-lock food box of appropriate size (has the capacity to hold 1-2 6-well plate inside)
anti-acetylated tubulin Sigma-Aldrich T7451
Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) Cell Signaling 4408
Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 555 Conjugate) Cell Signaling 4413
Alexa Fluor® 647 Phalloidin Cell Signaling 8940
DAPI Cell Signaling 4083
ProLong Gold Antifade Mountant Life Technologies P36930

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. De Robertis, E. M., Kuroda, H. Dorsal-ventral patterning and neural induction in Xenopus embryos. Annual Rev Cell Dev Biol. 20, 285-308 (2004).
  2. Wilson, S. W., Houart, C. Early steps in the development of the forebrain. Dev Cell. 6, 167-181 (2004).
  3. Hemmati-Brivanlou, A., Melton, D. Vertebrate embryonic cells will become nerve cells unless told otherwise. Cell. 88, 13-17 (1997).
  4. Hemmati-Brivanlou, A., Melton, D. A. Inhibition of activin receptor signaling promotes neuralization in Xenopus. Cell. 77, 273-281 (1994).
  5. Fainsod, A., et al. The dorsalizing and neural inducing gene follistatin is an antagonist of BMP-4. Mech Dev. 63, 39-50 (1997).
  6. Piccolo, S., Sasai, Y., Lu, B., De Robertis, E. M. Dorsoventral patterning in Xenopus: inhibition of ventral signals by direct binding of chordin to BMP-4. Cell. 86, 589-598 (1996).
  7. Zimmerman, L. B., De Jesus-Escobar, J. M., Harland, R. M. The Spemann organizer signal noggin binds and inactivates bone morphogenetic protein 4. Cell. 86, 599-606 (1996).
  8. Koyano, S., Ito, M., Takamatsu, N., Takiguchi, S., Shiba, T. The Xenopus Sox3 gene expressed in oocytes of early stages. Gene. 188, 101-107 (1997).
  9. Rogers, C. D., Harafuji, N., Archer, T., Cunningham, D. D., Casey, E. S. Xenopus Sox3 activates sox2 and geminin and indirectly represses Xvent2 expression to induce neural progenitor formation at the expense of non-neural ectodermal derivatives. Mech Dev. 126, 42-55 (2009).
  10. Zhang, C., Basta, T., Jensen, E. D., Klymkowsky, M. W. The beta-catenin/VegT-regulated early zygotic gene Xnr5 is a direct target of SOX3 regulation. Development. 130, 5609-5624 (2003).
  11. Penzel, R., Oschwald, R., Chen, Y., Tacke, L., Grunz, H. Characterization and early embryonic expression of a neural specific transcription factor xSOX3 in Xenopus laevis. Int J Dev Biol. 41, 667-677 (1997).
  12. Bellefroid, E. J., et al. X-MyT1, a Xenopus C2HC-type zinc finger protein with a regulatory function in neuronal differentiation. Cell. 87, 1191-1202 (1996).
  13. Moody, S. A., Miller, V., Spanos, A., Frankfurter, A. Developmental expression of a neuron-specific beta-tubulin in frog (Xenopus laevis): a marker for growing axons during the embryonic period. J Comp Neurol. 364, 219-230 (1996).
  14. Oschwald, R., Richter, K., Grunz, H. Localization of a nervous system-specific class II beta-tubulin gene in Xenopus laevis embryos by whole-mount in situ hybridization. Int J Dev Biol. 35, 399-405 (1991).
  15. Chitnis, A., Henrique, D., Lewis, J., Ish-Horowicz, D., Kintner, C. Primary neurogenesis in Xenopus embryos regulated by a homologue of the Drosophila neurogenic gene Delta. Nature. 375, 761-766 (1995).
  16. Roberts, A. Early functional organization of spinal neurons in developing lower vertebrates. Brain Res Bull. 53, 585-593 (2000).
  17. Hartenstein, V. Early neurogenesis in Xenopus: the spatio-temporal pattern of proliferation and cell lineages in the embryonic spinal cord. Neuron. 3, 399-411 (1989).
  18. Hirabayashi, Y., et al. The Wnt/beta-catenin pathway directs neuronal differentiation of cortical neural precursor cells. Development. 131, 2791-2801 (2004).
  19. Munji, R. N., Choe, Y., Li, G., Siegenthaler, J. A., Pleasure, S. J. Wnt signaling regulates neuronal differentiation of cortical intermediate progenitors. J Neurosci. 31, 1676-1687 (2011).
  20. Bonev, B., Stanley, P., Papalopulu, N. MicroRNA-9 Modulates Hes1 ultradian oscillations by forming a double-negative feedback loop. Cell Rep. 2, 10-18 (2012).
  21. Bonev, B., Pisco, A., Papalopulu, N. MicroRNA-9 reveals regional diversity of neural progenitors along the anterior-posterior axis. Dev Cell. 20, 19-32 (2011).
  22. Munoz, R., et al. Regeneration of Xenopus laevis spinal cord requires Sox2/3 expressing cells. Dev Biol. , (2015).
  23. Zhang, S., Li, J., Lea, R., Vleminckx, K., Amaya, E. Fezf2 promotes neuronal differentiation through localised activation of Wnt/beta-catenin signalling during forebrain development. Development. 141, 4794-4805 (2014).
  24. Zhang, S., Li, J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signalling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis. PloS one. 8, e79469 (2013).
  25. Wang, T. W., et al. Sox3 expression identifies neural progenitors in persistent neonatal and adult mouse forebrain germinative zones. J Comp Neurol. 497, 88-100 (2006).
  26. Sabherwal, N., et al. The apicobasal polarity kinase aPKC functions as a nuclear determinant and regulates cell proliferation and fate during Xenopus primary neurogenesis. Development. 136, 2767-2777 (2009).
  27. Falk, J., et al. Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus. BMC Dev Biol. 7, 107 (2007).
  28. Moreno, N., Retaux, S., Gonzalez, A. Spatio-temporal expression of Pax6 in Xenopus forebrain. Brain Res. 1239, 92-99 (2008).
  29. Kay, B. K., Shah, A. J., Halstead, W. E. Expression of the Ca2+-binding protein, parvalbumin, during embryonic development of the frog, Xenopus laevis. J Cell Biol. 104, 841-847 (1987).
  30. Park, B. Y., Hong, C. S., Weaver, J. R., Rosocha, E. M., Saint-Jeannet, J. P. Xaml1/Runx1 is required for the specification of Rohon-Beard sensory neurons in Xenopus. Dev Biol. 362, 65-75 (2012).
  31. Lea, R., Bonev, B., Dubaissi, E., Vize, P. D., Papalopulu, N. Multicolor fluorescent in situ mRNA hybridization (FISH) on whole mounts and sections. Methods Mol Biol. 917, 431-444 (2012).
  32. Canaria, C. A., Lansford, R. Advanced optical imaging in living embryos. Cell Mol Life Sci. 67, 3489-3497 (2010).
  33. Prouty, A. M., Wu, J., Lin, D. T., Camacho, P., Lechleiter, J. D. Multiphoton laser scanning microscopy as a tool for Xenopus oocyte research. Methods Mol Biol. 322, 87-101 (2006).
  34. Love, N. R., et al. pTransgenesis: a cross-species, modular transgenesis resource. Development. 138, 5451-5458 (2011).
  35. Kovacevic Grujicic, N., Mojsin, M., Krstic, A., Stevanovic, M. Functional characterization of the human SOX3 promoter: identification of transcription factors implicated in basal promoter activity. Gene. 344, 287-297 (2005).
  36. Wang, S., et al. Myt1 and Ngn3 form a feed-forward expression loop to promote endocrine islet cell differentiation. Dev Biol. 317, 531-540 (2008).
  37. Rogers, C. D., Archer, T. C., Cunningham, D. D., Grammer, T. C., Casey, E. M. Sox3 expression is maintained by FGF signaling and restricted to the neural plate by Vent proteins in the Xenopus embryo. Dev Biol. , 307-319 (2008).

Tags

Neuroscience גיליון 110, פיתוח מערכת העצבים המרכזית immunostaining והבחנה עצבית נוירוגנזה העיקרי
הערכת Neurogenesis יסודי<em&gt; Xenopus</em&gt; עוברים באמצעות Immunostaining
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, S., Li, J., Lea, R., Amaya,… More

Zhang, S., Li, J., Lea, R., Amaya, E. Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining. J. Vis. Exp. (110), e53949, doi:10.3791/53949 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter