Summary
Dit artikel een gemakkelijke en snelle werkwijze voor het visualiseren van verschillende neuronale celpopulaties in het centrale zenuwstelsel van embryonale ontwikkeling middels immunofluorescentiekleuring op de afdelingen.
Introduction
In vertebraten, de ontwikkeling van het centrale zenuwstelsel omvat meerdere duidelijkere en opeenvolgende fasen. De eerste stap is neurale inductie bij naïeve ectodermale cellen worden gespecificeerd naar een neuraal lot plaats van een epidermale lot. Meerdere onderling verbonden regulerende mechanismen betrokken in deze fase van Xenopus en andere modelsystemen 1,2. Dit proces wordt voornamelijk gecoördineerd door uitgescheiden factoren die door de onderliggende mesoderm, zoals chordine, noggin en follistatin 3-7. Na neurale inductie, een deelverzameling van neurale voorlopercellen verlaat de celcyclus en beginnen te differentiëren in genoemd neurogenese primaire proces. Niet alle neuronale precursoren differentiëren op dit moment. De overblijvende neurale precursorcellen blijven prolifereren en hielden daar de stamcel pool nodig voor verdere groei van het centrale zenuwstelsel tijdens de ontwikkeling en in de volwassenheid.
deze proliferating neurale precursorcellen worden gekenmerkt door hun expressie van SRY (geslacht bepalend gebied Y) -box 3 (sox3) gen 8-11. De andere populatie van cellen, die afrit de celcyclus en zich verbinden tot een gedifferentieerd lot, worden geïdentificeerd door de expressie van de differentiatie-gen markers, tubuline, beta 2B klasse IIb (tubb2b, N-bad) en myeline transcriptiefactor 1 (myt1) 12-14. De gedifferentieerde neuronale cellen uiteindelijk aanleiding geven tot verschillende soorten neuronen waaronder, maar niet beperkt tot, motor, inter- en sensorische neuronen gelegen in verschillende gebieden in de neurale buis 15-17.
Hoewel aanzienlijke inspanningen zijn gewijd aan het blootleggen van de regulerende mechanismen die de patronen en het lot bepalen van de gebeurtenissen in de voorste neuroectoderm regeren, heeft minder aandacht geboekt bij het onderzoek naar de neurogene gebeurtenissen die zich voordoen na deaanvankelijke patroonvorming podium. Inderdaad, signaaltransductie, transcriptionele regelgeving, evenals post-translationele modificaties zijn allemaal betrokken bij dit later stadium, het beheersen van zowel de timing en het geslacht specificatie tijdens de neurogenese 18-20. Verder onderzoek naar deze mechanismen vereisen een betrouwbare methode om gemakkelijk te visualiseren en te onderscheiden verschillende populaties van neuronale cellen. De bovengenoemde neurale markers, waaronder Sox3, Myt1 en N-bad, kan een middel voor het identificeren van deze verschillende celpopulaties, waardoor de noodzakelijke basis voor het openbaren van de onderliggende mechanismen van neuronale differentiatie 21-23.
Hoewel differentiële labeling van neuronale celpopulaties zijn aangetoond in andere modelorganismen, relatief weinig studies de Xenopus systeem krijgen tot zijn recht in dit verband. Dit is voornamelijk te wijten aan een gebrek aan compatibele antilichamen die op betrouwbare wijze de verschillende neur identificerenonale cel bevolkingsgroepen in de neurale buis. Hier beschrijven we een werkwijze voor het visualiseren van neuronale differentiatie in vroege embryonale ontwikkeling via immunokleuring, die een krachtige en gemakkelijke benadering voor het onderzoeken van primaire neurogenese in Xenopus verschaft. Dit protocol moet voldoende leidraad voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in de vroege ontwikkeling van Xenopus centrale zenuwstelsel tussen fase 26 en fase 45.
Protocol
Alle dierproeven werden goedgekeurd door de Universiteit van Manchester Animal Welfare Centre en werden bedekt door een Britse ministerie van Binnenlandse Zaken Project License.
1. Verzameling en Fixatie van Xenopus embryo's
- Bereid reagentia en materialen voor experimenten.
- Bereid 10x Marc's Modified Ringers (MMR) door het oplossen van 56,5 g NaCl in ongeveer 800 ml ultrazuiver water en het toevoegen van voorraadoplossingen van 1 M KCl, 1 M MgSO4, 1 M CaCl2 en 1 M HEPES pH 7,4 tot een uiteindelijke concentratie te bereiken van 20 mM KCl, 10 mM MgSO 4, 20 mM CaCl2, 50 mM HEPES. Stel de pH tot 7,4 met 10 M NaOH en pas vervolgens het uiteindelijke volume tot 1 L.
- Steriliseer de 10x MMR oplossing autoclaaf bij 121 ° C gedurende 20 min op een vloeibare cyclus. Bij gebruik, verdunnen met DDH 2 O tot 0,1 x eindconcentratie en voeg 20 mg / L gentamycine microbiële groei remmen.
- Voeg 10x TBS-oplossing door het mengen van 24 g Tris-HCl, 5,6 g Tris-base, 88 g NaCl en oplossen in ongeveer 900 ml ultrapuur water. De uiteindelijke oplossing zal een pH-waarde rond 7,6 te hebben. Pas met ofwel 10 M NaOH of geconcentreerd HCl tot een uiteindelijke pH van 7,6 en de uiteindelijke volume tot 1 L. bereiken
- Bij het gebruik maken 1x TBS door het verdunnen van 1 deel 10x TBS-oplossing met 9 delen van ultrapuur water.
- Voeg 10x MEM zout door het oplossen van 209,2 g MOPS in ongeveer 800 ml ultrazuiver water en het toevoegen van voorraadoplossingen van 0,5 M EGTA en 1 M MgSO4 tot een eindconcentratie van 20 mM EGTA, 10 mM MgSO 4 bereiken. Stel de pH tot 7,4 met 10 M NaOH en pas vervolgens het uiteindelijke volume tot 1 L.
- Steriliseer het MEM zoutoplossing autoclaaf bij 121 ° C gedurende 20 min op een vloeistofkringloop (de oplossing geel met een paar maanden opslag bij kamertemperatuur of nadat deze is geautoclaveerd, maar kleurverandering heeft geen invloed op het gebruik ervan ). Echter, de oplossing na langdurige opslag (meer dan 6 maanden) gebruiken.
- Maak 1x MEMFA oplossing door verdunning 1 deel MEM zouten, 1 deel 37% formaldehyde met 8 delen van ultrazuiver water (v / v, stabiel bij 4 ° C gedurende ten minste 1-2 weken).
- Bereid 4% paraformaldehyde in TBS (voor daaropvolgende kleuring met falloïdine) door het oplossen van 4 g paraformaldehyde poeder in 100 ml 1 x TBS oplossing Verwarm de oplossing tot 60 ° C en enkele druppels van 10 M NaOH te helpen oplossen. Aliquot in 5-10 ml volume en de bevriezing van de -20 ° C. Niet opnieuw invriezen eenmaal ontdooid.
LET OP: Paraformaldehyde poeder is een irriterende stof en is giftig bij inademing, waardoor de wegen stap moet worden uitgevoerd in een zuurkast. - Label zoveel 4 ml glazen flesjes met schroefdoppen voorafgaand aan de collectie te proeven.
- Bereid 15% gelatine / 15% sucrose door gieten 20 ml 40% visgelatine (pre-warmte in een 50 ° C waterbad) in een 50 ml centrifugebuis. Voeg 8 g sucrose en vul de buis naar de 50 ml lijn met 1x TBS.
- Plaats de gelatine buis op een roterende mixer of rollend bedom 's nachts te mengen bij kamertemperatuur. Deze gelatine-oplossing is stabiel bij 4 ° C gedurende 1 week. Do verlopen oplossing niet te gebruiken en niet invriezen en ontdooien.
- Bereid en Fix X. laevis of X. tropicalis embryo's gekweekt om gewenste Stages.
- Cultuur de bevruchte X. laevis of X. tropicalis embryo's in 0.1x MMR met gentamycine tot de gewenste fasen.
LET OP: In het algemeen, het verzamelen van embryo's tussen de trappen 23 en 40. Later verzamelen van embryo's na etappe 40 is mogelijk, vooral bij het observeren van axonale groei van het ruggenmerg, maar in gedachten houden dat er extra gelatine doorbraaktijd kan worden verlangd. Het embryo kan wildtype transgene, mutant, remmer behandelde, morfolino (MO) -injected of geëlektroporeerd 23,24. - Verzamel 20-50 embryo's in elk 4 ml glazen flesje, verwijder zoveel medium mogelijk en te vervangen door MEMFA.
LET OP: Als de daaropvolgende kleuring gaat phalloidin Gebruik 4% paraformaldehydein plaats van MEMFA omdat commerciële geleverd formaldehydeoplossingen bevatten gewoonlijk tot 10% methanol als een stabilisator die stoort phalloidin kleuring. - Fix overnacht bij 4 ° C of, indien in een noodsituatie, bij kamertemperatuur gedurende 2 uur op een roterende mixer. De embryo's in stabiele fixatie oplossing gedurende ten minste 1 week bij 4 ° C.
- Na fixatie was de embryo 3 maal gedurende 20 min met behulp 1x TBS met 0,05% Triton X-100. Na de laatste wasbeurt, verwijder zoveel TBS-Triton mogelijk en voeg 3 ml van 15% gelatine / 15% sucrose in elk flesje.
- Plaats de flesjes op een roller bed overnacht bij kamertemperatuur. Voor embryo's ouder dan 40 stadium, gebruik van ten minste 24 uur van de penetratie tijd. Na penetratie, ga meteen naar paragraaf 2.2 op de volgende dag.
- Cultuur de bevruchte X. laevis of X. tropicalis embryo's in 0.1x MMR met gentamycine tot de gewenste fasen.
2. Montage en cryosectioning van Xenopus embryo's
- Bereid reagentia en materialen voor experimenten.
- Neem een doos positief charged dia's, idealiter ongeopend.
OPMERKING: Na het openen houdt de objectglaasjes in een droge toestand (zoals een droogkast) en binnen 1 maand te zorgen voor de statische lading op de glijbaan wordt gehandhaafd. Do verlopen dia's niet te gebruiken, aangezien samples uit zal vallen tijdens immunokleuring. - Pre-chill de cryostaat kamer tot -30 ° C. Stel het instrument parameters als -35 ° C voor microtoom en 12 um coupedikte. Installeer de dikke deksel glazen plaat op het podium en laat de cryostaat in evenwicht komen gedurende ten minste 30 minuten vóór deel begint.
- Bereid schilderen borstels voor het verplaatsen van sectie strips, houden binnen de cryostaat kamer.
- Bereid potloden voor het schrijven op dia's, zet ze op kamertemperatuur.
- Draag handschoenen tijdens cryosectie. Do blote handen niet gebruiken.
- Neem een doos positief charged dia's, idealiter ongeopend.
- Montage Xenopus embryo's
- Zorgvuldig aspireren 5-10 embryo's uit het glazen flesje met behulp van een plastic of glazen pipet zonder dat er luchtbellen. Overdracht van de embryo's inaan de montage kamer en observeren onder een stereoscoop. Vul de montage kamer met gelatineoplossing aan de stijfheid van de sectie blok waarborgen.
- Regelen van de embryo's volgens figuur 1 met een paar fijne tip pincet. Markeer de oriëntatie van koppen door trekken een pijl op de rand van de tank af met een cryogene-compatibele marker. Voor meerdere groepen van embryo's, schrijf de beschrijving van elke groep op de rand van de overeenkomstige kamer ook.
- Plaats voorzichtig de kamer horizontaal in een schuim doos half gevuld met droogijs en sluit het deksel. Houd u aan de montage kamer freeze in 5-10 minuten. Verwerk elke kamer serieel (dwz plaats de vorige kamer op droog ijs alvorens tot de volgende) als deze voldoende tijd voor elke kamer te bevriezen en te voorkomen dat het droogijs vak overvol zal verlaten.
LET OP: Frozen montage kamers niet nodig om horizontaal te staan en kunnen worden gestapeld binnen het strafschopgebied. - Doorgaan met cryosectioning of desgewenst houdt bevroren monsters bij -80 ° C gedurende ten minste 1-2 weken zonder verlies van immunogeniciteit.
- Cryosectie van Gemonteerd Xenopus embryo's
- Verwijder een bevroren monsterblok uit de kamer door de bodem van de kamer met een stomp stok (zoals een potlood).
- Voeg enkele druppels weefsel vriesmedium, (een polyethyleenglycol en polyvinylalcohol bevattende medium) op het monster bedrijf schijf en zet het monsterblok met het voorste uiteinde van het embryo naar boven wijst (Figuur 2). Laat de mounted- blok staan in de cryostaat kamer gedurende ongeveer 1 min of totdat het weefsel bevriezen medium ondoorzichtig.
- Onmiddellijk installeert het monster bedrijf schijf op de microtoom met de onderzijde van het monsterblok naar boven. Snij een deel van het monsterblok met een mes wanneer het monsterblok nog relatief "zacht" naar de lengte van elke sectie te verminderen(indien gewenst). Uit de steekproef bedrijf schijf op de microtoom gedurende ten minste 5 minuten, zodat de temperatuur op elkaar kunnen.
- Geleidelijk aan trim de sample blok naar beneden totdat de hoofden van de kikkervisjes zijn zichtbaar door de doorschijnende gelatine. Te verhogen trimmen snelheid, breng dan een hoger (dikkere) instelling van coupedikte (bv 20-25 uM) in dit stadium (zoals het inschakelen van de optie 'knippen'), maar niet te dik, want sample blok kan vallen uit de steekproef Holding disc . Observeer de prestaties van cryostaat, zoals de scherpte en de hoek van de schoep in dit stadium het ontstaan van een lange strook volgende paragrafen waarborgen.
- Zodra het kikkervisje hoofden zichtbaar worden, pas de instellingen van de cryostaat terug naar normaal (bijv 10-12 uM) en schoon zowel de microtoom en het podium met behulp van een kwast. Voorzichtig maken 2-3 secties als een proef met de instelling handwiel (geen gebruik maken van de gemotoriseerde instelling) om ervoor te zorgen dat afgewerkte plakjes str kunnen vormenips, niet overlappen of vast te houden aan het blad.
- Ga door het trimmen tot de hoofden van kikkervisjes bijna zijn blootgesteld (dit kan enige ervaring, maar haalbaar nodig). Borstel uit een spoor secties op het podium en het verzamelen van het monster secties zal beginnen.
- Maak ongeveer 10-15 secties en laat ze vormen een lange strook.
- Flip over de dikke deksel glazen plaat aan de zijkant en voorzichtig de strip te verwijderen uit het blad met een fijn-tip kwast en leg het op het podium met een lange as parallel aan het blad.
- Kies er een positief geladen slide bij kamertemperatuur, etiket het met een potlood (die niet uitgeschakeld worden gewassen tijdens de daaropvolgende kleuring behandelingen), drukt u op het snel, maar stevig op de strip met het label naar beneden en verwijder de dia uit de cryostaat kamer. Als dit juist gebeurt, moet de strook onmiddellijk houden aan de positief geladen slide (figuur 3A).
- Herhaal deze stap tot 20-30 plakjes op elkaar geschoven hebbene en parallel (figuur 3B). Dit is voldoende om het hele hersengebied X. dekken tropicalis embryo en de meeste van de voorhersenen en middenhersenen regio X. laevis embryo's.
- Lucht Droog de objectglaasjes gedurende 10 minuten, onmiddellijk over of de objectglaasjes in een doos bewaren bij -80 ° C gedurende ten minste 3-6 maanden zonder verlies van immunogeniciteit.
3. Immunokleuring van doorsnede Xenopus embryo's
- Bereid reagentia en materialen voor experimenten.
- Bereid 0,05% TBS-Triton X-100 door de toevoeging van Triton X-100 in 1 x TBS tot een eindconcentratie van 0,05% te bereiken. Deze oplossing is stabiel bij kamertemperatuur gedurende 3-4 dagen. Do verlopen oplossing niet gebruiken.
- Bereid 5% door warmte geïnactiveerd geit serum of 5% BSA in TBST als blokkeerbuffer. Ten eerste warmte-geïnactiveerd geit / lam serum door het plaatsen van ongeveer 20-30 ml serum in een 65 ° C waterbad gedurende 30-60 min. Aliquot in 1,5 ml centrifugebuizen en bevriezing van -20 ° C. Geen re-inactivatie is vereist bij het gebruik van.
- Verdun het warmte geïnactiveerd serum of BSA in TBST tot een eindconcentratie van 5% te bereiken vóór gebruik.
- Bereid geschikte primaire antilichamen volgens verdunningen in het blokkeren van buffer (bijvoorbeeld 1: 500 anti-Sox3 10,25 / 1: 250 anti-Myt1 26 / anti-geacetyleerde tubuline). Met ongeveer 100 gl antilichaamoplossing elke dia.
- Bereid geschikte fluorescerende antilichamen (bv anti-muis / konijn rode fluorescerende kleurstof-geconjugeerde antilichamen) in het blokkeren van buffer (meestal 1: 500).
- (Optioneel) Voeg rode fluorescerende kleurstof-geconjugeerde Phalloidin (1: 500) in secundair antilichaam mix aan actine netwerk te onthullen.
- (Optioneel) Voeg DAPI (0,5 ug / ml uiteindelijke concentratie) in secundair antilichaam mix nucleaire lokalisatie te visualiseren.
- Neem de anti-fade montage medium uit de vriezer en ontdooien in water op kamertemperatuur bad.
- immunokleuring
- Haal de bevroren dia's van -80 ° C en leg ze op een stuk papier handdoek in een afzuigkap minstens 1 uur aan een gecondenseerde waterdruppels te elimineren, dan bak de gedroogde dia's op een 85-90 ° C verwarmen blok met de plakjes omhoog gedurende 15 min om de hechting te activeren. Tenslotte laat de objectglaasjes afkoelen tot kamertemperatuur (ten minste 10 minuten).
- Vul de kleuring pot met pure aceton en incubeer de dia's in aceton gedurende 10 minuten om te vissen gelatine te verwijderen. Als er meerdere dia's zijn te behandelen, schik ze op een kleuring rek. Lucht drogen de behandelde-dia's voor 15 min in een afzuigkap. Niet opnieuw gebruik maken van de aceton.
- Zorgvuldige wijze een ring rond de monsters op de dia met behulp van een PAP pen zonder dat de monsters te raken. Zorg ervoor dat de ring is self-ingesloten, anders antilichaam oplossing zal stromen tijdens de kleuring. Volledig droog de PAP pen ring.
- Vul een andere kleuring pot met 1x TBS zonder Triton X-100. Insert de gedroogde schuift in de kleuring pot en laat rehydratatie minstens 1 uur. Ondertussen bereidt de blokkerende buffer door verdunning hetzij geïnactiveerd geit serum of BSA tot 5% eindconcentratie behulp 1x TBS met 0,05% Triton X-100.
- Maak een natte doos door het plaatsen van 1-2 juni-well platen in een click-lock food box en vul de putten helft met ultrapuur water. Verwijderen gerehydrateerd objectglaasjes uit de kleuring pot en plaats ze horizontaal op de 6-well platen (zonder deksel plaat).
- Voeg voorzichtig 300-600 ul van het blokkeren van buffer in de PAP ring. Verzegel de vochtige kast door het vergrendelen van de deksel op zijn plaats en incubeer bij kamertemperatuur gedurende tenminste 1 uur.
- Verdun de juiste primaire antilichamen in het blokkeren van buffer. Over het algemeen gebruiken 100-150 ul verdund antilichaam oplossing per slide. Als er meerdere dia's worden verwerkt, opschalen het volume proportioneel.
- Na het blokkeren, verwijder voorzichtig de blokkerende buffer van dia's door aspiratie en snel toe te voegen primary antilichaamoplossing voorkomen uitdrogen, dan sluit de natte doos en incuberen bij 4 ° C overnacht.
- Op de volgende dag, verwijdert de primaire antilichaamoplossing van de objectglaasjes door afzuiging. Was de dia Door in kleurbakjes gevuld met 1 x TBS met 0,05% Triton X-100, 3 keer, 15 minuten elk. Ondertussen verdunnen geschikte fluorescente secundaire antilichamen met blokkerende buffer (met of zonder DAPI of phalloidin).
- Voeg voorzichtig 100-150 ul van secundair antilichaam oplossing op de dia's. Plaats de dia's in de natte doos en sluit de deksel. Incubeer de glaasjes gedurende 1-2 uur bij kamertemperatuur.
- Was de dia's in kleurbakjes gevuld met 1 x TBS met 0,05% Triton X-100, 3 keer, 15 minuten elk. Voor deze laatste wassing ontdooien de anti-fade montage medium in een 50 ° C waterbad gedurende 10 minuten indien bewaard bij -20 ° C. Afkoelen de montage medium op kamertemperatuur voor gebruik.
- Voeg ongeveer 20 ul (één druppel) van de montage medium opde glijbaan en leg een groot dekglaasje (minstens 22 mm x 64 mm) over de monsters. Let op het gebruik van fluorescerende of confocale microscoop binnen 6 uur na montage.
- Als beeldvorming niet kan worden gedaan op dezelfde dag, verzegelen dia's met behulp van nagellak en plaats ze in de natte doos bij 4 ° C gedurende de nacht.
LET OP: De anti-fade montage medium zal geleidelijk krijgen geoxideerd na een paar dagen (en draai bruinachtig) dus het is aan te bevelen om de beelden zo snel mogelijk te nemen.
- Als beeldvorming niet kan worden gedaan op dezelfde dag, verzegelen dia's met behulp van nagellak en plaats ze in de natte doos bij 4 ° C gedurende de nacht.
Representative Results
De representatieve resultaten tonen dwarsdoorsneden van fase 30 Xenopus embryo's op verschillende niveaus, namelijk de voorhersenen, middenhersenen, achterhersenen en ruggenmerg, gekleurd met verschillende antilichamen (Figuur 4). Zoals gezegd, Sox3 gemerkt neuronale voorlopercellen celpopulatie plaatst in de nabijheid van het lumen van de neurale buis, terwijl MyT1-gesplitste gelabelde primaire neuronen migreren naar buiten en zoek bij de marginale laag (basale lamina) van de neurale buis. Anti-acetyl-tubuline labels axons in gedifferentieerde neuronen, die binnen de gehele neurale buis kan worden waargenomen.
Side-specifiek gen knockdown of overexpressie een algemeen gebruikte methode neurobiologie te beoordelen of het moduleren van de expressie van specifieke genen (s) verstoort de groei en differentiatie van neuronale cellen. In dergelijke gevallen kunnen Morpholinos (MO's) of DNA construct (en) waarin Pro -moter aangedreven gen (en) worden geïnjecteerd in een van de twee blastomeren op twee-cellig stadium 23. Als alternatief kunnen zij worden geïnjecteerd in de hersenen ventrikel, gevolgd door elektroporatie, wat zal resulteren in knockdown of overexpressie van gewenste gen (en) 27. In beide gevallen zullen de effecten beperkt tot één zijde van het embryo, waardoor de andere zijde van het embryo onbehandelde interne controle.
Na fixatie snijden en immunokleuring, worden de effecten van gen knockdown / overexpressie gekwantificeerd door het tellen en de cel aantallen verschillende populaties vergelijken aan beide zijden van het embryo. Door het verzamelen van deze gegevens uit verschillende embryo's, kan een statistische analyse worden uitgevoerd. In onze representatieve resultaten, werd geen verstoring in het embryo. Voorbeelden van gen verstoring en hun effecten op de verschillende neuronale celpopulaties kan worden gevonden in de referenties 20,23.
t "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figuur 1:. Embryo regeling en oriëntatie in de sectie mal (A) Een cartoon afbeelding toont de montage-montage, let op de lade is gelabeld met de datum, podium, en de oriëntatie van embryo's. (B) Een afbeelding met de natuurlijke uitstraling van de dragende opstelling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2:. De oriëntatie en positie van de gelatine blok op het monster voorhanden schijf (A) Een cartoon afbeelding toont de sectie blok assemblage, er rekening mee dat de embryo's zich in een "heads up" positie en de gelatine blok is stevig onto het monster Holding disc door het weefsel bevriezen medium op de basis (zie figuur 2B). (B) Een afbeelding met de natuurlijke uitstraling van de sectie blok assemblage, let op de accumulatie van het weefsel bevriezen medium tussen de gelatine blok en het monster voorhanden schijf. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3:. Continu snijden (A) Model van een sectie kamer. Het monster deelneming disc moet worden gedraaid en vastgezet op het standpunt dat de embryo kant naar boven wijst. Na een paar (6-10) secties, worden de lange strook van de continue sectie tegels voorzichtig gescheiden van het mes (blauw) met behulp van een fijn penseel, en vervolgens 90 ° gedraaid op het bedrijf plaat. Dan is een kamer-temp positief geladen slide isstevig op de sectie strip gedrukt naar beneden en meteen hief de verzamelde afgewerkte strips. (B) Normaal gesproken elke dia is geschikt voor 2 parallelle lijnen van strips, zoals weergegeven. Vergeet niet om gedetailleerd verslag op de dia label met behulp potlood te maken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Dwarsdoorsnede van het podium 30 X. laevis kikkervisjes en vlekken in het zenuwweefsel, 20X. (A) Schema's met vermelding van de relatieve posities (voorhersenen, middenhersenen, achterhersenen en ruggenmerg) van de sectie vliegtuigen op Xenopus kikkervisjes. (B) De overeenkomstige doorsneden gekleurd met anti-Sox3 (rood), anti-geacetyleerde-tubuline (Green) en DAPI (blauw), die de relatieve locaties van neurale stamcellen zwembaden en neurofilamenten in de neurale buis. (C) Overeenkomstige doorsneden gekleurd met anti-MyT1 (rood) en DAPI (blauw), die de relatieve locaties van primaire gedifferentieerde neuronen in de neurale buis. Schaal bar = 20 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Hier laten we een handige en efficiënte methode voor het visualiseren primaire neurogenese in Xenopus embryo. Deze methode maakt de beoordeling van verschillende soorten neurale cellen, zoals neuronale stamcellen en gedifferentieerde neuronen primaire behulp celtype-specifieke merkers.
Het protocol is algemeen robuust met zeer hoge reproduceerbaarheid. Voor embryo's die zijn dan vooraf uitkomen stadia (dwz tot stadium 28), raden we aan het handmatig verwijderen van de vitelline membraan voorafgaand aan fixatie als dit maakt het mogelijk embryo's volledig krul voor fixatie. Dit is vooral belangrijk bij het verzamelen van embryo's bij relatief vroeg stadium (voor het uitkomen), aangezien gebogen embryo uiterst moeilijk te regelen in de gewenste oriëntatie in de montage kamer. We hebben niet ervaren een verlies van immunogeniciteit na MEMFA of PFA fixatie dus extra antigeenterugtrekking stap is niet nodig voor dit protocol. Daarnaast is dezeimmunokleuring procedure kan worden uitgevoerd op monsters van chromogene / fluorescente in situ hybridisatie uitgevoerd. In een dergelijk scenario, is het raadzaam om het protease K behandeling stap tijdens de in situ hybridisatie protocol over te slaan. Na chromogeen / substraat fluorescent reactie kan monsters gewassen met TBS en ingebed in visgelatine oplossing op dezelfde manier MEMFA / PFA gefixeerde monsters. Monsterflesjes niet blootstaat aan licht door het wikkelen van de flacons in aluminiumfolie of fluorescente in situ hybridisatie worden met immunofluorescentie kleuring later afgebeeld.
In sommige gevallen kan embryo overmatig krimpen na gelatine penetratie. Dit wordt waarschijnlijk veroorzaakt door een onvoldoende fixatie of onvoldoende TBS-extractie Triton. Controleer of embryo's in PFA / MEMFA vastgesteld ten minste 2-3 uur en bij voorkeur overnacht bij 4 ° C. Als het probleem aanhoudt, verhoging van de wastijd van TBS-Triton tot 3 voor 1 uur.
Tijdens cryo-sectioning, de stijfheid van monsterblok kan variëren als verschillende partijen visgelatine verschillende eigenschappen. Dit probleem kan gedeeltelijk worden gecompenseerd door aanpassing van de temperatuur van het microtoom. Een lagere temperatuur resulteert in een "hardere" monsterblok echter onder zware lage temperatuur het monsterblok wordt helder en moeilijk punt. Sommige fine-tuning of gebruiken (met behulp van mock sample blokken zonder embryo's) voor elke snijden kan gunstig zijn voor gebruik op bijzonder waardevol monsters.
Een veel voorkomende probleem tijdens snijden is de dunne secties soms de neiging om vast te houden op de dikke glasplaat in plaats van te blijven plat op de stalen podium. Dit kan met name het verstoren, omdat het voortdurend onderbreekt de continue snijbeweging. Dergelijke gevallen worden meestal veroorzaakt door een van twee redenen: de sectie kamer en (vooral) de dikke glasplaat niet te koud genoeg is, of overmatige statische lading op de machine en de operator, vooral bij droog weer. De eerste kan worden opgelost door het draaien van de temperatuur van de sectie kamer en het verlaten van de glasplaat binnen voor extra tijd (eventueel 's nachts); en de laatste door de juiste aarding van de cryostaat. het metalen oppervlak van de cryostaat aansluiten op een metalen kraan of soortgelijke water tubing systeem van metaal kan een alternatieve manier om de statische lading vrij te geven. Na elk gebruik, moet de dikke glasplaat goed worden gewassen met een niet-bijtend schoonmaakmiddel (zoals afwasmiddel), gespoeld door ultrapuur water, worden besproeid met zuivere ethanol, en gewikkeld in een handdoek papier om het oppervlak en de randen te beschermen tegen beschadiging.
De in het protocol genoemde antilichamen zijn in het algemeen specifiek en we zelden tegenkomen niet-specifieke adsorptie of hoge achtergrond signaal. Opgemerkt wordt dat, bij gebruik van hitte-geïnactiveerd geit / lam serum als blokkeermiddel, hitte-inactivatie (zoals zichtbaar gemaakt door de vorming van zachte neerslagmiddel in het serum) bereikenworden vermeden omdat dit neerslagmiddel is zeer aantrekkelijk voor secundaire antilichamen en kunnen bijdragen aan een bron van hoge achtergrond.
Het is mogelijk en soms gewenst om dubbele kleuring uitvoeren om verschillende populaties van neuronale cellen gelijktijdig te visualiseren. Dergelijke dubbele-kleuring is mogelijk en in het algemeen geeft bevredigende resultaten met de volgende combinaties: Sox3 / N-tub of Myt1 / N-bad. Echter, dubbele kleuring van Sox3 en Myt1 gecompliceerd door het feit dat de twee antilichamen zijn beiden van konijnen oorsprong. We hebben verschillende antilichaam direct merken kits, maar geen bevredigende resultaten werden waargenomen (laag signaal-ruisniveau) getest, mogelijk als gevolg van het ontbreken van signaalversterking van secundaire antilichamen. Eén mogelijke benadering om dit probleem te omzeilen is om transgene lijnen in Xenopus verhogen, zoals hierna besproken.
Een van de belangrijkste beperkingen van dit protocol is dat, terwijl dit protocol zou voldoende distinguish twee pools van neuronale cellen, namelijk de Sox3 expressie neurale stamcel zwembad en Myt1 expressie gedifferentieerde neuronen, het mist de mogelijkheid om verschillende subpopulaties van gedifferentieerde neuronen te onthullen. Dergelijke sub-populaties, die inclusief, maar niet beperkt tot, primaire motorische neuronen, interneuronen en sensorische neuronen, worden meestal gekenmerkt door hun differentieel tot expressie merkergenen 28-30. Zoals hierboven vermeld, kunnen de recente vooruitgang in de ontwikkeling van veelkleurige in situ hybridisatie gecombineerd met immunofluorescentie antilichamen gebaseerde detectiemethode in Xenopus embryo's in de leemte deze subpopulaties van gedifferentieerde neuronen te onderzoeken op mogelijke 31. Als alternatief, zoals is aangetoond in muizen model, zou het ook gewenst zijn om een uitgebreidere reeks celtype-specifieke antilichamen te maken tegen verschillende celpopulaties onderscheiden Xenopus.
Het isook vermeldenswaardig dat, als aanvulling op deze werkwijze, recente ontwikkelingen in optische beeldvorming en beeldanalyse zoals multifoton microscopie, 3D reconstructie en segmentatie, kan ook worden aangebracht na de eerste beoordelingen voor uitgebreidere opmerkingen van Xenopus oöcyten en bereiken vroege embryo's, met name onder een levende instelling 32,33. Daarom, om de proliferatie, differentiatie en beweging van neuronale cellen in levende dieren te volgen, zou het wenselijk zijn om één of meer transgene lijnen die fluorescerende eiwitten aangedreven door celtype-specifieke promotor herbergen live waarneming van dergelijke celpopulaties in vroege Xenopus, kan worden gecontroleerd embryo. De oprichting van een X. laevis lijn met neuro-specifieke β-tubuline promotor die tauGFP en haar toepassingen hebben verstrekt een mooi voorbeeld 23,34. Met de volledige promotorsequenties volgens zowel sox3 en myt1 kenmerk vertebraten 35-37 is shOuld relatief eenvoudig om extra transgene lijnen in Xenopus die op grote schaal zou moeten bijdragen aan zowel de Xenopus gemeenschap en een meer algemene gebied van primaire neurogenese onderzoek vast te stellen.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Prof. Michael Klymkowsky aan de Universiteit van Colorado in Boulder en prof Nancy Papalopulu in de Universiteit van Manchester voor vriendelijk het verstrekken van anti-Sox3 en anti-Myt1 antilichamen, respectievelijk. Wij danken de leden van de Papalopulu lab voor hun inzichtelijke suggesties bij de ontwikkeling van dit protocol. Dit werk werd ondersteund door twee Healing Foundation studentships te SZ en JL, twee projectsubsidies van de Healing Foundation om SZ / EA en JL / EA respectievelijk één programma subsidie van de Wellcome Trust EA (WT082450MA), en één institutionele strategische ondersteuning subsidie van de Wellcome Trust [097820 / Z / 11 / Z].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Tris-base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 746452 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 793639 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | RDD003 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| 37% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Base Mould Disposable 15 Mm x 15 Mm x 5 Mm Simport | VWR | EMB-200-015A | |
| Base Mould Disposable 7 Mm x 7 Mm x 5 Mm Simport | VWR | EMB-200-010K | |
| Superfrost Plus slides | ThermoFisher | 12-550-15 | |
| Tissue Freezing Medium (OCT) | Leica | 14020108926 | |
| Cryostat | Leica | CM3050 | |
| Gloves | |||
| Dry Ice | |||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| 85-90 °C Heat block | |||
| PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Acetone, analytical grade | |||
| Staining jar with slide racks | |||
| Click-lock food box of appropriate size (has the capacity to hold 1-2 6-well plate inside) | |||
| anti-acetylated tubulin | Sigma-Aldrich | T7451 | |
| Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) | Cell Signaling | 4408 | |
| Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 555 Conjugate) | Cell Signaling | 4413 | |
| Alexa Fluor® 647 Phalloidin | Cell Signaling | 8940 | |
| DAPI | Cell Signaling | 4083 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Life Technologies | P36930 |
References
- De Robertis, E. M., Kuroda, H. Dorsal-ventral patterning and neural induction in Xenopus embryos. Annual Rev Cell Dev Biol. 20, 285-308 (2004).
- Wilson, S. W., Houart, C. Early steps in the development of the forebrain. Dev Cell. 6, 167-181 (2004).
- Hemmati-Brivanlou, A., Melton, D. Vertebrate embryonic cells will become nerve cells unless told otherwise. Cell. 88, 13-17 (1997).
- Hemmati-Brivanlou, A., Melton, D. A. Inhibition of activin receptor signaling promotes neuralization in Xenopus. Cell. 77, 273-281 (1994).
- Fainsod, A., et al. The dorsalizing and neural inducing gene follistatin is an antagonist of BMP-4. Mech Dev. 63, 39-50 (1997).
- Piccolo, S., Sasai, Y., Lu, B., De Robertis, E. M. Dorsoventral patterning in Xenopus: inhibition of ventral signals by direct binding of chordin to BMP-4. Cell. 86, 589-598 (1996).
- Zimmerman, L. B., De Jesus-Escobar, J. M., Harland, R. M. The Spemann organizer signal noggin binds and inactivates bone morphogenetic protein 4. Cell. 86, 599-606 (1996).
- Koyano, S., Ito, M., Takamatsu, N., Takiguchi, S., Shiba, T. The Xenopus Sox3 gene expressed in oocytes of early stages. Gene. 188, 101-107 (1997).
- Rogers, C. D., Harafuji, N., Archer, T., Cunningham, D. D., Casey, E. S. Xenopus Sox3 activates sox2 and geminin and indirectly represses Xvent2 expression to induce neural progenitor formation at the expense of non-neural ectodermal derivatives. Mech Dev. 126, 42-55 (2009).
- Zhang, C., Basta, T., Jensen, E. D., Klymkowsky, M. W. The beta-catenin/VegT-regulated early zygotic gene Xnr5 is a direct target of SOX3 regulation. Development. 130, 5609-5624 (2003).
- Penzel, R., Oschwald, R., Chen, Y., Tacke, L., Grunz, H. Characterization and early embryonic expression of a neural specific transcription factor xSOX3 in Xenopus laevis. Int J Dev Biol. 41, 667-677 (1997).
- Bellefroid, E. J., et al. X-MyT1, a Xenopus C2HC-type zinc finger protein with a regulatory function in neuronal differentiation. Cell. 87, 1191-1202 (1996).
- Moody, S. A., Miller, V., Spanos, A., Frankfurter, A. Developmental expression of a neuron-specific beta-tubulin in frog (Xenopus laevis): a marker for growing axons during the embryonic period. J Comp Neurol. 364, 219-230 (1996).
- Oschwald, R., Richter, K., Grunz, H. Localization of a nervous system-specific class II beta-tubulin gene in Xenopus laevis embryos by whole-mount in situ hybridization. Int J Dev Biol. 35, 399-405 (1991).
- Chitnis, A., Henrique, D., Lewis, J., Ish-Horowicz, D., Kintner, C. Primary neurogenesis in Xenopus embryos regulated by a homologue of the Drosophila neurogenic gene Delta. Nature. 375, 761-766 (1995).
- Roberts, A. Early functional organization of spinal neurons in developing lower vertebrates. Brain Res Bull. 53, 585-593 (2000).
- Hartenstein, V. Early neurogenesis in Xenopus: the spatio-temporal pattern of proliferation and cell lineages in the embryonic spinal cord. Neuron. 3, 399-411 (1989).
- Hirabayashi, Y., et al. The Wnt/beta-catenin pathway directs neuronal differentiation of cortical neural precursor cells. Development. 131, 2791-2801 (2004).
- Munji, R. N., Choe, Y., Li, G., Siegenthaler, J. A., Pleasure, S. J. Wnt signaling regulates neuronal differentiation of cortical intermediate progenitors. J Neurosci. 31, 1676-1687 (2011).
- Bonev, B., Stanley, P., Papalopulu, N. MicroRNA-9 Modulates Hes1 ultradian oscillations by forming a double-negative feedback loop. Cell Rep. 2, 10-18 (2012).
- Bonev, B., Pisco, A., Papalopulu, N. MicroRNA-9 reveals regional diversity of neural progenitors along the anterior-posterior axis. Dev Cell. 20, 19-32 (2011).
- Munoz, R., et al. Regeneration of Xenopus laevis spinal cord requires Sox2/3 expressing cells. Dev Biol. , (2015).
- Zhang, S., Li, J., Lea, R., Vleminckx, K., Amaya, E. Fezf2 promotes neuronal differentiation through localised activation of Wnt/beta-catenin signalling during forebrain development. Development. 141, 4794-4805 (2014).
- Zhang, S., Li, J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signalling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis. PloS one. 8, e79469 (2013).
- Wang, T. W., et al. Sox3 expression identifies neural progenitors in persistent neonatal and adult mouse forebrain germinative zones. J Comp Neurol. 497, 88-100 (2006).
- Sabherwal, N., et al. The apicobasal polarity kinase aPKC functions as a nuclear determinant and regulates cell proliferation and fate during Xenopus primary neurogenesis. Development. 136, 2767-2777 (2009).
- Falk, J., et al. Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus. BMC Dev Biol. 7, 107 (2007).
- Moreno, N., Retaux, S., Gonzalez, A. Spatio-temporal expression of Pax6 in Xenopus forebrain. Brain Res. 1239, 92-99 (2008).
- Kay, B. K., Shah, A. J., Halstead, W. E. Expression of the Ca2+-binding protein, parvalbumin, during embryonic development of the frog, Xenopus laevis. J Cell Biol. 104, 841-847 (1987).
- Park, B. Y., Hong, C. S., Weaver, J. R., Rosocha, E. M., Saint-Jeannet, J. P. Xaml1/Runx1 is required for the specification of Rohon-Beard sensory neurons in Xenopus. Dev Biol. 362, 65-75 (2012).
- Lea, R., Bonev, B., Dubaissi, E., Vize, P. D., Papalopulu, N. Multicolor fluorescent in situ mRNA hybridization (FISH) on whole mounts and sections. Methods Mol Biol. 917, 431-444 (2012).
- Canaria, C. A., Lansford, R. Advanced optical imaging in living embryos. Cell Mol Life Sci. 67, 3489-3497 (2010).
- Prouty, A. M., Wu, J., Lin, D. T., Camacho, P., Lechleiter, J. D. Multiphoton laser scanning microscopy as a tool for Xenopus oocyte research. Methods Mol Biol. 322, 87-101 (2006).
- Love, N. R., et al. pTransgenesis: a cross-species, modular transgenesis resource. Development. 138, 5451-5458 (2011).
- Kovacevic Grujicic, N., Mojsin, M., Krstic, A., Stevanovic, M. Functional characterization of the human SOX3 promoter: identification of transcription factors implicated in basal promoter activity. Gene. 344, 287-297 (2005).
- Wang, S., et al. Myt1 and Ngn3 form a feed-forward expression loop to promote endocrine islet cell differentiation. Dev Biol. 317, 531-540 (2008).
- Rogers, C. D., Archer, T. C., Cunningham, D. D., Grammer, T. C., Casey, E. M. Sox3 expression is maintained by FGF signaling and restricted to the neural plate by Vent proteins in the Xenopus embryo. Dev Biol. , 307-319 (2008).
