Protocol
embrioni aviaria non sono considerati animali vertebrati ai sensi della normativa IUCAC.
1. Ottenere embrioni per la chirurgia
- Incubare 80 - 90 uova di gallina Bovan fecondate (smussato finire) in un umidificata (60%) bilanciere incubatore a 40 ° C per circa 72 ore per ottenere embrioni a Hamilton e Hamburger (HH) fase 17. determinare il numero esatto di uova sulla base di analisi della potenza e il tasso di sopravvivenza degli embrioni 17. Utilizzare i vassoi di uova di plastica per l'incubazione per consentire un'adeguata circolazione dell'aria.
- Dopo questa fase di sviluppo desiderato è raggiunto, versare circa 20 ml di acqua calda (37 ° C) di tampone di Tyrode (integrato con bicarbonato di sodio (1 g / L)) in un x 26 mm piastra di Petri a 100 mm.
- Sterilizzare un guscio d'uovo con il 70% di etanolo.
- rompere delicatamente il guscio con un manico bisturi e rilasciare con cautela il contenuto nel piatto contenente tampone di Tyrode. Scartare gli embrioni se (i) in cui appaiono visivamente anomala (ii)non sono in fase di sviluppo a destra (iii) sono impropriamente orientati sulla tuorlo e / o (iv) si verifica un sanguinamento. Conservare eventuali embrioni non soggetti a un intervento chirurgico subito dopo essere state poste ex ovo a 40 ° C in modo da non compromettere lo sviluppo.
Nota: Staging è effettuata sulla base di Hamilton e Hamburger 18. Anomalie di embrioni di pollo è determinata ad occhio nudo e nell'ambito di applicazione dissezione. Assicurarsi che l'embrione ha piegatura appropriata e flessione e vascolare.
2. OFT Banding
- Tweeze fuori singoli thread lunghi 1 cm da un unico 11/0 nylon sutura chirurgica e formare un nodo sciolto. UV sterilizzare tutti i nodi preformati.
- Sotto un microscopio dissezione, assicurarsi visivamente che il cuore batte a una velocità normale (~ 120 battiti / min). In caso contrario, eliminare l'embrione.
- Appena prima dell'intervento chirurgico, applicare 5 - 6 ml di acqua calda (37 ° C) di tampone di Tyrode alla superficie embrione utilizzando una pipetta di trasferimento.
- Far passare una estremità libera del nodo preformato sotto l'OFT, posizionare la sutura al OFT / ventricolo giunzione (OVJ) (o posizione desiderata), e passare l'estremità libera nel nodo costrizione in tal modo l'OFT comprese le membrane che circondano il cuore.
- Dopo l'intervento chirurgico, bagnare la superficie del tuorlo con 5 - 6 ml di calda (37 ° C) di tampone di Tyrode utilizzando una pipetta di trasferimento.
- Mantenere gli embrioni di controllo ex ovo come gli embrioni a bande; tuttavia non li soggetti alla procedura chirurgica.
- Incubare gli embrioni, per la quantità di tempo desiderato, a 40 ° C in un (60%) incubatrice umidificata.
- Una volta che il punto di tempo desiderato viene raggiunto, asportare l'embrione dal tuorlo con le forbici diritte. Sezionare il cuore con una pinza sottile e utilizzare per diversi studi a valle, come i cambiamenti nella morfologia cardiaca a causa di alterata emodinamica 17.
3. A conferma che l'intervento bendaggio causa un cambiamento nella Emodinamica
Nota: La costrizione parziale dovuto all'intervento bande porta ad un aumento della velocità del flusso sanguigno al OVJ. Questo parametro emodinamico è convenientemente valutata utilizzando immagini ecografiche 2D, che viene eseguita nel punto desiderato tempo dell'esperimento.
- Poiché solo un singolo embrione può essere ripreso alla volta, mantenere tutti gli altri embrioni designati per l'imaging ad ultrasuoni in un incubatore a 40 °.
- Porre la capsula di Petri contenente l'embrione di essere ripreso su una piastra elettrica fissata a 40 ° C.
- Riempire il piatto, fino all'orlo, con acqua calda (37 ° C) del buffer di Tyrode. Versare lentamente la soluzione tampone nel piatto in modo da mantenere intatto il tuorlo. Se, tuttavia, l'integrità del tuorlo è compromessa durante questa fase, scartare l'embrione.
- Orient dell'embrione tale che l'asse centrale dell'embrione è perpendicolare alla sonda ad ultrasuoni che è sospeso da un supporto regolabile.
- Con l'opera macchina ad ultrasuoniTing in B-mode, ottenere un'immagine 2D del cuore pulsante sullo schermo e spostare il palco (piastra elettrica) in modo tale che l'OFT, ventricolo e OVJ sono chiaramente visibili.
- Passare alla modalità pulsato onda (PW), alla frequenza di ripetizione degli impulsi desiderata (ad esempio, 20 kHz) e di ottenere esattamente dati di velocità al OVJ. Una immagine B-mode del cuore pulsante si ottiene sullo schermo.
- Spostare lo stadio per vedere l'OFT, ventricolo e la OVJ. Utilizzando il software macchina ad ultrasuoni, ottenere misure di velocità esattamente al OVJ.
Nota: Se la frequenza cardiaca di un embrione diminuisce durante l'imaging, i dati di velocità così ottenuti non devono essere utilizzati per l'analisi. Tutti embrioni utilizzati per misure di velocità non dovrebbero preferibilmente essere utilizzati per altri esperimenti dopo ecografica.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mostrato nella Figura 1 sono strumenti necessari per OFT bande raccomandato. La capsula di Petri (Figura 1A) contenente l'embrione ex ovo deve essere sufficientemente profonda in modo da non distruggere l'embrione quando coperto con il coperchio. Capsule di Petri profondi (Figura 1C) dovrebbero essere utilizzati anche per l'imaging ad ultrasuoni per consentire un adeguato volume di tampone di Tyrode da versare in cima al tuorlo.
Una singola 1 centimetro filo (Figura 2A) è tweezed fuori da un 11/0 sutura di nylon (Figura 1A) e legato in un nodo sciolto (Figura 1B). Tutti i nodi preformati sono sterilizzati ai raggi UV. La figura 3A mostra una camera rocker umidificata cui uova di pollo fecondate sono incubate fino alla fase desiderata. La figura 3B mostra un incubatore dell'embrione, dove hanno legato e gli embrioni di controllo sono mantenuti ex ovo
Mostrato in figura 4A è un embrione HH17 sopra il tuorlo ex ovo. Figura 4B è una rappresentazione schematica che mostra la posizione della sutura (banda) al OVJ di un embrione HH17. Figura 4C è una immagine rappresentativa di un embrione fasciato ripreso 48 ore dopo l'intervento chirurgico.
L'effetto dell'intervento bande sulla velocità del flusso di sangue attraverso il sito costrizione viene misurata mediante ecografia 2D. Come previsto, la velocità alla OVJ è maggiore nell'embrione bande rispetto al controllo (Figura 5). Abbiamo recentemente eseguito fluidodinamica computazionale analisi (CFD) su cuori bande e di controllo in corrispondenza del punto di tempo di 24 ore che mostra gli effetti della OFT strisce sulla velocità del flusso sanguigno e di taglio della parete dello stress 17.
<p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1">
Figura 1. strumenti chirurgici. (A) 11/0 nylon di sutura. (B) piastra di Petri contenente nodi pre-formato. (C) profonda capsula di Petri per la coltura degli embrioni ex ovo e ecografia. (D) Trasferimento pipetta. (E) Scalpel handle per rompere il guscio dell'uovo. (F) forbici dritte per embrione escissione per gli studi post-operatorio. (G) una pinza sottile clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. sutura per OFT Banding. (A) Un unico filo 1 centimetro tweezed fuori da una sutura.
Figura 3. incubazione Chambers. (A) umidificata incubatore bilanciere per le uova fecondate. (B) camera umidificata per la cultura ex ovo di embrioni bande e di controllo. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. OFT Banding. (A) Tutta la HH17 embrione di pollo mantenuto ex ovo, bar scala = 10 mm (B) Rappresentazione schematica raffigurante la costrizionesito (rosso). (C) fasciato embrione ripreso 48 ore dopo l'OFT strisce, bar scala = 0,5 mm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Ultrasound-derivato Velocity misurazioni. Profili di velocità rappresentativo di controllo (A) e (B) fasciato embrioni ottenuti in un punto nel tempo di 1 ora. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Questa tecnica è relativamente semplice e facile da eseguire, tuttavia alcuni punti chiave devono essere tenuti in considerazione in modo da ottenere risultati accurati valle. Gli embrioni devono essere mantenuti ex ovo in una capsula di Petri che contiene tampone di Tyrode di fornire adeguata reidratazione. E 'anche importante per idratare il tuorlo post-chirurgia con tampone di Tyrode e per assicurarsi che la camera di incubazione è adeguatamente idratato. Interventi chirurgici non devono essere eseguite su un embrione eventualmente sanguinamento è visibile o il tuorlo è anche un po 'rotto. Questo influenza la sopravvivenza degli embrioni, soprattutto per esperimenti a lungo termine. Un'altra causa potenziale di letalità di embrioni, è se la fascia intorno alla OFT è troppo stretto quando applicato prima, in tal modo compromettere in modo significativo la funzione cardiaca.
Allo stato attuale, si usa ultrasuoni come strumento di conferma per determinare la variazione di velocità del flusso sanguigno su OFT banding. In futuro, ci sarà confermare con micro-tomografia computerizzata (CT). Abbiamo anche determinare visivamente la tenuta fascia intorno alla OFT in immagini 2D B-mode. È importante sottolineare che non si osservano differenze nella frequenza cardiaca e del flusso volumetrico (calcolata utilizzando CFD) tra embrioni nei banded e gruppo di controllo 17. Questi indicano che la fisiologia del sistema cardiovascolare non è compromesso negli embrioni bande, così convalidando ulteriormente l'intervento strisce.
Al punto di tempo desiderato, dopo strisce, diverse analisi possono essere eseguite per capire l'effetto di emodinamica alterati in processi di sviluppo delle valvole critica. Questi includono, ma non sono limitati a, determinando cambiamenti nei livelli di trascrizione di geni regolatori chiave coinvolti nello sviluppo della valvola, determinando la localizzazione dei componenti di ECM e la determinazione della ultrastruttura della OFT.
Infine, questa tecnica migliora l'attuale metodo di banding l'OFT nell'embrione all'interno dell'uovo finestra 19. Tale metodo è gravemente ostacolato dalla incapacità di accumulare embrioni necessari per fare analisi molecolari a valle. Questa nuova tecnica può essere utilizzata in esperimenti di soccorso pure. Questa applicazione permette di bande OFT di essere salvati ed embrione permesso di recuperare l'insulto. Nessun metodo corrente può fare questo ed essere ancora in grado di eseguire analisi a valle statisticamente significative.
Abbiamo impiegato con successo questa tecnica per cambiare gli stimoli emodinamici nel cuore di embrioni di pollo in una fase molto precoce dello sviluppo (HH 16 - 17). Il protocollo bendaggio potrebbe presentare una sfida quando si esegue l'intervento nelle fasi successive di sviluppo a causa del rischio di intaccare qualsiasi dei vasi sanguigni extraembrionali. Inoltre, negli stadi di sviluppo, è spesso difficile mantenere il sacco vitellino intatti quando il contenuto delle uova vengono trasferiti nella capsula di Petri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized Bovan chicken eggs | Clemson University, Clemson, SC | ||
| 11 / 0 Nylon suture | Ashaway | S30001 | UV sterilize knots before surgery |
| 100 x 26 mm petri dish | VWR | 25387-030 | |
| Transfer pipettes | Thermo Scientific | 232-20S | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Straight scissor | Roboz | RS-6702 | |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Tyrodes buffer | Sigma-Aldrich | 2145-10L | Filter sterlize before use |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Vevo 770 Ultrasound Imaging system | VisualSonics, Inc. | VS-11392 | |
| 708 Ultrasound transducer | VisualSonics, Inc. | VS-11171 |
References
- Neeb, Z., Lajiness, J., Bolanis, E., Conway, S. Cardiac outflow tract anomalies. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (4), 499-530 (2013).
- Combs, M., Yutzey, K. Heart valve development: regulatory networks in development and disease. Circ Res. 105 (5), 408-421 (2009).
- Hinton, R., Yutzey, K. Heart valve structure and function in development and disease. Annu Rev Physiol. 73, 29-46 (2011).
- von Gise, A., Pu, W. Endocardial and epicardial epithelial to mesenchymal transitions in heart development and disease. Circ Res. 110 (12), 1628-1645 (2012).
- Person, A., Klewer, S., Runyan, R. Cell biology of cardiac cushion development. Int Rev Cytol. 243, 287-335 (2005).
- de Vlaming, A., et al. Atrioventricular valve development: new perspectives on an old theme. Differentiation. 84 (1), 103-116 (2012).
- Butcher, J., McQuinn, T., Sedmera, D., Turner, D., Markwald, R. Transitions in early embryonic atrioventricular valvular function correspond with changes in cushion biomechanics that are predictable by tissue composition. Circ Res. 100 (10), 1503-1511 (2007).
- Hove, J., et al. Intracardiac fluid forces are an essential epigenetic factor for embryonic cardiogenesis. Nature. 421 (6919), 172-177 (2003).
- Tan, H., et al. Fluid flow forces and rhoA regulate fibrous development of the atrioventricular valves. Dev Biol. 374 (2), 345-356 (2013).
- Biechler, S., et al. The impact of flow-induced forces on the morphogenesis of the outflow tract. Front Physiol. 5, (2014).
- Hu, N., Clark, E. Hemodynamics of the stage 12 to stage 29 chick embryo. Circ Res. 65 (6), 1665-1670 (1989).
- Hogers, B., DeRuiter, M., Gittenberger-de Groot, A., Poelmann, R. Unilateral vitelline vein ligation alters intracardiac blood flow patterns and morphogenesis in the chick embryo. Circ Res. 80 (4), 473-481 (1997).
- Hogers, B., DeRuiter, M., Gittenberger-de Groot, A., Poelmann, R. Extraembryonic venous obstructions lead to cardiovascular malformations and can be embryolethal. Cardiovasc Res. 41 (1), 87-99 (1999).
- Reckova, M., et al. Hemodynamics is a key epigenetic factor in development of the cardiac conduction system. Circ Res. 93 (1), 77-85 (2003).
- Stekelenburg-de Vos, S., et al. Acutely altered hemodynamics following venous obstruction in the early chick embryo. J Exp Biol. 206 (pt 6), 1051-1057 (2003).
- Lucitti, J., Tobita, K., Keller, B. Arterial hemodynamics and mechanical properties after circulatory intervention in the chick embryo. J Exp Biol. 208 (pt 10), 1877-1885 (2005).
- Menon, V., Eberth, J., Goodwin, R., Potts, J. Altered Hemodynamics in the Embryonic Heart Affects Outflow Valve Development. J. Cardiovasc. Dev. Dis. 2 (2), 108-124 (2015).
- Hamburger, V., Hamilton, H. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 473-481 (1951).
- Midgett, M., Goenezen, S., Rugonyi, S. Blood flow dynamics reflect degree of outflow tract banding in Hamburger-Hamilton stage 18 chicken embryos. J R Soc Interface. 11 (100), (2014).
