Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Kan işleme için hızlı bir yöntem insan kanı plazma peptid düzeylerinin veriminin arttırılması için

Published: April 28, 2016 doi: 10.3791/53959
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1, 3, 3, 1, 1, 1
1Charité Center for Internal Medicine and Dermatology, Division General Internal and Psychosomatic Medicine, Charité Universitätsmedizin Berlin, Campus Benjamin Franklin, 2Department of Internal Medicine, Institute of Neurogastroenterology and Motility, Martin-Luther Hospital, Academic Teaching Institution of Charité Universitätsmedizin Berlin, 3Department of Hepatology and Gastroenterology, Molecular Cancer Research Center (MKFZ), Campus Virchow-Klinikum, Charité-Universitätsmedizin Berlin

Summary

Hızlı kan işleme yöntemi, insanlarda kullanılan ve daha yüksek peptit seviyelerini veren ve doğru moleküler biçiminin değerlendirilmesi için sağlar edilebilir. Bu nedenle, bu yöntem peptid araştırmalarında değerli bir araç olacaktır.

Abstract

gıda alımı düzenleme alanındaki araştırmalar önem kazanmaktadır. Bu genellikle gıda alımını düzenleyen peptidlerin ölçümü yapılacaktır. Bir peptidin konsantrasyonu, doğru belirlenmesi için, kan işleme sırasında dayanıklı olması gerekir. Bununla birlikte, bu hızla endojen peptidazlar tarafından parçalanan çok peptidler için durum böyle değildir. Son zamanlarda, biz Ar educed sıcaklıkları, Bir cidification kullanan bir kan işleme yöntem geliştirdi, P eksojen kontrolleri ve sıçanlarda kullanmak için D ilution (HIZLI) sotopic, inhibisyon rotease. Burada, insanlarda kullanım için, bu teknik tesis ve kurtarma, moleküler form ve gıda alımı, düzenleyici hormon dolaşımdaki konsantrasyonunu araştırdık. Hızlı yöntem önemli ölçüde 125l-etiketli somatostatin-28 (+% 39), glukagon benzeri peptit-1 (+% 35) için kurtarma, asil ghrelin ve glukagon (+% 32), insülin ve Kisspeptin (+% 29 geliştirilmiş ), nesfatin-1 (+% 28), leptin(+% 21) ve standart işleme (buz üzerinde EDTA kan, p <0.001) peptid YY 3-36 (+% 19). Standart işlemden sonra asil ghrelin% ​​62 olasılıkla desasil ghrelin temsil önceki bir tepe elde bozulmuş ise yüksek performanslı sıvı kromatografisi, hızlı işlenmesi sonra istenen pozisyonda endojen asil grelin elüsyon göstermiştir. Standart işleme (p = 0.03) Aşağıdaki 1:23 ile karşılaştırıldığında 3: HIZLI işlendikten sonra normal kilolu bireylerde kandaki asil / desasil ghrelin oranı 1 oldu. Ayrıca endojen Kisspeptin seviyeleri standart işleme kıyasla, hızlı sonrası daha yüksek (+% 99, p = 0.02). Hızlı kan işleme yöntemi insanlarda kullanılabilir yüksek peptid seviyeleri verir ve doğru moleküler biçiminin değerlendirilmesi için izin verir.

Introduction

Obezitenin 1,2 dünya çapında giderek yaygınlaşması ışığında, gıda alımı düzenleme alanında araştırma önem kazanmaktadır. Şimdiye kadar sadece bir peptit periferik üretilen bilinmektedir ve merkezi geçmiş yıl içinde, gıda alımını, yani ghrelin 3 uyarmak için hareket ederken, peptidler geniş bir yelpazede, örneğin, gıda alımını azalttığı tespit edilmiştir. Leptin, peptid YY (PYY) ve glukagon-benzeri peptit-1 (GLP-1) ve insülin 4 Bu nedenle, açlık ve tokluk peptit seviyelerinin düzenleyici mekanizmaların araştıran çalışmalarda genellikle değerlendirilir, aynı zamanda, kabul edilir çalışılan peptid stabil ve plazma oluşumu sırasında, yüksek verimlerle geri alınacak. Eg önce gösterildiği gibi Ancak, çok sık bu durum hızlı endojen arıza durum böyle değil. ghrelin 5 desasil için asil, parçalanır ghrelin. Bu nedenle, son zamanlarda kan işlenme HIZLI yöntemi tarifR educed sıcaklıkları, bir cidification kullanılarak sıçanlarda şarkı, P dışsal kontrol ve D ilution 6 sotopic inhibisyonu rotease. Bu yöntem, 11 12 peptidlerinin test edilmiş ve (buz üzerinde EDTA kan) standart kan işleme göre doğru dolaşan moleküler biçimde belirlenmesi için izin verilen 6 iyileşme gösterilmektedir. Bu yöntem, kortikotropin salıveren faktör 13 gibi grelin sirküle saptanması için sonraki birçok araştırmada 7-12 kullanılmıştır. Bu nedenle, yöntem, kemirgenlerde peptid araştırma için yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Kemirgen çalışmaları başka türden her zaman çevrilebilir değildir Bununla birlikte, yöntem, aynı zamanda, insan kanında kullanım için oluşturulmalıdır.

Bu çalışmanın amacı, yaygın 14 ve sık sık u tavsiye edilir standart kan işleme, buz üzerinde EDTA kan ile karşılaştırıldığında insanlarda kan işleme HIZLI yöntemi test etmek olduKlinik yanı sıra araştırma ortamında sed. Son zamanlarda, aşağıdaki işleme (gıda alımı üzerine etkileri Tablo 1'de gösterilmiştir) düzenlenmesi besleme bir rol oynadığı düşünülmektedir oluşturulan peptidler ve yeni aday dahil olmak üzere gıda alımının düzenlenmesi yer 125I-işaretli peptidlerin seçimi kurtarma test Her iki yöntem ile. Hormonlar, farklı uzunluk ve şarj (Tablo 2) peptidleri temsil eden seçilmiştir. Ayrıca, ghrelin için biz standart ve HIZLI metodu izleyerek moleküler formu (ler) araştırıldı. Son olarak, endojen grelin (asil ve desasil grelin) yanı sıra Kisspeptin seviyeleri, aynı zamanda en son HIZLI ya da standart işlem, aşağıdaki yiyecek alımı 15,16 düzenlenmesinde önemli bir rol oynadığı düşünülmektedir bir peptit değerlendirildi. Buna ek olarak, biz de possib incelemek için (10,2-67,6 kg arasında değişen / m 2) vücut kitle indeksi geniş bir yelpazede konular nüfusu bu peptid seviyeleri incelendiKronik değişmiş vücut ağırlığına bağlı le farklar.

tablo 1

Tablo 2

Tanı, Değerlendirme ve Plan:
Çalışmaya katılanlar
Tüm çalışma katılımcıları yeni Charité-Universitätsmedizin Berlin Psikosomatik Tıp Bölümü (içerme hastaneye yatış iki gün içinde oldu) hastaları hastaneye ve yazılı bilgilendirilmiş onam alındı. cinsiyet herhangi bir etkisi yalnızca kadın hasta dahil edildi önlemek için. 42 denek toplam Çalışmaya katılan ve üç gruba ayrıldı: normal kilolu (BMI 18,5-25 kg / m2, n = 12), anoreksiya nervoza (VKİ <17.5 kg / m2, n = 15) ve obezite (BMI> 30 kg / m2, n = 15). Anoreksik ve obez hastalar vardıHastalıkların-10 Uluslararası Sınıflandırması göre tanı ve sırasıyla kilo (anoreksiya nervoza) ya da kilo (obezite), hastanede. Tüm normal kilolu hastalar nedeniyle ilgili somatik bozukluklar olmadan somatoform belirtiler münhasıran hastaneye kaldırıldı. Gastrointestinal somatoform belirti veya gastrointestinal cerrahi öyküsü olan hastalar çalışma dışı bırakıldı. Dışlama kriterleri de bir yaş <18 yıl, mevcut gebeliği ve işlenmemiş psikotik hastalıklar kapsıyor. Kan toplama artırmak veya sırasıyla, vücut ağırlığını azaltmak için diyet tedavisi almadan önce hastaneye yat gün sonra 2 veya 3 gerçekleştirildi. Antropometrik parametreler aynı gün değerlendirildi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

protokolü (/ 114/10 protokol numarası EA1) insan araştırma için yerel etik kurul tarafından onaylandı.

1. Kan İşleme

  1. Standart prosedür veya HIZLI yönteme göre bir önkol ven ve süreç gecede hızlı bir sonra 07:00 ile 08:00 saatleri arasında venöz kan toplayın. Kan çekilmeden önce egzersiz veya duman değil konuları söyleyin.
  2. Standart işlem için, 4 ° C'de 10 dakika boyunca 3000 x g'de 10 dakika içinde soğutulmuş EDTA içeren tüplere kan ve santrifüj toplar. Süpernatant toplayın ve radioimmunoassay ile daha sonra işlenene kadar -80 ° C tutun.
  3. HIZLI işlem için, hemen kan seyreltilmiş buz soğukluğundaki tampon içinde 1:10 (pH 3.6) 0.1 M amonyum asetat, 0.5 M NaCI ihtiva eden ve enzim inhibitörleri (kan çekilmesinden sonra 1 dakika içinde) (diprotin A, E-64-D, antipain , löpeptin, kimostatin, 1 ug / ml). Daha sonra, 4 ° C'de 10 dakika boyunca 3000 x g'de 10 dakika içinde santrifüj ve supernatant bize toplamaksıçanlarda 6 önce ayrıntılı olarak polipropilen tüpler bir pipet ing.
    1. % 100 asetonitril (hızı 10 mL / dakika) ile şarj kromatografisi kartuş (360 mg, 55-105 um), 1 ml'lik sabit bir hızda süpernatan ile% 0.1 trifloroasetat (TFA, kuru, 10 ml / dakika) ve yük dengelenmesi / bir şırınga pompası kullanılarak dak.
    2. Daha sonra, 3 ml% 0.1 TFA ile birlikte kartuş (hızı 10 mL / dakika) ile yıkayın ve yavaş yavaş% 0.1 TFA (2 mL / dakika) ihtiva eden 2 mL% 70 asetonitril ile elüte.
    3. radyoimmünoanaliz ile daha sonra işlenene kadar -80 ° C'de vakum santrifüj ve deposunu kullanan kuru elüt örnekler.
      NOT: Polipropilen (HIZLI işleme) ve borosilikat (radioimmunoassay) bağlanma özelliklerini önemli ölçüde daha düşük bir yüzey sergiler ve böylece 26 önce çalışılan peptidlerin çoğu için peptid kaybını minimize tüplerde tüm adımları yürütün.

2. Ölçümler

NOT: Bu bölümdeki adımlar bir laboratuvarda yapılmalıdırradyoaktif malzeme ile çalışmak için onaylanmıştır. Ben alınmalıdır 125 ile çalışmak için standart önlemler.

  1. Radyo-işaretli peptidlerin geri kazanımı
    1. 125I-radyoetiketlenmiş insan peptidleri elde edilir (örn., Asil-grelin, GLP-1, glukagon, insülin, Kisspeptin, leptin, nesfatin-1 PYY 3-36 ve somatostatin-28).
    2. daha sonra, taze,% 0.1 asetik asit ile sulandırıldı, deney kadar toz formunda peptidler saklayın (~ ml başına 100,000 cpm).
    3. standart kan işleme için, tüpler, 3.000-6.000 cpm radyo-50 ul bir tüp içine transferi 1 ml kan içeren soğutulmuş EDTA, kan çekilmesi hemen sonra (doğrudan sayılır deney başlamadan önce).
    4. HIZLI işlem için, 9 mL HIZLI tampon içeren bir tüp içine kan EDTA içeren transfer 1 ml kan (bileşimin 1.3) ve 500 ul radyo-30,000-60,000 cpm. radiolabe nedeniyle 01:10 seyreltme kullanımı 10 kat daha hacimliHIZLI işleme l.
    5. Daha sonra, işlem örnekleri olarak aşama 1.3.2 1.2 tarif edilmiştir.
    6. kurtarma deneyler için, vakum santrifüj yoluyla değil kuru örnekler yapmak ve -80 ° C'de muhafaza etmeyin. Bunun yerine, doğrudan daha sonra bir gama sayacı kullanılarak radyoaktif işaretli peptidlerin kurtarma değerlendirmek.
    7. RAPID örneklerin kullanılan radyo-miktarının karşılaştırılabilirliğini elde etmek için toplam hacminin 1/10 analiz ederken, standart örneklerde tüm süpernatant ölçün. ölçümü için, gama sayacı içine uydurma tüplerde süpernatant aktarmak ve dakika başına sayıları değerlendirmek
    8. % 100 standart olarak, işleme tabi olmayan 125l-radyo işaretli peptid, 50 ul iki örnek kullanın. 2.1.7 tarif edildiği gibi, diğer örnekleri ile aynı anda ölçülür.
    9. Her peptid için deneyini beş altı kez yapın.
  2. Radyoaktif Ghrelin'in Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi
    1. c kan çekiniztüpler ve (deney başlamadan önce direkt olarak sayılır) 15.000-20.000 cpm içeren 200 ul radyoaktif işaretli-açil ghrelin içeren tüplere transfer 1 ml içeren tepeli EDTA.
    2. HIZLI işlem için, 9 mL HIZLI tampon içeren bir tüp içine transferi 1 ml kan (bileşimin 1.3) ve 200 ul radyo-etiketli asil grelin 15.000-20.000 cpm.
    3. Daha sonra, işlem örnekleri olarak aşama 1.3.2 1.2 tarif edilmiştir.
    4. ters fazlı HPLC ile daha fazla analiz için su içinde doğrudan% 17 asetonitril içinde dengelenmiş bir stabil bir bağ C18 kolonu (50 mm x 2.1 mm, 1.8 um) (her ikisi de% 0.1 TFA ile takviye edilmiş) üzerinde numunelerin yük.
    5. 5 dakika dengelenmesinden sonra, (1 ml / dakika akış oranı) 40 dakika içinde örnek elüt edilmesi için 17-40% asetonitril gradyanı kullanın.
    6. 1 ml her dakika fraksiyonlarını toplamak ve bir gama sayacı kullanılarak radyoaktivite analiz.
    7. Ayrı bir deneyde, yükleme 200 ul radyo-etiketli asil grelin 15.000-20.000 ihtiva edenkopyaya doğrudan kolona ve adım 2.2.6 ile 2.2.4 açıklandığı gibi HPLC gerçekleştirin.
  3. Radioimmunoassay
    1. radyoimüno için, dondurulmuş üst fazlar (standart işleme) çözülmesi ve oda sıcaklığında kurutulur tozu (hızlı yöntem) vakum.
    2. Hemen önce radyoimmunoasay plazmanın (500 ul) orijinal hacmine göre çift distile H2O kuru HIZLI örnekleri yeniden askıya.
    3. Üreticinin protokollerine göre, ticari radyo immün analizleri kullanılarak 12,27 daha önce açıklandığı gibi Kisspeptin toplam (desasil ve açil ghrelin hem de dahil) yanı sıra, asil ghrelin değerlendirin. istikrarlı pelet oluşumuna izin borosilikat tüpler kullanın.
      1. Birinci gün, 24 saat bir süre için, üretici tarafından sağlanan seyreltme tahlil tampon maddesi ve birincil antikor (ör., Anti-grelin) numuneler kuluçkalayın.
      2. Günde iki, vo 125 I izleyici (örneğin 125 I-grelin) ekleyinrtex ve 24 saatlik bir süre için inkübe edilir.
      3. üçüncü günde, çökeltme reaktif, vorteks eklemek ve üretici tarafından tavsiye edildiği gibi kuluçkaya yatmaktadır. Sonra, santrifüj tüpleri 4 ° C'de 20 dakika boyunca 3000 x g'de. Süpernatantlar çıkarın ve bir gama sayacı kullanılarak topaklar radyoaktivite sayımı
    4. toplam eksi asil ghrelin fark olarak desasil ghrelin hesaplayın. her bir örnek için desasil ghrelin tarafından asil bölerek asil / desasil ghrelin oranını değerlendirmek.
    5. Tüm örnekler Süreç - eğer mümkünse - bir toplu arası tahlil değişkenliği önlemek için. Bu deneyde test içi değişkenliği Kisspeptin için <% 8, <toplam% 7 ve açil Grelin <% 9 idi.

3. İstatistiksel Analiz

  1. Kolmogorov-Smirnov testi ile verilerin dağılımını belirlemek. ortalamanın ortalama ± standart hata (SEM) gibi verileri ifade eder.
  2. İki arasındaki farkları değerlendirmekt-testi ile grupları. Holm-Sidak yöntemiyle takip tüm çift-bilge çoklu karşılaştırma prosedürleri (Tukey post hoc testi) veya iki yönlü ANOVA ile çoklu gruplar arasındaki farklılıkları değerlendirmek.
  3. Önemli p <0.05 düşünün ve bir istatistik programı kullanılarak analiz gerçekleştirin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

HIZLI kan işleme standart kan işleme göre insan kanında 125 I-radyoetiketli peptidlerin verimini artırır.
Standart kan işleme (buz üzerinde EDTA kan) sonra, radyo-etiketli peptidleri ve geri (- K 48-68%, Şekil 1A arasında) 9/9 peptitlerde ~% 60 idi. Hızlı işlem, yani somatostatin-28, 125-etiketli peptidde (+% 39, Şekil 1A) elde geliştirilmiş, glukagon benzeri peptid-1 (+% 35, Şekil 1B), asil grelin (n-oktanoil grelin, +% 32, Şekil 1C), glukagon (+% 32, Şekil 1B), insülin (+% 29, Şekil 1 E), Kisspeptin (+% 29, Şekil 1F), nesfatin-1 (+% 28, Şekil 1G), standart işleme (p kıyasla leptin (+% 21, Şekil 1H) ve peptid YY 3-36 (+% 19, Şekil 1K) <0.001). Bu 9 peptidler olarak, hızlı yöntem sonrası iyileşme (- K 71-98%, Şekil 1A arasında) ~% 90 olmuştur.

Şekil 1
Şekil 1:. Standard veya hızlı kan işleme radyoaktiviteyle işaretlenmiş bir peptid, aşağıdaki insan kanı 125I-işaretli peptidlerin geri kazanımı Standart prosedür (buz üzerinde EDTA kan) veya hızlı bir yöntem (düşük sıcaklıklarda, asitleştirme, proteaz göre insan kanı ilave edildi ve işlenmiştir engelleme, izotopik dışsal kontroller ve seyreltme). süpernatantlar toplanmış ve radyoaktivite için sayıldı. Her sütun, beş altı deneylerin ortalama ± SEM temsil eder. *** P <0.001 vs standart işleme. Tıklayınız vie içinBu rakamın wa daha büyük bir versiyonu.

Beklenen Pozisyon olarak HIZLI İşleme, Ghrelin elutes ardından.
Standart işlemden sonra, bir önceki en yüksek grelin (Şekil 2) karşılık gelen desasil muhtemelen gözlenirken insan kanı hızlı işleme sonra 125I-işaretli grelin beklenen pozisyonunda yıkandı. Bu peptidin% 62 bozulma temsil etmektedir.

şekil 2
Şekil 2:. 125I-işaretli asil Ghrelin çıkış profili İnsan Kanı standart ya da hızlı kan işleme radyoaktiviteyle işaretlenmiş bir peptid, aşağıdaki standart prosedüre veya hızlı yönteme uygun olarak, kan ilave edildi ve işlenmiştir. Daha sonra, üst faz, yüksek performanslı sıvı kromatografi kolonuna yüklenmiştir. eluat sütun olduHer dakika seçildi ve radyoaktivite bakımından sayıma. Standart sonra daha önce akıtılan büyük bir bölümünü işlenirken HIZLI işlendikten sonra, beklenen zamanda ayrıştırılmıştır peptid çoğu büyük olasılıkla desasil ghrelin temsil eder. Kısaltma:. Cpm, dakika başına sayım bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

HIZLI Kan İşleme Standardı İşleme karşılaştırıldığında Asil / desasil Ghrelin Oranı ve Artan Endojen Kisspeptin Kan Düzeyleri Sonuçları geliştirir.
Kan standart veya HIZLI prosedüre göre anoreksik, normal kilolu ve obez kişilerde çekilmiş ve işlendi. Endojen grelin (toplam ve asil grelin) radyoimünotahlili ile değerlendirildi. Antropometrik ve komorbiditeleri / çalışma gruplarının ilaç Tablo 3 ve 4'te gösterilmiştir. HIZLI işlendikten sonra normal kilolu deneklerin kanında asil / desasil grelin oranı 1: 3 standart kan işleme (p = 0.03; Şekil 3A), aşağıdaki 1:23 ile karşılaştırıldığında. (: V 3 01:13; p = 0.04; Şekil 3A, 1). (3 vs 1:19, p <0.001 1) ve şişman koşullar benzer sonuçlar anoreksik altında gözlendi. Herhangi bir farklılık, standart ya da hızlı işlem (Şekil 3A) için üç farklı grup arasında gözlenmiştir. Vücut ağırlığı / metabolik durum hiçbir etkisi varken iki yönlü ANOVA, işleme yönteminin etkilemeli bir Tespit edilen önemli (F 1,64 = 15.3, p <0.001) belirtilen (F 2,64 = 0.5, p = 0.62).

Tablo 3

tp_upload / 53959 / 53959table4.jpg "/>

Fark (obezite koşullarda anlamlı değildi iken dolaşan endojen Kisspeptin düzeyleri anlamlı derecede yüksek anoreksik standart işlem (+% 60, p = 0.02) ve normal kilolu kişilerde (+% 99, p = 0.02) ile karşılaştırıldığında HIZLI şunlardı % 23, p = 0.39; Şekil 3B). Anlamlı bir fark üç farklı VKİ grupları arasında gözlenmiştir (p> 0.05; Şekil 3B). Vücut ağırlığı / metabolik durum hiçbir etkisi varken iki yönlü ANOVA, (F 2,74 = 0.5, p = 0.60) işleme yönteminin etkilemeli bir Tespit edilen önemli (F 1,74 = 10.8, p = 0.002) gösterdi.

Şekil 3, Şekil 3: Açil / desasil Ghrelin Oranı Sirkülasyon ve aşağıdaki Farklı Metabolik Koşullarında Kisspeptin Düzeyleri Sirkülasyon HIZLI veya Standart Kan İşleme Kan standart bir prosedür ya da HIZLI yönteme göre bir gece aç kaldıktan sonra anoreksik, normal kilolu veya obez kişilerde çekilmiş ve işlendi.. Süpernatan toplandı ve asil ve toplam ghrelin düzeyleri ya Kisspeptin düzeyleri (B), radyoimmünoanaliz ile değerlendirildi. Desasil grelin toplam ghrelin gelen asil çıkartılmasıyla elde edilmiştir. Oranı desasil grelin (A) asil bölünmesi ile elde edilmiştir. Grup boyutu sütun alt gösterilir. Veriler ortalama ± SEM olarak ifade edilmiştir. * P <0.05, ** p <v 0.01 ve *** p <0.001. standart işleme. büyük halini görmek için tıklayınızbu figür.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kan işleme HIZLI yöntem sıçanlarda 6 standart kan işleme göre 11/12 peptidler için kurtarma geliştirilmiş bundan önce bildirmiştir. Bu çalışmada, bu yöntem, aynı zamanda, insanlarda kullanım için uygun olduğunu göstermiştir. HIZLI işleme ardından, test 9 125 9-etiketli peptidler için kurtarma standart kan işleme (buz üzerinde EDTA kan) göre geliştirilmiştir. gözlemlenen gelişme, özellikle peptid verimi düşük olduğunda maskelenebilir olabilecek tek ince farklar beklenen koşullar altında ilgili olması muhtemeldir 19-39% arasında değişmektedir.

Biz de göstermiştir ki HIZLI kan işleme ghrelin standart kan işlendikten sonra 2/3 ghrelin desasil için bozulmuş olsa da, doğru moleküler formu (asil ghrelin) gösteren HPLC sonra doğru ayrıştırma pozisyonda tespit edildikten sonra. Asil grubu D, grelin reseptörü 28'e bağlanma için gerekli olduğuE-asilasyon ölçüde peptidin biyolojik fonksiyonunu değiştirmesi beklenmektedir. Bununla birlikte, desasil grelin artan biyolojik açıdan aktif bir peptit 29 olarak kabul edilmektedir. İlginçtir, desasil ghrelin gıda alımı 30 ya da kolon motilitesi 31 için daha önce gösterildiği gibi ghrelin etkilerini ortadan kaldırmak için önerilmiştir. Bu daha doğru moleküler formu soruşturma önemini vurgulamaktadır.

normal kilolu bireylerde Kisspeptin endojen seviyelerini okuyan, biz standart kan işleme göre RAPID aşağıdaki ölçüde yüksek düzeyde (+% 99) gösterdi. Bununla birlikte, herhangi bir gelişme genel bir artış Kisspeptin seviyeleri nedeniyle olabilir obezite koşulları altında gözlendi (v obez +% 50. Normal ağırlık). nedeni olabilir, anlamlı bir fark gözlenmemiştir yöntemle biriyle işlenmiş kanda BMI gruplarına (anoreksiya nervoza, normal kilolu ve obezite) arasındaki tek açlık düzeyleri wer oE değerlendirildi. Farklılıklar belirgin postprandiyal dönemde, gelecekteki çalışmalarda araştırılmalıdır bir hipotez olabilir.

Kisspeptin veya proteaz önleyicileri 33 eklenerek (standart işleme de ifade bu çalışmada) buz 32 sadece EDTA tüpleri kullanılarak çalışmalar önce ölçülmüştür. Bu çalışmaya göre tüplerin soğutma peptid bozulmasını önlemek için yeterli değildir. Tek başına asitlenme veya tek proteaz inhibitörleri Kisspeptin korumak için yeterli olup olmadığını gelecekteki çalışmalarda araştırılmalıdır.

Benzer bir şekilde, hızlı işlenmesi de önemli ölçüde arttı asil / desasil grelin oranı ile gösterildiği gibi, endojen asil grelin verim artar (1: 3) standart kan işleme (1:23) ile karşılaştırıldığında. önce (standart işlendikten sonra 1:19 karşılaştırıldığında) HIZLI işleme aşağıdaki 5: 1 asil / desasil ghrelin oranını rapor nerede bu bulgunun kemirgen çalışmaları ile iyi uyumu gösterir.Daha önce bildirilen 1:55 34,35 ile 1:15 asil / desasil ghrelin oranının geniş aralıkları nedeniyle desasil ghrelin bir de-asilasyon bağımlı yüksek oranda nedenle büyük olasılıkla vardı. Kisspeptin için yukarıda tarif edildiği gibi, asil / desasil grelin oranı hiçbir değişiklik kronik değiştirilmiş vücut ağırlığı (vs. Obezite. Normal ağırlığına karşı anoreksiya nervoza) farklı koşullar altında gözlendi. Bu nedeniyle de asil / desasil ghrelin sadece açlık düzeyleri değerlendirildi ve tokluk düzenleme daha önemli olduğu gerçeğini olabilir. Diğer taraftan, bu, aynı zamanda, kronik değiştirilmiş vücut ağırlığına rağmen asil ve desasil grelin oranı bazal koşullar altında değişmez ve bu koşullar altında gözlenmiş olan adaptif değişikliklerin önemli bir rol oynamaz belirtir. Ancak, HIZLI yöntemi standart yemek protokollerini kullanarak ve uygulayarak gelecekte yapılacak çalışmalar daha da bu soruyu cevaplamak için yardımcı olacaktır.

HIZLI benimetod ile aşağıdaki bileşenleri kullanır: kimyasal reaksiyonlar çoğunlukla sıcaklığında 36 buz soğukluğundaki bir çözeltisi kullanılarak bir sıcaklık azalması dayandığından peptit bozunma yavaşlatır. Daha sonra, aynı zamanda, pH (asidifikasyon) bir azalma bozulma 37 hızını azaltır. Ayrıca, pH bir azalma diğer yüzeylere peptidlerin adsorpsiyonu azaltır ve bu nedenle, aynı zamanda peptid kaybı riskini azaltır. (. Örneğin katepsin B / S): Burada kullanılan proteaz inhibitörleri, geniş bir endojen peptidazlar spektrumunu kapsamak için seçilmiştir tiol proteazlar için bir inhibitörü olarak, dipeptidil peptidaz IV, E-64-D bir inhibitörü olarak diprotin A olarak antipain'e kimotripsin, papain ve katepsin B / G bir inhibitörü olarak tripsin, plazmin, papain ve katepsin ve kimostatin için bir inhibitör olarak löpeptin tripsin, papain ve katepsin A / B için bir inhibitörüdür. Ayrıca, izotopik peptidler yöntemle iyileşme iyileşme değerlendirmek için yararlıdır. Son olarak, oran o kadarf enzim-substrat kompleks oluşumu enzim (peptidaz) konsantrasyonuna bağlıdır ve alt-tabaka (peptid hormonu) plazma 38 seyreltme oluşum oranını azaltır ve bu nedenle, parçalanma (on kat inceltilmiş Michaelis hızına göre bir yüz azaltır -Menten kinetiği).

HIZLI yöntemin avantajlarına rağmen, yöntemin çeşitli sınırlamalar da kabul edilmelidir. Protokolün en kritik adım zamanıdır. Kan örnekleri hemen klinik ortamda zor olabilir kan çekilmesinden sonra HIZLI tamponu içinde seyreltilmiş edilmelidir. Ayrıca, yöntem, daha zaman alıcı, bir eğitim daha yüksek bir düzeyde gerektirir ve aynı zamanda standart kan işleme kıyasla daha pahalıdır. klinik rutin uygulamak zor olmasına rağmen, sadece küçük farklar beklenen özellikle araştırma amaçlı yararlı olacaktır ve bu nedenle, peptidin yüksek verimli bir tercih edilir.

HIZLI yöntem tarif ve tüm bileşenleri ile önerilmesine rağmen, mevcut kağıt (R educed sıcaklıklar, bir cidification, P eksojen kontrolleri ve D ilution sotopic, inhibisyon rotease), gelecekteki çalışmalar bu tekniğin değişiklikler kullanabilir. izotopik eksojen kontrollerin kullanımı zorunlu ve bu nedenle peptidler HIZLI işlem kullanarak kurtarma büyük ilerleme gösteriyor hangi değerlendirmek için pilot çalışmalar sınırlı olmayabilir. Diğer peptidler değerlendirilir Dahası, aynı zamanda proteaz inhibitör kokteyli bileşimi değiştirilebilir. Yeni peptid ölçülür, ancak bu test edilmelidir.

Özet olarak, kan işleme hızlı yöntem insan kanı için kullanılan ve büyük ölçüde standart kan işleme göre test 9/9 peptidlerin kurtarma geliştirilebilir. iyileşme orta derecede bir gelişme için sadece küçük bir peptit için de bu iki zorunluluk gözlenmiştiryöntem yeni bir peptid bakıldığında, test edilecek gerekebilir. asil Grelin gösterilen ve aynı zamanda önemli ölçüde standart kan işleme göre bu Kisspeptin gibi peptidlerin endojen dolaşımdaki seviyelerinin verim artar Dahası, hızlı yöntem doğru moleküler formun tespiti için verir. Bu nedenle, bu yöntem örneğin, peptid seviyeleri dolaşan değerlendiren insan çalışmalarında yararlı bir araç olmalıdır. açlık ve tokluk düzenlenmesinde rol olanlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Bu çalışma Eğitim ve Araştırma 03IPT614A (CG) Alman Araştırma Vakfı STE 1765 / 3-1 (AS) ve Alman Bakanlığı tarafından desteklenmiştir. Biz organizasyon ve antropometrik ölçümler yürütülmesi konusunda yardım için Reinhard Lommel ve Petra Busse mükemmel teknik destek yanı sıra Karin Johansson ve Christina Hentzschel teşekkür

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Diprotin A Peptides International, Louisville, KY, USA IDP-4132
E-64-d Peptides International, Louisville, KY, USA IED-4321-v
Antipain Peptides International, Louisville, KY, USA IAP-4062
Leupeptin Peptides International, Louisville, KY, USA ILP-4041
Chymostatin Peptides International, Louisville, KY, USA ICY-4063
Sep-Pak C18 cartridges Waters Corporation, Milford, MA, USA WAT051910 360 mg, 55-105 µm
Acyl-ghrelin Millipore, Billerica, MA, USA 9088-HK Radioactive
GLP-1 Millipore, Billerica, MA, USA 9035-HK Radioactive
Glucagon Millipore, Billerica, MA, USA 9030 Radioactive
Insulin Millipore, Billerica, MA, USA 9011S Radioactive
Leptin Millipore, Billerica, MA, USA 9081-HK Radioactive
Kisspeptin-10 Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA T-048-56 Radioactive
Nesfatin-1 Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA T-003-26 Radioactive
PYY3-36 Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA T-059-02  Radioactive
Somatostatin-28 Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA T-060-16  Radioactive
ZORBAX Rapid Resolution HT SB-C18 column Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA 822700-902 2.1 mm x 50 mm, 1.8 µm
Agilent 1200 LC  Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA HPLC, several components, therefore no single catalog number
Kisspeptin  RIA Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA # RK-048-56 Radioactive
Total ghrelin RIA Millipore, Billerica, MA, USA # GHRT-89HK  Radioactive
Active ghrelin RIA Millipore, Billerica, MA, USA # GHRA-88HK Radioactive
SigmaStat 3.1 Systat Software, San Jose, CA, USA online download

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Finucane, M. M., et al. National, regional, and global trends in body-mass index since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 960 country-years and 9.1 million participants. Lancet. 377 (9765), 557-567 (2011).
  2. James, W. P. The epidemiology of obesity: the size of the problem. J Intern Med. 263 (4), 336-352 (2008).
  3. Stengel, A., Taché, Y. Gastric peptides and their regulation of hunger and satiety. Curr Gastroenterol Rep. 14 (6), 480-488 (2012).
  4. Hussain, S. S., Bloom, S. R. The regulation of food intake by the gut-brain axis: implications for obesity. Int J Obes (Lond). 37 (5), 625-633 (2013).
  5. Hosoda, H., et al. Optimum collection and storage conditions for ghrelin measurements: octanoyl modification of ghrelin is rapidly hydrolyzed to desacyl ghrelin in blood samples). Clin Chem. 50 (6), 1077-1080 (2004).
  6. Stengel, A., et al. The RAPID method for blood processing yields new insight in plasma concentrations and molecular forms of circulating gut peptides. Endocrinology. 150 (11), 5113-5118 (2009).
  7. Stengel, A., et al. Lipopolysaccharide differentially decreases plasma acyl and desacyl ghrelin levels in rats: Potential role of the circulating ghrelin-acylating enzyme GOAT. Peptides. 31 (9), 1689-1696 (2010).
  8. Stengel, A., et al. Cold ambient temperature reverses abdominal surgery-induced delayed gastric emptying and decreased plasma ghrelin levels in rats. Peptides. 31, 2229-2235 (2010).
  9. Stengel, A., et al. Central administration of pan-somatostatin agonist ODT8-SST prevents abdominal surgery-induced inhibition of circulating ghrelin, food intake and gastric emptying in rats. Neurogastroenterol Motil. 23 (7), e294-e308 (2011).
  10. Stengel, A., et al. Abdominal surgery inhibits circulating acyl ghrelin and ghrelin-O-acyltransferase levels in rats: role of the somatostatin receptor subtype 2. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 301, G239-G248 (2011).
  11. Wang, L., et al. Intravenous injection of urocortin 1 induces a CRF2 mediated increase in circulating ghrelin and glucose levels through distinct mechanisms in rats. Peptides. 39, 164-170 (2013).
  12. Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Wang, L., Taché, Y. Orexigenic response to tail pinch: role of brain NPY(1) and corticotropin releasing factor receptors. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 306 (3), R164-R174 (2014).
  13. Goebel, M., Stengel, A., Wang, L., Reeve, J., Taché, Y. Lipopolysaccharide increases plasma levels of corticotropin-releasing hormone in rats. Neuroendocrinology. 93 (3), 165-173 (2011).
  14. Banfi, G., Salvagno, G. L., Lippi, G. The role of ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) as in vitro anticoagulant for diagnostic purposes. Clin Chem Lab Med. 45 (5), 565-576 (2007).
  15. Stengel, A., Wang, L., Goebel-Stengel, M., Taché, Y. Centrally injected kisspeptin reduces food intake by increasing meal intervals in mice. Neuroreport. 22 (5), 253-257 (2011).
  16. De Bond, J. A., Smith, J. T. Kisspeptin and energy balance in reproduction. Reproduction. 147 (3), R53-R63 (2014).
  17. Wren, A. M., et al. Ghrelin enhances appetite and increases food intake in humans. J Clin Endocrinol Metab. 86 (12), 5992 (2001).
  18. Schulman, J. L., Carleton, J. L., Whitney, G., Whitehorn, J. C. Effect of glucagon on food intake and body weight in man. J Appl Physiol. 11 (3), 419-421 (1957).
  19. Steinert, R. E., Poller, B., Castelli, M. C., Drewe, J., Beglinger, C. Oral administration of glucagon-like peptide 1 or peptide YY 3-36 affects food intake in healthy male subjects. Am J Clin Nutr. 92 (4), 810-817 (2010).
  20. Dewan, S., et al. Effects of insulin-induced hypoglycaemia on energy intake and food choice at a subsequent test meal. Diabetes Metab Res Rev. 20 (5), 405-410 (2004).
  21. Schlogl, M., et al. Increased 24-hour ad libitum food intake is associated with lower plasma irisin concentrations the following morning in adult humans. Appetite. 90, 154-159 (2015).
  22. Heymsfield, S. B., et al. Recombinant leptin for weight loss in obese and lean adults: a randomized, controlled, dose-escalation trial. JAMA. 282 (16), 1568-1575 (1999).
  23. Shimizu, H., et al. Peripheral administration of nesfatin-1 reduces food intake in mice: the leptin-independent mechanism. Endocrinology. 150, 662-671 (2009).
  24. Batterham, R. L., et al. Inhibition of food intake in obese subjects by peptide YY3-36. N Engl J Med. 349 (10), 941-948 (2003).
  25. Shibasaki, T., et al. Antagonistic effect of somatostatin on corticotropin-releasing factor-induced anorexia in the rat. Life Sci. 42 (3), 329-334 (1988).
  26. Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Taché, Y., Reeve, J. R. Jr The importance of using the optimal plasticware and glassware in studies involving peptides. Anal Biochem. 414 (1), 38-46 (2011).
  27. Smets, E. M., et al. Decreased plasma levels of metastin in early pregnancy are associated with small for gestational age neonates. Prenat Diagn. 28 (4), 299-303 (2008).
  28. Kojima, M., et al. Ghrelin is a growth-hormone-releasing acylated peptide from stomach. Nature. 402 (6762), 656-660 (1999).
  29. Stengel, A., Yin Taché, Y., Yang, the Gastric X/A-like Cell as Possible Dual Regulator of Food Intake. J Neurogastroenterol Motil. 18 (2), 138-149 (2012).
  30. Inhoff, T., et al. Desacyl ghrelin inhibits the orexigenic effect of peripherally injected ghrelin in rats. Peptides. 29, 2159-2168 (2008).
  31. Hirayama, H., et al. Contrasting effects of ghrelin and des-acyl ghrelin on the lumbo-sacral defecation center and regulation of colorectal motility in rats. Neurogastroenterol Motil. 22 (10), 1124-1131 (2011).
  32. Horikoshi, Y., et al. Dramatic elevation of plasma metastin concentrations in human pregnancy: metastin as a novel placenta-derived hormone in humans. J Clin Endocrinol Metab. 88 (2), 914-919 (2003).
  33. Yang, Y. U., Xiong, X. Y., Yang, L. I., Xie, L., Huang, H. Testing of kisspeptin levels in girls with idiopathic central precocious puberty and its significance. Exp Ther Med. 9 (6), 2369-2373 (2015).
  34. Hosoda, H., Kojima, M., Matsuo, H., Kangawa, K. Ghrelin and des-acyl ghrelin: two major forms of rat ghrelin peptide in gastrointestinal tissue. Biochem Biophys Res Commun. 279 (3), 909-913 (2000).
  35. Raff, H. Total and active ghrelin in developing rats during hypoxia. Endocrine. 21 (2), 159-161 (2003).
  36. Evans, M. J., Livesey, J. H., Ellis, M. J., Yandle, T. G. Effect of anticoagulants and storage temperatures on stability of plasma and serum hormones. Clin Biochem. 34 (2), 107-112 (2001).
  37. Nabuchi, Y., Fujiwara, E., Kuboniwa, H., Asoh, Y., Ushio, H. The stability and degradation pathway of recombinant human parathyroid hormone: deamidation of asparaginyl residue and peptide bond cleavage at aspartyl and asparaginyl residues. Pharm Res. 14 (12), 1685-1690 (1997).
  38. White, A., Handler, P., Smith, E. L. Principles of Biochemistry. , 5th ed, McGraw-Hill Book Co. New York. (1973).

Tags

İmmünoloji Sayı 110 iştahsızlık vücut kitle indeksi ghrelin hormon Kisspeptin obezite
Kan işleme için hızlı bir yöntem insan kanı plazma peptid düzeylerinin veriminin arttırılması için
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Teuffel, P., Goebel-Stengel, M.,… More

Teuffel, P., Goebel-Stengel, M., Hofmann, T., Prinz, P., Scharner, S., Körner, J. L., Grötzinger, C., Rose, M., Klapp, B. F., Stengel, A. A RAPID Method for Blood Processing to Increase the Yield of Plasma Peptide Levels in Human Blood. J. Vis. Exp. (110), e53959, doi:10.3791/53959 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter