En ny metod för att bedöma Motor Resultat av Deep Brain Stimulation effekter i Hemiparkinsonian Rat: Trappa och Cylinder Test

Abstract

Djup hjärnstimulering av nucleus subthalamicus är en effektiv behandlingsform för Parkinsons sjukdom. I vårt labb har vi etablerat ett protokoll för att screena olika neurostimulering mönster hemiparkinsonian (ensidig skadade) råttor. Den består av att skapa en ensidig Parkinsons lesion genom att injicera 6-hydroxidopamin (6-OHDA) i högra mediala framhjärnan bunt, implantera kroniska stimuleringselektroder in i nucleus subthalamicus och utvärdera motoriska resultat vid slutet av 24 h perioder av kabelbundna extern neurostimulering . Stimuleringen utfördes med konstant ström stimulering. Amplituden sattes 20% under den individuell tröskel för biverkningar. Motorn utvärdering av resultatet gjordes av bedömningen av spontan tass användning i cylindertestet enligt Shallert och bedömningen av skickliga gående i trappan testet enligt Montoya. Detta protokoll beskriver i detalj utbildning i trappan rutan, cylinder testet, såväl som användningen av båda i hemiparkinsonian råttor. Användningen av båda testerna är nödvändigt, eftersom trappan testet verkar vara mer känsliga för fingerfärdighet försämring och uppvisar större känslighet kan förändras under neurostimulering. Kombinationen av den ensidiga Parkinson modellen och de två beteendetester möjligt att bedöma olika stimuleringsparametrar på ett standardiserat sätt.

Introduction

Djup hjärnstimulering av nucleus subthalamicus (STN) är ett effektivt behandlingsalternativ för Parkinsons sjukdom ^en och annan rörelsestörningar. De bakomliggande mekanismerna är fortfarande dåligt kända och multifaktoriell, men en viktig del är moduleringen av neuronala nätverksaktivitet genom upprepad depolarisering av axoner i närheten av stimulerande elektroden ^2-4. Högfrekvent (> 100 Hz) stimulering krävs för en gynnsam effekt i de flesta hjärn mål och för de flesta indikationer på DBS. Biverkningar av djup hjärnstimulering resultat från oavsiktlig coactivation av andra fibrer, som omfattas av stimuleringen volymen och som subserve olika funktioner, såsom pyramidbanan. Därför skulle det vara önskvärt att utveckla stimuleringsparametrar, som företrädesvis aktiverar positiva neurala element, samtidigt som man undviker coactivation av biverkningselement ^5,6. Även neurofysiologi kan erbjuda en sådan fin Tuning alternativ för DBS, har vetenskapliga framsteg varit minimal under de senaste två decennierna, eftersom programstrategier har i första hand bedömts av "trial and error" för patienter och begränsas av de begränsade alternativ programmering av kommersiellt tillgängliga DBS-enheter, istället för att använda neurofysiologisk insikt och definierade experimentella inställningar för att systematiskt undersöka hela parameterrymden.

För att övervinna translationell vägspärr i DBS forskning föreslår vi ett protokoll för att screena alternativa stimuleringsparametrar i gnagarmodeller av parkinsonism före klinisk undersökning. Ensidig Parkinsons sjukdom i råttor modelleras med 6-hydroxidopamin injektioner i höger mediala framhjärnan bunt ^7,8. Den resulterande skadan, beskrivs vidare som hemiparkinsonian, bedöms i apomorfin testet genom utvärdering rotations poäng efter lågdos apomorfin injektion och bekräftade efter slakt av tyrosinhydroxylas immunohistochemistry. Metoden är lätt att applicera och mycket reproducerbar, samtidigt som man en låg mortalitet och morbiditet. De resulterande motoriken är mycket diskret ^7,8; djuren uppvisar en liten försämring av den kontra vänster tass under både spontan utforskning och komplexa grip beteende ^9,10.

För att bedöma effekten av Deep Brain Stimulation protokoll tester krävs som tillåter mätning av en snabb och pålitlig förändring i motorprestanda och kan upprepas över tiden med olika neuro inställningar. Flera grupper har föreslagit olika stimuleringsmetoder och olika tester för att bedöma de motoriska funktioner hos råttor ¹¹ med mycket varierande och inkonsekventa resultat ^11-14. Detta tvingade oss att välja en uppsättning av tester med hög förutse giltighet och komplementaritet. Dessutom, för bedömning av motor utfall enligt Deep Brain Stimulation förhållanden utfördes tester gynnade som skulle kunna utföras av animals ansluten via kabel till stimulusgeneratorn. För dessa ändamål har vi etablerat vårt test batteri bestående av en test för tass använda asymmetri och ett test för skicklig gående. Studiens utformning illustreras i figur 1.

För spontana tass användning utförde vi cylinder test som beskrivs av Shallert ^15, vilket är en allmänt använt test för tass användning under vertikal utforskning. Ingen utbildning av djuret krävs. För bedömningen av mer komplexa gripa beteende har vi etablerat trappan testet enligt Montoya ^16. Vår protokoll modifieras enligt Kloth ^17. Råttorna tränas under en period av tolv dagar för att nå pellets från testrutan. Efter praktikperioden kan tillämpas testet för att mäta den komplexa grepp beteende genom att räkna framgång beskrivs som antalet pellets ätit. Artikeln presenterar detaljerad utbildning i trappan rutan liksom utförandet av både behavioral tester under naiva, hemiparkinsonian och Deep Brain Stimulation förhållanden.

Protocol

Djurförsök godkändes av University of Würzburg och de rättsliga statliga myndigheterna i Unterfrankens i enlighet med riktlinjerna för djurskydd och Europeiska gemenskapernas rådets riktlinjer (godkännandenummer: 55,2-2531,01 76/11). Alla ansträngningar gjordes för att minimera smärta eller obehag av de djur som används.

Obs: Elektrod implantation utfördes såsom beskrivits på annat håll ^18.

1. Cylinder Test (Figur 2)

1. Framställa en klar plast glascylinder (höjd: 40 cm, diameter: 19 cm) genom att rengöra cylindern med en 0,1% ättiksyralösning.
2. Förbered kort med datum för experiment och varje råtta identifikationsnummer.
3. Placera två speglar i 90 ° vinkel bakom cylindern.
4. Placera kameran framför cylindern så att avståndet mellan kameran och cylindern tillåter en bra bild av tassarna.
5. Placera råttan i transportlådan.
   Notera: Djuren bör hanteras av försöksledaren före testet för att undvika stress.
6. Transportera råtta från buren till cylindern med hjälp av transportlådan.
7. Placera råttan i cylindern (fig 3).
   1. Utför alltid alla beteendetester på samma tid på dagen för att undvika dygnsrytm skillnader i aktivitet. Om djuret är ansluten till stimulans generator via kabel kontrollera att sladden inte är vriden under experimentet.
8. Tryck på "record" -knappen på kameran. Visa kortet med den faktiska dagen för experimentet och råtta identifikationsnummer på kameran. Starta inspelningen.
9. Efter fem minuter, ta bort djuret från cylindern och sätta tillbaka den i buren med hjälp av transportlådan.
10. Rengör cylinder med en 0,1% ättiksyralösning.
11. Utvärdera tassen syfte inspelad video genom att räkna de vänstra och högra tass väggkontakter (paw användning i procent) samt rearings (stående på baktassarna med eller utan underlag på cylinderväggen). Cylinder test kan också utvärderas automatiskt av en lämplig mjukvara.
    Obs: En frisk råtta använder båda tassarna lika. Den hemiparkinsonian råttan använder den påverkas på grund av Skada på mindre utsträckning tass.

2. Trappa Test (Figur 4)

1. förvärvet fas
   1. En dag före träningen bekanta djuren med de pellets som används i trappuppgången testet.
      1. Valfritt: Om du vill öka djurets motivation använda en dietrestriktioner (10-15 g standardlaboratoriefoder för att hålla kroppsvikten vid 90% av den fria matningsnivån ^16). Detta är dock inte obligatoriskt att uppnå en positiv träningseffekt. Studien genomfördes utan begränsning mat.
   2. Förbered en klar plast glas trappa låda (höjd: 34,5 cm, längd: 35,5 cm, bredd: 12 cm och smal fack 6 cm) med att rengöra lådan med en 0,1% acetic syralösning. Obs: Trappan box är en två-fack-box med en upphöjd plattform och två trappor i den smala utrymmet. Vänster steg i trappan i den smala utrymmet kan nås endast med vänster tass, rätt steg endast med rätt tass.
      Notera: De standard trappa lådor består av två avdelningar med ett lock, om den skall användas för försök med råttor stimulerade via kabel, använd en hög låda utan lock.
   3. Ta trappan och fyll brunnarna på varje steg med åtta 45 mg pellets.
   4. Sätt trappan och sätta ytterligare åtta pellets på den ökade plattformen.
   5. Placera råttan i transportlådan.
   6. Transportera råtta från buren till trappan lådan med transportlådan.
   7. Placera råttan i trappan rutan (Figur 5).
   8. Efter fem minuter, ta bort djuret från trappan boxen och lägger tillbaka den i buren med hjälp av transportlådan.
   9. Notera hur mångapellets åts från plattform och (eventuellt) från höger och vänster trappa.
   10. Fyll trappan genom att fylla brunnarna på varje steg med åtta 45 mg pellets.
   11. Rengöra trappan låda med en 0,1% ättiksyralösning och placera de ytterligare pellets på plattformen.
   12. Upprepa denna procedur (förvärv fas) tre dagar i rad.
       Obs: Alla experiment beskrivna utfördes på Sprague Dawley. Varaktigheten av de olika utbildningsmoduler kan skilja på råttor av olika stammar, kön och vender.
2. Fritt val Test
   1. Rengöra trappan låda med en 0,1% ättiksyralösning.
   2. Ta trappan och fyll brunnarna på varje steg med åtta 45 mg pellets.
   3. Placera råttan i transportlådan.
   4. Transportera råtta från buren till trappan lådan med transportlådan.
   5. Placera råttan i trappan rutan.
   6. Efter fem minuter, ta bort djuret från trappanfall boxen och lägger tillbaka den i buren med hjälp av transportlådan.
      Notera hur många pellets åts från höger och vänster trappa.
   7. Obs: Om de djur som fortfarande har problem med att greppa pellets, tillsätt lite mer på plattformen där de lätt kan nås.
   8. Fyll trappan genom att fylla brunnarna på varje steg med åtta 45 mg pellets.
   9. Rengöra trappan låda med en 0,1% ättiksyralösning för nästa djur.
   10. Upprepa denna procedur (fritt val fas) tre dagar i rad.
       Obs: De presenterade resultaten erhölls genom att utbilda genomföras utan en viloperiod mellan moduler. Vissa grupper föredrar en vila dag för konsolidering, för att stödja utbildningen.
3. Tvingad Choice Test
   1. Rengöra trappan låda med en 0,1% ättiksyralösning.
   2. Ta trappan och fyll brunnarna på varje steg på den vänstra trappan med åtta (tre första dagarna av modulen) eller fyra (rad three dagar i modulen) 45 mg pellets.
      1. Utföra den påtvingade valstest på den sida, där försämring kommer att ske.
         Obs: Vi utför Parkinsons skada på den högra hjärnhalvan och därför träna selektivt vänster tass.
   3. Placera råttan i transportlådan.
   4. Transportera råtta från buren till trappan lådan med transportlådan.
   5. Placera råttan i trappan rutan.
   6. Efter fem minuter, ta bort djuret från trappan boxen och lägger tillbaka den i buren med hjälp av transportlådan.
   7. Notera hur många pellets åts från vänster trappa.
   8. Fyll trappan genom att fylla brunnarna på varje steg med åtta eller fyra 45 mg pellets (antal pellets beror på utbildning dag).
   9. Rengöra trappan låda med en 0,1% ättiksyralösning för nästa djur.
   10. Upprepa denna procedur (forcerad val fas) sex dagar i rad.
4. Datainsamling
   <li> Utför experimentet såsom beskrivits för forcerad val modulen (fyra pelletar i varje brunn till vänster trappa) på två på varandra följande dagar. Beräkna andelen framgångsrika (antal pellets ätit) som medelvärdet av de två dagarna.

Representative Results

Alla djur genomgick en obduktion histologisk kontroll av både dopaminerga skada och elektrod plats. Endast djur med korrekt elektrodplacering i STN (Figur 6) och fullständig dopaminerg skada (> 90% förlust av dopaminerga neuroner i substantia nigra) ingick i resultatavsnittet (Figur 7).

Cylinder test enligt skadade tillstånd visade att den skadade vänster tass användning minskade från cirka 50% (naiva, frisk råtta) till 15,11% (medelvärde). Under vanlig 130 Hz stimulering efter en 24 hr stimuleringsperioden (pulsbredd 60 ^ sek), som är standardprotokollet i Parkinsonpatienter ökade tass användning till 21,9% (figur 8). Grund av en hög standardavvikelse denna skillnad är inte statistiskt signifikant. Antalet rearings visade inte annoces mellan bluff och stimulerat tillstånd, men denna parameter kommer att ingå i fortsatta studier som mätning av råttans verksamhet. Föreställningen var tydligen inte störs av stimuleringskabeln (Figur 9).

Alla djur som används i vår djup hjärnstimulering studie kunde lära pelleten nå inom den beskrivna tidslinjen för tolv dagar. Den genomsnittliga andelen framgångsrika före lesionering var 13,5 av 28 pellets (48,2%). Efter lesionering den genomsnittliga framgång minskat betydligt till 2,4 pellets (8,6%). Den ökade igen till 7 pellets (25%) under regelbunden 130 Hz stimulering i slutet av en 24 timmars stimulering period (Figur 10). Föreställningen var inte störs av stimuleringskabeln (Figur 7). De två motortester var ett komplement i bedömningen av motoriken i hemiparkinsonian råtta och hade en bra förutsäga giltighet baserat på förbättringen enligt standard therap eutic villkor. Stimuleringen kabel verkade ha någon inverkan på utförandet av testet (figur 11).

Figur 1:.. Studiedesign De enskilda åtgärder för att genomföra ett experiment på olika stimuleringsprotokoll i hemiparkinsonian råttor Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2:.. Cylindertestuppställning Cylinder låda ordnade med speglar Klicka här för att se en större version av denna siffra.

3 "src =" / filer / ftp_upload / 53951 / 53951fig3.jpg "/>
Figur 3:.. Cylinder testet En hemiparkinsonian råtta under cylindertestet Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4:. Trappa testuppställning Trappan låda ordnas med pellets på vänster trappa. (A) från sidan, (B) uppifrån. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5: Trapptest En hemiparkinsonian råtta under trappan test..Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6:.. Stimulering plats Coronary råtthjärna sektion (tionin färgning) med rätt STN indikeras med svart cirkel och motsvarande spiksignal registreras under implantationskirurgi Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 7: Dokumentation av skadan Immunohistokemi 6-OHDA för tyrosinhydroxylas, ett markörenzym av dopaminerga neuroner.. Koronar sektion av råtthjäma akteruter ensidiga 6-OHDA lesion. Jämförelse av den vänstra friska sidan (Le) och den skadade högra sidan (Ri). Unilateral förlust av dopaminerga fibrer i striatum (a) och dopaminerga neuroner i substantia nigra pars compacta (SNC), (c). Skalstreck = 100 nm. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.

Figur 8: Paw använda cylindertestet Resultaten av cylindertestet uttryckt som kontra (påverkas på grund av skada) tass användning i procent (100% - ipsilaterala tassen använd [%]), under olika förhållanden (skadad mot 130 Hz stimulering). . Data ges som medelvärde ± SEM, n = 7. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 9:. Cylinder testet med stimulering kabel A stimulerade hemiparkinsonian råtta under cylindertest. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 10:. Framgång i trapphuset testet Resultaten av trappan testet uttrycks som antal greppas pellets under olika betingelser (friska, skadade och 130 Hz stimulering). Data ges som medelvärde ± SEM, n = 7. P <0,05 (*) ansågs vara statistiskt signifikant (en envägs ANOVA + t-test).3951 / 53951fig10large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 11:. Trappa testet med stimulering kabel A stimulerade hemiparkinsonian råtta under trappan test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Den här artikeln beskriver en detaljerad utbildning protokoll för cylindern och trapptest. Den senare är utformad för att utvärdera komplexa grepp beteende och finmotorik rörelser på grund av skickliga gående i råttor ^16,17. Utfallet mätningen uttrycks som antalet pellets äts under testet, vilket är en objektiv mätning. Protokollet kan användas i råttmodeller för Parkinsons sjukdom och andra modeller motorsjukdoms. Cylinder test involverar en enkel metod för att utvärdera tass användning hos råttor. Det kräver ingen utbildning och kan användas på ett mycket standardiserat sätt, genom förblindade utvärdering från ett videoband. Vi väljer dessa tester bland andra (öppet fält, enda pellet nå tester, och gånganalys) av flera skäl. Båda testerna visar på ett tillförlitligt sätt tassen nedskrivning skapas i vår Parkinsons modell ^10. De är relativt robust i utfall och testresultaten kan erhållas på ett mycket objektivt sätt. Båda testerna kan användas upprepade gånger i shOrt tidsintervall. I trappan testet, pellets gripa ökar under inlärningsfasen och stabiliserar på en individuell platånivå, så efter att ha nått platå, det kan användas utan att behöva tänka på utbildning beroende förbättring över tiden ^16,20.

Medan cylindertestet är lätt att applicera, kan råttor blev uttråkad och inaktiv. Djuren kan motiveras av mörker (som utför testet med rött ljus) eller sent på ljus-mörker-cykel. Mätningen av rearings är användbart för att övervaka råttans normal aktivitet. För framgångsrik trappa träning, är det viktigt att motivera djuren under förvärvsfasen. Det är viktigt att se till att råttan är i stånd att få tag i pellets vid den första grip tillvägagångssätt. Den omedelbara positiva belöningen resulterar i goda träningseffekter i senare faser. En annan kritisk steg inträffar när råttan är inte intresserad av uppgiften. I detta fall kan det vara nödvändigt att tillämpa en mild mat begränsning tillsrätt motivation nivån uppnås.

En annan viktig fråga för vår studiedesign var en bra prediktiv validitet av det fastställda förfarandet. Designen planeras att användas som ett screening plattform för nya stimuleringsprotokoll. Även djup hjärnstimulering är ett behandlingsalternativ inte bara för Parkinsons sjukdom, men också för tremor, depression, tvångssyndrom, dystoni och många andra förhållanden, de mekanismer som ligger bakom den effektivitet fortfarande dåligt förstådd ^1,21. Att ta itu med nya närmar rationell baserad stimulering en god djurmodell krävs.

Ett mer pragmatiskt tillvägagångssätt tvingade oss att välja en beteende inställning som skulle kunna utföras av djur som är anslutna via kabel till stimuleringsanordningen. Cylindern var lämpligt för detta ändamål. Den kommersiellt tillgängliga trappa rutan har ett lock, därför utformade vi en kopia av originalkartong, som är högre och utan lock. Detta gör det möjligt att testaprestanda under djup hjärnstimulering. Problemet med kabeldrivna stimulering är vanligt i preklinisk forskning. Det finns vissa enheter som möjliggör stimulering utan en kabel men deras användning är fortfarande begränsad ^22-24. För vår forskning har vi att ställa in olika stimuleringsmönster och även utföra långsiktig stimulans. För närvarande kan detta endast utföras av kabeldrivna stimulering eftersom det möjliggör en snabb omprogrammering av olika stimuleringsfunktioner utan att röra djuret. I detta avseende denna studiedesign lämpar sig för de flesta forskargrupper som arbetar med motor resultatet i djupa hjärnan stimuleras råttor.

Sammanfattningsvis visar detta manuskript en fullängds protokoll för att studera motor utfall hemiparkinsonian råttor under olika experimentella DBS villkor. Den beskriver ett detaljerat protokoll för utbildning i trappan rutan, samt användningen av cylindertest. Problem som är förknippade med den beskrivna träningsmetoden kan uppträda när man råttor av olikastammar, kön eller vender används. Råttor varierar beroende på kön och påfrestningar i deras utförande av beteendetester ^20,25,26. I honråttor har brunstcykel också en inverkan på deras dagliga prestanda ^27. För att hantera denna begränsning kan honråttor hållas utan män som inte längre är synkront estrus cykeln ^28. Det kan också vara nödvändigt att justera längden på träningsfasen enligt individuella inlärningskurvor i outbreed råttstammar. Mat begränsning ofta används i beteendetester bör tillämpas noggrant. Livsmedelsbrist kan öka motivationen, men å andra sidan minskar noggrannheten hos gripa ^20,29. Den beskrivna beteende batteri, i kombination med hemiparkinsonian modellen kan användas för att studera olika behandlingsalternativ och deras inverkan på motor resultatet. För djup hjärnstimulering av nucleus kärna, har denna studiedesign en hög prediktiv validitet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Staircase box without lid	Glas Keil, Germany		custom made
Cylinder box	Glas Keil, Germany		custom made
Dustless precision pellets, 45 mg	Bio Serv	F0021