Summary
이 문서 섹션에 면역 형광 염색법을 사용하여 Xenopus의 배아의 중추 신경계에서 다른 신경 세포 집단을 시각화 편리하고 빠른 방법을 제시한다.
Introduction
척추 동물에있어서, 중추 신경계의 발달은 여러 독특한 아직 연속 단계를 포함한다. 첫 번째 단계는 나이브 외배엽 세포는 신경 운명보다는 표피 운명 향해 지정되는 신경 유도된다. 여러 상호 규제 메커니즘 Xenopus의 다른 모델 시스템 1, 2에서이 단계에서 참여하고 있습니다. 이 과정은 주로 chordin, 소량 및 follistatin의 3-7로서 기본이되는 중배엽에 의해 생성 분비 요인에 의해 조정된다. 신경 유도 후, 신경 전구 세포의 서브 세트는 세포주기를 종료하고 주 신경 지칭되는 과정에서 구분하기 시작한다. 모든 신경 전구체이 시점에서 구별되지 않습니다. 나머지 신경 전구 세포를 개발함으로써 전역 성인기에 중추 신경계의 지속적인 성장에 필요한 줄기 세포의 풀을 유지하고 증식하는 것을 계속한다.
이러한 홍보신경 전구 세포를 oliferating하는 SRY (섹스 결정 지역 Y) -box 3 (sox3) 유전자 8-11의 발현을 특징으로한다. 차별화 된 운명에 투입 출구 세포주기 및 세포의 다른 인구는, 분화 유전자 마커, 튜 불린의 표현, 베타에 의해 식별됩니다 2B 클래스 IIB (tubb2b, N-욕조) 및 수초 전사 인자 1 (myt1) 12-14. 그러한 분화 된 신경 세포는 결국 포함 뉴런의 다양한 카테고리를 야기하지만, 모터에 한정되지 않고, 인터페이스와 신경관 15-17 내에 뚜렷한 영역에 위치하는 감각 뉴런.
상당한 노력이 앞쪽에 neuroectoderm 이벤트를 결정하는 패터닝과 운명을 지배하는 규제 메커니즘을 폭로에 전념되었지만, 적은주의는 다음 발생하는 신경 인성 사건을 조사에 이루어진 것으로,초기 패터닝 단계. 실제로, 신호 전달, 전사 규정뿐만 아니라, 번역 후 변형은 모든 신경 18-20 중 둘 타이밍 리니지 사양 제어,이 이후 단계에 포함된다. 이러한 메커니즘에 추가 조사를 쉽게 시각화하고 신경 세포의 다른 집단과 구별하기 위해 신뢰할 수있는 방법이 필요합니다. Sox3, Myt1 포함한 신경 마커를, 상술의, 그리고 N-욕조, 따라서 신경 분화 21-23의 기본 메커니즘을 드러내는에 필요한 기반을 제공하고, 서로 다른 세포 집단을 식별하기위한 수단을 제공 할 수있다.
신경 세포 집단의 차동 라벨링 다른 유기체 모델에서 입증되었지만, 비교적 소수의 연구가 이러한 관점에서 최대한으로 Xenopus의 시스템을 이용했다. 이 확실 다양한 neur 식별 호환 항체 소수 주로 기인신경 튜브도 그러 세포 집단. 여기, 우리는 제노 푸스에서 차 신경을 조사하기위한 강력하고 편리한 방법을 제공 면역 염색을 통해 초기 Xenopus의 배아에서 신경 세포의 분화를 시각화하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 단계 26 단계 (45) 사이에 Xenopus의 중추 신경 시스템의 초기 개발에 관심이있는 연구자에 대한 충분한 지침을 제공한다.
Protocol
모든 동물 실험은 맨체스터 동물 복지 센터의 대학에서 승인하고 영국 홈 오피스 프로젝트 라이센스에 포함되었다.
1. 수집 및 고정 Xenopus의 배아의
- 실험 시약 및 재료를 준비합니다.
- 최종 농도를 달성하기 위하여 10 배 마크의 변형 링거 (MMR), 1 M 황산, 1 M CaCl2를, 1 M HEPES pH가 7.4를 약 800 mL의 초순수에 염화나트륨 56.5 g을 용해시키고, 1 M의 KCl 스톡 용액을 첨가하여 준비 하는 20 mM의 KCl, 10 mM의 황산, 20 mM의 CaCl2를 50 mM의 HEPES 중. 10 M의 NaOH로 pH 7.4까지를 조정하고 1 L.로 최종 볼륨을 조절
- 액체 사이클 20 분 동안 121 ° C에서 고압 증기 멸균하여 10 배 MMR 솔루션을 소독. 사용시, 0.1X 최종 농도 DDH 2 O 희석 및 미생물의 성장을 억제하기 위해 20 ㎎ / ℓ의 겐타 마이신을 추가합니다.
- 24g 트리스 -HCl, 5.6 g 트리스 B를 혼합하여 10 배 TBS 용액을ASE, 88g의 NaCl 및 약 900 ml의 초순수에 용해. 최종 용액은 약 7.6의 pH 값을 가질 것이다. 1 L.에 7.6의 최종 pH 및 최종 부피를 달성하기 위해 10 M 수산화 나트륨 또는 진한 염산 중 하나와 조정
- 사용시에, 초순수의 9 배 부품 TBS 용액 1 부를 희석 1X TBS를 만든다.
- 20 mM의 EGTA, 10mM의 황산의 최종 농도를 달성하기 위해 0.5 M EGTA 및 1M 황산의 스톡 용액을 대략 800 mL의 초순수 209.2 g의 MOPS을 용해시키고 추가로 10 배 MEM 소금 있도록. 10 M의 NaOH로 pH 7.4까지를 조정하고 1 L.로 최종 볼륨을 조절
- 이 멸균 한 후, 용액을 실온에서 저장 수개월에 의해 황변이나 수 (액체 사이클에서 20 분 동안 121 ℃에서 오토 클레이 빙하여 MEM 염 용액 살균하지만 색상의 변화는 그 사용에 영향을주지 않는다 ). 그러나, 장기간 보관 (6 개월 이상) 후 솔루션을 사용하지 마십시오.
- 1 배 MEM 확인MEM 소금 1 부, (적어도 1-2주 4 ° C에서 안정의 v / V) 초순수의 8 부와 37 %의 포름 알데히드의 한 부분을 희석하여 FA 솔루션입니다.
- 60 ° C에 1 배 TBS 솔루션 열 100 ml의 용액에 파라 포름 알데히드 분말 4g을 용해하여 (팔로이 딘을 포함하는 후속 염색) TBS에서 4 % 파라 포름 알데히드를 준비하고 용해 지원하기 위해 10 M NaOH를 몇 방울을 추가합니다. -20 ° C에서 5 ~ 10 ml의 볼륨과 동결에 나누어지는. 다시 동결하지 마십시오 한 번 해동.
주의 : 파라 포름 알데히드 분말을 자극하며, 따라서 계량 공정은 흄 후드에서 수행되어야하며, 흡입시 독성이다. - 컬렉션을 샘플링하기 전에 스크류 캡 많은 4 ml의 유리 병 레이블.
- 50 mL의 원심 분리 튜브로 (50 ° C의 물 욕에서 예열) 40 % 어류 젤라틴 20 ㎖를 주입하여 15 % 젤라틴 / 15 % 수 크로즈를 준비한다. 자당의 8g을 추가하고 1 배의 TBS로 50 ㎖ 라인에 튜브를 입력합니다.
- 회전 믹서 나 롤링 침대에 젤라틴 튜브를 배치밤새 실온에서 혼합한다. 이 젤라틴 용액 1 주일 동안 4 ° C에서 안정적입니다. 만료 된 솔루션을 사용하지 마십시오 동결 - 해동을하지 않습니다.
- 준비하고 X를 수정 laevis의 또는 X를 원하는 단계에 tropicalis 배아 배양.
- 기름지게 X. 문화 laevis의 또는 X를 tropicalis 원하는 단계까지 겐타 마이신과 0.1X의 MMR에서 배아.
참고 : 일반적으로, 단계 (40) 후 단계 (23)와 배아의 40 이후 수집 사이의 배아를 수집 척수에서 축삭의 성장을 관찰하지만, 추가 젤라틴 침투 시간이 요구 될 수 있음을 유의 특히, 수있다. 배아 야생형 유전자 돌연변이 일 수 있고, 처리 억제제, 모르 폴리 노 (MO)를 주사 하였을 또는 (23, 24)를 전기 천공. - 각 4 ㎖의 유리 병에 20-50 배아를 수집 가능한 한 많은 매체를 제거하고 MEMFA로 교체합니다.
참고 : 다음 염색 팔로이 딘을 포함하는 경우, 4 % 파라 포름 알데히드를 사용대신 MEMFA의 상용 공급 포름 알데히드 솔루션은 일반적으로 팔로이 딘 염색을 방해하는 안정제로 최대 10 % 메탄올을 포함입니다. - 실온에서 긴급에서 만약 회전 혼합기에서 2 시간 동안 4 ℃에서 밤새 또는 고정. 배아는 4 ° C에서 최소 1 주일 동안 고정 용액에서 안정 될 것입니다.
- 정착 후, 0.05 % 트리톤 X-100, 1X TBS를 사용하여 20 분 동안 배아 3 회 세척 하였다. 최종 세척 후, 가능한 한 많은 TBS-트리톤을 제거하고 각각의 바이알에 15 % 젤라틴 / 15 % 수 크로스 용액 (3)을 추가한다.
- 실온에서 밤새 침대 롤러에 튜브를 놓습니다. 단 40 세 이상 배아를 들어, 침투 시간이 최소 24 시간을 사용합니다. 침투 한 후, 다음 날 2.2 절에 바로 진행합니다.
- 기름지게 X. 문화 laevis의 또는 X를 tropicalis 원하는 단계까지 겐타 마이신과 0.1X의 MMR에서 배아.
2. 설치 및 냉동 절편 Xenopus의 배아의
- 실험 시약 및 재료를 준비합니다.
- 긍정적으로 charg 중 한 상자를 가지고에드는 이상적으로 개봉, 슬라이드.
참고 : 연 경우 (예 : 건조 박스 등) 마른 상태에서 슬라이드를 유지하고 슬라이드에 정전기가 유지되어 있는지 확인하려면 1 개월 이내에 사용한다. 샘플 면역 염색하는 동안 떨어질 때문에 만료 된 슬라이드를 사용하지 마십시오. - -30 ° C의 저온 유지 챔버를 사전 진정. 마이크로톰에 대한 -35 ° C와 12 μm의 단면 두께와 악기 매개 변수를 설정합니다. 무대에 두꺼운 커버 유리 판을 설치하고 섹션이 시작되기 전에 저온 유지 장치가 적어도 30 분 동안 평형 수 있습니다.
- 섹션 스트립을 이동 페인트 브러시를 준비, 그라 이오 스탯 챔버 내부에 보관하십시오.
- 슬라이드에 쓰기 위해 연필을 준비 실온에서 넣어.
- 동결 절단 (Cryosections) 동안 장갑을 착용 할 것. 맨손을 사용하지 마십시오.
- 긍정적으로 charg 중 한 상자를 가지고에드는 이상적으로 개봉, 슬라이드.
- Xenopus의 배아를 장착
- 조심스럽게 기포를 도입하지 않고 플라스틱이나 유리 피펫을 사용하여 유리 바이알 중 5 ~ 10 배아를 대기음. 에서 배아를 이동상기 챔버에 장착 입체경 하에서 관찰한다. 단면 블록의 강성을 보장하기 위해 젤라틴 용액 장착 챔버를 채운다.
- 미세 팁 포셉 한 쌍을 사용하여 그림 1에 따라 배아를 정렬합니다. 극저온 호환 마커를 사용하여 상기 챔버의 테두리에 화살표를 그려서 헤드의 방향을 표시한다. 배아 여러 그룹뿐만 아니라 해당 챔버의 테두리에 각 그룹의 설명을 기록.
- 조심스럽게 드라이 아이스와 반 가득 거품 상자에 가로 실을 배치하고 뚜껑을 닫습니다. 5 ~ 10 분에 장착 챔버 동결을 준수하십시오. 이 동결과 과밀되기 위해 드라이 아이스 상자를 방지하기 위해 각 챔버 충분한 시간을 떠날 것으로 (즉, 다음 단계로 진행하기 전에 드라이 아이스 위에 이전 실 배치) 직렬로 각 챔버를 처리합니다.
참고 : 냉동 장착 챔버가 수평으로 서 할 필요가 없습니다 및 상자 안에 쌓아 될 수있다. - 필요한 경우, 면역 원성을 잃지 않고 적어도 1~2주을 위해 -80 ° C에서 냉동 샘플을 보관, 냉동 절편을 진행하거나.
- 마운트 Xenopus의 배아 동결 절단 (Cryosections)
- (예 연필) 무딘 막대기를 사용하여 상기 챔버의 바닥을 가압하여 챔버로부터 언 샘플 블록을 제거한다.
- 샘플 유지 디스크에 조직 동결 매체의 몇 방울 (폴리에틸렌 글리콜, 폴리 비닐 알코올 함유 배지)를 추가하고 배아의 앞쪽 끝 샘플 블록을 탑재하는 것은 (그림 2)를 가리 킵니다. mounted- 블록은 약 1 분 동안 또는 조직 동결 매체가 불투명 될 때까지 저온 유지 챔버 내부에 서 있습니다.
- 바로 위를 향 샘플 블록의 바닥면이 마이크로톰에 샘플 유지 디스크를 설치합니다. 샘플 블록은 여전히 상대적으로 "부드러운"인 경우, 각 섹션의 길이를 줄이기 위해 블레이드를 사용하여 샘플 블록의 일부를 잘라내(경우 원하는). 온도가 평형에 도달 할 수 있도록 적어도 5 분 동안 마이크로톰에 샘플 유지 디스크를 남겨주세요.
- 올챙이의 머리가 투명한 젤라틴을 통해 볼 수 있습니다 때까지 점차적으로 아래 샘플 블록을 잘라. 샘플 블록 샘플 유지 디스크에서 떨어질 수 있기 때문에 (예 : "트림"옵션을 사용하도록 설정 등)이 단계에서 섹션 두께 (예를 들어 20 ~ 25 μM)의 이상 (두꺼운) 설정을 적용, 속도를 트리밍 증가하지만 너무 두꺼운하려면 . 저온 유지 장치의 성능을 관찰 등이 단계에서 샤프니스 블레이드의 각도가 다음 섹션의 긴 스트립의 발생을 보장한다.
- 올챙이 헤드가 볼 수있게되면, 페인트 브러시를 사용하여 다시 (예 : 10 ~ 12 μM) 정상 모두 마이크로톰 깨끗하고 무대에 저온 유지 장치의 설정을 조정합니다. 부드럽게 완성 된 조각이 캐릭터 라인을 형성 할 수 있는지 확인합니다 (모터 설정을 사용하지 않는) 핸드 휠 설정을 사용하여 시험으로 2 ~ 3 절을IPS는 중복 또는 블레이드에 집착하지.
- 올챙이의 머리가 거의 노출 될 때까지 (이 경험하지만 달성을해야 할 수도 있습니다) 트리밍 계속합니다. 무대에서 어떤 남은 부분과 시작 샘플 섹션의 수집을 브러시.
- 약 10 ~ 15 절을하고 긴 띠를 형성 할 수 있습니다.
- 옆에 두꺼운 커버 유리 판을 뒤집어 부드럽게 잘 팁 페인트 브러시를 사용하여 블레이드에서 스트립을 제거하고 잎에 긴 축에 평행으로 무대를 준비.
- 실온에서 한 양으로 하전 된 슬라이드를 선택 (이후의 염색 처리하는 동안 씻어되지 않습니다) 연필로 레이블을 눌러 그것을 빨리 단단히 라벨면을 아래로 향하게 스트립에와 저온 유지 챔버에서 슬라이드를 제거합니다. 제대로하면 스트립은 즉시 양으로 대전 된 슬라이드 (그림 3A)에 충실해야합니다.
- 각 슬라이드에 20 ~ 30 조각을이 단계를 반복하여전자 및 병렬 (그림 3B)에 배치. 이것은 X. 전체 뇌 영역을 커버하기에 충분 tropicalis 배아와 X의 전뇌의 대부분 중뇌 지역 배아를 laevis의.
- 10 분 동안 슬라이드를 공기 - 건조 바로 진행하거나, 면역 원성을 잃지 않고 적어도 3~6개월을 위해 -80 ° C에서 슬라이드 박스에 슬라이드를 저장합니다.
단면 Xenopus의 배아 3. 면역 염색
- 실험 시약 및 재료를 준비합니다.
- 0.05 %의 최종 농도를 달성하기 위해 1X TBS로 트리톤 X-100을 첨가하여 0.05 % TBS-트리톤 X-100을 준비한다. 이 솔루션 3 ~ 4 일 동안 실온에서 안정하다. 만료 된 솔루션을 사용하지 마십시오.
- 버퍼를 차단으로 TBST 5 % 열 불 활성화 염소 혈청 또는 5 % BSA를 준비합니다. 첫째, 30 ~ 60 분 동안 65 ℃로 물을 욕조에 약 20 ~ 30 ㎖의 혈청을 배치하여 염소 / 양고기 혈청을 열 비활성화. 1.5 ml의 원심 분리기로 나누어지는튜브 및 -20 ° C에서 동결. 아니 다시 불 활성화는 사용에 필요하지 않습니다.
- 사용 전에 5 %의 최종 농도를 달성하는 TBST에 열 불 활성화 된 혈청 또는 BSA 희석.
- (500 항 Sox3 10.25 / 1 : 250 안티 Myt1 26 / 안티 - 아세틸 화 튜 불린 예 1) 버퍼를 차단에 희석에 따라 적절한 일차 항체를 준비합니다. 각 슬라이드에 항체 용액의 약 100 μl를 사용합니다.
- 버퍼 (500 일반적으로 1)를 차단하는 적절한 형광 항체 (예, 항 - 마우스 / 토끼 적색 형광 염료 복합 항체)를 준비한다.
- 액틴 네트워크를 나타 내기 위해 차 항체 믹스에 : (선택 사항) 적색 형광 염료 복합 Phalloidin의 (500 일)를 추가합니다.
- (선택 사항) 핵 지역화를 시각화 차 항체 믹스에 DAPI (0.5 μg의 / ml의 최종 농도)를 추가합니다.
- 냉장고에서 안티 - 페이드 장착 매체를 타고 상온의 물을 욕조에 녹여.
- 면역 염색
- -80 ° C에서 냉동 슬라이드를 제거하고 적어도 1 시간은 다음과 85-90 ° C 열 블록에 건조 된 슬라이드를 구워, 어떤 응축 된 물방울을 제거하기위한 환기 후드 내부에 수건 종이에 배치 15 분 동안이 위를 향하도록 슬라이스 접착 메커니즘을 활성화합니다. 마지막으로, 슬라이드를 실온으로 (적어도 10 분)를 냉각 할 수 있습니다.
- 순수한 아세톤으로 염색 항아리 채우기와 생선 젤라틴을 제거하는 10 분 동안 아세톤 슬라이드를 품어. 여러 슬라이드가 처리 될 경우 염색 랙으로 배열. 환기 후드에서 15 분 동안 처리-슬라이드를 공기 - 건조. 하지 마십시오 아세톤을 다시 사용합니다.
- 조심스럽게 샘플을 건드리지 않고 PAP 펜을 사용하여 슬라이드에 샘플 주위에 반지를 그립니다. 그렇지 않으면 항체 솔루션 염색 중에 흘러, 반지 자기 밀폐 있는지 확인하십시오. 완전히 PAP 펜 링을 건조.
- 트리톤 X-100없이 1 배 TBS와 다른 염색 항아리를 채우십시오. Inser염색 항아리에 건조-슬라이드를 T와 적어도 1 시간 동안 수분 보충을 할 수 있습니다. 한편, 0.05 % 트리톤 X-100, 1X TBS를 사용하여 5 %의 최종 농도에 열 불 활성화 된 산양 혈청 또는 BSA를 희석 한 블로킹 버퍼를 준비한다.
- 클릭 잠금 음식 상자 안에 1 ~ 2 6 잘 플레이트를 배치하여 습식 상자를 확인하고 초순수로 중간 우물을 입력합니다. 염색 항아리에서 재수 슬라이드를 제거하고 (접시 뚜껑없이) 수평으로 6 웰 플레이트에 배치합니다.
- 조심스럽게 PAP 링 내부 버퍼를 차단 300 ~ 600 μl를 추가합니다. 위치로 덮개를 고정하여 습윤 상자 밀봉 적어도 1 시간 동안 실온에서 배양한다.
- 버퍼를 차단에서 적절한 일차 항체를 희석. 일반적으로, 슬라이드 당 100 ~ 150 μl를 희석 항체 솔루션을 사용합니다. 여러 슬라이드를 처리하는 경우 비례 적으로 볼륨을 확장 할 수 있습니다.
- 차단 한 후, 조심스럽게 흡인하여 슬라이드에서 차단 버퍼를 제거하고 신속하게 페이지를 추가드라이 아웃을 방지하기 rimary 항체 용액 후 습윤 상자를 밀봉하고, 밤새 4 ℃에서 배양한다.
- 다음 날, 흡인하여 슬라이드에서 차 항체 솔루션을 제거합니다. 0.05 % 트리톤 X-100, 3 시간 15 분으로 각각 1X TBS 가득 염색 단지에 삽입하여 슬라이드를 세척한다. 한편, (또는 DAPI 또는 팔로이 딘없이) 버퍼를 차단하여 적절한 형광 차 항체를 희석.
- 조심스럽게 슬라이드에 차 항체 용액 100 ~ 150 μl를 추가합니다. 습식 상자 안에 슬라이드를 넣고 뚜껑을 밀봉. 실온에서 1-2 시간 동안 인큐베이션 슬라이드.
- 0.05 % 트리톤 X-100, 3 회, 15 분 각각에 1 배 TBS 가득 염색 항아리에 슬라이드를 씻으십시오. -20 ° C에 저장된 경우, 최종 세척에서, 10 분 동안 50 ° C의 물을 용기에 안티 - 페이드 장착 매체 해동. 사용하기 전에 실온으로 장착 매체로 냉각.
- 에 장착 매체의 약 20 μL (한 방울)를 추가슬라이드 및 샘플을 통해 큰 커버 슬립 (적어도 22mm X 64mm)를 적용합니다. 6 시간 포스트 장착 내에서 형광 공 초점 현미경을 이용하여 관찰한다.
- 이미지가 같은 날에 수행 할 수없는 경우, 매니큐어를 사용하여 슬라이드를 밀봉하고 밤새 4 ° C에서 습식 상자 안에 배치합니다.
참고 : 안티 - 페이드 장착 매체가 점차적으로 몇 일 후에 산화 (그리고 갈색 설정) 때문에 가능한 빨리 이미지를 가지고하는 것이 좋습니다 얻을 것이다.
- 이미지가 같은 날에 수행 할 수없는 경우, 매니큐어를 사용하여 슬라이드를 밀봉하고 밤새 4 ° C에서 습식 상자 안에 배치합니다.
Representative Results
대표 결과는 다른 항체 (그림 4)로 염색 다른 수준, 즉 전뇌, 중뇌, 후뇌, 척수, 무대 30 Xenopus의 배아의 단면을 보여줍니다. 언급 한 바와 같이, 차별화 된 주 뉴런이 바깥쪽으로 마이그레이션 및 신경 튜브의 한계 계층 (기초 얇은 판) 근처에 위치 MyT1 표지 동안 신경 전구 세포 인구, 신경 튜브의 루멘의 근접에 위치 Sox3 표지. 안티 - 아세틸 - 튜 불린은 전체 신경 튜브 내에서 관찰 할 수있는 차별화 된 뉴런의 축색 돌기 레이블.
사이드 특정 유전자 녹다운 또는 과발현은 특정 유전자 (들)의 발현을 조절하는 것은 신경 세포의 성장과 분화를 방해 여부를 평가하는 신경 생물학에서 광범위하게 사용되는 방법이다. 이러한 경우, 어느 Morpholinos (MOS) 또는 DNA 구조체 (들)을 수행 프로 프로모터 구동 유전자 (들)이 세포 단계에서 23 개의 할구 중 하나에 주입된다. 대안 적으로, 그들은 최저 또는 과발현 목적 유전자 (들) (27)의 전기 발생한다이어서 뇌 뇌실 내로 주입 될 수있다. 두 경우 모두, 치료 효과는 내부 대조군으로서 태아의 반대측을, 배아의 일측에 한정 될 것이다.
고정, 절편 및 면역 후 유전자 녹다운 / 과발현의 영향은 계산 배아의 양측에 서로 다른 집단의 세포 수를 비교하여 정량한다. 여러 배아로부터 이들 데이터를 축적하여 통계 분석이 수행 될 수있다. 우리의 대표적인 결과에서, 어떤 교란은 배아에서 만든되지 않았다. 유전자 섭동 상이한 신경 세포 집단에 미치는 영향의 예는 참조 20,23에서 찾을 수있다.
t "FO : 유지-together.within 페이지 ="1 ">
그림 1 :. 섹션 금형 배아 배치 및 방향 (A) 장착 어셈블리를 보여주는 만화 묘사, 트레이는 날짜, 무대, 그리고 배아의 방향으로 표시되어 있습니다. (B) 장착 어셈블리의 자연 모습을 보여주는 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 :. 오리엔테이션 및 샘플 유지 디스크의 젤라틴 블록의 위치 (A) 섹션 블록 어셈블리를 보여주는 만화 묘사, 배아는 "최대 머리"위치에있는 젤라틴 블록이 제대로 O를 고정되어 있습니다기지에서 조직 동결 매체하여 샘플 유지 디스크 NTO (그림 2B 참조). (B) 섹션 블록 어셈블리의 자연 모습을 보여주는 이미지, 젤라틴 블록과 샘플 유지 디스크 사이의 조직 동결 매체의 축적을 확인합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 :. 섹션 챔버의 연속 절편 (A) 모델입니다. 샘플 유지 디스크가 배아면이 위를 향하게되는 위치로 회전 및 고정되어야한다. 소수 (6-10) 섹션 후 연속 구역 타일의 긴 스트립 부드럽게 미세 브러시를 사용하여 블레이드 (청색)로부터 분리 된 후, 지지판에 90 °졌다. 그런 다음 방 온도는 긍정적으로 슬라이드가 충전단단히 아래로 향하게 섹션 스트립에 누르면 즉시 수집 완성 된 스트립에 올려. 도시 된 바와 같이, (B)는 일반적으로 각각의 슬라이드는, 스트립이 평행선을 수용 할 수있다. 연필을 사용하여 슬라이드 레이블에 대한 자세한 기록을 확인해야합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 단계 30 X의 단면 , 20 배. (A) 회로도는 Xenopus의 올챙이에 단면 평면의 상대 위치 (전뇌, 중뇌, 후뇌, 척수)를 나타내는 신경 조직에 올챙이와 염색을 laevis의. (B) 항 Sox3 (적색), 항 - 아세틸 - 튜 불린 (초 물들 대응 단면신경관 내에 신경 줄기 세포뿐만 아니라 풀 neurofilaments의 상대 위치를 나타내는 n) 및 DAPI (청색). 신경 튜브 내에서 차별화 된 주 뉴런의 상대적 위치를 보여주는 방지 MyT1 (빨강)과 DAPI (청색)로 염색 단면을, 대응 (C). 스케일 바 = 20 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
여기에서 우리는 Xenopus의 배아에서 차 신경을 시각화하는 편리하고 효율적인 방법을 보여줍니다. 이 방법은 세포 형 특이 적 마커를 사용하여 신경 줄기 세포 및 분화 된 신경 세포를 포함한 차 신경 세포의 종류의 평가를 허용한다.
프로토콜은 재현성이 매우 높은 수준으로 일반적으로 강하다. 사전 부화 단계에있는 배아의 경우 (즉, 최대 28 단계로), 이것은 태아가 완전히 고정하기 전에 펴다 할 수 있도록 우리가 수동으로 이전의 고정에 난황 막을 제거하는 것이 좋습니다. 절곡 배아 실장 챔버 내부의 원하는 방향으로 배열하는 것이 매우 곤란하기 때문에, (부화 전에) 비교적 초기 단계 배아를 수집 할 때 특히 중요하다. 우리는 MEMFA 또는 PFA 고정 따라서 추가 항원 검색 단계 후 면역 원성의 손실을 경험하지이 프로토콜에 대한 필요가 없습니다했다. 또한, 본면역 염색 과정은 계내 혼성화에 발색 / 형광 샘플에서 수행 될 수있다. 이러한 시나리오에서, 원위치 혼성화 프로토콜 동안 프로테아제 K 처리 단계를 생략 할 것을 권장한다. 형광 / 발색 기질의 반응 후, 샘플을 TBS로 세척 할 수 있고, MEMFA / PFA 고정 샘플을 유사한 방식으로 어류 젤라틴 수용액에 매립. 샘플 튜브는 원위치 혼성화 형광 나중에 면역 염색과 함께 이미징 될 경우 알루미늄 호일에 튜브를 배치하여 빛으로부터 보호 할 수있다.
일부의 경우, 배아 젤라틴 침투 후 지나치게 수축된다. 이것은 가능성이 어느 부족 고정 또는 불충분 한 TBS-트리톤 추출로 인해 발생합니다. 배아는 적어도 2 ~ 3 시간 동안 PFA / MEMFA에 고정 바람직 밤새 4 ° C에서되었는지 확인합니다. 문제가 지속되면, 1 시간 동안 3 TBS-트리톤의 세탁 시간을 증가시킨다.
극저온 SECTIO 중닝는 샘플 블록의 강성은 생선 젤라틴 등 다양한 배치가 서로 다른 특성이 다를 수 있습니다. 이 문제는 부분적으로 마이크로톰의 온도를 조정함으로써 보상 될 수있다. 낮은 온도는 샘플 블록 섹션에 선명하고 어려워진다 그러나 과도한 저온 아래에 "열심히"샘플 블록에서 발생합니다. 각각의 단면 전 (배아없이 모의 샘플 블록을 사용하여) 일부 미세 조정 또는 관행은 특히 유용 샘플에 사용하기 전에 도움이 될 수 있습니다.
절편시 일반적으로 발생하는 문제는 얇은 섹션 때때로 두꺼운 유리 접시에 스틱이 아닌 스틸 무대에 평평하게 유지하는 경향이있다. 이것은 연속 절편 프로세스를 중단 때문에 특히 방해가 될 수있다. 섹션 챔버 (특히) 두꺼운 유리판 기계와 오에 충분한 감기, 또는 과도한 정전기없는 : 이러한 경우는 일반적으로 두 가지 이유 중 하나에 의해 발생특히 건조한 날씨에 perator. 전자는 부 챔버의 온도를 낮추는 여분 시간 (아마도 밤새) 미국 내 유리판을 남김으로써 해결 될 수있다; 제대로 저온 유지 장치를 접지하여 후자. 금속 탭 또는 금속제의 유사 물 튜브 시스템으로 저온 유지 장치의 금속 표면을 연결하면 정전기를 방출하는 다른 방법 일 수있다. 사용 후, 두꺼운 유리판을, 초순수에 의해 세정 (예 주방용 액체와 같은) 비 부식성 세제로 잘 세척한다 순수 에탄올을 분무하고, 손상 표면과 에지를 보호하기 위해 수건 종이에 싸서.
프로토콜에 열거 된 항체는 일반적으로 특정하고 우리는 거의 비특이적 흡착 또는 높은 배경 신호가 발생하지 않습니다. 그것은 주목해야한다해야 차단제 (혈청 무성한 침전물의 형성에 의해 가시화로) 과도한 열 불 활성화로 열 불 활성화 염소 / 양고기 혈청을 사용하는 경우, 그이 침전제로 피할 수 이차 항체에 매우 매력과 높은 배경의 소스에 기여할 수있다.
이 가능하고, 때때로 동시에 신경 세포의 개체군을 시각화 이중 염색을 수행하기 원하는. 이러한 이중 염색이 가능하며 일반적으로 다음과 같은 조합으로 만족스러운 결과를 제공합니다 Sox3 / N-욕조 또는 Myt1 / N-욕조. 그러나 Sox3 및 Myt1의 이중 염색은이 항체가 토끼 원점에서 둘 다 사실에 의해 복잡하다. 우리는 가능성으로 인해 이차 항체에서 신호 증폭의 부족으로 여러 항체 직접 라벨 키트, 그러나 더 만족스러운 결과를 (낮은 신호 대 잡음 레벨) 관찰되지 않았다을 테스트했습니다. 이 문제를 회피하기위한 하나의 가능한 방법은 후술하는 바와 같이, Xenopus의 형질 전환 라인을 마련하는 것이다.
이 프로토콜의 주요 제한 사항 중 하나는, 그 동안이 프로토콜 할 수 충분히 디입니다신경 세포의 두 가지 풀 stinguish, 즉 Sox3 발현하는 신경 줄기 세포의 풀과 Myt1 발현 분화 신경 세포는 분화 신경 세포는 다른 하위 집단을 표시하는 능력이 부족하다. 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다 하위 집단, 일차 운동 뉴런의 interneurons 및 감각 뉴런은 보통 차등 발현 마커 유전자 (28-30)을 특징으로한다. 위에서 언급 한 바와 같이, Xenopus의 배아에서 항체 기반의 면역 검출 방법과 함께 현장 하이브리드에 여러 가지 빛깔의 개발에 최근의 발전 가능성 조사 (31)에 대한 차별화 된 신경 세포의 이러한 하위 집단을 나타 내기 위해 격차를 입력 할 수 있습니다. 다르게는, 생쥐 모델에서 입증 된 바와 같이, 또한 Xenopus의 그러한 다른 세포 집단을 구별하는 세포 유형 특이 적 항체의 더 포괄적 인 세트를 발생하는 것이 바람직 할 것이다.
그것은이다또한 가치가이 방법에 추가로, 그 언급, 이러한 광자 현미경, 3 차원 재구성 및 분할 등의 광학 이미징 및 이미지 분석 최근 발전은 또한 초기 평가는보다 포괄적 인 Xenopus의 난 모세포의 관찰뿐만 아니라 달성 한 후 적용 할 수 있습니다 특히 32, 33을 설정하는 라이브에서 초기 배아. 따라서, 증식, 분화, 살아있는 동물에서 신경 세포의 움직임을 추적하기 위해서는 초기 Xenopus의 이러한 세포 집단의 실시간 관찰을 허용하는 세포 유형 특이 적 프로모터에 의해 구동되는 형광 단백질 항구 하나 이상의 형질 전환 라인을 확립하는 것이 바람직 할 것이다 배아. X의 설립 tauGFP 및 응용 프로그램을 구동 신경 특정 β-tubulin의 프로모터와 laevis의 라인은 좋은 예 23,34를 제공하고 있습니다. sox3 및 척추 동물 35-37 특징 myt1 모두의 전체 프로모터 서열, 그것은 쉬입니다Xenopus의 커뮤니티와 주요 신경 연구의 일반적인 필드 모두에 광범위하게 기여해야 Xenopus의 추가적인 유전자 변형 라인을 설정하기가 비교적 쉬운 울드.
Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
우리는 친절 각각 반 Sox3 및 안티 Myt1 항체를 제공하기 위해 맨체스터 대학에서 볼더의 콜로라도 대학에서 교수 마이클 Klymkowsky 교수 낸시 Papalopulu 감사합니다. 우리는이 프로토콜을 개발하는 그들의 통찰력 제안에 대한 Papalopulu 실험실의 구성원을 감사드립니다. 이 작품은 SZ 및 JL 두 가지 치유 재단 Studentships에 의해 지원되었으며, SZ / EA 각각 JL / EA, EA의 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust) (WT082450MA)에서 하나의 프로그램 보조금을 치유 재단, 한 기관의 전략적 지원 보조금에서이 프로젝트 보조금 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust) [097820 / Z / 11 / Z]에서.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Tris-base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 746452 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 793639 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | RDD003 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| 37% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Base Mould Disposable 15 Mm x 15 Mm x 5 Mm Simport | VWR | EMB-200-015A | |
| Base Mould Disposable 7 Mm x 7 Mm x 5 Mm Simport | VWR | EMB-200-010K | |
| Superfrost Plus slides | ThermoFisher | 12-550-15 | |
| Tissue Freezing Medium (OCT) | Leica | 14020108926 | |
| Cryostat | Leica | CM3050 | |
| Gloves | |||
| Dry Ice | |||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| 85-90 °C Heat block | |||
| PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Acetone, analytical grade | |||
| Staining jar with slide racks | |||
| Click-lock food box of appropriate size (has the capacity to hold 1-2 6-well plate inside) | |||
| anti-acetylated tubulin | Sigma-Aldrich | T7451 | |
| Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) | Cell Signaling | 4408 | |
| Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 555 Conjugate) | Cell Signaling | 4413 | |
| Alexa Fluor® 647 Phalloidin | Cell Signaling | 8940 | |
| DAPI | Cell Signaling | 4083 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Life Technologies | P36930 |
References
- De Robertis, E. M., Kuroda, H. Dorsal-ventral patterning and neural induction in Xenopus embryos. Annual Rev Cell Dev Biol. 20, 285-308 (2004).
- Wilson, S. W., Houart, C. Early steps in the development of the forebrain. Dev Cell. 6, 167-181 (2004).
- Hemmati-Brivanlou, A., Melton, D. Vertebrate embryonic cells will become nerve cells unless told otherwise. Cell. 88, 13-17 (1997).
- Hemmati-Brivanlou, A., Melton, D. A. Inhibition of activin receptor signaling promotes neuralization in Xenopus. Cell. 77, 273-281 (1994).
- Fainsod, A., et al. The dorsalizing and neural inducing gene follistatin is an antagonist of BMP-4. Mech Dev. 63, 39-50 (1997).
- Piccolo, S., Sasai, Y., Lu, B., De Robertis, E. M. Dorsoventral patterning in Xenopus: inhibition of ventral signals by direct binding of chordin to BMP-4. Cell. 86, 589-598 (1996).
- Zimmerman, L. B., De Jesus-Escobar, J. M., Harland, R. M. The Spemann organizer signal noggin binds and inactivates bone morphogenetic protein 4. Cell. 86, 599-606 (1996).
- Koyano, S., Ito, M., Takamatsu, N., Takiguchi, S., Shiba, T. The Xenopus Sox3 gene expressed in oocytes of early stages. Gene. 188, 101-107 (1997).
- Rogers, C. D., Harafuji, N., Archer, T., Cunningham, D. D., Casey, E. S. Xenopus Sox3 activates sox2 and geminin and indirectly represses Xvent2 expression to induce neural progenitor formation at the expense of non-neural ectodermal derivatives. Mech Dev. 126, 42-55 (2009).
- Zhang, C., Basta, T., Jensen, E. D., Klymkowsky, M. W. The beta-catenin/VegT-regulated early zygotic gene Xnr5 is a direct target of SOX3 regulation. Development. 130, 5609-5624 (2003).
- Penzel, R., Oschwald, R., Chen, Y., Tacke, L., Grunz, H. Characterization and early embryonic expression of a neural specific transcription factor xSOX3 in Xenopus laevis. Int J Dev Biol. 41, 667-677 (1997).
- Bellefroid, E. J., et al. X-MyT1, a Xenopus C2HC-type zinc finger protein with a regulatory function in neuronal differentiation. Cell. 87, 1191-1202 (1996).
- Moody, S. A., Miller, V., Spanos, A., Frankfurter, A. Developmental expression of a neuron-specific beta-tubulin in frog (Xenopus laevis): a marker for growing axons during the embryonic period. J Comp Neurol. 364, 219-230 (1996).
- Oschwald, R., Richter, K., Grunz, H. Localization of a nervous system-specific class II beta-tubulin gene in Xenopus laevis embryos by whole-mount in situ hybridization. Int J Dev Biol. 35, 399-405 (1991).
- Chitnis, A., Henrique, D., Lewis, J., Ish-Horowicz, D., Kintner, C. Primary neurogenesis in Xenopus embryos regulated by a homologue of the Drosophila neurogenic gene Delta. Nature. 375, 761-766 (1995).
- Roberts, A. Early functional organization of spinal neurons in developing lower vertebrates. Brain Res Bull. 53, 585-593 (2000).
- Hartenstein, V. Early neurogenesis in Xenopus: the spatio-temporal pattern of proliferation and cell lineages in the embryonic spinal cord. Neuron. 3, 399-411 (1989).
- Hirabayashi, Y., et al. The Wnt/beta-catenin pathway directs neuronal differentiation of cortical neural precursor cells. Development. 131, 2791-2801 (2004).
- Munji, R. N., Choe, Y., Li, G., Siegenthaler, J. A., Pleasure, S. J. Wnt signaling regulates neuronal differentiation of cortical intermediate progenitors. J Neurosci. 31, 1676-1687 (2011).
- Bonev, B., Stanley, P., Papalopulu, N. MicroRNA-9 Modulates Hes1 ultradian oscillations by forming a double-negative feedback loop. Cell Rep. 2, 10-18 (2012).
- Bonev, B., Pisco, A., Papalopulu, N. MicroRNA-9 reveals regional diversity of neural progenitors along the anterior-posterior axis. Dev Cell. 20, 19-32 (2011).
- Munoz, R., et al. Regeneration of Xenopus laevis spinal cord requires Sox2/3 expressing cells. Dev Biol. , (2015).
- Zhang, S., Li, J., Lea, R., Vleminckx, K., Amaya, E. Fezf2 promotes neuronal differentiation through localised activation of Wnt/beta-catenin signalling during forebrain development. Development. 141, 4794-4805 (2014).
- Zhang, S., Li, J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signalling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis. PloS one. 8, e79469 (2013).
- Wang, T. W., et al. Sox3 expression identifies neural progenitors in persistent neonatal and adult mouse forebrain germinative zones. J Comp Neurol. 497, 88-100 (2006).
- Sabherwal, N., et al. The apicobasal polarity kinase aPKC functions as a nuclear determinant and regulates cell proliferation and fate during Xenopus primary neurogenesis. Development. 136, 2767-2777 (2009).
- Falk, J., et al. Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus. BMC Dev Biol. 7, 107 (2007).
- Moreno, N., Retaux, S., Gonzalez, A. Spatio-temporal expression of Pax6 in Xenopus forebrain. Brain Res. 1239, 92-99 (2008).
- Kay, B. K., Shah, A. J., Halstead, W. E. Expression of the Ca2+-binding protein, parvalbumin, during embryonic development of the frog, Xenopus laevis. J Cell Biol. 104, 841-847 (1987).
- Park, B. Y., Hong, C. S., Weaver, J. R., Rosocha, E. M., Saint-Jeannet, J. P. Xaml1/Runx1 is required for the specification of Rohon-Beard sensory neurons in Xenopus. Dev Biol. 362, 65-75 (2012).
- Lea, R., Bonev, B., Dubaissi, E., Vize, P. D., Papalopulu, N. Multicolor fluorescent in situ mRNA hybridization (FISH) on whole mounts and sections. Methods Mol Biol. 917, 431-444 (2012).
- Canaria, C. A., Lansford, R. Advanced optical imaging in living embryos. Cell Mol Life Sci. 67, 3489-3497 (2010).
- Prouty, A. M., Wu, J., Lin, D. T., Camacho, P., Lechleiter, J. D. Multiphoton laser scanning microscopy as a tool for Xenopus oocyte research. Methods Mol Biol. 322, 87-101 (2006).
- Love, N. R., et al. pTransgenesis: a cross-species, modular transgenesis resource. Development. 138, 5451-5458 (2011).
- Kovacevic Grujicic, N., Mojsin, M., Krstic, A., Stevanovic, M. Functional characterization of the human SOX3 promoter: identification of transcription factors implicated in basal promoter activity. Gene. 344, 287-297 (2005).
- Wang, S., et al. Myt1 and Ngn3 form a feed-forward expression loop to promote endocrine islet cell differentiation. Dev Biol. 317, 531-540 (2008).
- Rogers, C. D., Archer, T. C., Cunningham, D. D., Grammer, T. C., Casey, E. M. Sox3 expression is maintained by FGF signaling and restricted to the neural plate by Vent proteins in the Xenopus embryo. Dev Biol. , 307-319 (2008).
