Summary
HURTIG blodbearbeidelsesmetode kan anvendes på mennesker og gir større peptid-nivåer så vel som gjør det mulig for vurdering av den korrekte molekylære form. Derfor vil denne metoden være et verdifullt verktøy i peptid forskning.
Abstract
Forskning innen matinntak regulering er å få betydning. Dette inkluderer ofte måling av peptider som regulerer inntaket av mat. For riktig bestemmelse av et peptid konsentrasjon, bør det være stabil under behandling av blodet. Dette er imidlertid ikke tilfelle for flere peptider som er raskt degradert av endogene peptidaser. Nylig har vi utviklet et blodbehandlingsmetoden ansette R utledes temperaturer, A cidification, P rotease hemming, jeg sotopic eksogene kontroller og D ilution (RAPID) for bruk i rotter. Her har vi etablert denne teknikken for bruk i mennesker og undersøkt utvinning, molekylær form og sirkulerende konsentrasjon av matinntak regulatoriske hormoner. HURTIG Fremgangsmåte betydelig forbedret utvinning av 125 I-merket somatostatin-28 (+ 39%), glukagon-lignende peptid-1 (+ 35%), acyl ghrelin og glukagon (+ 32%), insulin og kisspeptin (+ 29% ), nesfatin-1 (+ 28%), leptin(+ 21%) og peptid YY 3-36 (+ 19%) sammenlignet med standard behandling (EDTA blod på is, p <0,001). Høytrykks-væskekromatografi viste eluering av endogent acyl ghrelin ved den forventede posisjon etter rask behandling, mens etter standard behandling 62% av acyl ghrelin ble degradert resulterer i en tidligere topp sannsynligvis representerer desacyl ghrelin. Etter rask behandling acyl / desacyl ghrelin forholdet i blodet hos normalvektige forsøkspersoner var 1: 3 forhold til 1:23 følgende standard behandling (p = 0,03). Også endogene kisspeptin nivåene var høyere etter RAPID forhold til den vanlige behandling (+ 99%, p = 0,02). HURTIG blodbearbeidelsesmetode kan anvendes på mennesker, gir større peptid nivåer og tillater evaluering av den korrekte molekylære form.
Introduction
I lys av den verdensomspennende økende utbredelsen av fedme 1,2, er forskning på feltet av matinntak regulering stadig viktigere. Selv så langt bare en peptid er kjent som perifert produsert og sentralt virkende å stimulere matinntak, nemlig ghrelin tre, i løpet av de siste tiårene, har et bredt spekter av peptider blitt identifisert som reduserer matinntaket, f.eks. leptin, peptid YY (PYY), og også glukagon-lignende peptid-1 (GLP-1) og insulin 4, Derfor, i studier som undersøker de regulerende mekanismer i sult og metthetsfølelse peptid-nivåer er ofte vurdert og på samme tid, er det antatt at peptidet studerte er stabil og gjenvunnet ved høyt utbytte i løpet av plasmadannelse. Men svært ofte dette er ikke tilfelle på grunn av rask endogen sammenbrudd som vist før for f.eks. ghrelin som er degradert fra acyl til desacyl ghrelin 5. Derfor har vi nylig beskrev rask metode for blod processynge i rotter ansette R utledes temperaturer, A cidification, P rotease hemming, jeg sotopic eksogene kontroller og D ilution 6. Denne metoden forbedret utvinning for 11 av 12 testede peptider og tillatt for bestemmelse av den korrekte sirkulerende molekylære form sammenlignet med standard blodbearbeidelses (EDTA blod på is) 6. Denne metoden har vært brukt i flere påfølgende studier 7-12 for påvisning av sirkulerende ghrelin samt kortikotropin-frigjørende faktor 13. Derfor har metoden vist seg nyttig for peptid forskning i gnagere. Men siden gnagere er ikke alltid oversettes til en annen art, bør etableres fremgangsmåten for bruk i menneskeblod i tillegg.
Formålet med denne studien var å teste rask metode for behandling av blodet hos mennesker sammenlignet med standard blodbearbeidelses, EDTA-blod på is, som er mye anbefales 14 og ofte used i den kliniske samt forskning innstilling. Vi testet utvinning av et utvalg av 125 I-merkede peptider som er involvert i reguleringen av matinntak blant etablerte peptider, så vel som nye kandidater nylig foreslått å spille en rolle i å mate regulerings (effekter på inntak av mat er vist i tabell 1) etter behandlingen med begge metodene. Hormoner ble også valgt til å representere peptider med forskjellig lengde og lading (tabell 2). Videre, for ghrelin vi undersøkt molekylære form (er) ved å følge standard og rask metode. Til slutt vurderes vi endogene ghrelin (acyl og desacyl ghrelin) samt kisspeptin nivåer, et peptid også nylig foreslått å spille en rolle i reguleringen av matinntak 15,16 følgende RAPID eller standard behandling. I tillegg har vi også undersøkt disse peptid nivåer i en populasjon av individer med et bredt spekter av body mass index (varierer 10,2 til 67,6 kg / m 2) for å studere possible forskjeller knyttet til kronisk endret kroppsvekt.
Diagnose, Assessment, og Plan:
deltakerne i studien
Alle deltakerne i studien ble nylig innlagt på sykehus pasienter (inkludering var innen to dager etter innleggelse på sykehuset) av divisjon for Psykosomatisk medisin ved Charité-Universitätsmedizin Berlin og ga skriftlig informert samtykke. For å unngå effekten av kjønn eneste kvinnelige pasienter ble inkludert. Totalt 42 personer deltok i denne studien, og ble delt inn i tre grupper: normal vekt (BMI 18,5 til 25 kg / m 2, n = 12), anorexia nervosa (BMI <17,5 kg / m 2, n = 15) og fedme (BMI> 30 kg / m 2, n = 15). Anorektisk og overvektige pasienter vardiagnostisert i henhold til International Classification of Diseases-10 og innlagt på sykehus for vektøkning (anorexia nervosa) eller vektreduksjon (fedme), henholdsvis. Alle normalvektige pasienter ble innlagt utelukkende på grunn av somatoforme symptomer uten relevante somatiske lidelser. Pasienter med gastrointestinale somatoforme symptomer eller en historie med gastrointestinal kirurgi ble ekskludert. Eksklusjonskriterier også omfattet en alder <18 år, nåværende graviditet og ubehandlede psykotiske sykdommer. Blodprøvetaking ble utført på dag 2 eller 3 etter sykehusinnleggelse før du mottar kosten behandling for å øke eller redusere kroppsvekt, henholdsvis. Antropometriske parametere ble vurdert på samme dag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen ble godkjent av lokale etisk komité for menneskeforskning (protokoll nummer EA1 / 114/10).
1. Blood Processing
- Samle veneblod 07:00 til 08:00 etter en natts faste fra en underarm vene og prosess i henhold til standard prosedyre eller RAPID metoden. Instruere fag for å ikke trener eller røyk før blod uttak.
- For standard behandling, samle blod i kjølte EDTA-holdige rør og sentrifuger i 10 minutter ved 3000 xg i 10 min ved 4 ° C. Samle supernatanten og hold ved -80 ° C inntil videre behandling ved radioimmunoanalyse.
- For rask behandling, straks fortynnet blod (innen 1 min etter at blodtilbaketrekning) 1:10 i iskald buffer (pH 3,6) inneholdende 0,1 M ammoniumacetat, 0,5 M NaCl og enzyminhibitorer (diprotin A, E-64-d, antipain , leupeptin, chymostatin, 1 ug / ml). Deretter, sentrifuger i 10 minutter ved 3000 xg i 10 min ved 4 ° C og samle supernatanten ossing en pipette i polypropylen rør som beskrevet før i rotter 6.
- Charge kromatografi kassetter (360 mg, 55-105 um) med 100% acetonitril (hastighet 10 ml / min), i likevekt med 0,1% trifluoracetat (TFA, hastighet 10 ml / min) og last med supernatanten ved en konstant hastighet på 1 ml / min ved anvendelse av en sprøytepumpe.
- Deretter vaskes patroner med 3 ml 0,1% TFA (hastighet 10 ml / min) og langsomt elueres med 2 ml 70% acetonitril inneholdende 0,1% TFA (2 ml / min).
- Tørre eluted prøver ved hjelp vakuumsentrifugering og oppbevares ved -80 ° C inntil videre bearbeiding av radioimmunoassay.
MERK: Gjennomføre alle trinn i polypropylen (rask behandling) og borsilikat (radioimmunoassay) rør som viser betydelig lavere overflatebindende egenskaper og dermed minimere peptid tap for de fleste av peptidene studert før 26.
2. Målinger
MERK: Trinn i denne seksjonen skal utføres i et laboratoriumsertifisert for arbeid med radioaktivt materiale. Standard forholdsregler for arbeidet med 125 jeg bør tas.
- Gjenoppretting av Radiomerket Peptider
- Skaffe 125 I-radiomerkede menneskelige peptider (f.eks. Acyl-ghrelin, GLP-1, glukagon, insulin, kisspeptin, leptin, nesfatin-en, PYY 3-36 og somatostatin-28).
- Hold peptider i pulverform inntil eksperimentet, og deretter ferskt fortynnes i 0,1% eddiksyre (~ 100 000 cpm pr ml).
- For standard blod behandling, rett etter blod uttak i avkjølt EDTA som inneholder rør, overføre 1 ml blod i et rør med 50 mL av radiomerket inneholder 3,000-6,000 kpm (regnes direkte før forsøket starter).
- For rask behandling, overføring 1 ml blod av EDTA som inneholder blod inn i et rør som inneholder 9 ml RAPID buffer (for sammensetningen se 1.3) og 500 mL radiomerket inneholder 30,000-60,000 kpm. På grunn av fortynning på 1:10 bruk 10-ganger høyere volum av radiolabel for rask behandling.
- Etterpå prosessprøver som beskrevet i trinn 1.2 til 1.3.2.
- For utvinning eksperimenter, ikke tørre prøver av vakuumsentrifugering, og ikke oppbevar ved -80 ° C. I stedet vurdere utvinning av radioaktivt merkede peptider direkte etterpå ved hjelp av en gammateller.
- Måle hele supernatanten i standardprøver, mens i RAPID prøvene analysere 1/10 av det totale volum for å oppnå sammenlignbarhet av mengden av radiomerket substans anvendes. For måling, overføre væsken i rør som passer inn i en gammateller og vurdere de tellinger per minutt
- Som et 100% standard, anvende to prøver med 50 ul av 125I-radiomerket peptid som ikke gjennomgår behandling. Mål samtidig med andre prøver som beskrevet i 2.1.7.
- Utfør eksperimentet fem til seks ganger for hvert peptid.
- High Performance Liquid Chromatography of Radiomerket ghrelin
- Trekk blod i chilled EDTA som inneholder rør og overføring 1 ml til rør som inneholder 200 mL radiomerket-acyl ghrelin inneholder 15.000-20.000 kpm (regnes direkte før forsøket starter).
- For rask behandling, overføring 1 ml blod inn i et rør som inneholder 9 ml RAPID buffer (for sammensetningen se 1.3) og 200 pl radiomerket acyl ghrelin inneholder 15.000-20.000 kpm.
- Etterpå prosessprøver som beskrevet i trinn 1.2 til 1.3.2.
- For ytterligere analyse ved reversfase-HPLC, lastes direkte prøvene på en stabil binding C18-kolonne (2,1 mm x 50 mm, 1,8 mm) ekvilibrert i 17% acetonitril i vann (begge supplert med 0,1% TFA).
- Etter 5 min ekvilibrering, bruke en gradient 17-40% acetonitril for å eluere prøven i 40 minutter (strømningshastighet på 1 ml / min).
- Samle fraksjoner på 1 ml hvert minutt og analysere radioaktivitet ved bruk av en gammateller.
- I et eget eksperiment, last 200 mL radiomerket acyl ghrelin inneholder 15.000-20.000cpm i kolonnen direkte og utføre HPLC som beskrevet i trinn 2.2.4 til 2.2.6.
- radioimmunoassay
- For radioimmunoanalyse, tine frosne supernatantene (standard prosessering) og vakuumtørket pulver (RAPID-metoden) ved romtemperatur.
- Umiddelbart før radioimmunoassay, re-suspen tørre hurtige utvalg i dobbelt destillert H2O i henhold til det opprinnelige volum av plasma (500 ul).
- Vurdere kisspeptin og totalt (inkludert både desacyl og acyl ghrelin) samt acyl ghrelin som beskrevet tidligere 12,27 bruke kommersielle radioimmunanalyser i henhold til produsentens protokoller. Bruk borosilicate rør som gir stabil pellet formasjon.
- På dag en, inkubere prøvene med analysebuffer og primært antistoff (f.eks. Anti-ghrelin) i fortynningen gitt av produsenten i en periode på 24 timer.
- På dag to, tilsett 125 jeg tracer (f.eks 125 I-ghrelin), vortex og inkuberes i en periode på 24 timer.
- På dag tre, legge den utløsende reagens, Vortex og inkuber som anbefalt av produsenten. Deretter sentrifugerør ved 3000 xg i 20 min ved 4 ° C. Fjern supernatanten og telle radioaktiviteten i pelletene ved anvendelse av en gammateller
- Beregn desacyl ghrelin som forskjellen i total minus acyl ghrelin. Vurdere acyl / desacyl ghrelin forholdet ved å dele acyl av desacyl ghrelin for hver enkelt prøve.
- Behandle alle prøvene - hvis mulig - i en batch for å unngå inter-assay variabilitet. Den intra-assay variasjon i dagens eksperiment var <8% for kisspeptin, <7% for total og <9% for acyl ghrelin.
3. Statistisk analyse
- Bestemme fordelingen av dataene ved hjelp av Kolmogorov-Smirnov test. Uttrykke dataene som gjennomsnitt ± standard feil av gjennomsnittet (SEM).
- Vurdere forskjeller mellom togrupper ved t-test. Vurdere forskjeller mellom flere grupper av alle parvise flere sammenligning prosedyrer (Tukey post hoc test) eller to-veis ANOVA etterfulgt av Holm-Sidak metoden.
- Tenk p <0,05 betydelig og utføre analyser ved hjelp av et statistikkprogram.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
RAPID blodbearbeidelses øker utbyttet av 125 I-radioaktivt merkede peptider i humant blod sammenlignet med standard blodbearbeidelses.
Etter standard blod behandling (EDTA blod på is), utvinning av radiomerkede peptider var ~ 60% i 9/9 peptider (som strekker seg 48-68%, figur 1A - K). RAPID behandling forbedret utbytte i alle 125I-merkede peptider, nemlig i somatostatin-28 (+ 39%, figur 1A), glukagon-lignende peptid-1 (+ 35%, figur 1B), acyl ghrelin (n-oktanoyl ghrelin, + 32%, figur 1C), glukagon (+ 32%, figur 1D), insulin (+ 29%, figur 1E), kisspeptin (+ 29%, figur 1F), nesfatin-1 (+ 28%, figur 1G), leptin (+ 21%, figur 1 H) og peptid YY 3-36 (+ 19%, figur 1K) sammenlignet med standard behandling (p <00,001). I disse 9 peptider, oppgangen etter den raske metoden var ~ 90% (varierer 71-98%, figur 1A - K).
Figur 1:. Gjenoppretting av 125 I-merkede Peptider i Human Blood følgende standard eller RAPID Blood Processing Radiomerket peptid ble lagt inn i menneskeblod og behandlet i henhold til standard prosedyre (EDTA blod på is) eller RAPID-metoden (reduserte temperaturer, forsuring, protease hemming, isotopiske eksogene kontroller og fortynning). Supernatantene ble oppsamlet og tellet for radioaktivitet. Hver kolonne representerer gjennomsnitt ± SEM av fem til seks forsøk. *** P <0,001 vs. standard behandling. Klikk her for å viewa større versjon av dette tallet.
Etter rask behandling, Ghrelin elueres ved forventede posisjon.
Etter rask behandling av humant blod, 125 I-merket ghrelin eluert ved den forventede posisjon, mens etter standard prosedyre tidligere topp ble observert mest sannsynlig svarer til desacyl ghrelin (figur 2). Dette representerte en 62% degradering av peptidet.
Figur 2:. Elueringsprofilen 125 I-merket acyl ghrelin i Human Blood følgende standard eller RAPID Blood Processing Radiomerket peptid ble lagt inn i menneskeblod og behandlet i henhold til standard prosedyre eller RAPID metoden. Deretter ble supernatanten applisert på en høytrykks-væskekromatografi-kolonne. Eluatet ble coltes hvert minutt og telles for radioaktivitet. Etter rask behandling meste av peptid elueres til forventet tid, mens etter standard behandling av en stor andel elueres tidligere, mest sannsynlig representerer desacyl ghrelin. Forkortelse:. Spm, tellinger per minutt Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
RAPID Blood Processing Forbedrer Acyl / Desacyl Ghrelin forhold og resulterer i økt Endogen Kisspeptin blod nivåer sammenlignet med standard behandling.
Blod ble trukket fra anorektisk, normal vekt og overvektige pasienter og behandles i henhold til standarden eller RAPID prosedyre. Endogen ghrelin (total og acyl ghrelin) ble bestemt ved radioimmunanalyse. Antropometriske og andre samtidige sykdommer / medisiner av studiegruppene er vist i tabell 3 og 4. Etter rask behandling acyl / desacyl ghrelin forholdet i blodet hos normalvektige forsøkspersoner var 1: 3 forhold til 1:23 følgende standard blod behandling (p = 0,03, figur 3A). Lignende resultater ble observert i henhold til anorektisk (1: 3 vs 01:19, p <0,001) og overvektige tilstander (1: 3 vs 01:13, p = 0,04; figur 3A.). Det ble ikke observert forskjeller mellom de tre ulike grupper for standard eller rask behandling (figur 3A). Toveis ANOVA indikerte en signifikant innflytelse av behandlingsmetoden (F 1,64 = 15,3, p <0,001), mens den kroppsvekt / metabolske tilstand hadde ingen effekt (F 2,64 = 0,5, p = 0,62).
tp_upload / 53959 / 53959table4.jpg "/>
Sirkulerende endogene kisspeptin nivåene var signifikant høyere etter hurtig sammenlignet med standard behandling i anorektisk (+ 60%, p = 0,02) og normal vekt fag (+ 99%, p = 0,02), mens forskjellen nådde ikke signifikans under betingelser med fedme ( 23%, p = 0,39; figur 3B). Det ble ikke observert signifikante forskjeller mellom de tre ulike BMI-grupper (p> 0,05, figur 3B). Toveis ANOVA indikerte en signifikant innflytelse av behandlingsmetoden (F 1,74 = 10,8, p = 0,002), mens den kroppsvekt / metabolske tilstand hadde ingen effekt (F 2,74 = 0,5, p = 0,60).
Figur 3: Sirkulasjons Acyl / Desacyl Ghrelin Ratio og Sirkulasjons Kisspeptin Nivåer under forskjellige metabolske betingelser følgende RAPID eller Standard Blood Processing Blod ble trukket tilbake fra anorektisk, normal vekt eller overvektige pasienter etter en natts faste og behandlet i henhold til standard prosedyre eller RAPID metoden.. Supernatanten ble oppsamlet og acyl, så vel som de totale nivåer ghrelin eller kisspeptin nivå (B) bestemt ved radioimmunoanalyse. Desacyl ghrelin ble oppnådd ved å trekke acyl fra total ghrelin. Forholdet ble beregnet ved å dividere acyl med desacyl ghrelin (A). Gruppestørrelsen er antydet ved bunnen av kolonnene. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. * P <0,05, ** p <0,01 og *** p <0,001 vs. standard behandling. Klikk her for å se en større versjon avdette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi rapporterte tidligere at RAPID metode for blod behandling økt utvinning for 11/12 peptider sammenlignet med standard behandling av blodet hos rotter 6. I foreliggende studie har vi vist at denne fremgangsmåte også er egnet for anvendelse i mennesker. Etter rask behandling, ble utbyttet for 9 av 9 125 I-merkede peptider testet forbedret sammenlignet med standard blodbearbeidelses (EDTA blod på is). Den observerte forbedring varierte 19-39% som kan tenkes å være aktuelt, særlig under forhold når kun små forskjeller forventes som kan være maskert når utbyttet av peptidet er lav.
Vi viste også at etter RAPID blodbearbeidelses ghrelin detekteres i riktig posisjon etter elueringen HPLC indikerer den korrekte molekylære form (acyl ghrelin), mens etter standard blodbearbeidelses 2/3 nedbrytes til desacyl ghrelin. Da acylgruppen er avgjørende for binding til reseptoren ghrelin 28, de-acylering forventes å sterkt endre den biologiske funksjon av peptidet. Men også desacyl ghrelin er i økende grad anerkjent som et biologisk aktivt peptid 29. Interessant nok var desacyl ghrelin foreslått å motvirke effektene av ghrelin, som vist før etter matinntak 30 eller tykktarmsmotilitet 31. Dette understreker videre viktigheten av å undersøke den riktige molekylær form.
Når man studerer endogene nivåer av kisspeptin i normalvektige forsøkspersoner viste vi stor økte nivåer (+ 99%) etter RAPID sammenlignet med standard blod behandling. Men ingen forbedring ble observert under forhold med fedme, noe som kan skyldes den generelle økte kisspeptin nivåer (+ 50% i obese vs. Normal vekt). Mellom BMI grupper (anorexia nervosa, normal vekt og fedme) i blod behandlet med enten metoden, ingen signifikante forskjeller ble observert som kan være på grunn av det faktum at bare fastende nivåer were vurdert. Forskjeller kan være tydelig postprandially, en hypotese som bør undersøkes i fremtidige studier.
Kisspeptin har blitt målt før i studier ved bruk av bare EDTA-rør på is 32 (i den foreliggende undersøkelsen refereres til som standard behandling), eller ved tilsetning av protease-inhibitorer 33. På bakgrunn av den foreliggende studien avkjøling av rørene er ikke tilstrekkelig til å forhindre nedbrytning peptid. Enten forsuring alene eller singel proteasehemmere er nok til å bevare kisspeptin bør undersøkes i fremtidige studier.
Tilsvarende RAPID behandling øker også utbyttet av endogen acyl ghrelin som indikert av en betydelig økt acyl / desacyl ghrelin ratio (1: 3) sammenlignet med standard blod behandling (01:23). Dette funnet viser god samsvar med gnagere der vi rapporterte en acyl / desacyl ghrelin forholdet 1: 5 etter rask behandling før (i forhold til 01:19 etter standard behandling).De brede områder av acyl / desacyl ghrelin forhold på 1:15 til 01:55 34,35 rapportert før var derfor mest sannsynlig på grunn av en de-acylering avhengig høy andel av desacyl ghrelin. Som beskrevet ovenfor for kisspeptin ble ingen endringer av acyl / desacyl ghrelin forholdet observert under ulike forhold av kronisk endret kroppsvekt (anorexia nervosa vs. Normal vekt vs. Fedme). Det kan også være på grunn av det faktum at bare fastende nivåer av acyl / desacyl ghrelin ble vurdert og postprandial regulering er mer viktig. På den annen side indikerer dette også at til tross for kronisk endres kroppsvekt andelen av acyl og desacyl ghrelin ikke endres under basale betingelser og kan ikke spille en viktig rolle i den adaptive endringer som observeres under disse betingelser. Imidlertid vil fremtidige studier med standardiserte måltid protokoller og bruke den rask metode bidra til ytterligere å svare på dette spørsmålet.
Den RAPID megthod anvender følgende komponenter: Siden kjemiske reaksjoner for det meste avhenge av temperatur 36 en reduksjon av temperatur ved hjelp av en is-kald løsning forsinker nedbrytningen av peptidet. Deretter også en nedgang i pH-verdi (surgjøring) reduseres hastigheten på degradering 37. Videre er en reduksjon i pH-verdi reduserer adsorpsjonen av peptider til andre overflater, og derfor reduserer også risikoen for peptidet tap. Den protease-inhibitorer er brukt her ble valgt for å dekke et bredt spektrum av endogene peptidaser: (. F.eks cathepsin B / H) diprotin A som en inhibitor av dipeptidylpeptidase IV, E-64-d som en inhibitor for tiol proteaser, antipain så en inhibitor for trypsin, papain og cathepsin A / B, leupeptin som en inhibitor for trypsin, plasmin, papain og cathepsin og chymostatin som en inhibitor for chymotrypsin, papain og cathepsin B / G. Videre isotopiske peptider er nyttige for å vurdere forbedring av utvinning ved fremgangsmåten. Til slutt, som frekvensen of enzym-substrat-kompleksdannelse avhenger konsentrasjonen av enzymet (peptidase) og substratet (peptid hormon) 38 fortynning av plasma reduserer frekvensen av formasjonen og derfor nedbrytning (en tidobbelt fortynning reduserer hastigheten en hundredfold henhold til Michaelis -Menten kinetikk).
Til tross for fordelene av den raske fremgangsmåten, bør flere begrensninger av fremgangsmåten bli anerkjent i tillegg. Den mest kritiske trinn i protokollen er tid. Blodprøver bør fortynnes i RAPID buffer umiddelbart etter blod uttak som kan være vanskelig i klinisk setting. Dessuten er metoden mer tidkrevende, krever en høyere grad av trening og er også dyrere enn standard blodbearbeidelses. Selv om det kan være vanskelig å gjennomføre i klinisk rutinemessig, vil det være nyttig for forskningsformål, spesielt når det forventes bare små forskjeller, og derfor et høyt utbytte av peptidet er ønskelig.
Selv om RAPID Metoden er beskrevet og anbefalt med alle sine komponenter (R utledes temperaturer, A cidification, P rotease hemming, jeg sotopic eksogene kontroller og D ilution) i dagens papir, kan fremtidige studier bruke modifikasjoner av denne teknikken. Bruk av isotoper eksogene kontroller kan ikke være obligatorisk, og derfor begrenset til pilotstudier for å vurdere hvilke peptider viser størst forbedring i utvinningen ved hjelp av rask behandling. Dessuten, også sammensetningen av protease inhibitor cocktail kan være modifisert ved andre peptider som blir vurdert. Dette bør imidlertid bli testet når et nytt peptid måles.
Oppsummert kan den RAPID fremgangsmåten i blodbearbeidelses brukes for menneskeblod og sterkt forbedret utvinning av 9/9 peptider som ble testet sammenlignet med standard blodbearbeidelses. Siden for noen peptider bare en liten til moderat forbedring av utvinning ble observert, nødvendighetenav fremgangsmåten kan måtte bli testet når et nytt peptid blir analysert. Videre tillater den RAPID metode for påvisning av den korrekte molekylære form som vist for acyl ghrelin og også øker betydelig utbyttet av endogene sirkulerende nivåer av peptider slik som kisspeptin sammenlignet med standard blodbearbeidelses. Derfor bør denne metoden være et nyttig verktøy i studier på mennesker som vurderer sirkulerende peptid nivåer, f.eks. de som er involvert i reguleringen av sult og metthetsfølelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av den tyske Research Foundation STE 1765 / 3-1 (AS) og tyske departementet for utdanning og forskning 03IPT614A (CG). Vi takker Reinhard Lommel og Petra busse for deres utmerkede teknisk støtte samt Karin Johansson og Christina Hentzschel for hjelp med organisering og gjennomføring av antropometriske målinger
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Diprotin A | Peptides International, Louisville, KY, USA | IDP-4132 | |
| E-64-d | Peptides International, Louisville, KY, USA | IED-4321-v | |
| Antipain | Peptides International, Louisville, KY, USA | IAP-4062 | |
| Leupeptin | Peptides International, Louisville, KY, USA | ILP-4041 | |
| Chymostatin | Peptides International, Louisville, KY, USA | ICY-4063 | |
| Sep-Pak C18 cartridges | Waters Corporation, Milford, MA, USA | WAT051910 | 360 mg, 55-105 µm |
| Acyl-ghrelin | Millipore, Billerica, MA, USA | 9088-HK | Radioactive |
| GLP-1 | Millipore, Billerica, MA, USA | 9035-HK | Radioactive |
| Glucagon | Millipore, Billerica, MA, USA | 9030 | Radioactive |
| Insulin | Millipore, Billerica, MA, USA | 9011S | Radioactive |
| Leptin | Millipore, Billerica, MA, USA | 9081-HK | Radioactive |
| Kisspeptin-10 | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | T-048-56 | Radioactive |
| Nesfatin-1 | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | T-003-26 | Radioactive |
| PYY3-36 | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | T-059-02 | Radioactive |
| Somatostatin-28 | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | T-060-16 | Radioactive |
| ZORBAX Rapid Resolution HT SB-C18 column | Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA | 822700-902 | 2.1 mm x 50 mm, 1.8 µm |
| Agilent 1200 LC | Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA | HPLC, several components, therefore no single catalog number | |
| Kisspeptin RIA | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | # RK-048-56 | Radioactive |
| Total ghrelin RIA | Millipore, Billerica, MA, USA | # GHRT-89HK | Radioactive |
| Active ghrelin RIA | Millipore, Billerica, MA, USA | # GHRA-88HK | Radioactive |
| SigmaStat 3.1 | Systat Software, San Jose, CA, USA | online download |
References
- Finucane, M. M., et al. National, regional, and global trends in body-mass index since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 960 country-years and 9.1 million participants. Lancet. 377 (9765), 557-567 (2011).
- James, W. P. The epidemiology of obesity: the size of the problem. J Intern Med. 263 (4), 336-352 (2008).
- Stengel, A., Taché, Y. Gastric peptides and their regulation of hunger and satiety. Curr Gastroenterol Rep. 14 (6), 480-488 (2012).
- Hussain, S. S., Bloom, S. R. The regulation of food intake by the gut-brain axis: implications for obesity. Int J Obes (Lond). 37 (5), 625-633 (2013).
- Hosoda, H., et al. Optimum collection and storage conditions for ghrelin measurements: octanoyl modification of ghrelin is rapidly hydrolyzed to desacyl ghrelin in blood samples). Clin Chem. 50 (6), 1077-1080 (2004).
- Stengel, A., et al. The RAPID method for blood processing yields new insight in plasma concentrations and molecular forms of circulating gut peptides. Endocrinology. 150 (11), 5113-5118 (2009).
- Stengel, A., et al. Lipopolysaccharide differentially decreases plasma acyl and desacyl ghrelin levels in rats: Potential role of the circulating ghrelin-acylating enzyme GOAT. Peptides. 31 (9), 1689-1696 (2010).
- Stengel, A., et al. Cold ambient temperature reverses abdominal surgery-induced delayed gastric emptying and decreased plasma ghrelin levels in rats. Peptides. 31, 2229-2235 (2010).
- Stengel, A., et al. Central administration of pan-somatostatin agonist ODT8-SST prevents abdominal surgery-induced inhibition of circulating ghrelin, food intake and gastric emptying in rats. Neurogastroenterol Motil. 23 (7), e294-e308 (2011).
- Stengel, A., et al. Abdominal surgery inhibits circulating acyl ghrelin and ghrelin-O-acyltransferase levels in rats: role of the somatostatin receptor subtype 2. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 301, G239-G248 (2011).
- Wang, L., et al. Intravenous injection of urocortin 1 induces a CRF2 mediated increase in circulating ghrelin and glucose levels through distinct mechanisms in rats. Peptides. 39, 164-170 (2013).
- Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Wang, L., Taché, Y. Orexigenic response to tail pinch: role of brain NPY(1) and corticotropin releasing factor receptors. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 306 (3), R164-R174 (2014).
- Goebel, M., Stengel, A., Wang, L., Reeve, J., Taché, Y. Lipopolysaccharide increases plasma levels of corticotropin-releasing hormone in rats. Neuroendocrinology. 93 (3), 165-173 (2011).
- Banfi, G., Salvagno, G. L., Lippi, G. The role of ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) as in vitro anticoagulant for diagnostic purposes. Clin Chem Lab Med. 45 (5), 565-576 (2007).
- Stengel, A., Wang, L., Goebel-Stengel, M., Taché, Y. Centrally injected kisspeptin reduces food intake by increasing meal intervals in mice. Neuroreport. 22 (5), 253-257 (2011).
- De Bond, J. A., Smith, J. T. Kisspeptin and energy balance in reproduction. Reproduction. 147 (3), R53-R63 (2014).
- Wren, A. M., et al. Ghrelin enhances appetite and increases food intake in humans. J Clin Endocrinol Metab. 86 (12), 5992 (2001).
- Schulman, J. L., Carleton, J. L., Whitney, G., Whitehorn, J. C. Effect of glucagon on food intake and body weight in man. J Appl Physiol. 11 (3), 419-421 (1957).
- Steinert, R. E., Poller, B., Castelli, M. C., Drewe, J., Beglinger, C. Oral administration of glucagon-like peptide 1 or peptide YY 3-36 affects food intake in healthy male subjects. Am J Clin Nutr. 92 (4), 810-817 (2010).
- Dewan, S., et al. Effects of insulin-induced hypoglycaemia on energy intake and food choice at a subsequent test meal. Diabetes Metab Res Rev. 20 (5), 405-410 (2004).
- Schlogl, M., et al. Increased 24-hour ad libitum food intake is associated with lower plasma irisin concentrations the following morning in adult humans. Appetite. 90, 154-159 (2015).
- Heymsfield, S. B., et al. Recombinant leptin for weight loss in obese and lean adults: a randomized, controlled, dose-escalation trial. JAMA. 282 (16), 1568-1575 (1999).
- Shimizu, H., et al. Peripheral administration of nesfatin-1 reduces food intake in mice: the leptin-independent mechanism. Endocrinology. 150, 662-671 (2009).
- Batterham, R. L., et al. Inhibition of food intake in obese subjects by peptide YY3-36. N Engl J Med. 349 (10), 941-948 (2003).
- Shibasaki, T., et al. Antagonistic effect of somatostatin on corticotropin-releasing factor-induced anorexia in the rat. Life Sci. 42 (3), 329-334 (1988).
- Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Taché, Y., Reeve, J. R. Jr The importance of using the optimal plasticware and glassware in studies involving peptides. Anal Biochem. 414 (1), 38-46 (2011).
- Smets, E. M., et al. Decreased plasma levels of metastin in early pregnancy are associated with small for gestational age neonates. Prenat Diagn. 28 (4), 299-303 (2008).
- Kojima, M., et al. Ghrelin is a growth-hormone-releasing acylated peptide from stomach. Nature. 402 (6762), 656-660 (1999).
- Stengel, A., Yin Taché, Y., Yang, the Gastric X/A-like Cell as Possible Dual Regulator of Food Intake. J Neurogastroenterol Motil. 18 (2), 138-149 (2012).
- Inhoff, T., et al. Desacyl ghrelin inhibits the orexigenic effect of peripherally injected ghrelin in rats. Peptides. 29, 2159-2168 (2008).
- Hirayama, H., et al. Contrasting effects of ghrelin and des-acyl ghrelin on the lumbo-sacral defecation center and regulation of colorectal motility in rats. Neurogastroenterol Motil. 22 (10), 1124-1131 (2011).
- Horikoshi, Y., et al. Dramatic elevation of plasma metastin concentrations in human pregnancy: metastin as a novel placenta-derived hormone in humans. J Clin Endocrinol Metab. 88 (2), 914-919 (2003).
- Yang, Y. U., Xiong, X. Y., Yang, L. I., Xie, L., Huang, H. Testing of kisspeptin levels in girls with idiopathic central precocious puberty and its significance. Exp Ther Med. 9 (6), 2369-2373 (2015).
- Hosoda, H., Kojima, M., Matsuo, H., Kangawa, K. Ghrelin and des-acyl ghrelin: two major forms of rat ghrelin peptide in gastrointestinal tissue. Biochem Biophys Res Commun. 279 (3), 909-913 (2000).
- Raff, H. Total and active ghrelin in developing rats during hypoxia. Endocrine. 21 (2), 159-161 (2003).
- Evans, M. J., Livesey, J. H., Ellis, M. J., Yandle, T. G. Effect of anticoagulants and storage temperatures on stability of plasma and serum hormones. Clin Biochem. 34 (2), 107-112 (2001).
- Nabuchi, Y., Fujiwara, E., Kuboniwa, H., Asoh, Y., Ushio, H. The stability and degradation pathway of recombinant human parathyroid hormone: deamidation of asparaginyl residue and peptide bond cleavage at aspartyl and asparaginyl residues. Pharm Res. 14 (12), 1685-1690 (1997).
- White, A., Handler, P., Smith, E. L. Principles of Biochemistry. , 5th ed, McGraw-Hill Book Co. New York. (1973).
