Summary
RAPID bloed verwerkingsmethode kan worden gebruikt bij mensen en hogere opbrengsten peptide niveaus en maakt de beoordeling van de juiste moleculaire vorm. Daarom zal deze methode een waardevol instrument in peptide onderzoek.
Abstract
Onderzoek op het gebied van de voedselinname regelgeving wordt steeds belangrijker. Dit omvat vaak het meten van peptiden de voedselopname. Voor de juiste bepaling van de concentratie van een peptide moet stabiel tijdens bloedbewerking zijn. Dit is echter niet voor meerdere peptiden die snel worden afgebroken door endogene peptidasen. Onlangs hebben we een bloedverwerkend werkwijze gebruik R educed temperaturen cidification A, P rotease remming I sotopic exogene controles en D ilution (RAPID) voor gebruik bij ratten. Hier hebben we deze techniek voor gebruik bij mensen vastgesteld en onderzocht herstel moleculaire vorm en circulerende concentratie van voedselinname regulerende hormonen. De snelle werkwijze aanzienlijk verbeterd herstel voor 125-gemerkte somatostatine-28 (+ 39%), glucagon-achtige peptide-1 (+ 35%), acyl ghreline en glucagon (+ 32%), insuline en kisspeptin (+ 29% ) nesfatin-1 (+ 28%), leptine(+ 21%) en peptide YY 3-36 (+ 19%) in vergelijking met standaard verwerking (EDTA bloed op ijs, p <0,001). Hoge prestatie vloeistofchromatografie toonde de elutie van endogene acyl ghreline op de verwachte positie RAPID verwerking, terwijl na standaardverwerking 62% van acyl ghreline werd afgebroken waardoor een eerdere piek waarschijnlijk vertegenwoordigen desacyl ghreline. Na een snelle verwerking van de acyl / desacyl ghrelin verhouding in het bloed van een normaal gewicht was 1: 3 ten opzichte van 01:23 volgende standaard verwerking (p = 0,03). Ook endogene kisspeptin niveaus waren hoger na RAPID in vergelijking met standaard verwerking (+ 99%, p = 0,02). RAPID bloed verwerkingsmethode kan worden gebruikt bij mensen, levert hogere peptide niveaus en maakt de beoordeling van de juiste moleculaire vorm.
Introduction
In het licht van de wereldwijde toenemende prevalentie van obesitas 1,2, wordt onderzoek op het gebied van de voedselinname regelgeving steeds belangrijker. Terwijl tot nu toe slechts één peptide is bekend dat de omtrek opgesteld en centraal werkende voedselinname, namelijk ghreline 3 stimuleren, in de afgelopen decennia is een groot aantal peptiden geïdentificeerd die verminderen voedselinname, bijv. leptine, peptide YY (PYY) en glucagon-achtig peptide-1 (GLP-1) en insuline 4, Daarom is in studies naar de regulatiemechanismen van honger-peptide niveaus worden vaak beoordeeld en tegelijkertijd wordt aangenomen dat het peptide bestudeerde stabiel en teruggewonnen in hoge opbrengsten bij plasma formatie. Echter, vaak is dit niet het geval is door snelle endogene afbraak zoals eerder getoond bijv. ghreline die gedegradeerd van acyl ghreline tot 5 desacyl. Daarom hebben we onlangs beschreef de snelle methode voor het bloed proceszingen bij ratten in dienst R educed temperaturen, A cidification, P rotease inhibitie, ik sotopic exogene controles en D ilution 6. Deze methode verbeterd herstel van 6 11 van 12 peptiden getest en toegestaan voor het bepalen van de juiste circulerende moleculaire vorm in vergelijking met standaard Bloedverwerkingsfilter (EDTA bloed op ijs). Deze werkwijze is gebruikt in verscheidene latere studies 7-12 voor de detectie van ghreline en corticotropine releasing factor 13. Daarom is de werkwijze nuttig voor peptide onderzoek bij knaagdieren aangetoond. Echter, aangezien knaagdieren studies zijn niet altijd te vertalen naar een andere soort, de methode moet worden vastgesteld voor het gebruik in het menselijk bloed ook.
Het doel van het onderhavige onderzoek was de snelle werkwijze voor het bloedverwerkende testen bij mensen in vergelijking met standaard bloedbewerkingsprocedure, EDTA bloed op ijs, die algemeen wordt aanbevolen 14 en vaak used in de klinische en onderzoek instellingen. We testten het herstel van een selectie van 125 I-gelabelde peptiden die betrokken zijn bij de regulatie van voedselinname waaronder gevestigde peptiden evenals nieuwe kandidaten onlangs voorgesteld om een rol spelen bij het voeden van regulering spelen (effecten op voedselinname zijn weergegeven in tabel 1) na verwerking met beide methoden. Hormonen werden gekozen om peptiden van verschillende lengte en lading (tabel 2) te vertegenwoordigen. Bovendien is het voor ghrelin onderzochten we de moleculaire vorm (s) naar aanleiding van de standaard en snelle methode. Tenslotte onderzochten we endogeen ghreline (acyl en desacyl ghreline) en kisspeptin niveaus, een peptide onlangs voorgesteld een rol in de regulering van voedselinname 15,16 volgende RAPID of standaard bewerking beschikt. Daarnaast onderzochten we ook deze peptide niveaus in een populatie van patiënten met een breed scala van body mass index (variërend 10,2-67,6 kg / m 2) possib studerenle verschillen met betrekking tot chronisch gewijzigd lichaamsgewicht.
Diagnose, Evaluatie en Plan:
studie deelnemers
Alle deelnemers aan de studie werden onlangs in het ziekenhuis opgenomen patiënten (inclusie was binnen twee dagen na opname in het ziekenhuis) van de afdeling Psychosomatische Medicine in Charité-Universitätsmedizin Berlijn en gaven schriftelijk informed consent. Om enige impact van gender enige vrouwelijke patiënten geïncludeerd te voorkomen. Een totaal van 42 patiënten namen deel aan het onderzoek en werden verdeeld in drie groepen: normaal gewicht (BMI 18,5-25 kg / m 2, n = 12), anorexia nervosa (BMI <17,5 kg / m 2, n = 15) en obesitas (BMI> 30 kg / m 2, n = 15). Anorexia en obese patiënten warengediagnosticeerd volgens de International Classification of Diseases-10 en het ziekenhuis voor gewichtstoename (anorexia nervosa) of gewichtsvermindering (obesitas), respectievelijk. Alle normaal gewicht patiënten werden uitsluitend in het ziekenhuis als gevolg van somatoforme klachten zonder relevante somatische aandoeningen. Patiënten met gastro-intestinale somatoforme symptomen of een voorgeschiedenis van gastro-intestinale chirurgie werden uitgesloten. Uitsluitingscriteria omvatte ook een leeftijd <18 jaar, de huidige zwangerschap en onbehandelde psychotische aandoeningen. Bloedafname uitgevoerd op dag 2 of 3 na ziekenhuisopname voor het ontvangen dieetbehandeling voor het vergroten of verkleinen lichaamsgewicht, respectievelijk. Antropometrische parameters werden op dezelfde dag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het protocol werd goedgekeurd door de lokale ethische commissie voor menselijke onderzoek (protocol nummer EA1 / 114/10).
1. Blood Processing
- Verzamel veneuze bloed 7:00-08:00 na een nacht vasten van een ader en het proces onderarm volgens de standaard procedure of de snelle methode. Instrueer de onderwerpen niet uit te oefenen of roken voor bloedafname.
- Voor standaard verwerking, het verzamelen van bloed in EDTA-bevattende gekoelde en centrifugeer binnen 10 minuten bij 3000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Verzamel de supernatant en bewaar bij -80 ° C tot verdere verwerking door radioimmunoassay.
- Voor snelle verwerking onmiddellijk verdund bloed (binnen 1 min na bloedafname) 01:10 in ijskoude buffer (pH 3,6) die 0,1 M ammoniumacetaat, 0,5 M NaCl en enzymremmers (diprotine A, E-64-d, antipaïne , leupeptine, chymostatine, 1 ug / ml). Vervolgens centrifuge binnen 10 minuten bij 3000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C en laat ons supernatanting een pipet in polypropyleen buizen zoals hiervoor beschreven in ratten 6.
- Charge chromatografie cartridges (360 mg, 55-105 pm) met 100% acetonitril (rate 10 ml / min), in evenwicht met 0,1% trifluoracetaat (TFA, snelheid 10 ml / min) en de supernatant lading met een constante snelheid van 1 ml / min met behulp van een injectiepomp.
- Daarna wassen patronen met 3 ml 0,1% TFA (rate 10 ml / min) en langzaam elueer met 2 ml 70% acetonitril dat 0,1% TFA (2 ml / min).
- Droge geëlueerde monsters met behulp van vacuüm centrifugatie en opslag bij -80 ° C tot verdere verwerking door radioimmunoassay.
LET OP: Voer alle stappen in polypropyleen (RAPID verwerking) en borosilicaat (radioimmunoassay) buizen die aanzienlijk lager oppervlak bindende eigenschappen vertonen en dus peptide verlies voor het grootste deel van de peptiden onderzocht vóór 26 minimaliseren.
2. Metingen
LET OP: De stappen in deze sectie moeten worden uitgevoerd in een laboratoriumgecertificeerd voor het werken met radioactief materiaal. Standaard voorzorgsmaatregelen voor het werken met 125 I moeten worden genomen.
- Herstel van radioactief gelabeld Peptiden
- Verkrijgen 125I radioactief gemerkte menselijke-peptiden (bijv. Acyl-ghreline, GLP-1, glucagon, insuline, kisspeptin, leptine, nesfatin-1, PYY 3-36 en somatostatine-28).
- Houd peptiden in poedervorm tot het experiment, toen vers verdund in 0,1% azijnzuur (~ 100.000 cpm per ml).
- Voor standaard bloed verwerking, direct na de bloedafname in gekoelde EDTA-bevattende buizen, breng 1 ml bloed in een buis met 50 ul van radiolabel met 3.000-6.000 tpm (direct geteld voor het experiment begint).
- Voor een snelle verwerking, breng 1 ml bloed van EDTA met bloed in een buis met 9 ml RAPID buffer (voor de samenstelling zie 1.3) en 500 ul radiolabel met 30,000-60,000 cpm. Door het gebruik 1:10 verdunning 10-maal groter volume radiolabel voor een snelle verwerking.
- Daarna proces monsters zoals beschreven in stap 1.2 tot 1.3.2.
- Voor het herstel experimenten, niet droog monsters door middel van vacuüm centrifugeren en niet bewaren bij -80 ° C. In plaats daarvan beoordeelt herstel van radioactief gemerkte peptiden direct daarna met behulp van een gamma-teller.
- Meet de gehele supernatant standaardmonsters, terwijl RAPID monsteranalysen 1/10 van het totale volume vergelijkbaarheid van de hoeveelheid radiolabel gebruikte verkrijgen. Voor het meten, overdracht van de bovenstaande vloeistof in buizen passend in de gamma-teller en de tellingen per minuut te beoordelen
- Als standaard 100%, gebruikt twee monsters met 50 pl 125I radioactief gemerkt peptide dat geen bewerking ondergaan. Meet tegelijkertijd met andere monsters zoals beschreven in 2.1.7.
- Voer het experiment 5-6 keer voor elk peptide.
- High Performance Liquid Chromatography van radioactief gelabeld Ghreline
- Trekken bloed in chilled EDTA bevattende buizen en overdracht 1 ml tot buizen die 200 pi radioactief gemerkt-acyl ghreline met 15.000-20.000 cpm (direct geteld voor het experiment begint).
- Voor een snelle verwerking, breng 1 ml bloed in een buis met 9 ml RAPID buffer (voor de samenstelling zie 1.3) en 200 pi radioactief gemerkt acyl ghreline met 15.000-20.000 cpm.
- Daarna proces monsters zoals beschreven in stap 1.2 tot 1.3.2.
- Voor verdere analyse met omkeerfase HPLC, direct geladen monsters op een stabiele binding C18 kolom (2,1 mm x 50 mm, 1,8 urn) geëquilibreerd in 17% acetonitril in water (aangevuld met 0,1% TFA).
- Na 5 min equilibreren gebruik een gradiënt 17-40% acetonitril aan het monster elueren in 40 minuten (stroomsnelheid van 1 ml / min).
- Verzamel fracties van 1 ml per minuut en analyseren van radioactiviteit met behulp van een gamma-teller.
- In een afzonderlijk experiment belasting 200 gl radioactief gemerkte acyl ghreline met 15.000-20.000cpm op de kolom direct en voer HPLC zoals beschreven in de stappen 2.2.4 tot en met 2.2.6.
- radioimmunoassay
- Voor radioimmunoassay, ontdooien bevroren supernatanten (standaard verwerking) en vacuüm gedroogd poeder (RAPID-methode) bij kamertemperatuur.
- Onmiddellijk voor radioimmunoassay, resuspendeer droge RAPID monsters met tweemaal gedestilleerd H2O volgens de oorspronkelijke volume plasma (500 ui).
- Evalueren kisspeptin en totale (zowel desacyl en acyl ghreline) en acyl ghreline zoals eerder beschreven 12,27 behulp van commerciële radioimmunoassays volgens de protocollen van de fabrikant. Gebruik borosilicaat buizen die stabiele formatie pellet mogelijk te maken.
- Op dag één, incubeer de monsters met testbuffer en primair antilichaam (bijv. Anti-ghreline) in de verdunning van de fabrikant gedurende 24 uur.
- Op dag twee, voeg de tracer 125I (bijvoorbeeld 125I-ghreline), vortex en incubeer gedurende 24 uur.
- Op dag drie, voeg reagens worden, vortex en incubeer zoals aanbevolen door de fabrikant. Vervolgens centrifugebuizen bij 3000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatants en tel radioactiviteit in de pellets onder toepassing van een gammateller
- Bereken desacyl ghreline als het verschil van de totale minus acyl ghreline. Beoordelen van de acyl / desacyl ghrelin verhouding door deling acyl door desacyl ghreline voor elk individueel monster.
- Verwerk alle monsters - indien mogelijk - in de ene partij naar inter-assay variabiliteit te voorkomen. De intra-assay variatie in het onderhavige experiment was <8% voor kisspeptin, <7% voor totaal en <9% voor acyl ghreline.
3. Statistische analyse
- Bepaal de verdeling van de gegevens waarbij de Kolmogorov-Smirnov-test. Versneld data als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM).
- Beoordelen van verschillen tussen tweegroepen van t-test. Beoordelen van de verschillen tussen de verschillende groepen door alle pair-wise meervoudige vergelijking procedures (Tukey post hoc test) of two-way ANOVA gevolgd door Holm-Sidak methode.
- Overweeg p <0,05 significant en het uitvoeren van analyses met behulp van een statistisch programma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
RAPID bloedverwerkende verhoogt de opbrengst aan 125 I-radiogelabelde peptiden in menselijk bloed in vergelijking met standaard bloedbewerkingsprocedure.
Na standaard bloed verwerking (EDTA bloed op het ijs), het herstel van radioactief gemerkte peptiden was ~ 60% in 9/9 peptiden (variërend 48-68%, Figuur 1A - K). RAPID verwerking verbeterde de opbrengst in elke 125I-gemerkte peptiden, namelijk in somatostatine-28 (+ 39%, figuur 1A), glucagon-achtige peptide-1 (+ 35%, figuur 1B), acyl ghreline (n-octanoyl ghreline, + 32%, figuur 1C), glucagon (+ 32%, figuur 1D), insuline (+ 29%, Figuur 1E), kisspeptin (+ 29%, Figuur 1F), nesfatin-1 (+ 28%, figuur 1G), leptine (+ 21%, figuur 1 H) en peptide YY 3-36 (+ 19%, figuur 1K) in vergelijking met standaard behandeling (p <00,001). In deze peptiden 9, het herstel na de snelle werkwijze was ~ 90% (bereik 71-98%, Figuur 1A - K).
Figuur 1:. Herstel van 125I-gemerkte peptiden in menselijk bloed na standaard of RAPID bloedbewerkingscircuit Gelabeld peptide werd menselijk bloed toegevoegd en behandeld volgens standaardprocedure (EDTA bloed op ijs) of snelle werkwijze (verlaagde temperaturen, verzuring, protease remming, isotopische exogene controles en verdunning). De supernatanten werden verzameld en geteld op radioactiviteit. Elke kolom vertegenwoordigt het gemiddelde ± SEM van 5-6 experimenten. *** P <0,001 vs. standaard verwerking. Klik hier om viewa grotere versie van dit cijfer.
Na een snelle verwerking, Ghreline elueert op de verwachte positie.
Na een snelle verwerking van menselijk bloed 125I gelabeld ghreline geëlueerd bij de verwachte plaats, terwijl na standaardprocedure eerder piek werd waarschijnlijk waargenomen gevonden volgens desacyl ghreline (figuur 2). Dit betekent een 62% afbraak van het peptide.
Figuur 2:. Elutieprofiel van 125I-gemerkte acyl ghreline in Human Blood volgende standaard of RAPID bloedbewerkingscircuit Gelabeld peptide werd menselijk bloed toegevoegd en bewerkt volgens standaardprocedure of snelle werkwijze. Daarna werd de supernatant aangebracht op een high performance liquid chromatografie kolom. Het eluaat was colteerd elke minuut en geteld op radioactiviteit. Na een snelle verwerking meeste peptide elueerde op het verwachte tijdstip, en na standaard verwerken van een groot deel eerder geëlueerd, waarschijnlijk vertegenwoordigen desacyl ghreline. Afkorting:. Cpm, counts per minuut Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
RAPID Blood Processing Verbetert de Acyl / desacyl Ghreline Ratio en resulteert in een verhoogde endogene kisspeptin bloedspiegels Vergeleken met Standard Processing.
Bloed werd van anorexia, een normaal gewicht en obese proefpersonen ingetrokken en verwerkt volgens de standaard of snelle procedure. Endogeen ghreline (totaal en acyl ghreline) werd bepaald door radioimmunoassay. Antropometrische en comorbiditeit / medicatie van de studiegroepen worden in tabellen 3 en 4. Na een snelle verwerking de acyl / desacyl ghrelin verhouding in het bloed van een normaal gewicht was 1: 3 ten opzichte van 01:23 volgende standaard bloed verwerking (p = 0,03; figuur 3A). Vergelijkbare resultaten werden waargenomen onder anorexia (1: 3 vs. 01:19, p <0,001) en obesitas voorwaarden (1: 3 vs 1:13; p = 0,04; Figuur 3A.). Er werden geen verschillen waargenomen tussen de drie verschillende groepen voor standaard of snelle verwerking (figuur 3A). Two way ANOVA wees op een significante invloed van de verwerkingsmethode (F 1,64 = 15,3, p <0,001), terwijl het lichaamsgewicht / metabolische aandoening geen effect gehad (F 2,64 = 0,5, p = 0,62).
tp_upload / 53959 / 53959table4.jpg "/>
Circulerende endogene kisspeptin niveaus waren significant hoger na RAPID vergelijking met standaard verwerking anorexia (+ 60%, p = 0,02) en normaal gewicht (+ 99%, p = 0,02), terwijl het verschil niet significant was onder omstandigheden van obesitas ( 23%, p = 0,39; figuur 3B). Geen significante verschillen waargenomen tussen de drie verschillende BMI groepen (p> 0,05; figuur 3B). Two way ANOVA wees op een significante invloed van de verwerkingsmethode (F 1,74 = 10,8, p = 0,002), terwijl het lichaamsgewicht / metabolische aandoening geen effect gehad (F 2,74 = 0,5, p = 0,60).
Figuur 3: De doorgeven Acyl / desacyl Ghreline Ratio en doorgeven kisspeptin Levels onder verschillende metabole condities volgende RAPID of Standard Blood Processing Bloed werd van anorexia, een normaal gewicht of obesitas onderwerpen ingetrokken na een nacht vasten en verwerkt volgens de standaard procedure of de snelle methode.. De bovenstaande vloeistof werd verzameld en acyl evenals totale ghreline niveaus of kisspeptin niveaus (B) beoordeeld door radioimmunoassay. Desacyl ghreline werd verkregen door het aftrekken van acyl van totaal ghreline. De verhouding werd berekend door acyl door desacyl ghreline (A). De groepsgrootte is aangegeven bij de onderkant van de kolommen. Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM. * P <0,05, ** p <0,01 en *** p <0,001 vs. standaard verwerking. Klik hier om een grotere versie te bekijkendit figuur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We meldden eerder dat de snelle methode voor de verwerking van bloed verbeterde de recovery voor 11/12 peptides in vergelijking met standaard verwerking bloed bij ratten 6. In deze studie hebben we aangetoond dat deze methode ook geschikt voor gebruik bij mensen. Na snelle verwerking werd het herstel voor 9 van 9 125I-gemerkte peptiden getest dan standaard Bloedverwerkingsfilter (EDTA bloed op ijs). De waargenomen verbetering varieerde 19-39% die van belang kan zijn, vooral onder omstandigheden wanneer slechts subtiele verschillen naar verwachting wat kan worden gemaskeerd als de opbrengst van het peptide laag.
We toonden ook aan dat na RAPID bloed verwerking ghreline wordt gedetecteerd op de juiste elutiepositie na HPLC met vermelding van de juiste moleculaire vorm (acyl ghreline), terwijl na de standaard bloed verwerking 2/3 zijn afgebroken tot ghreline desacyl. Omdat de acylgroep is essentieel voor binding aan de ghreline receptor 28, de-acylering wordt verwacht dat de biologische functie van het peptide sterk veranderen. Echter, ook desacyl ghreline wordt steeds meer erkend als een biologisch actief peptide 29. Interessant was desacyl ghreline voorgesteld om de effecten van ghreline tegen zoals eerder getoond voedselinname 30 of motiliteit 31. Dit benadrukt verder het belang van het onderzoek naar de juiste moleculaire vorm.
Bij het bestuderen van de endogene niveaus van kisspeptin in normaal gewicht, toonden we sterk verhoogde niveaus (+ 99%) na RAPID in vergelijking met standaard bloed te verwerken. Er werd echter geen verbetering waargenomen onder omstandigheden van obesitas, die verschuldigd zijn om de totale verhoogde niveaus kisspeptin (+ 50% bij obese vs. Normaal gewicht). BMI tussen groepen (anorexia nervosa, en obesitas normaal) in bloed behandeld met beide methoden werden geen significante verschillen waargenomen die te wijten kunnen zijn aan het feit dat slechts nuchtere niveaus were geëvalueerd. Verschillen kunnen duidelijk postprandiaal, een hypothese die onderzocht moeten worden in toekomstige studies zijn.
Kisspeptin al eerder gemeten in studies met alleen EDTA buizen op ijs 32 (in dit onderzoek aangeduid standaard verwerking) of door toevoeging van proteaseremmers 33. Gebaseerd op dit onderzoek het koelen van de buizen niet voldoende is om peptide degradatie voorkomen. Of verzuring alleen of enkele proteaseremmers zijn genoeg om kisspeptin behouden moet worden onderzocht in toekomstige studies.
Evenzo snelle verwerking verhoogt ook de opbrengst van endogene acyl ghreline zoals aangegeven door een sterk verhoogde acyl / desacyl ghreline verhouding (1: 3) in vergelijking met standaard Bloedverwerkingsfilter (01:23). Deze bevinding toont goede overeenstemming met knaagdieren studies waar we meldde een acyl / desacyl ghrelin verhouding van 1: 5 volgende RAPID verwerking vóór (in vergelijking met 1:19 na standaard verwerking).Het brede bereik van de acyl / desacyl ghrelin verhouding van 1:15-01:55 34,35 vóór gerapporteerd zijn dus waarschijnlijk veroorzaakt door een de-acylering afhankelijke groot deel van desacyl ghreline. Zoals hierboven beschreven voor kisspeptin werden geen veranderingen van de acyl / desacyl ghrelin verhouding waargenomen onder verschillende omstandigheden chronisch gewijzigd lichaamsgewicht (anorexia nervosa vs. Normaal gewicht vs. Obesitas). Dit kan ook het gevolg zijn van het feit dat slechts nuchtere niveaus van acyl / desacyl ghrelin beoordeeld en de postprandiale verordening belangrijker. Anderzijds betekent dit ook dat ondanks chronisch gewijzigd lichaamsgewicht het aantal acyl en desacyl ghreline wordt onder basale omstandigheden niet veranderd en kan een belangrijke rol bij de adaptieve veranderingen die onder deze omstandigheden niet worden afgespeeld. Echter, zullen toekomstige studies met behulp van gestandaardiseerde maaltijd protocollen en het toepassen van de snelle methode helpen om deze kwestie verder te beantwoorden.
De RAPID method gebruikt de volgende componenten: Omdat chemische reacties voornamelijk afhankelijk van de temperatuur 36 een verlaging van de temperatuur met een ijskoude oplossing vertraagt de afbraak van het peptide. Vervolgens, een afname in pH (verzuring) vermindert de snelheid van de afbraak 37. Bovendien kan een verlaging van pH verlaagt adsorptie van peptiden aan andere oppervlakken en vermindert daardoor het risico van verlies peptide. De proteaseremmers die hier gebruikt werden gekozen om een breed spectrum van endogene peptidasen omvatten: (bijv. Cathepsine B / H) diprotine A als een remmer van dipeptidylpeptidase IV, E-64-d als een remmer voor thiol proteases, antipaïne als een remmer van trypsine, papaïne en cathepsine A / B, leupeptine als inhibitor van trypsine, plasmine, papaïne en cathepsine en chymostatine als een remmer van chymotrypsine, papaïne en cathepsine B / G. Bovendien isotopische peptiden zijn nuttig voor het verbeteren van herstel bepalen volgens de werkwijze. Wat ten slotte het tarief of het enzym-substraat complexvorming afhankelijk van de concentratie van het enzym (peptidase) en het substraat (peptide hormoon) 38 verdunning van het plasma verlaagt de snelheid van vorming en derhalve afbraak (een tienvoudige verdunning vermindert het honderdvoudig volgens de Michaelis -Menten kinetiek).
Ondanks de voordelen van de snelle werkwijze moeten verscheidene beperkingen van de werkwijze ook worden bevestigd. De meest kritische fase van het protocol is tijd. Bloedmonsters in de RAPID buffer worden verdund onmiddellijk na bloedafname moeilijk kan zijn in de klinische setting. Bovendien is de methode is tijdrovend, vereist het bereiken ervan en speelt ook duurder dan standaard bloedbewerkingsprocedure. Hoewel het moeilijk te implementeren in de klinische praktijk kan worden, zal het nuttig voor onderzoeksdoeleinden, in het bijzonder wanneer slechts kleine verschillen verwacht en derhalve een hoge opbrengst van het gewenste peptide.
Hoewel de snelle werkwijze wordt beschreven en aanbevolen met alle componenten (R educed temperaturen cidification A, P rotease remming I sotopic exogene controle en ilution D) in dit document, kunnen toekomstige studies modificaties van deze techniek. Het gebruik van isotopen exogene controles kunnen niet verplicht en daarom beperkt tot pilotstudies om te beoordelen welke peptiden tonen de grootste verbetering in het herstel met behulp van RAPID verwerking. Bovendien, ook de samenstelling van de proteaseremmer cocktail kan worden gewijzigd wanneer andere peptiden worden beoordeeld. Dit moet echter worden getest als er een nieuwe peptide wordt gemeten.
Samenvattend kan de RAPID werkwijze bloedbewerkings- worden gebruikt voor menselijke bloed en het herstel van 9/9 peptiden getest in vergelijking met standaard bloedbewerkingsprocedure sterk verbeterd. Aangezien sommige peptiden slechts een kleine tot matige verbetering van herstel waargenomen, de noodzaakvan de werkwijze kan worden getest als er een nieuwe peptide wordt geanalyseerd. Bovendien is de RAPID methode het detecteren van de juiste moleculaire vorm zoals getoond acyl ghreline ook verhoogt aanzienlijk de opbrengst van endogene circulerende niveaus van peptiden zoals kisspeptin vergelijking met standaard bloedbewerkingsprocedure. Daarom moet deze methode een bruikbaar instrument in menselijke studies beoordeling van circulerende peptide niveaus, bijvoorbeeld zijn. degenen die betrokken zijn bij de regulatie van honger en verzadiging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Duitse Research Foundation STE 1765 / 3-1 (AS) en het Duitse ministerie van Onderwijs en Onderzoek 03IPT614A (CG). Wij danken Reinhard Lommel en Petra Busse voor hun uitstekende technische ondersteuning en Karin Johansson en Christina Hentzschel voor hulp bij de organisatie en uitvoering van antropometrische metingen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Diprotin A | Peptides International, Louisville, KY, USA | IDP-4132 | |
| E-64-d | Peptides International, Louisville, KY, USA | IED-4321-v | |
| Antipain | Peptides International, Louisville, KY, USA | IAP-4062 | |
| Leupeptin | Peptides International, Louisville, KY, USA | ILP-4041 | |
| Chymostatin | Peptides International, Louisville, KY, USA | ICY-4063 | |
| Sep-Pak C18 cartridges | Waters Corporation, Milford, MA, USA | WAT051910 | 360 mg, 55-105 µm |
| Acyl-ghrelin | Millipore, Billerica, MA, USA | 9088-HK | Radioactive |
| GLP-1 | Millipore, Billerica, MA, USA | 9035-HK | Radioactive |
| Glucagon | Millipore, Billerica, MA, USA | 9030 | Radioactive |
| Insulin | Millipore, Billerica, MA, USA | 9011S | Radioactive |
| Leptin | Millipore, Billerica, MA, USA | 9081-HK | Radioactive |
| Kisspeptin-10 | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | T-048-56 | Radioactive |
| Nesfatin-1 | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | T-003-26 | Radioactive |
| PYY3-36 | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | T-059-02 | Radioactive |
| Somatostatin-28 | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | T-060-16 | Radioactive |
| ZORBAX Rapid Resolution HT SB-C18 column | Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA | 822700-902 | 2.1 mm x 50 mm, 1.8 µm |
| Agilent 1200 LC | Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA | HPLC, several components, therefore no single catalog number | |
| Kisspeptin RIA | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | # RK-048-56 | Radioactive |
| Total ghrelin RIA | Millipore, Billerica, MA, USA | # GHRT-89HK | Radioactive |
| Active ghrelin RIA | Millipore, Billerica, MA, USA | # GHRA-88HK | Radioactive |
| SigmaStat 3.1 | Systat Software, San Jose, CA, USA | online download |
References
- Finucane, M. M., et al. National, regional, and global trends in body-mass index since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 960 country-years and 9.1 million participants. Lancet. 377 (9765), 557-567 (2011).
- James, W. P. The epidemiology of obesity: the size of the problem. J Intern Med. 263 (4), 336-352 (2008).
- Stengel, A., Taché, Y. Gastric peptides and their regulation of hunger and satiety. Curr Gastroenterol Rep. 14 (6), 480-488 (2012).
- Hussain, S. S., Bloom, S. R. The regulation of food intake by the gut-brain axis: implications for obesity. Int J Obes (Lond). 37 (5), 625-633 (2013).
- Hosoda, H., et al. Optimum collection and storage conditions for ghrelin measurements: octanoyl modification of ghrelin is rapidly hydrolyzed to desacyl ghrelin in blood samples). Clin Chem. 50 (6), 1077-1080 (2004).
- Stengel, A., et al. The RAPID method for blood processing yields new insight in plasma concentrations and molecular forms of circulating gut peptides. Endocrinology. 150 (11), 5113-5118 (2009).
- Stengel, A., et al. Lipopolysaccharide differentially decreases plasma acyl and desacyl ghrelin levels in rats: Potential role of the circulating ghrelin-acylating enzyme GOAT. Peptides. 31 (9), 1689-1696 (2010).
- Stengel, A., et al. Cold ambient temperature reverses abdominal surgery-induced delayed gastric emptying and decreased plasma ghrelin levels in rats. Peptides. 31, 2229-2235 (2010).
- Stengel, A., et al. Central administration of pan-somatostatin agonist ODT8-SST prevents abdominal surgery-induced inhibition of circulating ghrelin, food intake and gastric emptying in rats. Neurogastroenterol Motil. 23 (7), e294-e308 (2011).
- Stengel, A., et al. Abdominal surgery inhibits circulating acyl ghrelin and ghrelin-O-acyltransferase levels in rats: role of the somatostatin receptor subtype 2. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 301, G239-G248 (2011).
- Wang, L., et al. Intravenous injection of urocortin 1 induces a CRF2 mediated increase in circulating ghrelin and glucose levels through distinct mechanisms in rats. Peptides. 39, 164-170 (2013).
- Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Wang, L., Taché, Y. Orexigenic response to tail pinch: role of brain NPY(1) and corticotropin releasing factor receptors. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 306 (3), R164-R174 (2014).
- Goebel, M., Stengel, A., Wang, L., Reeve, J., Taché, Y. Lipopolysaccharide increases plasma levels of corticotropin-releasing hormone in rats. Neuroendocrinology. 93 (3), 165-173 (2011).
- Banfi, G., Salvagno, G. L., Lippi, G. The role of ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) as in vitro anticoagulant for diagnostic purposes. Clin Chem Lab Med. 45 (5), 565-576 (2007).
- Stengel, A., Wang, L., Goebel-Stengel, M., Taché, Y. Centrally injected kisspeptin reduces food intake by increasing meal intervals in mice. Neuroreport. 22 (5), 253-257 (2011).
- De Bond, J. A., Smith, J. T. Kisspeptin and energy balance in reproduction. Reproduction. 147 (3), R53-R63 (2014).
- Wren, A. M., et al. Ghrelin enhances appetite and increases food intake in humans. J Clin Endocrinol Metab. 86 (12), 5992 (2001).
- Schulman, J. L., Carleton, J. L., Whitney, G., Whitehorn, J. C. Effect of glucagon on food intake and body weight in man. J Appl Physiol. 11 (3), 419-421 (1957).
- Steinert, R. E., Poller, B., Castelli, M. C., Drewe, J., Beglinger, C. Oral administration of glucagon-like peptide 1 or peptide YY 3-36 affects food intake in healthy male subjects. Am J Clin Nutr. 92 (4), 810-817 (2010).
- Dewan, S., et al. Effects of insulin-induced hypoglycaemia on energy intake and food choice at a subsequent test meal. Diabetes Metab Res Rev. 20 (5), 405-410 (2004).
- Schlogl, M., et al. Increased 24-hour ad libitum food intake is associated with lower plasma irisin concentrations the following morning in adult humans. Appetite. 90, 154-159 (2015).
- Heymsfield, S. B., et al. Recombinant leptin for weight loss in obese and lean adults: a randomized, controlled, dose-escalation trial. JAMA. 282 (16), 1568-1575 (1999).
- Shimizu, H., et al. Peripheral administration of nesfatin-1 reduces food intake in mice: the leptin-independent mechanism. Endocrinology. 150, 662-671 (2009).
- Batterham, R. L., et al. Inhibition of food intake in obese subjects by peptide YY3-36. N Engl J Med. 349 (10), 941-948 (2003).
- Shibasaki, T., et al. Antagonistic effect of somatostatin on corticotropin-releasing factor-induced anorexia in the rat. Life Sci. 42 (3), 329-334 (1988).
- Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Taché, Y., Reeve, J. R. Jr The importance of using the optimal plasticware and glassware in studies involving peptides. Anal Biochem. 414 (1), 38-46 (2011).
- Smets, E. M., et al. Decreased plasma levels of metastin in early pregnancy are associated with small for gestational age neonates. Prenat Diagn. 28 (4), 299-303 (2008).
- Kojima, M., et al. Ghrelin is a growth-hormone-releasing acylated peptide from stomach. Nature. 402 (6762), 656-660 (1999).
- Stengel, A., Yin Taché, Y., Yang, the Gastric X/A-like Cell as Possible Dual Regulator of Food Intake. J Neurogastroenterol Motil. 18 (2), 138-149 (2012).
- Inhoff, T., et al. Desacyl ghrelin inhibits the orexigenic effect of peripherally injected ghrelin in rats. Peptides. 29, 2159-2168 (2008).
- Hirayama, H., et al. Contrasting effects of ghrelin and des-acyl ghrelin on the lumbo-sacral defecation center and regulation of colorectal motility in rats. Neurogastroenterol Motil. 22 (10), 1124-1131 (2011).
- Horikoshi, Y., et al. Dramatic elevation of plasma metastin concentrations in human pregnancy: metastin as a novel placenta-derived hormone in humans. J Clin Endocrinol Metab. 88 (2), 914-919 (2003).
- Yang, Y. U., Xiong, X. Y., Yang, L. I., Xie, L., Huang, H. Testing of kisspeptin levels in girls with idiopathic central precocious puberty and its significance. Exp Ther Med. 9 (6), 2369-2373 (2015).
- Hosoda, H., Kojima, M., Matsuo, H., Kangawa, K. Ghrelin and des-acyl ghrelin: two major forms of rat ghrelin peptide in gastrointestinal tissue. Biochem Biophys Res Commun. 279 (3), 909-913 (2000).
- Raff, H. Total and active ghrelin in developing rats during hypoxia. Endocrine. 21 (2), 159-161 (2003).
- Evans, M. J., Livesey, J. H., Ellis, M. J., Yandle, T. G. Effect of anticoagulants and storage temperatures on stability of plasma and serum hormones. Clin Biochem. 34 (2), 107-112 (2001).
- Nabuchi, Y., Fujiwara, E., Kuboniwa, H., Asoh, Y., Ushio, H. The stability and degradation pathway of recombinant human parathyroid hormone: deamidation of asparaginyl residue and peptide bond cleavage at aspartyl and asparaginyl residues. Pharm Res. 14 (12), 1685-1690 (1997).
- White, A., Handler, P., Smith, E. L. Principles of Biochemistry. , 5th ed, McGraw-Hill Book Co. New York. (1973).
