Abstract
Til tross for fremskritt i forståelsen av hode og nakke plateepitelkarsinom (HNSCC) progresjon, forblir fem års overlevelse lav på grunn av lokale tilbakefall og fjernmetastaser. En hypotese for å forklare dette gjentakelse er tilstedeværelse av kreft stilk-lignende celler (cscs) som presenterer iboende kjemo- og radio-motstand. For å kunne utvikle nye terapeutiske strategier, er det nødvendig å ha eksperimentelle modeller som validerer effektiviteten av målrettet behandling, og derfor for å ha pålitelige fremgangsmåter for identifisering og isolering av cscs. For å oppnå dette, presenterer vi en protokoll for isolering av cscs fra humane HNSCC-cellelinjer som er avhengig av kombinasjonen av to suksessive cellesorteringer som utføres av fluorescensaktivert cellesortering (FACS). Den første er basert på eiendommen til cscs å overuttrykke ATP-bindende kassett (ABC) transportørproteiner og dermed ekskludere, blant annet viktige DNA-fargestoffer som Hoechst 33342. Cellene sortert med ther fremgangsmåten er identifisert som en "side populasjon" (SP). Som SP-cellene representerer en lav andel (<5%) av parentale celler, er det nødvendig med en vekstfase for å øke deres antall før den andre cellesortering. Det neste trinnet gjør det mulig for utvelgelse av celler som besitter to andre HNSCC stamcelle egenskaper, dvs. høy ekspresjon nivå av celleoverflatemarkør CD44 (CD44 høy) og over-ekspresjon av aldehyddehydrogenase (ALDH høy). Siden bruk av en enkelt markør har en rekke begrensninger og fallgruver for isolering av cscs, kombinasjonen av SP, blir CD44 og ALDH markører tilveiebringe et nyttig verktøy for å isolere cscs for videre analyse og funksjonelle analyser som krever levedyktige celler. Stammen aktige egenskaper ved cscs ble endelig validert in vitro med dannelsen av tumorispheres og ekspresjonen av β-catenin.
Introduction
Hode og hals plateepitelkarsinom (HNSCC) er en vanlig kreft over hele verden og til tross for fremgang i dagens behandling, pasienter med avansert sykdom har en dårlig prognose. Den samlede fem års overlevelse av pasienten er rundt 30% til tross for en kombinasjon av terapeutiske tilnærminger inkludert kirurgi, cellegift eller strålebehandling og målrettede-terapi. Nyere studier attributt lokalt tilbakefall og fjernmetastaser til overlevelse av kreft stamceller lignende celler (cscs) etter kreft terapier 1. Det er vist som støtter eksistensen av celler som presenterer stamceller egenskaper (udifferensiert status, selvfornyelse og differensiering kapasiteter, og telomerase aktivitet) i ulike solide tumorer inkludert bryst, hjerne, prostata, lunge, tykktarm, bukspyttkjertel, lever og hud 2- 10. Men opprinnelsen til cscs fortsatt uklart 11,12. De kan oppstå ved malign transformasjon av normale stamceller 3,13 eller dedifferenfor handling av kreftceller som kjøper cscs-lignende funksjoner 14,15. Derfor vil forstå karakteristiske veier relatert til cscs gi innsikt i tidlig diagnose og behandling av resistent HNSCC.
Det har blitt foreslått at cscs også ha resistente fenotyper som unndrar standard kjemoterapi og strålebehandling, noe som resulterer i tumor tilbakefall i forhold til hoveddelen av tumorceller 16-19 og er lokalisert i hypoksisk nisjer 20. Mange faktorer har blitt foreslått for å forklare disse motstander cscs, for eksempel tilbøyelighet til quiescence, økt DNA reparasjon, oppregulert cellesyklus kontrollmekanismer, og frie radikaler, dvs 21. Videre kan flere onkogene molekylære reaksjonsveier være spesielt aktiveres i cscs 17. For å bedre kunnskapen om cscs for videre målrettet-terapi, trenger vi pålitelige metoder for identifisering og isolering av cscs, på grunn av heterogenitet av stamcellerelaterte markører iulike typer av kreft 22.
I HNSCC, stem-lignende tumor initiere celler har blitt isolert fra primærpasient tumorer ved å sortere celler som uttrykker forskjellige CSC biomarkører (for eksempel medikament-utløps transportører uttrykk 23, CD44 høy, CD24 lav CD133 høy, c-Met + fenotype 10,24, 25, eller ALDH høy aktivitet 26) eller dyrke primær pasient svulst å danne squamospheres som har CSC egenskaper. Likevel antall squamospheres reduseres dramatisk etter to passeringer, og dermed gi en liten sample size for videre karakterisering studerer 27. Derfor in vitro prøver å starte fra etablerte cellelinjer er en enklere løsning for å designe eksperimenter for å forbedre kunnskap om cscs.
Målet med denne artikkelen er å foreslå en metode for å isolere cscs fra HNSCC cellelinjer ved hjelp multiparametric flowcytometrisk analyse ennd celle sortering. Uttrykket av CD44 i sammenheng med flere cscs egenskaper, inkludert ALDH aktivitet, er Side Befolkning (SP) fenotype, spheroid formasjon evne og tumorigenicity brukes til å isolere og karakterisere dette sub-populasjon av cscs. CD44, et celleoverflate-glykoprotein, er involvert i celle adhesjon og migrering. CD44 er sterkt uttrykt i mange solide tumorer cscs 28, blant annet i hodet og halskreft modeller 29-31. Videre kan CD44 høy celler generere in vivo en heterogen tumor mens CD44 lav celler kan ikke 10. SP-analysen er basert på differensialpotensialet av celler til dyseutstrømningen Hoechst fargestoff 22 via den ATP-bindende kassett (ABC) familie av transportørproteiner overuttrykt i CSC membranen. Denne analysen omfatter bruk av ABC-transportør inhibitorer slik som verapamil i kontrollprøver. Aldehyd dehydrogenase (ALDH) er en intracellulær enzym som er involvert i å konvertere retinol til retinoic syre under tidlig stamcelledifferensiering 25,26. Celler som viser høy ALDH aktivitet showet stilk-lignende celle atferd i HNSCC 26 og en svært få antall ALDH høye cellene er i stand til å generere tumorer in vivo 26,32.
Kombinasjonen av disse markører og egenskapene ble med hell brukt ved Bertrand e t al., For å studere den motstand in vitro og in vivo av disse cscs til foton og karbon ion stråling 19. Resultatene viste klart at kombinasjonen av forskjellige cellemarkører og egenskaper er mer selektive for praktiske studier på HNSCC cscs populasjoner enn enkeltmarkør tilnærminger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr prosedyrer ble utført i henhold til lokale retningslinjer for dyr omsorg. Alle detaljene i denne studien ble godkjent av CECCAPP, en fransk etikkomité.
1. Valg av en Side Befolkning (SP) ved Hoechst Dye utstrømning analysen
- Beising 50 millioner celler med Hoechst 33342 fargestoff.
- Forbered to 15 ml sterile rør med en konisk bunn: ett rør merket "Hoechst" og en merket "Hoechst og Verapamil". Fremstille 10 ml av 5 mM Verapamil-hydroklorid oppløsning i sterilt vann. Forbered dyrkingsmediet (CM) for stamceller.
- For å fremstille CM for CSC (CM-CSC), kombinere følgende: Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM): F12 (1: 3, volum: volum), 5% føtalt kalveserum (FCS), 0,04 mg / l av hydrokortison , 100 U / ml penicillin, 0,1 g / l av streptomycin og 20 ug / L av epidermal vekstfaktor (EGFR).
- Under en laminær hette, trypsineres celler. Fjern media, vask med sterile fosfatbufret saltvann (PBS) og tilsett 1 ml trypsin-EDTA (0,5 g / L) for et 75 cm² kolbe. Inkuber 3 minutter ved 37 ° C. Stopp reaksjonen ved å tilsette kulturmedium som brukes for den parentale cellelinje. Telle antall celler ved hjelp av en celleteller.
- For å fremstille CM foreldrecellelinje (CM-P), supplere DMEM med 10% FCS, 0,4 mg / l av hydrokortison, 100 U / ml penicillin og 0,1 g / l av streptomycin).
- Fortynn cellesuspensjonen oppnådd i trinn 1.1.2 for å oppnå 10 7 celler / ml i CM-P. Splitte cellesuspensjonen i 2 rør forberedt: sette 100 mL (10 6 celler) i røret "Hoechst og Verapamil" og 4 ml (4 x 10 7 celler) i røret "Hoechst".
- I sample "Hoechst og Verapamil", tilsett 10 pl 5 mM Verapamil-hydroklorid oppløsning (sluttkonsentrasjon: 0,5 mM) og bland forsiktig. Tilsett 5 ul av 1 g / l Hoechst oppløsning (endelig konsentrasjon: 0,1 g / l). I prøven & #34, Hoechst ", legge til 5 mL av 1 g / l Hoechst løsning per 10 6 celler (200 pl totalt) Heretter holde prøvene beskyttet mot direkte lys eksponering ved hjelp av aluminiumsfolie..
- Inkuber alle rørene i et vannbad ved 37 ° C i 1 time 30 min. Bland forsiktig hvert 15 min for å hindre at celler fra å bosette seg.
- Sentrifugerør ved 250 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Fjern supernatant og resuspender hver pellet med 2 ml av 1 x PBS.
- Sentrifugerør ved 250 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Fjern supernatant. Resuspender "Hoechst og Verapamil" pellet i 500 ul av 5 mg / l propidiumjodid (PI) fortynnet i PBS-buffer og "Hoechst" pellet i 4 ml 5 mg / l PI fortynnet i PBS-buffer.
- Overfør prøveløsninger gjennom en 70 mikrometer celle sil for å fjerne aggregater og samle enkeltceller i rør for prøveopptak på flowcytometeret. Hold prøver på is og beskytte mot direkte lys eksponering ved hjelp av aluminiumsfolie.
- Forbered to 15 ml sterile rør med en konisk bunn: ett rør merket "Hoechst" og en merket "Hoechst og Verapamil". Fremstille 10 ml av 5 mM Verapamil-hydroklorid oppløsning i sterilt vann. Forbered dyrkingsmediet (CM) for stamceller.
- jegsolation av Side Befolkning Eksklusive Hoechst fargestoff av Cell Sorting.
- Utfør Hoechst negative cellen separasjon på en flowcytometri sorter med følgende parametre: UV laser (355 nm), 2 detektorer på UV laser banen med blå Hoechst (450/50 BP) og rød Hoechst (610/20 BP) filtre, og 2 samlere.
- Først analysere sample "Hoechst" som fungerer som en positiv kontroll for flekker og flowcytometer set-up.
- Bruke cytometeret programvaren, på "Global regneark" -vinduet, klikk på "Dot Plot" (femte øverst til høyre på bildet) og lage et diagram på den globale arket. På koordinere, med et høyreklikk, velg FSC-A (forover scatter) og på abscissen SSC-A (side scatter) (figur 1A). På samme måte, opprette en SSC-W versus SCC-H prikkplott. På denne andre prikkplott, for å skape en P1 region, klikk på "Polygon gate" (fjortende øverst til høyre på bildet) (figur 1B) 33.
Merk: P1 regionen vilomfatte enkeltceller og diskriminere dubletter. - Valgfritt: Ekskluder PI positive celler ved å opprette en FSC-A versus PI inngjerdet på P1. På denne prikkplott, velg PI negative befolkningen (P2) for å utelukke PI positive døde celler.
- Bruke cytometeret programvaren, på "Global regneark" -vinduet, klikk på "Dot Plot" og lage et diagram på den globale arket. På koordinere, med et høyreklikk, velg blå Hoechst-A og på abscissen, rød Hoechst-A. Med et høyreklikk på befolkningen, velg "Vis befolkningen" og P1. På denne prikkplott, skape en region (P2) for å velge de negative Hoechst fargestoff side befolkningen (SP) celler som vises som en side arm på venstre side av hoved populasjon av celler (figur 1C).
- Analyser prøven "Hoechst" og samle 10.000 hendelser. For å sikre at porten P2, som representerer SP befolkningen, er godt posisjonert, analysere prøven "Hoechst og Verapamil" (10.000 hendelser)å observere forsvinningen av SP populasjonen (figur 1D).
- Samle SP Hoechst fargestoff negative celler i en 15 ml tube inneholder 1 ml av CM-CSC utarbeidet i 1.1.1.1.
- Ved slutten av cellesortering, sentrifuger cellesuspensjonen ved 250 xg i 5 minutter, fjern supernatanten og resuspender pelleten med 1 ml av CM-CSC. Tell antall sorterte cellene ved anvendelse av en celleteller og overføre passende antall celler i et kulturflaske (se tabell 1). Legg CM-CSC og inkuber ved 37 ° C og 5% CO2 atmosfære.
- Opprettholde celler i kultur under de samme betingelsene for maksimalt 2 passasjer til det er minimum 5 x 10 7 celler (se punkt 3, "Cell kultur metoden").
- Utfør Hoechst negative cellen separasjon på en flowcytometri sorter med følgende parametre: UV laser (355 nm), 2 detektorer på UV laser banen med blå Hoechst (450/50 BP) og rød Hoechst (610/20 BP) filtre, og 2 samlere.
2. Valg av CD44 høy / ALDH høy Sub-befolkningen i Side Befolknings Ordnet
- Beising 50 millioner av SP Celler med ALDH Detection Kit og CD44 antistoff.
- Forbered syv 15 ml sterile rør merket som følger: "Ufarget" (Tube a), "CD44-APC" (Tube b), "IgG1-APC" (Tube c), "ALDH" (Tube d), "ALDH og DEAB "(Tube e)," ALDH og CD44-APC "(Tube f)," ALDH, DEAB og CD44-APC "(Tube g). Hold alle rør og reagenser ved 4 ° C i løpet av farging.
- Forbered buffer A med 4,5 ml av bufferen en (inkludert i pakken) og 45 ul av CD44-APC (allofykocyanin) antistoff (fortynning 1: 100). Forbered buffer B med 100 ul buffer 1 og 1 mL av IgG1-APC antistoff (fortynning 1: 100). Forbered buffer C med 4 ml buffer 1 og 20 pl av reagens av settet.
- Forbered en cellesuspensjon av de tidligere sorterte cellene (trinn 1.2.5) 10 7 celler / ml. Tilsett 100 ul (10 6 celler) av cellesuspensjonen til rør a, b og c, og 4 ml (4 x 10 7 celler) til røret f. For øyeblikket ikke sette cellene i rørene d, e og g.
- Sentrifuger rør inneholdende cellene ved 250 xg i 5 minutter. Fjern supernatanten og resuspender pelleten i rørene a, b og c i 100 pl buffer 1. Tilsett 5 ul av diethylaminobenzaldehyde (DEAB), en ALDH inhibitor til rørene e og g.
- Resuspender celler i rør f med 4 ml reagens C og umiddelbart overføre 100 ul inn i rørene d, e og g. Inkuber alle rørene i et vannbad ved 37 ° C i 30 minutter og beskyttes mot direkte lys eksponering ved hjelp av aluminiumsfolie. Bland cellesuspensjonen forsiktig ved virvling etter 15 min for å forhindre celler fra settling.
- Fra dette øyeblikk, holde rørene på is og beskyttet mot direkte lys eksponering ved hjelp av aluminiumsfolie. Sentrifuger alle rør ved 250 xg i 5 minutter ved 4 ° C og fjern supernatanten.
- Resuspender rør f i 4 ml og rørene b og g med 100 ul buffer A. Resuspender rør c med 100 pl buffer B. Til andre rør, tilsett 100 ul buffer 1. Inkuber 10 min ved 4 °C.
- Sentrifuger alle rør ved 250 xg i 5 minutter ved 4 ° C og fjern supernatanten. Skyll en gang med 1 ml buffer 1 (4 ml for rør f) og sentrifuger på nytt ved 250 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Fjern supernatanten. Re-suspendere tube f pellet i 4 ml og alle andre rør i 1 ml buffer 1.
- Overfør prøven løsninger gjennom 70 mikrometer celle siler for å fjerne aggregater og samle enkeltceller i passende rør for prøveopptak på strømningscytometer.
- Isolasjon av CD44 høy / ALDH høy cellepopulasjon av fluorescens Aktivert Cell Sorting.
- Utfør CD44 høy / ALDH høy celle sortering på en flowcytometri sorter med følgende parametre: Blå laser (488 nm) og rød laser (633 nm), en detektor på blå laser banen med en FITC filter (530/30), en detektor på den røde laseren banen med en APC filter (660/20) og 2 samlere.
- Bruke cytometeret programvaren, klikk på "Dot Plot "(den femte øverste bildet til høyre) for å lage en FSC-A versus SSC-A prikkplott som beskrevet i punkt 1.2.1.2, for å sjekke celle morfologi og velg en befolkning består av enkeltceller med en SSC-W versus SSC-H prikkplott.
- Bruke cytometeret programvaren, på "Global regneark" -vinduet, klikk på "Dot Plot" og lage et diagram på den globale arket. På koordinere, med et høyreklikk, velg APC-A og på abscissen FITC-A for å velge dobbel farget befolkningen. Lag en gate ved hjelp av rør d og e for å velge ALDH høye celler (Figur 2A). Merk: Positive celler forsvinner i rør e behandlet med DEAB (figur 2B).
- På samme diagram, oppretter en ny port ved hjelp av rør b og c for å velge CD44 høye celler (figur 2C og 2D). Positive celler forsvinne i rør inneholdende IgG1-APC. Analyser rør f og g og opprette en tredje gate som inkluderer CD44 høy / ALDH <sup> høye celler (Figur 2E og 2F).
Merk: Hvis positive celler er til stede i rør inneholdende IgG1-APC (figur 2D), er ikke spesifikke interaksjonen mellom celler og APC-farget antistoff.
- På samme diagram, oppretter en ny port ved hjelp av rør b og c for å velge CD44 høye celler (figur 2C og 2D). Positive celler forsvinne i rør inneholdende IgG1-APC. Analyser rør f og g og opprette en tredje gate som inkluderer CD44 høy / ALDH <sup> høye celler (Figur 2E og 2F).
- Samle CD44 høy / ALDH høye celler i en 15 ml tube inneholder 1 ml av CM-CSC. Samle også CD44 lav / ALDH lavt inn i en 15 ml tube inneholder 1 ml av CM 19. Merk: Forbered CM-CSC som beskrevet i trinn 1.1.1.1.
- Sentrifuger cellesuspensjonen ved 250 xg i 5 minutter, fjern supernatanten og resuspender pelleten med 1 ml av CM-CSC. Tell antall sorterte cellene.
3. Cell Culture Method
- Etter den dobbelt sortering av cellene som beskrevet ovenfor, plate de sorterte celler i et passende kulturflaske (tabell 1) med CM-CSC ved 37 ° C med 5% CO2. Etter 18-24 timer,sjekk om cellene har klebet og endre dyrkningsmediet. Endre dyrkningsmediet etter 3 dager inntil de voksende koloniene er større enn 50% sammenflytende.
- Bruk det passende volum av trypsin 0,5 g / L - EDTA (tabell 1) for å trypsineres cellene fra dyrkningskolben. Inkuber cellene 3 til 5 minutter ved 37 ° C. Tilsett passende mengde av CM-CSC (tabell 1) for å stoppe virkningen av trypsin.
- Telle antall celler oppnådd og plate 4 x 10 5 celler i en 175 cm² kulturflaske med CM-CSC. Inkuber ved 37 ° C og 5% CO2. Ved denne konsentrasjonen, vil celler med en doblingstid på 24 timer er 70% konfluent i 7 dager.
- Bruk cscs for in vitro eller in vivo forsøk før de har gjennomgått 3 passasjer.
4. Bekreftelse av Tumor Potensial og CSC Kjennetegn
- Tumor Sphere Dannelse å bekrefte svulsten Potensiale CD44 høy / ALDHhøye Cells.
- Trypsineres cellene, som beskrevet i 3.2. Tilsett 1 x 10 6 celler til et 15 ml rør og sentrifuger ved 250 xg i 5 minutter. Fjern supernatanten og re-suspendere pellet i et DMEM: F12 (3: 1) mellom FCS gratis, 20 ng / ml rhEGF, 4 mg / L av heparin og 1x B27. Inkuber cellene i en seks vel lav forankringsplatene kulturflaske ved 37 ° C og 5% CO2.
Merk: Bruk DMEM: F12 (3: 1) medium inneholdende 5% FCS, 20 ng / ml rhEGF, 4 mg / L av heparin og 1x B27 hvis cellen ikke vokser uten FCS. - Observere dannelse med et optisk mikroskop fra 4 til 10 dager tumoren sfære etter utsåing (figur 3A).
Merk: Tumor sfære diameter bør være mer enn 35 um. CD44 høy / ALDH høye celler vil vise en raskere og mer forbedret svulst sfære dannelse i form av antall og størrelse i forhold til CD44 lav / ALDH lav.
- Trypsineres cellene, som beskrevet i 3.2. Tilsett 1 x 10 6 celler til et 15 ml rør og sentrifuger ved 250 xg i 5 minutter. Fjern supernatanten og re-suspendere pellet i et DMEM: F12 (3: 1) mellom FCS gratis, 20 ng / ml rhEGF, 4 mg / L av heparin og 1x B27. Inkuber cellene i en seks vel lav forankringsplatene kulturflaske ved 37 ° C og 5% CO2.
- Evaluering av In Vivo tumorigenitet EtterSubkutan injeksjon av CD44 høye / ALDH høye Cells i NOD-SCID mus.
- Etter sortering, re-suspendere celler i PBS ved tre forskjellige konsentrasjoner (10 fire celler / ml, 10 5 celler / ml, og 10 6 celler / ml). Injiser subkutant 100 ul 10 4 celler / ml (10 tre celler) i den høyre flanke region av 6 mus. Gjør det samme for 10 5 celler / ml (10 fire celler), og 10 6 celler / ml (10 5 celler).
Merk: Lavere fortynning enn 10 3 celler kan testes. - Injisere samme konsentrasjon av CD44 lav / ALDH lave celler i venstre flanke regionen. Monitor injisert mus i opp til 10 uker for å se tumorprogresjon 19.
- Etter sortering, re-suspendere celler i PBS ved tre forskjellige konsentrasjoner (10 fire celler / ml, 10 5 celler / ml, og 10 6 celler / ml). Injiser subkutant 100 ul 10 4 celler / ml (10 tre celler) i den høyre flanke region av 6 mus. Gjør det samme for 10 5 celler / ml (10 fire celler), og 10 6 celler / ml (10 5 celler).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Isolasjon av cscs fra HNSCC cellelinjer som kreves to påfølgende sortering på grunn av svært lav prosentandel av cscs i foreldrenes cellelinje. Den første sortering var basert på evnen til cscs å utelukke Hoechst fargestoff på grunn av for legemiddelavlevering transportører. Dette resulterte i anskaffelse på 1-5% av den totale cellepopulasjon sorteres (figur 1). Under Hoechst fargestoff negative cellesortering, sjekke størrelsen og granulering av sorterte cellene ved å se på FSC-A versus SSC-et prikkplott (figur 1A). Deretter diskriminere dubletter og celler fragmenter ved hjelp av SSC-W versus SSC-H prikkplott og velge befolkningen P1 (Figur 1B). På denne P1 befolkningen, skape en Hoechst Red-A versus Hoechst Blue-et prikkplott. Med røret merket "Hoechst", vises SP som en sidearm til venstre fra hovedceller befolkningen (figur 1C). Denne befolkningen må forsvinne når de are behandlet med Verapamil (figur 1D), en inhibitor av ABC-transportører. PI farging tillater utelukkelse av PI-positive døde celler fordi denne gruppen er under-skala på Hoechst Red-A skala (figur 1C og 1D, blå ellipser).
Den andre cellesortering var basert på den høye uttrykk for CD44 reseptoren og høy ALDH enzymaktivitet som tillot kjøp av 0,5-2% fra SP celler tidligere sortert (figur 2). Før sortering, ble forskjellige kontroller anvendt. De første er de "ALDH" og "ALDH + DEAB" -rør som trengs for å plassere den første porten på FITC høy-celler (figurene 2A og 2B): ALDH høy-celler ble separert på den FITC-A versus APC-A dot plottet ved hjelp av "ALDH" rør (figur 2A). Den gode plasseringen av porten ble kontrollert ved hjelp av "ALDH + DEAB "tube.:. Som DEAB inhiberer ALDH, må positive celler forsvinner fra porten (figur 2B) Hvis de ikke, endrer reaksjonsbetingelsene (ved å øke mengden av DEAB for eksempel) Det andre styre er" CD44-APC "og" IgG1-APC "-rør som tillot å posisjonere den andre porten på APC høy-celler (figurene 2C og 2D) ved hjelp av celler farget med CD44-APC-antistoff (figur 2C). Denne populasjonen må forsvinne med styrerøret som inneholdt IgG1-APC celler (figur 2D). Hvis den ikke gjør det, bindingen med antistoffet er ikke bestemt, og BSA 0,5% bør legges til buffer 1 fra ALDH deteksjon kit under antistoffreaksjon. til slutt, den tredje kontroll gjelder "ALDH og CD44-APC" tube og "ALDH, DEAB og CD44-APC" rør (Tall 2E, 2F, 2G og 2H). den doble staining ALDH / CD44 røret blir brukt til å posisjonere den siste porten på de doble positive celler (figur 2E) og det samme rør som ble behandlet med DEAB er en kontroll for å verifisere at ALDH høye celler forsvinner (figur 2F).
Denne protokollen blir brukt for å sortere cscs fra SQ20B og Fadu cellelinjer. Når sorteringen utføres for første gang på en ny cellelinje, for å sikre at sorterte celler har stilk-lignende celler egenskaper, er det nødvendig å bekrefte deres tumor potensial. En av de stilk-liknende celle egenskap er dens evne til å danne tumorspheres in vitro i et FSC fritt medium. Under denne tilstanden, kan bare kreft stamceller-lignende celler overlever og sprer (figur 3A). Videre qPCR eksperimenter viser en høy ekspresjon av β-catenin (markør for stilk-lignende karakteristikk) i CD44 høy / ALDH høy-celler (figur 3B), så vel som BMI-1 og Notch 19 </ Sup>. Til slutt, CD44 høy / ALDH høy-celler er også i stand til å danne svulster når injisert i små mengder sammenlignet med CD44 lav / ALDH lave celler 19.
Figur 1: Isolering av en side befolkningen utenom Hoechst fargestoff (A) FSC-A versus SSC-A dot plot.. (B) SSC-W versus SSC-H dot plot. (C, D) Hoechst Red-A versus Hoechst Blue-et prikkplott ved hjelp av "Hoechst" rør (C) eller med "Hoechst og Verapamil" rør (D). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Så rting av CD44 høye / ALDH høye celler fra Hoechst fargestoff negative celler. FITC-A versus APC-et prikkplott ved hjelp av "ALDH" rør (A), den "ALDH + DEAB" rør (B), den "CD44-APC" røret (C), den "IgG1-APC" rør (D), den "ALDH og CD44-APC" rør (E og G) eller "ALDH, DEAB og CD44-APC" rør (F og H). Figurene A, B, C, D, E og F oppnådd ved bruk av SQ20B cellelinje. Figurene G og H oppnådd ved bruk av Fadu cellelinje. Grønn indikerer CD44 lav / ALDH lave celler (Q3); mørk blå indikerer CD44 lav / ALDH høye celler (Q1); lilla indikerer CD44 høy / ALDH lave celler (Q4); lys blå indikerer CD44 høy / ALDH høye celler (Q2)._upload / 53958 / 53958fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 3: Bekreftelse av tumor potensialet til CD44 høye / ALDH høye celler Ordnet CD44 høy / ALDH høy-celler var i stand til å danne tumorspheres in vitro (A) i et dårlig-FCS media. Scale bar, 25 mikrometer. Videre CD44 høy / ALDH høy overuttrykke β-catenin, en markør for tumorigenitet (B). Dette kvantifisering er utført av qPCR og feilfelt representerer SD. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Antall cellersortert | Kultur kolbe typen | Trypsin Volum (ml) | Kultur Medium Volum (ml) |
| 10,000-200,000 | En brønn i en 6-brønns plate eller et 3,5 cm petriskål | 0.5 | 2 |
| 200,000-1,000,000 | En T25 kultur kolbe | 1 | 4 |
| > 1000000 | En T75 kultur kolbe | 2 | 10 |
Tabell 1: Culture kolbe typen som skal brukes i henhold til antall celler sortert Detaljer om kultur kolbe størrelse for omtrentlig antall celler sortert gis.. Volumet av trypsin og volum av medium som kreves for kulturflaske type er også gitt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver en pålitelig fremgangsmåte for vellykket isolering av cscs fra en spesifikk cellelinje som er anvendelig for andre HNSCC cellelinjer. Isolerte hode og nakke cscs er så egnet for videre molekylær karakterisering in vitro og funksjonell validering av transplantasjon i immunodeficient mus 19. Imidlertid kan noen endringer testes avhengig av hvilken side populasjonen eller CD44 høy / ALDH høye prosentandeler som er tilstede i den parentale cellelinje. Hvis for eksempel prosentandelen av celler i populasjonen side er for lav i en bestemt cellelinje, det CD44 høy / ALDH høy sortering kan utføres direkte. Markørene brukt i denne studien kan erstattes av andre egnede markører for cellelinje undersøkt slik som CD133 høy 34 eller CD10 høy 35.
Denne protokollen er basert på to cellesorteringer. Tre farge sortering med SP + CD44 + ALDH var ikke possible med cellelinjene som ble testet. Først foreldrecellelinjene testet her til stede mindre enn 5% av SP og mindre enn 10% CD44 høy / ALDH høy-celler i SP. Derfor SP / CD44 høy / ALDH høy utgjør mindre enn 0,5% av foreldrenes cellelinje. Derfor er det nødvendig med en første SP sortering for å berike befolkningen i CD44 høye og / eller ALDH høye celler. For det andre, til å sortere 1% av den parentale cellelinje, det tar 5 timer for å oppnå omtrent 300 000 celler. Derfor, hvis en 3-farge cellesortering er foretatt, vil mengden av celler oppsamlet være meget lav. Videre lenger sortering anbefales ikke da det kan påvirke cellenes levedyktighet.
På grunn av selektiviteten av denne isolasjon protokollen, er den viktigste begrensning lite antall cscs oppnås. Dette kan være problematisk å utføre ytterligere forsøk, siden det ikke er anbefalt å bruke dem etter 3 passasjer på grunn av den raske tap av CD44 og ALDH markører. Videre før hver ny eksperiment, hvor mange prosent av CD44 høy / ALDH høye celler fortsatt til stede i cellesuspensjonen bør testes for å sjekke antall cscs som har differensiert.
Det er viktig å fremstille Verapamil-hydroklorid oppløsning og kulturmedium inneholdende EGF like før anvendelse som disse molekylene er svært ustabil. En stamløsning av EGF ved 20 mg / l er stabil i tre måneder ved -20 ° C. Variasjoner av Hoechst-protokollen finnes, men den endelige fargekonsentrasjons som vanligvis anvendes er 5 ug / ml. Dessuten, i løpet av den første sortering, forskjellige vekstmedium sammensetninger bør testes i henhold til den anvendte cellelinjen. Når sorterings forholdene er validert, er det nødvendig å kontrollere egenskapene til den sorterte cellepopulasjonen ved hjelp av ulike metoder (seksjon 4).
Celleoverflatemarkører, ALDH-aktivitet og evne til å effluks vitale fargestoffer er allerede benyttet individually i litteraturen for å isolere cscs fra HNSCC. Imidlertid protokollen som er beskrevet her har den unike fordelen av å bruke kombinasjoner av ulike markører for å oppnå høy spesifisitet i cscs isolert fra HNSCC cellelinjer. Videre er CD44 sortering kan bli realisert med et antistoff anti-CD44 konjugert med magnetiske mikrokuler og sorteres med en magnetisk kolonne 36, men denne metode er bare anvendbar for celleoverflatemarkører, og kan ikke benyttes for en ALDH sortering, å hindre dobbel sortering . En annen metode som brukes for å oppnå cscs er tumorsphere kultur fra primærsvulster 37 eller xenografter 38. Men kjøp av disse primære svulster eller transplantater i forbindelse med etiske begrensninger.
Etter denne metoden isolater levedyktige HNSCC cscs, kan de anvendes (etter at deres tumorgenisitet) i et antall eksperimenter som måler den fysiologiske funksjon av disse cellene. Den tillater derfor vurdere oppførselenav cscs følgende ulike terapeutiske tilnærminger (strålebehandling, kjemoterapi). Den gjør det også studiet av ulike biologiske parametere som migrasjon / invasjon, DNA-reparasjon, cellesignalering, osv. Derfor skaffe cscs fra ulike cellelinjer er et attraktivt valg for å undersøke cscs egenskaper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Calf Serum Gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Hydrocortisone water soluble | Sigma-Aldrich | H0396-100MG | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Dominique Dutscher | L0022-100 | |
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| F12 Nut Mix (1x) + GlutaMAX-I | Gibco | 31765-027 | |
| EGF | Promega | G5021 | The solution must be prepared just before use because it is very unstable |
| Heparin | StemcellTM Technologies | 7980 | |
| B-27 Supplement (50x), minus vitamin A | Gibco | 12587-010 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Corrosive, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4 |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V-4629 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 3 |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4 |
| ALDEFLUOR Kit | Stem Cell | 1700 | |
| CD44-APC, human antibody | Miltenyi Biotech | 130-095-177 | |
| IgG1-APC, human antibody | Miltenyi Biotech | 130-093-189 | |
| Z1 coulter particle | Beckman Coulter | 6605698 | |
| Optical microscope | Olympus | CKX31 | |
| SQ20B cell line | Gift from the John Little’s Laboratory | - | |
| FaDu cell line | ATCC | HTB-43 | |
| Low anchorage plates | Thermo Fischer Scientific | 145383 | |
| BD FACSDiva software v8.0.1 | BD Biosciences | - |
References
- Baumann, M., Krause, M., Hill, R. Exploring the role of cancer stem cells in radioresistance. Nat Rev Cancer. 8 (7), 545-554 (2008).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (7), 3983-3988 (2003).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
- Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells. Cancer Res. 65 (23), 10946-10951 (2005).
- Eramo, A., et al. Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population. Cell Death Differ. 15 (3), 504-514 (2008).
- Dalerba, P., et al. Phenotypic characterization of human colorectal cancer stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (24), 10158-10163 (2007).
- Hermann, P. C., et al. Distinct populations of cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity in human pancreatic cancer. Cell Stem Cell. 1 (3), 313-323 (2007).
- Yang, Z. F., et al. Significance of CD90 cancer stem cells in human liver cancer. Cancer Cell. 13 (2), 153-166 (2008).
- Fang, D., et al. A tumorigenic subpopulation with stem cell properties in melanomas. Cancer Res. 65 (20), 9328-9337 (2005).
- Prince, M. E., et al. Identification of a subpopulation of cells with cancer stem cell properties in head and neck squamous cell carcinoma. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (3), 973-978 (2007).
- Clarke, M. F., et al. Cancer stem cells -- Perspectives on current status and future directions: AACR Workshop on cancer stem cells. Cancer Res. 66 (19), 9339-9344 (2006).
- Soltanian, S., Matin, M. M. Cancer stem cells and cancer therapy. Tumor Biol. 32 (3), 425-440 (2011).
- Molyneux, G., et al. BRCA1 basal-like breast cancers originate from luminal epithelial progenitors and not from basal stem cells. Cell Stem Cell. 7 (3), 403-417 (2010).
- Vermeulen, L., et al. Single-cell cloning of colon cancer stem cells reveals a multi-lineage differentiation capacity. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (36), 13427-13432 (2008).
- Ratajczak, M. Z. Cancer stem cells -- Normal stem cells 'Jedi' that went over to the 'dark side.'. Folia Histochem Cytobiol. 43 (4), 175-181 (2005).
- Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
- Liu, G., et al. Analysis of gene expression and chemoresistance of CD133+ cancer stem cells in glioblastoma. Mol Cancer. 5, 67 (2006).
- Moncharmont, C., et al. Targeting a cornerstone of radiation resistance: Cancer stem cell. Cancer Lett. 322 (2), 139-147 (2012).
- Bertrand, G., et al. Targeting Head and Neck Cancer Stem Cells to Overcome Resistance to Photon and Carbon Ion Radiation. Stem Cell Rev. 10 (1), 114-126 (2013).
- Das, B., Tsuchida, R., Malkin, D., Koren, G., Baruchel, S., Yeger, H. Hypoxia enhances tumor stemness by increasing the invasive and tumorigenic side population fraction. Stem Cells. 26 (7), 1818-1830 (2008).
- Diehn, M., et al. Association of reactive oxygen species levels and radioresistance in cancer stem cells. Nature. 458 (7239), 780-783 (2009).
- Chen, Z. G. The cancer stem cell concept in progression of head and neck cancer. J Oncol. 2009, 894064 (2009).
- Zhang, P., Zhang, Y., Mao, L., Zhang, Z., Chen, W. Side population in oral squamous cell carcinoma possesses tumor stem cell phenotypes. Cancer Lett. 277 (2), 227-234 (2009).
- Zhang, Q., et al. A subpopulation of CD133(+) cancer stem-like cells characterized in human oral squamous cell carcinoma confer resistance to chemotherapy. Cancer Lett. 289 (2), 151-160 (2010).
- Sun, S., Wang, Z. Head neck squamous cell carcinoma c-Met⁺ cells display cancer stem cell properties and are responsible for cisplatin-resistance and metastasis. Int J Cancer. 129 (10), 2337-2348 (2011).
- Chen, Y. C., et al. Aldehyde dehydrogenase 1 is a putative marker for cancer stem cells in head and neck squamous cancer. Biochem Biophys Res Commun. 385 (3), 307-313 (2009).
- Lim, Y. C., et al. Cancer stem cell traits in squamospheres derived from primary head and neck squamous cell carcinomas. Oral Oncol. 47 (2), 83-91 (2011).
- Yu, Q., Stamenkovic, I. Cell surface-localized matrix metalloproteinase-9 proteolytically activates TGF-beta and promotes tumor invasion and angiogenesis. Genes Dev. 14 (2), 163-176 (2000).
- Krishnamurthy, S., et al. Endothelial cell-initiated signaling promotes the survival and self-renewal of cancer stem cells. Cancer Res. 70 (23), 9969-9978 (2010).
- Chikamatsu, K., Takahashi, G., Sakakura, K., Ferrone, S., Masuyama, K. Immunoregulatory properties of CD44+ cancer stem-like cells in squamous cell carcinoma of the head and neck. Head Neck. 33 (2), 208-215 (2011).
- Chen, Y. W., et al. Cucurbitacin I suppressed stem-like property and enhanced radiation-induced apoptosis in head and neck squamous carcinoma--derived CD44(+)ALDH1(+) cells. Mol Cancer Ther. 9 (11), 2879-2892 (2010).
- Clay, M. R., et al. Single-marker identification of head and neck squamous cell carcinoma cancer stem cells with aldehyde dehydrogenase. Head Neck. 32 (9), 1195-1201 (2010).
- Meinelt, E., et al. Technical Bulletin: Standardizing Application Setup Across Multiple Flow Cytometers Using BD FACSDiva Version 6 Software. , BD Biosciences. (2012).
- Zhou, L., Wei, X., Cheng, L., Tian, J., Jiang, J. J. CD133, one of the markers of cancer stem cells in Hep-2 cell line. Laryngoscope. 117 (3), 455-460 (2007).
- Fukusumi, T., et al. CD10 as a novel marker of therapeutic resistance and cancer stem cells in head and neck squamous cell carcinoma. Br J Cancer. 111 (3), 506-514 (2014).
- Shen, C., Xiang, M., Nie, C., Hu, H., Ma, Y., Wu, H. CD44 as a molecular marker to screen cancer stem cells in hypopharyngeal cancer. Acta Otolaryngol. 133 (11), 1219-1226 (2013).
- Kanojia, D., et al. Proteomic profiling of cancer stem cells derived from primary tumors of HER2/Neu transgenic mice. Proteomics. 12 (22), 3407-3415 (2012).
- Higgins, D. M., et al. Brain tumor stem cell multipotency correlates with nanog expression and extent of passaging in human glioblastoma xenografts. Oncotarget. 4 (5), 792-801 (2013).
