Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Vurdere Primær Neurogenesis i Published: April 12, 2016 doi: 10.3791/53949
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1, 1
1The Healing Foundation Centre, Faculty of Life Sciences, University of Manchester, 2Department of Cell and Molecular Biology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 3Department of Craniofacial Development and Stem Cell Biology, Dental Institute, King's College London
* These authors contributed equally

Summary

Denne artikkelen presenterer en praktisk og rask metode for å visualisere ulike nervecellepopulasjoner i det sentrale nervesystemet av Xenopus embryo ved hjelp av immunfluorescens flekker på deler.

Introduction

I vertebrater, utvikling av sentralnervesystemet omfatter flere distinkte, men etterfølgende etapper. Det første trinnet er nevrale induksjon, når naive ectodermal celler er spesifisert mot en neural skjebne heller enn en epidermal skjebne. Flere sammenhengende reguleringsmekanismer som er involvert i denne fasen i Xenopus og andre modellsystemer 1,2. Denne fremgangsmåte er i hovedsak koordineres av utskilte faktorer produsert av den underliggende mesoderm, slik som chordin, noggin og follistatin 3-7. Etter nevrale induksjon, en undergruppe av nevrale stamceller ut av cellesyklus og begynner å differensiere i en prosess referert til som primær nevrogenesen. Ikke alle nevrale forløpere skille på dette tidspunktet. De resterende nevrale forløper celler fortsette å spre seg, og dermed opprettholde stamcelle bassenget nødvendig for fortsatt vekst i sentralnervesystemet gjennom utvikling og inn i voksenlivet.

disse proliferating nevrale forløper celler er preget av deres uttrykk for SRY (sex bestemme region Y) -boks 3 (sox3) genet 8-11. Den andre populasjon av celler, som exit cellesyklus og forplikte seg til en differensiert skjebne, er identifisert av uttrykket av differensiering genmarkører, tubulin, beta 2B klasse IIb (tubb2b, N-tub) og myelin transkripsjonsfaktor 1 (myt1) 12-14. Slike differensierte neuronale celler til slutt gir opphav til forskjellige kategorier av nerveceller, inkludert, men ikke begrenset til, motor, inter- og sensoriske nevroner plassert i forskjellige områder i det neurale rør 15-17.

Mens en betydelig innsats har vært viet til å avdekke de reguleringsmekanismer som styrer mønster og skjebnen bestemme hendelser i fremre neuroectoderm har mindre oppmerksomhet blitt gjort på å undersøke nevrogene hendelser som oppstår etterinnledende mønster scenen. Faktisk, signaltransduksjon, transkripsjons forskrifter, samt posttranslasjonelle modifikasjoner er alle involvert i dette senere stadium, kontrollere både timing og avstamning spesifikasjon under nevrogenese 18-20. Videre undersøkelser i disse mekanismene krever en pålitelig metode for enkelt å visualisere og skille mellom forskjellige populasjoner av nerveceller. Ovennevnte nevrale markører, inkludert, Sox3, Myt1, og N-kar, kan være et middel for å identifisere disse forskjellige cellepopulasjoner, og dermed gi de nødvendige grunnlaget for å avsløre de underliggende mekanismene for neuronal differensiering 21-23.

Selv differensial merking av nervecellepopulasjoner er påvist i andre modellorganismer, har relativt få studier utnyttet Xenopus systemet til fulle i denne forbindelse. Dette skyldes i hovedsak en mangelen på kompatible antistoffer som pålitelig identifisere de ulike Neueronal cellepopulasjoner i nevralrøret. Her beskriver vi en fremgangsmåte for visualisering av neuronal differensiering i tidlige embryoer Xenopus via farging, noe som gir en robust og enkel metode for å undersøke grunn nevrogenesen i Xenopus. Denne protokollen skal gi tilstrekkelig veiledning for forskere som er interessert i den tidlige utviklingen av Xenopus sentralnervesystemet mellom scene 26 og scene 45.

Protocol

Alle dyreforsøk ble godkjent fra University of Manchester Animal Welfare Centre og ble dekket av en britisk Hjem Office Project License.

1. Innsamling og fiksering av Xenopus embryo

  1. Forbered Reagenser og materialer for eksperimenter.
    1. Forbered 10x Marc modifiserte Ringers (MMR) ved å oppløse 56,5 g NaCl i omkring 800 ml ultrarent vann og tilsette stamoppløsninger av 1 M KCl, 1 M MgSO4, 1 M CaCl2, og 1 M HEPES pH 7,4 for å oppnå en endelig konsentrasjon 20 mM KCl, 10 mM MgSO4, 20 mM CaCl2, 50 mM HEPES. Juster pH til 7,4 med 10 M NaOH og juster deretter den endelige volumet til en L.
    2. Steriliser 10x MMR oppløsningen ved autoklavering ved 121 ° C i 20 min på en væske syklus. Ved hjelp fortynnes med DDH 2 O til 0.1x endelig konsentrasjon og legge til 20 mg / L gentamycin å hemme bakterievekst.
    3. Gjøre 10x TBS-løsning ved å blande 24 g Tris-HCl, 5,6 g tris-base, 88 g NaCl og oppløsning i ca 900 ml ultrarent vann. Den endelige løsningen vil ha en pH-verdi rundt 7,6. Juster med enten 10 M NaOH eller konsentrert HCl for å oppnå en slutt-pH på 7,6 og sluttvolumet til en L.
    4. Ved å bruke, må 1x TBS ved fortynning av en del av 10 x TBS-løsning med 9 deler av ultrarent vann.
    5. Gjøre 10x MEM salt ved å oppløse 209,2 g MOPS i ca 800 ml ultrarent vann og tilsette stamoppløsninger av 0,5 M EGTA og 1M MgSO4 for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 20 mM EGTA, 10 mM MgSO4. Juster pH til 7,4 med 10 M NaOH og juster deretter den endelige volumet til en L.
    6. Steriliser MEM saltløsningen ved autoklavering ved 121 ° C i 20 min på en væske syklus (oppløsningen kan bli gul etter noen måneders lagring ved romtemperatur, eller etter at den er autoklavert, men denne forandring i farge påvirker ikke bruken ). Men ikke bruke løsningen etter langvarig lagring (mer enn 6 måneder).
    7. Gjør 1x MEMFA oppløsning ved fortynning av en del av MEM salter, 1 del av 37% formaldehyd sammen med 8 deler av ultrarent vann (v / v, stabile ved 4 ° C i minst 1-2 uker).
    8. Fremstille 4% paraformaldehyd i TBS (for påfølgende farging omfatter phalloidin) ved å oppløse 4 g paraformaldehyd pulver i 100 ml 1 x TBS-løsning Varm opp løsningen til 60 ° C og tilsett noen dråper av 10 M NaOH for å hjelpe oppløsning. Delmengde i 5-10 ml volum og fryse i -20 ° C. Ikke fryses igjen etter tining.
      FORSIKTIG: Paraformaldehyde pulver er en irriterende og er giftig ved innånding, dermed veiing trinnet skal utføres i et avtrekksskap.
    9. Merk så mange 4 ml hetteglass med skrulokk før prøvetakingen.
    10. Fremstille 15% gelatin / 15% sukrose ved å helle 20 ml 40% fiskegelatin (forvarming i et 50 ° C vannbad) i et 50 ml sentrifugerør. Tilsett 8 g sukrose og fylle røret til 50 ml tråd med 1x TBS.
    11. Plasser gelatin røret på en rotasjonsblander eller rullende bedå blande over natten ved romtemperatur. Denne gelatinoppløsning er stabil ved 4 ° C i en uke. Bruk ikke utløpt løsning og ikke fryse-tine.
  2. Forbered og Fix X. laevis eller X. tropic Embryoet Cultured å Ønskede stadier.
    1. Kultur det befruktede X. laevis eller X. tropic embryoene i 0.1x MMR med gentamicin til ønsket etapper.
      MERK: Vanligvis samler embryoer mellom stadier 23 og 40. Senere innsamling av embryoer etter etappe 40 er mulig, spesielt når observere aksonal vekst fra ryggmargen, men husk at ekstra gelatin penetrasjon tid kan være nødvendig. Embryoene kan være vill-type, transgene, mutant, inhibitor-behandlede, morfolino (MO) -injected, eller elektroporert 23,24.
    2. Samle 20-50 embryoer i hver 4 ml hetteglass, fjerne så mye medium som mulig og erstatte med MEMFA.
      MERK: Hvis påfølgende farging innebærer phalloidin, bruker 4% paraformaldehydeistedenfor MEMFA siden kommersielle tilføres formaldehydoppløsninger inneholder vanligvis opp til 10% metanol som en stabilisator som vil forstyrre phalloidin farging.
    3. Fiks over natten ved 4 ° C eller, hvis i en trang, ved romtemperatur i 2 timer på en roterende blander. Embryoene vil være stabil i fikseringsløsning i minst en uke ved 4 ° C.
    4. Etter fiksering vaskes embryoene 3 ganger i 20 minutter ved bruk av 1 x TBS med 0,05% Triton X-100. Etter den siste vask, fjerne så mye TBS-Triton som mulig, og tilsett 3 ml 15% gelatin / 15% sucrose i hvert hetteglass.
    5. Plasser hetteglassene på en berg seng over natten ved romtemperatur. For embryoer eldre enn scene 40, bruker minst 24 timer av holdbarhetstiden. Etter penetrasjon, fortsette umiddelbart til avsnitt 2.2 på neste dag.

2. Montering og Cryosectioning av Xenopus embryo

  1. Forbered Reagenser og materialer for eksperimenter.
    1. Ta en boks med positivt batteriet er ladeted lysbilder, ideelt uåpnet.
      MERK: Hvis åpnet, holder lysbildene i en tørr tilstand (for eksempel en tørr boks) og bruk innen en måned for å sikre den statiske ladningen på lysbildene opprettholdes. Ikke bruk utgåtte lysbilder siden prøvene vil falle av under farging.
    2. Pre-kjøle kryostaten kammeret til -30 ° C. Sett instrumentet parametere som -35 ° C i mikrotom og 12 mikrometer delen tykkelse. Installer tykt dekke glassplaten på scenen og la kryostaten likevekt i minst 30 min før delen starter.
    3. Forbered maling børster for flytting delen strimler, holde inne kryostaten kammeret.
    4. Forbered blyanter for å skrive på lysbilder, sette dem i romtemperatur.
    5. Bruk hansker under cryosection. Ikke bruk bare hendene.
  2. Montering Xenopus embryo
    1. Nøye aspirere 5-10 embryoer ut av den hetteglass ved hjelp av en plast eller glass pipette uten å innføre luftbobler. Overfør embryoene itil monteringskammeret og observere under et stereoskop. Fyll opp til monteringskammeret med gelatinoppløsning for å sikre stivheten av seksjonen blokken.
    2. Ordne embryoene som per figur 1 ved hjelp av et par fine tips tang. Marker orientering hoder ved å tegne en pil på kanten av kammeret ved hjelp av en kryogenisk-kompatibel markør. For flere grupper av embryoer, skrive ned beskrivelse av hver gruppe på kanten av det tilsvarende kammeret også.
    3. Plasser forsiktig kammeret horisontalt i et skum boks halve fylt med tørris og lukke lokket. Observer monteringskammeret fryse i 5-10 min. Behandle hvert kammer serielt (dvs. plassere den forrige kammeret på tørris før du går videre til den neste), da dette vil gi tilstrekkelig tid for hvert kammer å fryse og hindre tørris boksen for å bli overbefolket.
      MERK: Frosne festekamre trenger ikke å stå horisontalt og kan stables opp inne i boksen.
    4. Fortsett med cryosectioning eller, om nødvendig, holder frosne prøver ved -80 ° C i minst 1-2 uke uten å miste immunogenisitet.
  3. Cryosection av Montert Xenopus embryo
    1. Fjerne en prøve frosset blokk fra kammeret ved å trykke på bunnen av kammeret ved hjelp av en butt-pinne (for eksempel en blyant).
    2. Legge til flere dråper av vev-frysemedium, (en polyetylenglykol og polyvinylalkohol-inneholdende medium) på prøven holdeplaten og montere den prøveblokk med den fremre ende av embryoene peker opp (figur 2). Tillat den mounted- blokken stå inne i kryostaten kammeret i ca. 1 min eller inntil den vev-frysemedium blir ugjennomsiktig.
    3. Umiddelbart installere prøveholdeskiven på mikrotomen med bunnsiden av prøveblokken vender opp. Skjær av en del av prøven blokken ved hjelp av et blad når prøven blokken er likevel relativt "myke" for å redusere lengden av hver seksjon(hvis ønsket). La prøven holdeskiven på mikrotomen i minst fem minutter for å tillate dens temperatur for å nå likevekt.
    4. Gradvis trimme prøven kvartal ned til hodet på rumpetrollene er synlig gjennom gjennomsiktig gelatin. For å øke trimming hastighet, bruke en høyere (tykkere) innstilling av snittykkelse (f.eks 20-25 mm) på dette stadiet (som gjør det mulig å "trimme" alternativet), men ikke for tykk fordi prøveblokken kan falle av fra prøven beholdning platen . Observere resultatene av kryostaten, slik som skarphet og vinkelen av bladet på dette stadiet for å sikre dannelsen av en lang strimmel av etterfølgende seksjoner.
    5. Når rumpetroll hodene blir synlig, justere innstillingene for kryostaten tilbake til normal (f.eks 10-12 mm) og ren både mikro- og stadium ved hjelp av en pensel. Forsiktig gjøre 2-3 seksjoner som en prøveordning med håndhjulinnstillingen (ikke bruk den motoriserte innstilling) for å være sikker på at ferdige skiver kan danne strips, ikke overlappende eller holde seg til bladet.
    6. Fortsett trimming til hodene på rumpetrollene er nesten utsatt (dette kan trenge litt erfaring, men oppnåelig). Børst bort alle gjenværende deler på scenen og innsamling av prøve seksjoner vil begynne.
    7. Gjør ca 10-15 seksjoner og la dem danne en lang stripe.
    8. Flip over tykt dekke glassplaten til siden og fjern forsiktig stripe fra bladet med en fin-spiss pensel og ordne det på scenen med lange aksen parallell til bladet.
    9. Plukk en positivt ladet lysbilde ved romtemperatur, merk den med en blyant (som ikke vil bli vasket ut under påfølgende flekker behandlinger), trykker du det raskt, men fast på stripe med etikettsiden ned og fjerne lysbildet fra kryostaten kammeret. Hvis det gjøres riktig, bør stripen umiddelbart holde seg til de positivt ladede lysbilde (figur 3A).
    10. Gjenta dette trinnet for å ha 20-30 stykker på hvert glede og anordnet i parallell (figur 3B). Dette er tilstrekkelig til å dekke hele hjerneregionen av X. tropic embryoer og de ​​fleste av forhjernen og midthjernen regioner av X. laevis embryoer.
    11. Air-tørke lysbildene i 10 minutter, fortsette umiddelbart eller lagre lysbilder i en lysbilde boks ved -80 ° C i minst 3-6 måneder uten å miste immunogenisitet.

3. Farging av seksjonert Xenopus embryo

  1. Forbered Reagenser og materialer for eksperimenter.
    1. Forbered 0,05% TBS-Triton X-100 ved tilsetning av Triton X-100 i 1 x TBS for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 0,05%. Denne oppløsning er stabil ved romtemperatur i 3-4 dager. Bruk ikke utløpt løsning.
    2. Forbered 5% varme-inaktivert geit serum eller 5% BSA i TBST som blokkerer buffer. For det første varme inaktivere geit / lam serum ved å ha ca. 20-30 ml serum i et 65 ° C vannbad i 30-60 min. Delmengde inn i 1,5 ml sentrifugerør og fryse på -20 ° C. Ingen re-inaktive kreves ved bruker.
    3. Fortynn den varme-inaktivert serum eller BSA i TBST for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 5% før bruk.
    4. Forbered aktuelle primære antistoffer i henhold til fortynninger i blokkeringsbuffer (f.eks 1: 500 anti-Sox3 10,25 / 1: 250 anti-Myt1 26 / anti-acetylert tubulin). Bruk ca 100 mL av antistoff løsning på hvert lysbilde.
    5. Forbered passende fluorescerende antistoffer (f.eks anti-mus / kanin rød fluorescerende fargestoff-konjugert antistoffer) i blokkeringsbuffer (vanligvis 1: 500).
    6. (Valgfritt) Legg rød fluorescerende fargestoff-konjugert Phalloidin (1: 500) inn sekundært antistoff mix å avsløre aktin nettverk.
    7. (Valgfri) Tilsett DAPI (0.5 ug / ml sluttkonsentrasjon) til sekundært antistoff blandingen for å visualisere nukleære lokaliserings.
    8. Ta anti-fade monteringsmedium ut av fryseren og tine i romtemperatur vannbad.
  2. farging
    1. Ta de frosne lysbilder fra -80 ° C og legg dem på et stykke håndkle papir inne i et avtrekksskap i minst en time for å eliminere eventuelle kondenserte vanndråper, deretter bake de tørkede lysbilder på en 85-90 ° C varme blokk med skiver vendt opp i 15 minutter for å aktivere vedheft mekanisme. Endelig tillater lysbildene avkjøles til romtemperatur (minst 10 minutter).
    2. Fyll farging glasset med ren aceton og inkuber lysbildene i aceton i 10 minutter for å fjerne fiskegelatin. Hvis flere lysbilder skal behandles, arrangere dem på en farging rack. Air-tørke de behandlede-lysbilder i 15 min i et avtrekksskap. Ikke re-bruke aceton.
    3. trekke forsiktig en ring rundt prøvene på lysbildet ved hjelp av en PAP pennen uten å berøre prøvene. Sikre at ringen er selv lukket, ellers antistoffløsning vil strømme ut i løpet av flekker. Fullt tørke PAP pennen ringen.
    4. Fyll en annen farging krukke med 1x TBS uten Triton X-100. Insert tørket-glir inn i farging glasset og la rehydrering i minst en time. I mellomtiden fremstille blokkeringsbuffer ved fortynning av enten varmeinaktivert geiteserum eller BSA til 5% sluttkonsentrasjon ved bruk av 1 x TBS med 0,05% Triton X-100.
    5. Lag en våt boks ved å plassere 1-2 seks-brønns plater inne i en klikk-lås mat boksen og fylle brønnene halvveis med ultrarent vann. Fjern rehydrated lysbilder fra flekker glasset og plassere dem horisontalt på de seks-brønns plater (uten plate lokk).
    6. Nøye legge 300-600 mL av blokkering buffer inne i PAP ringen. Forsegle den våte boksen ved å låse lokket på plass og inkuber ved værelsetemperatur i minst en time.
    7. Fortynn de aktuelle primære antistoffer i blokkering buffer. Vanligvis bruker 100-150 mL fortynnet antistoff løsning per lysbilde. Hvis flere lysbilder behandles, skalere opp volumet proporsjonalt.
    8. Etter blokkering, forsiktig fjerne blokkerende buffer fra lysbilder ved aspirasjon og raskt legge primary antistoff løsning for å hindre uttørking, deretter forsegle våt boksen og inkuber ved 4 ° C over natten.
    9. På neste dag, fjerne den primære antistoff løsning fra lysbildene ved aspirasjon. Vask objektglassene ved å sette inn i fargings glass fylt med 1x TBS med 0,05% Triton X-100, 3 ganger, 15 minutter hver. I mellomtiden, fortynne de aktuelle fluorescerende sekundære antistoffer med blokkeringsbuffer (med eller uten DAPI eller phalloidin).
    10. legge nøye 100-150 mL av sekundært antistoff løsning på lysbildene. Plasser lysbildene inne i våt boksen og forsegle lokket. Inkuber objektglassene i 1-2 timer ved romtemperatur.
    11. Vask objektglassene i fargings glass fylt med 1x TBS med 0,05% Triton X-100, 3 ganger, 15 minutter hver. I siste vask tine anti-fade monteringsmedium i et 50 ° C vannbad i 10 min når den lagres ved -20 ° C. Kjøle ned monteringsmedium til romtemperatur før bruk.
    12. Tilsett ca 20 ul (en dråpe) av montering medium pålysbildet og bruke en stor dekkglass (minst 22 mm x 64 mm) over prøvene. Observer bruker fluorescerende eller konfokalmikroskop innen seks timer etter montering.
      1. Hvis bilde ikke kan gjøres på samme dag, forsegle lysbilder bruker neglelakk og plassere dem inne i våt boksen ved 4 ° C over natten.
        MERK: Den anti-fade monteringsmedium vil gradvis bli oksidert etter noen dager (og slå brunaktig) så det anbefales å ta bilder så snart som mulig.

Representative Results

De representative Resultatene viser tverrsnitt av scenen 30 Xenopus embryo på ulike nivåer, nemlig forhjernen, midthjernen, hindbrain og ryggmargen, farget med forskjellige antistoffer (figur 4). Som nevnt Sox3-merkede neuronal progenitor-cellepopulasjon finner i nærhet av hulrommet i det nevrale røret, mens MyT1-merket differensierte primære neuroner migrerer utover og lokalisere nær grensesjiktet (basal lamina) av neural røret. Anti-acetyl-tubulin etiketter axoner i differensierte nevroner, som kan observeres i hele nevralrøret.

Side-spesifikke genet knockdown eller overekspresjon er en mye brukt metode i neurobiology for å vurdere hvorvidt modulering av ekspresjonen av spesifikke gen (e) forstyrrer vekst og differensiering av neuronale celler. I slike tilfeller, enten Morpholinos (MOS) eller DNA-konstruksjon (er) som bærer pro moter-drevet gen (e) blir injisert inn i en av de to blastomeres ved to-trinns celle 23. Alternativt kan de bli injisert inn i hjernen ventrikkelen etterfulgt av elektroporering, noe som vil resultere i knockdown eller over-ekspresjon av det ønskede gen (er) 27. I begge tilfeller vil effekten være begrenset til en side av embryo, noe som gjør den motsatte side av embryoet som ubehandlede intern kontroll.

Etter fiksering, seksjonering, og farging, blir konsekvensene av genet knockdown / over-uttrykk kvantifisert ved å telle og sammenligne celle tall i ulike populasjoner på begge sider av embryo. Ved å samle opp disse data fra flere embryoer, kan statistisk analyse utføres. I våre representative resultater, ble ingen forstyrrelse gjort i embryoer. Eksempler på genet perturbasjon og deres virkninger på forskjellige nevronale cellepopulasjoner kan finnes i referansene 20,23.

t "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figur 1
Figur 1:. Embryo ordning og orientering i seksjonen formen (A) En tegneserie skildring som viser monteringsanordningen, merk magasinet har blitt merket med dato, scene, og retningen på embryoer. (B) Et bilde som viser den naturlige utseende av monteringsanordningen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2:. Orienteringen og stillingen av gelatin blokken på prøveholdeskiven (A) En tegneserie fremstilling som viser den delen blokken, merk at embryoer er i en "heads up" -stilling, og gelatinblokken sitter godt fast onfor prøven holdeskiven med vev-frysemedium på undersiden (se figur 2B). (B) Et bilde som viser den naturlige utseendet av seksjonen blokken, legg merke til opphopning av vev-frysemedium mellom gelatin blokk og prøven holdeplaten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3:. Kontinuerlig seksjonering (A) Modell av en seksjon kammer. Prøven beholdning plate skal roteres og festet til den posisjonen at embryoet siden vender opp. Etter noen (6-10) deler, er lang stripe av kontinuerlige delen fliser forsiktig skilt fra bladet (blå) med en fin pensel, og deretter slått 90 ° på holdeplaten. Deretter et rom-temp positivt ladet lysbildet erfast presset mot delen stripen vendt ned og umiddelbart løftet opp til innsamlede ferdige strimler. (B) Normalt kan hvert lysbilde plass til 2 parallelle linjer med strips, som vist. Husk å lage detaljert oversikt på lysbildet etiketten med blyant. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4: Tverrsnitt av scenen 30 X. laevis rumpetroll og flekker i nevrale vev, 20X. (A) Skjematisk indikerer de relative posisjoner (forhjernen, midthjernen, hindbrain og ryggmargen) i avsnitt fly på Xenopus rumpetroll. (B) Tilsvarende tverrsnitt farget med anti-Sox3 (rød), anti-acetylert-tubulin (Green), og DAPI (blå), som viser den relative plasseringen av nevrale stamcelle bassenger samt nevrofilamenter i nevralrøret. (C) Tilsvarende tverrsnitt farget med anti-MyT1 (rød) og DAPI (blå), som viser den relative plasseringen av differensierte primære nevroner i nevralrøret. Scale bar = 20 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Her viser vi en enkel og effektiv metode for å visualisere primær nevrogenese i Xenopus embryoer. Denne fremgangsmåte tillater vurdering av forskjellige typer av nerveceller, inkludert nevrale stamceller og differensierte primære neuroner bruk av celletypespesifikke markører.

Protokollen er vanligvis robuste med meget høy grad av reproduserbarhet. For embryoer som er i pre-klekking stadier (dvs. opp til scenen 28), anbefaler vi å manuelt fjerne vitelline membranen før fiksering, da dette gjør at embryoene fullt uncurl før fiksering. Dette er spesielt viktig ved innsamling embryoer ved relativt tidlige stadier (før klekking), siden bøyde embryoer er ekstremt vanskelig å anordne på ønsket orientering inne i monteringskammeret. Vi har ikke opplevd et tap av immunogenisitet etter MEMFA eller PFA fiksering dermed ytterligere antigen henting trinnet er ikke nødvendig for denne protokollen. I tillegg har dennefarging fremgangsmåte kan utføres i prøver fra kromogene / fluorescerende in situ hybridisering. I et slikt scenario, anbefales det å hoppe over protease K behandlingstrinn i løpet av in situ hybridisering protokollen. Etter kromogent / fluorescerende substrat reaksjon, kan prøvene vasket med TBS og innleiret i fiskegelatinoppløsning på en lignende måte til MEMFA / PFA faste prøver. Prøverør kan beskyttes mot lys ved å vikle hetteglassene i aluminiumsfolie hvis fluorescerende in situ hybridisering blir avbildet sammen med immunfluorescerende farging senere.

I noen tilfeller kan embryoer krympe overdrevet etter gelatin penetrasjon. Dette er mest sannsynlig forårsaket av enten utilstrekkelig fiksering eller utilstrekkelig TBS-Triton utvinning. Sørg for at embryoer har blitt fikset i PFA / MEMFA i minst 2-3 timer eller helst over natten ved 4 ° C. Hvis problemet vedvarer, øker vasketiden av TBS-Triton til 3 for en time.

I løpet av cryo-sectioning, kan stivheten av prøveblokken variere som forskjellige satser av fiskegelatin har forskjellige egenskaper. Dette problem kan delvis kompenseres ved å justere temperaturen på mikrotomen. En lavere temperatur vil resultere i en "hardere" prøveblokk i henhold imidlertid overdreven lav temperatur prøveblokken blir sprø og vanskelig å seksjon. Litt finjustering eller praksis (ved hjelp av mock sample blokker uten embryoer) før hver seksjonering kan være gunstig før bruk på særlig verdifulle prøver.

En vanlig forekommende problem under seksjonering er de tynne deler noen ganger har en tendens til å holde seg på den tykke glassplate i stedet for å holde seg flatt på stål scenen. Dette kan være spesielt forstyrre siden det stadig avbryter kontinuerlig snitteprosessen. Slike saker er vanligvis forårsaket av en av to grunner: den delen kammeret og (spesielt) den tykke glassplate ikke blir kaldt nok, eller overdreven statisk belastning på maskinen og den operator, spesielt i tørt vær. Førstnevnte kan løses ved å skru ned temperaturen i seksjonen kammeret og forlater glassplaten innen for ekstra tid (eventuelt natten over); og sistnevnte ved riktig jording kryostaten. Koble til metalloverflaten på kryostaten til en metall springen eller lignende Badering system laget av metall kan være en alternativ måte å slippe statisk elektrisitet. Etter hver bruk må tykk glassplate vaskes godt med ikke-korroderende detergent (for eksempel oppvaskmiddel), skyllet med ultrarent vann, sprøytet med ren etanol, og innpakket i papir håndkle for å beskytte overflaten og kantene fra skade.

Antistoffene som er oppført i protokollen er generelt spesifikke og vi sjelden støter på ikke-spesifikk adsorpsjon eller høyt bakgrunnssignal. Det skal bemerkes at, hvis ved hjelp av varme-inaktivert geit / lam serum som blokkeringsmiddel, for sterk varme-inaktivering (som visualisert ved dannelsen av fluffy fellingsmiddel i serum) børunngås da dette utfellingsmiddel er svært attraktive for sekundære antistoffer, og kan bidra til en kilde for høy bakgrunn.

Det er mulig, og noen ganger ønskelig, for å utføre dobbelt-farging for å visualisere forskjellige populasjoner av nevronale celler samtidig. En slik dobbel-farging er mulig og generelt gir tilfredsstillende resultater med følgende kombinasjoner: Sox3 / N-badekar eller Myt1 / N-badekar. Imidlertid er dobbelt-farging av Sox3 og Myt1 komplisert ved det faktum at de to antistoffer er både fra kanin-opprinnelse. Vi har testet flere antistoff direkte merkingssett, men ingen tilfredsstillende resultater ble observert (lavt signal-til-støy-nivå), muligens på grunn av mangel på signal forsterkning fra sekundære antistoffer. En mulig metode for å omgå dette problemet ville være å øke transgene linjer i Xenopus, som diskutert nedenfor.

En av de viktigste begrensningene i denne protokollen er at mens denne protokollen kunne nok distinguish to viktigste bassenger av nerveceller, nemlig Sox3-uttrykke nevrale stamceller bassenget og Myt1-uttrykker differensierte nevroner, mangler det evnen til å avdekke ulike sub-populasjoner av differensierte nevroner. Slike underpopulasjoner, som inkluderer, men er ikke begrenset til, primære motoriske nevroner, interneuroner og sensoriske neuroner, er vanligvis kjennetegnet ved deres differensielt uttrykte-markørgener 28-30. Som nevnt ovenfor, kan nylige fremskritt i utviklingen av flerfarget in situ hybridisering kombinert med antistoff-baserte immunfluorescens deteksjonsmetoden i Xenopus embryoer fylle gapet for å avsløre disse sub-populasjoner av neuroner differensiert for potensiell undersøkelse 31. Alternativt, som har blitt vist i mus modell, ville det også være ønskelig å skaffe et mer omfattende sett av celletypespesifikke antistoffer for å skille slike forskjellige cellepopulasjoner i Xenopus.

Det erogså verdt å nevne at, som et tillegg til denne metoden, nylige fremskritt i optisk bildebehandling og bildeanalyse, for eksempel multiphoton mikroskopi, 3D rekonstruksjon, og segmentering, kan også påføres etter innledende vurdering for å oppnå mer helhetlige observasjoner av Xenopus oocytter samt tidlige embryoer, særlig i henhold til en live-setting 32,33. Derfor, for å spore proliferasjon, differensiering, og bevegelse av neuronale celler i levende dyr, ville det være ønskelig å etablere en eller flere transgene linjer som havn fluorescerende proteiner som drives av celletype-spesifikk promoter for å tillate direkte observasjon av slike cellepopulasjoner i begynnelsen av Xenopus embryoer. Etableringen av en X. laevis tråd med neuro-spesifikke β-tubulin promoter kjøring tauGFP og dets programmer har gitt et fint eksempel 23,34. Med de fullstendige promotorsekvensene av både sox3 og myt1 karakterisert ved virveldyr 35-37, er det should være forholdsvis enkelt å etablere ytterligere transgene linjer i Xenopus som skal bidra i stor grad til både Xenopus fellesskap og en mer generell felt av primær nevrogenesen forskning.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker professor Michael Klymkowsky i University of Colorado i Boulder og professor Nancy Papalopulu ved universitetet i Manchester for vennlig å gi anti-Sox3 og anti-Myt1 antistoffer, henholdsvis. Vi takker medlemmene av Papalopulu lab for sine innsiktsfulle forslag for å utvikle denne protokollen. Dette arbeidet ble støttet av to Healing Foundation Stipend til SZ og JL, to prosjekttilskudd fra Healing Foundation til SZ / EA og JL / EA henholdsvis ett program stipend fra Wellcome Trust til EA (WT082450MA), og en institusjonell strategisk støtte stipend fra Wellcome Trust [097820 / Z / 11 / Z].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
gentamicin  Sigma-Aldrich G1397
Tris-HCl  Sigma-Aldrich T3253
Tris-base Sigma-Aldrich T1503
NaCl  Sigma-Aldrich S7653
KCl Sigma-Aldrich 746436
MgSO4 Sigma-Aldrich 746452
CaCl2 Sigma-Aldrich 793639
HEPES Sigma-Aldrich H3375
MOPS Sigma-Aldrich RDD003
EGTA Sigma-Aldrich E3889
37% formaldehyde  Sigma-Aldrich F8775
Gelatin from cold water fish skin Sigma-Aldrich G7765
Sucrose Sigma-Aldrich S7903
Base Mould Disposable 15 Mm x 15 Mm x 5 Mm Simport VWR EMB-200-015A
Base Mould Disposable 7 Mm x 7 Mm x 5 Mm Simport VWR EMB-200-010K
Superfrost Plus slides ThermoFisher 12-550-15
Tissue Freezing Medium (OCT) Leica  14020108926
Cryostat Leica  CM3050
Gloves
Dry Ice
Triton X-100  Sigma-Aldrich X100
 85-90 °C Heat block
PAP pen Sigma-Aldrich Z377821
Acetone, analytical grade
Staining jar with slide racks
Click-lock food box of appropriate size (has the capacity to hold 1-2 6-well plate inside)
anti-acetylated tubulin Sigma-Aldrich T7451
Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) Cell Signaling 4408
Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 555 Conjugate) Cell Signaling 4413
Alexa Fluor® 647 Phalloidin Cell Signaling 8940
DAPI Cell Signaling 4083
ProLong Gold Antifade Mountant Life Technologies P36930

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. De Robertis, E. M., Kuroda, H. Dorsal-ventral patterning and neural induction in Xenopus embryos. Annual Rev Cell Dev Biol. 20, 285-308 (2004).
  2. Wilson, S. W., Houart, C. Early steps in the development of the forebrain. Dev Cell. 6, 167-181 (2004).
  3. Hemmati-Brivanlou, A., Melton, D. Vertebrate embryonic cells will become nerve cells unless told otherwise. Cell. 88, 13-17 (1997).
  4. Hemmati-Brivanlou, A., Melton, D. A. Inhibition of activin receptor signaling promotes neuralization in Xenopus. Cell. 77, 273-281 (1994).
  5. Fainsod, A., et al. The dorsalizing and neural inducing gene follistatin is an antagonist of BMP-4. Mech Dev. 63, 39-50 (1997).
  6. Piccolo, S., Sasai, Y., Lu, B., De Robertis, E. M. Dorsoventral patterning in Xenopus: inhibition of ventral signals by direct binding of chordin to BMP-4. Cell. 86, 589-598 (1996).
  7. Zimmerman, L. B., De Jesus-Escobar, J. M., Harland, R. M. The Spemann organizer signal noggin binds and inactivates bone morphogenetic protein 4. Cell. 86, 599-606 (1996).
  8. Koyano, S., Ito, M., Takamatsu, N., Takiguchi, S., Shiba, T. The Xenopus Sox3 gene expressed in oocytes of early stages. Gene. 188, 101-107 (1997).
  9. Rogers, C. D., Harafuji, N., Archer, T., Cunningham, D. D., Casey, E. S. Xenopus Sox3 activates sox2 and geminin and indirectly represses Xvent2 expression to induce neural progenitor formation at the expense of non-neural ectodermal derivatives. Mech Dev. 126, 42-55 (2009).
  10. Zhang, C., Basta, T., Jensen, E. D., Klymkowsky, M. W. The beta-catenin/VegT-regulated early zygotic gene Xnr5 is a direct target of SOX3 regulation. Development. 130, 5609-5624 (2003).
  11. Penzel, R., Oschwald, R., Chen, Y., Tacke, L., Grunz, H. Characterization and early embryonic expression of a neural specific transcription factor xSOX3 in Xenopus laevis. Int J Dev Biol. 41, 667-677 (1997).
  12. Bellefroid, E. J., et al. X-MyT1, a Xenopus C2HC-type zinc finger protein with a regulatory function in neuronal differentiation. Cell. 87, 1191-1202 (1996).
  13. Moody, S. A., Miller, V., Spanos, A., Frankfurter, A. Developmental expression of a neuron-specific beta-tubulin in frog (Xenopus laevis): a marker for growing axons during the embryonic period. J Comp Neurol. 364, 219-230 (1996).
  14. Oschwald, R., Richter, K., Grunz, H. Localization of a nervous system-specific class II beta-tubulin gene in Xenopus laevis embryos by whole-mount in situ hybridization. Int J Dev Biol. 35, 399-405 (1991).
  15. Chitnis, A., Henrique, D., Lewis, J., Ish-Horowicz, D., Kintner, C. Primary neurogenesis in Xenopus embryos regulated by a homologue of the Drosophila neurogenic gene Delta. Nature. 375, 761-766 (1995).
  16. Roberts, A. Early functional organization of spinal neurons in developing lower vertebrates. Brain Res Bull. 53, 585-593 (2000).
  17. Hartenstein, V. Early neurogenesis in Xenopus: the spatio-temporal pattern of proliferation and cell lineages in the embryonic spinal cord. Neuron. 3, 399-411 (1989).
  18. Hirabayashi, Y., et al. The Wnt/beta-catenin pathway directs neuronal differentiation of cortical neural precursor cells. Development. 131, 2791-2801 (2004).
  19. Munji, R. N., Choe, Y., Li, G., Siegenthaler, J. A., Pleasure, S. J. Wnt signaling regulates neuronal differentiation of cortical intermediate progenitors. J Neurosci. 31, 1676-1687 (2011).
  20. Bonev, B., Stanley, P., Papalopulu, N. MicroRNA-9 Modulates Hes1 ultradian oscillations by forming a double-negative feedback loop. Cell Rep. 2, 10-18 (2012).
  21. Bonev, B., Pisco, A., Papalopulu, N. MicroRNA-9 reveals regional diversity of neural progenitors along the anterior-posterior axis. Dev Cell. 20, 19-32 (2011).
  22. Munoz, R., et al. Regeneration of Xenopus laevis spinal cord requires Sox2/3 expressing cells. Dev Biol. , (2015).
  23. Zhang, S., Li, J., Lea, R., Vleminckx, K., Amaya, E. Fezf2 promotes neuronal differentiation through localised activation of Wnt/beta-catenin signalling during forebrain development. Development. 141, 4794-4805 (2014).
  24. Zhang, S., Li, J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signalling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis. PloS one. 8, e79469 (2013).
  25. Wang, T. W., et al. Sox3 expression identifies neural progenitors in persistent neonatal and adult mouse forebrain germinative zones. J Comp Neurol. 497, 88-100 (2006).
  26. Sabherwal, N., et al. The apicobasal polarity kinase aPKC functions as a nuclear determinant and regulates cell proliferation and fate during Xenopus primary neurogenesis. Development. 136, 2767-2777 (2009).
  27. Falk, J., et al. Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus. BMC Dev Biol. 7, 107 (2007).
  28. Moreno, N., Retaux, S., Gonzalez, A. Spatio-temporal expression of Pax6 in Xenopus forebrain. Brain Res. 1239, 92-99 (2008).
  29. Kay, B. K., Shah, A. J., Halstead, W. E. Expression of the Ca2+-binding protein, parvalbumin, during embryonic development of the frog, Xenopus laevis. J Cell Biol. 104, 841-847 (1987).
  30. Park, B. Y., Hong, C. S., Weaver, J. R., Rosocha, E. M., Saint-Jeannet, J. P. Xaml1/Runx1 is required for the specification of Rohon-Beard sensory neurons in Xenopus. Dev Biol. 362, 65-75 (2012).
  31. Lea, R., Bonev, B., Dubaissi, E., Vize, P. D., Papalopulu, N. Multicolor fluorescent in situ mRNA hybridization (FISH) on whole mounts and sections. Methods Mol Biol. 917, 431-444 (2012).
  32. Canaria, C. A., Lansford, R. Advanced optical imaging in living embryos. Cell Mol Life Sci. 67, 3489-3497 (2010).
  33. Prouty, A. M., Wu, J., Lin, D. T., Camacho, P., Lechleiter, J. D. Multiphoton laser scanning microscopy as a tool for Xenopus oocyte research. Methods Mol Biol. 322, 87-101 (2006).
  34. Love, N. R., et al. pTransgenesis: a cross-species, modular transgenesis resource. Development. 138, 5451-5458 (2011).
  35. Kovacevic Grujicic, N., Mojsin, M., Krstic, A., Stevanovic, M. Functional characterization of the human SOX3 promoter: identification of transcription factors implicated in basal promoter activity. Gene. 344, 287-297 (2005).
  36. Wang, S., et al. Myt1 and Ngn3 form a feed-forward expression loop to promote endocrine islet cell differentiation. Dev Biol. 317, 531-540 (2008).
  37. Rogers, C. D., Archer, T. C., Cunningham, D. D., Grammer, T. C., Casey, E. M. Sox3 expression is maintained by FGF signaling and restricted to the neural plate by Vent proteins in the Xenopus embryo. Dev Biol. , 307-319 (2008).

Tags

Neuroscience , CNS utvikling farging neuronal differensiering primær neurogenesis
Vurdere Primær Neurogenesis i<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryoet Bruke Farging
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, S., Li, J., Lea, R., Amaya,… More

Zhang, S., Li, J., Lea, R., Amaya, E. Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining. J. Vis. Exp. (110), e53949, doi:10.3791/53949 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter