Introduction
המורפוגנזה הוא תהליך שמעצב העובר ויחד עם הצמיחה וההתבדלות שמניע את ontogeny מביצית מופרית לאורגניזם רב-תאיים בוגרת. התהליכים המוךפו"גנטי שהולכים במהלך ההתפתחות של בעלי חיים יכולים להיות מנותחים על ידי מיטב הדמיה של שלמי חי דגימות 1-3. הסיבה לכך היא כי הדמיה העובר כולו כזה משמרת את כל המרכיבים שמניעים ולהסדיר פיתוח כולל הדרגתי של מולקולות איתות, מטריקס, כלי דם, עצבוב וכן תכונות מכאניות של הרקמות המקיפות אותם. כדי לגשר על המאזניים, שבה morphogenesis מתרחשת, אירועי subcellular מהר צריכים להיות בשבי בסולם זמן דק בהקשר של פיתוח של הרקמה כולה על שעות או ימים. כדי למלא את כל הדרישות הללו, יישום מודרני 4 של המיקרוסקופ תאורת מטוס המאונך 5 פותחתה. במקור, זה היה שמו מיקרוסקופיה תאורת מטוס סלקטיבי (SPIM) 4; עכשיו גיליון אור חובק-כל טווח מיקרוסקופ פלואורסצנטי (LSFM) משמש בדרך כלל. LSFM מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה זמן, תוך גרימת פחות phototoxicity מאשר סריקת לייזר או דיסק מסתובב מיקרוסקופים confocal 6,7. כיום, יש כבר יישומים רבים של עקרון תאורה וכו 'אור בסיסי זה כבר נעשה שימוש לתדמית מגוון גדול של דגימות ותהליכים נגישים קודם לכן לחוקרים 8-11.
ברצוננו הראשון כדי להדגיש כמה יתרונות מרכזיים של LSFM פני גישות מיקרוסקופיה confocal קונבנציונליות:
כדי לרכוש תוצאות משמעותיות מניסויים מיקרוסקופים הדמיה לחיות, חשוב כי ההשגחה בלבד מינימאלית משפיעה על הדגימה. עם זאת, אורגניזמים רבים, כולל דג הזברה הם רגישים מאוד כדי חשיפה לאור לייזר, מה שהופך אותו מאתגר לתדמית אותם מיקרוסקופ confocal עם רזולוציה גבוהה בזמן ללא phototoxicity EFfects כמו 6,7 פיתוח נתקע או מתעכב. LSFM היא כיום טכניקת דימות פלואורסצנטי עם השפעות הרסניות לפחות על מדגם 7. מאז גיליון אור הליזר הדק מאיר רק את החלק של הדגימה כי הוא צלם בנקודת זמן מסוימת, המיקרוסקופ גיליון האור באמצעות פוטונים ביעילות רבה. כתוצאה מכך, החשיפה באור הנמוכה מאפשרת תצפיות זמן לשגות יותר של דגימות בריאות, למשל 12-17. יתר על כן, הודות הפולשנות המינימאלי של LSFM, מספר תמונות שנרכשו כבר לא מוכתבים על ידי כמה אור המדגם יכול לסבול, אלא על ידי כמות נתונים יכול להיות מעובד ומאוחסן.
בנוסח הזהה של שמירה על הדגימה בתנאים פיסיולוגיים קרובים, LSFM מגיע עם אסטרטגיות הרכבת מדגם אלטרנטיבה גם מתאימות עובר לחיות. בטכניקות LSFM, את העוברים בדרך כלל מוטבעים בתוך טור דק של agarose אחוז הנמוך. מאונטיןg לגלילי agarose מאפשר חופש המוחלט של סיבוב, כך המדגם ניתן לצפות מן הזווית המושלמת (ב LSFM המכונה נוף) ומכמה נופים זמניים. ההדמיה המרובה התצוגות והאיחוי מרובה תצוגות הבאות מועילה במיוחד עבור גדולות, דגימות פיזור ומאפשרת לכידתם עם גבוהה, רזולוציה איזוטרופיים. סיכום של אסטרטגיות הרכבת LSFM אפשריות אחרות ניתן למצוא במדריך הפעלת מיקרוסקופ הרשמי, בפרק על הכנת מדגם שנכתבה על ידי המעבדה של E. ריינו. זוהי קריאה מומלצת, במיוחד אם המטרה היא מדגמים שונים תמונה ממתוארת כאן.
רכישת תמונת LSFM היא תחום רחב, מצלמה מבוססת, בניגוד מיקרוסקופ confocal סריקת ליזר. התוצאה היא אות גבוהה יחס רעש (SNR) עבור תמונות רכשו יכולה להיות מהיר מאוד (עשרות עד מאה פריימים לשניים). הרגישות הגבוהה של LSFM נוספת מאפשרת הדמיה של samp ניאון בחולשהles, כמו גורמי שעתוק לידי ביטוי ברמות אנדוגני 18 או, בעתיד הקרוב, חלבונים אנדוגניים מתויג באמצעות CRISPR / Cas9. ה- SNR גבוה כמו כן, חשוב לניתוח תמונה במורד מוצלח. המהירות הגבוהה נדרשת לא רק כדי ללכוד תהליכים מהירים תאיים, אלא גם כדי שזה יקלוט את העובר כולו מתצוגות מספר מספיק מהר. פיוז'ן חלק של התצוגות המרובות יושג רק, אם התופעה שנצפתה לא משנה במהלך רכישת ערימות z כמה אלה קרובים מתצוגות נפרדות.
היתרונות של LSFM לא באים בדרך כלל על חשבון איכות התמונה. ההחלטה לרוחב של LSFM היא קצת יותר גרועה מאשר הרזולוציה של מיקרוסקופ confocal. הסיבה לכך היא כי מטרות האיתור המשמשות LSFM יש צמצם מספרי נמוך (בדרך כלל 1.0 או פחות) לעומת 1.2-1.3 יעדי מים או טבילת סיליקון על setups confocal הסטנדרטי. בנוסף, בשל גילוי השדה הרחב LSFM (absence של חריר), יש יותר out-of-פוקוס אור לעומת מיקרוסקופ confocal. הכמות מחוץ מוקד האור נקבעה על ידי עובי גיליון האור. אף על פי כן, חסרונות אלה מפוצים על ידי יחס אות לרעש גבוה ב LSFM. בפועל, הדבר גורם תמונות באיכות דומות בהשוואה למשל ספינינג רכישת confocal דיסק 15. כתוצאה מכך, זה מאפשר מיצוי אמין של תכונות כמו קרום תא או גרעינים, למשל, עבור שושלת תא התחקות 15,19.
ההחלטה צירית של LSFM נקבע, בנוסף המטרה זיהוי, על ידי עובי גיליון אור. ההחלטה צירית של LSFM יכול במקרים מסוימים לעלות את הרזולוציה של מיקרוסקופים confocal. ראשית, השיפור ברזולוציה מגיע כשהידיעה האור היא רזה יותר הרזולוציה הצירית של מטרת האיתור, אשר מתרחשת בדרך כלל עבור דגימות גדולות צלמו עם מטרה בהגדלה נמוכה. הדרך השנייה, כיצד LSFM יכול ACHieve טוב יותר ברזולוציה צירית, הוא ההיתוך המרובה התצוגות, בו המידע ברזולוצית XY גבוהה מתצוגות שונות בשילוב לתוך ערימת תמונה אחת. מחסנית התמזגה וכתוצאה מכך יש ברזולוציית איזוטרופיים מתקרב ערכי רזולוציה בכיוון לרוחב 20,21. תוכנית המשחק של רישום תצוגות מרובות על זה לזה המתואר במאמר זה מבוססת על שימוש חרוזי פוליסטירן פלורסנט כסמנים האמונים מוטבע agarose סביב המדגם 20,21.
כתוצאה מסחור LSFM, טכניקה זו היא כעת לרשות קהילה רחבה של מדענים 22. לכן, המוטיבציה לכתיבת פרוטוקול זה היא להפוך את הטכנולוגיה הזו נגישה ביולוגים התפתחותיים חסר ניסיון מעשי LSFM וכדי לקבל מדענים אלה התחילו להשתמש בטכנולוגיה זו עם דגימות שלהם. הפרוטוקול שלנו משתמש מיקרוסקופ גיליון האור המסחרי, המהווה t במיקרוסקופ פשוט מושגיתכובע קל לתפעול. אנחנו גם רוצים להזכיר פרוטוקולים אחרונים אחרים הדמית דג זברה עם setups LSFM הבית בנוי, אשר עשוי להיות מתאים כדי לענות על שאלות בפרט 23-25. אפשרות נוספת לכניסת LSFM הן הפלטפורמות הפתוחות 26,27, אשר להשתמש בעקרונות גישה הפתוחים להביא מיקרוסקופיה גיליון אור קהילה גדולה יותר. התיעוד של הן את החומרה ואת ההיבטים התוכנה ניתן למצוא בכתובת http://openspim.org ו https://sites.google.com/site/openspinmicroscopy/.
בפרוטוקול זה, אנו משתמשים דג הזברה החוליות כמערכת מודל ללמוד תהליכים התפתחותיים עם LSFM. המורפוגנזה של עין דג הזברה היא דוגמא כי מדגישה את היתרונות רבים של LSFM. LSFM כבר נעשה שימוש בעבר כדי לחקור התפתחות העין medaka 28 ו דג הזברה 29,30. בשלב המוקדם של התפתחות עין זה מסובך להתמצא העובר כראוי עבור מיקרוסקופיה קונבנציונלי,כמו החלמון המגושם אינו מאפשר העובר לשכב על הצד עם העין שלה מול המטרה. עם זאת, עם LSFM הרכבה לתוך עמודת agarose, המדגם ניתן למקם reproducibly. בנוסף, במהלך המעבר מן השלפוחית אופטית לשלב כוס האופטית, העין עוברת rearrangements הגדולה המוךפו"גנטי שהולכת מלווה צמיחה, מחייב לכיד ערימת z גדולה בשדה גדול של נוף. כמו כן, עד שהמשימה הזאת LSFM עדיפה על הדמית confocal קונבנציונלית. תהליך היווצרות כוס ראיה הוא תלת ממדי, ולכן קשה להבין ולדמיין אך ורק על ידי הדמיה מעין אחד. זה עושה הדמיה מרובה תצוגות עם רזולוציה איזוטרופיים מועילה. לאחר היווצרות כוס אופטית, הרשתית הופכת רגישה יותר ויותר חשיפת ליזר. לפיכך, phototoxicity נמוך הקשורים LSFM הוא יתרון גדול עבור הדמיה לטווח ארוך.
כאן אנו מציגים פרוטוקול אופטימיזציה עבור הדמיה של אחד עד שלושה ימים דג זברה ישנה עוברזחלי nd עם דגש על התפתחות העין. השיטה שלנו מאפשרת הקלטה של זמן לשגות סרטים מכסים עד 12-14 שעות עם רזולוציה גבוהה במרחב ובזמן. חשוב לציין, אנו גם מציגים צינור עיבוד נתונים, המהווה שלב הכרחי בדרך LSFM, כמו הטכניקה הזו תמיד מייצרת מערכי נתונים גדולים, לעתים קרובות בטווח הטרה.
Protocol
הערה: כל עבודת החיה בוצעה בהתאם האיחוד האירופי (EU) Directive 2011/63 / איחוד אירופיים חוק צער בעלי החיים הגרמני. הפרוטוקול נועד להיות אחריו ללא הפרעה, מן הרכבת הדמיה המדגמת. בהתאם הניסיון המעשי, זה ייקח 2-3 שעות כדי להתחיל ניסוי זמן לשגות. עיבוד נתונים אינו נכלל בחישוב פעם. כל החומר הנדרש לצורך הניסוי ניתן למצוא את רשימת החומר הדרוש לפני תחילת המסופק כמסמך משלים. יש להשתמש בכפפות אבקה חינם במהלך השלבים 1, 2, 3 ו -4 לקבלת שלבים 2, 3, 4 ו -5 של הפרוטוקול גם לעיין במדריך הפעלת מיקרוסקופ רשמי.
1. עבודת הכנה לפני ניסוי ההדמיה
- פתרון פלורסנט חרוז במלאי
- עבור פרוטוקול זה, השתמש חרוזי פוליסטירן בקוטר ננומטר 500 או 1,000 (שכותרתו עם צבע פלואורסצנטי פולטות אדום). דילול העבודה של החרוזים הוא 1: 4,000. ראשית, מערבולת פתרון המניות חרוזות דקות 1. לדלל 10 μl של חרוזים ב 990 μl של DDH 2 O. אחסן את הפתרון בחושך ב 4 ° C ולהשתמש 1 זה: דילול 100 כפתרון מניות בדילול נוסף 01:40.
- פתרון הכנה לקראת קאמרית לדוגמא
- מערבבים בכוס 100 מ"ל 38.2 מ"ל של מדיום E3 ללא מתילן כחול, 0.8 מ"ל של 10 מ"מ N -phenylthiourea ו 1 מ"ל של 0.4% MS-222. זה מועיל להשתמש במדיום E3 מסונן כדי למנוע חלקיקים קטנים של אבק או גבישים שלא נמסו צפים בתא המדגם מאוחר יותר.
- בחירת עובר דגי פלורסנט
- בימים לפני הניסוי, להכין עובר להביע חלבוני ניאון. ממש לפני הניסוי, למיין את העוברים תחת stereoscope ניאון עבור כוח רצוי של האות ניאון. קח 5-10 עוברים בריאים dechorionate אותם באמצעות פינצטה.
הערה: פרוטוקול זה הוא אופטימיזציה עבור 16-72 שעות ישנותעוברי.
- בימים לפני הניסוי, להכין עובר להביע חלבוני ניאון. ממש לפני הניסוי, למיין את העוברים תחת stereoscope ניאון עבור כוח רצוי של האות ניאון. קח 5-10 עוברים בריאים dechorionate אותם באמצעות פינצטה.
2. הגדרת הלשכה לדוגמא
- רכבת Windows הלשכה שלוש
- ישנם 4 חלונות בתא מדגם, אחד עבור המטרה ושלושה להיות אטום עם coverslips (בקוטר 18 מ"מ, שנבחרו 0.17 מ"מ עובי). אחסן coverslips אלה באתנול 70%. נגב אותם נקיים לפני חיבורו אתר: אתנול (1: 4).
- הכנס את coverslip לתוך החלון באמצעות מלקחיים הקטנות ולוודא שהוא מתאים לחריץ הקטן. כסה אותה עם אטם גומי בקוטר 17 מ"מ ו בורג בטבעת מתאם תאורת שימוש באפשרות חלון חדר. חזור על התהליך עבור שני חלונות האחרים.
- הצמדת חלקי הלשכה שנותרו
- בורג מתאם עבור אובייקטיבי המתאים לתוך הצד הנותר הרביעי של החדר. הכנס את האטם בקוטר 15 מ"מ לתוך המרכז של המתאם.
- בורג מתאם Luer-Lock הלבן לתוך הפתח הימני התחתון של צ'הmber ואת המחבר לטמיון האפור בפתיחה השמאלית העליונה. חסום את כל שלושת הפתחים שנותרו עם האטמים עיוורים השחורים.
- צרף הבלוק פלטייה בתחתית השקופית מתכת להשתלב של החדר באמצעות מפתח ברגים אלן. צרף את הצינור עם מזרק 50 מ"ל למתאם Luer-Lock. הכנס את חללית הטמפרטורה לתוך התא.
- הכנסת יעדי הלשכה לתוך מיקרוסקופ
- בדוק תחת stereoscope שכל היעדים הם נקיים. השתמש מטרות תאורה 10X / 0.2 לבין המטרה זיהוי תוכנית-Apochromat 20X / 1.0 W ולוודא כי צווארון תיקון מקדם השבירה שלה מוגדר 1.33 למים. הבריגו את המטרה איתור לתוך המיקרוסקופ, תוך שמירה על יעדי ומאיר מכוסה.
- הסר את פקקי פלסטיק המגנים מכסים את המטרות והמאירות. החלק בזהירות את תא אל מיקרוסקופ והדק אותה עם הבורג.
- חבר את פרו הטמפרטורהלהיות ואת גוש פלטייה עם מיקרוסקופ.
הערה: שתי השפופרות כי במחזור נוזל הקירור עבור בלוק פלטייה תואמות בשני המחברים. הם יוצרים מעגל מתפקד ללא קשר האוריינטציה של חיבור. - ממלאים את החדר דרך מזרק עם פתרון מוכן בשלב 1.2 עד הקצה העליון של חלונות החדר. בדוק כי התא לא דולף.
- הפעל את המיקרוסקופ, דגירת מחשבי השליטה ואחסון. הפעל את תוכנת ההפעלה-מיקרוסקופ ולהגדיר את טמפרטורת הדגירה ל -28.5 מעלות צלזיוס.
הערה: זה ייקח שעה 1 כדי לאזן לחלוטין. הכן את המדגם בינתיים.
לדוגמא הכנת 3.
- הכנת מערבבי Agarose
- 15 דקות לפני ביצוע של תמהיל agarose, להמיס אחד aliquot 1 מ"ל של 1% נקודת התכה נמוכה agarose (מומס בינוני E3) בתוך גוש חימום להגדיר עד 70 מעלות צלזיוס. לאחר agarose הוא לחלוטין molעשר, להעביר 600 μl לתוך צינור 1.5 מ"ל טריים, להוסיף 250 μl של מדיום E3, 50 μl של 0.4% MS-222 ו 25 μl של פתרון המניות חרוז vortexed.
הערה: זה עושה 925 μl של התמהיל, תוך נוסף 75 μl מחושב עבור הנוזל הוסיף מאוחר יותר יחד עם העוברים. - שמור את הצינור בתוך גוש חימום שני ב 38-40 מעלות צלזיוס או להבטיח כי agarose מאוד קרוב לנקודת gelling שלה לפני שמכניס עובר מדגם לתוכו.
- 15 דקות לפני ביצוע של תמהיל agarose, להמיס אחד aliquot 1 מ"ל של 1% נקודת התכה נמוכה agarose (מומס בינוני E3) בתוך גוש חימום להגדיר עד 70 מעלות צלזיוס. לאחר agarose הוא לחלוטין molעשר, להעביר 600 μl לתוך צינור 1.5 מ"ל טריים, להוסיף 250 μl של מדיום E3, 50 μl של 0.4% MS-222 ו 25 μl של פתרון המניות חרוז vortexed.
- הרכבה את העוברים
- קח חמישה נימים כוס 20 נפח μl (עם סימן שחור, ~ 1 מ"מ קוטר פנימי) והכנס את בוכנות טיפ התאמת טפלון לתוכם. דחוף את הבוכנה דרך הנימים כך קצה הטפלון הוא בתחתית של הנימים.
- העברת חמישה עוברי (מספר כי יכול להיות מותקן בו זמנית) עם כוס או טפטפת פלסטיק לתוך הצינור של 37 vortexed ° C לערבב agarose חם.
הערה: נסה לשאת מעל נפח מינימאלי של שנינות נוזלות יחדh את העוברים. - הכנס את נימי לתערובת ולמצוץ עובר אחד בתוך ידי משיכת עד הבוכנה. ודא כי ראשו של העובר נכנס הנימים לפני הזנב. הימנע מכל בועות אוויר בין הבוכנה ואת המדגם. לא צריך להיות ± 2 ס"מ של agarose מעל העובר ± 1 ס"מ מתחתיו. חזור על העוברים הנותרים.
- המתן עד agarose מבצרת לגמרי, וזה קורה תוך כמה דקות ולאחר מכן לאחסן דגימות במדיום E3, על ידי דבק אותם אל הקיר של מבחנה עם פלסטלינה או קלטת. הפתיחה התחתונה של הנימים צריכה להיות תלויה חופשית הפתרון המאפשר חילוף גזים מדגמים.
הערה: פרוטוקול דומה בסעיפים 3.1 ו -3.2 ניתן למצוא גם על http://openspim.org/Zebrafish_embryo_sample_preparation בעמוד הוויקי OpenSPIM.
4. מיצוב לדוגמא
- עצרת בעל מדגם
- הכנס 2 שרוולי פלסטיק בגודל הנכון (שחור)אחד נגד השני לתוך הגזע בעל מדגם. הצדדים המחסה שלהם צריכים להתמודד החוצה. צרף את בורג המהדק רופף על ידי סיבוב 2-3 סיבובים. הכנס את נימי דרך הבורג מהדק ולדחוף אותו דרך מחזיק עד פס הצבע השחור יהפוך לגלוי בצד השני. הימנע ממגע עם הבוכנה.
- חזק את הבורג מהדק. דחוף את agarose 1 ס"מ של עודף מתחת העובר מתוך נימי ופצע אותו. הכנס הגזע לתוך הדיסק בעל מדגם.
- אשר בתוכנה ששלב מיקרוסקופ נמצא במצב העומס. השתמש מסילות המנחה לגלוש הבעל כולו עם המדגם אנכי כלפי מטה לתוך המיקרוסקופ. הפעל אותה, כך מנעולי דיסק בעל מגנטי למקומו.
- איתור הנימים
- מעתה ואילך, לשלוט מיצוב מדגם ידי התוכנה. בכרטיסיית האתר לבחור את אתר אפשרות נימים ומקמו את נימי x, y ו- z אל מוקד בדיוק מעל אובייקט זיהויעדשת אייב. השתמש הייצוג הגרפי בנווט הדגימה להדרכה.
- לדחוף את העובר בעדינות מתוך הנימים עד שהוא מול האישון של מטרת זיהוי.
הערה: 'אתר הנימים' היא הצעד רק בפרוטוקול הנותר, שבמהלכה את המכסה העליון של המיקרוסקופ אמור להיפתח ואת המדגם נדחף החוצה.
- איתור המדגם
- Switch to באפשרות 'אתר המדגם' ו ב 0.5 זום להביא עין דג הזברה למרכז שדה הראייה. סובב את העובר, כך גיליון האור לא יעבור דרך כל חלקי שבירה או הקליטים ביותר של הדגימה לפני שהוא מגיע לעין. כמו כן, הקרינה הנפלטת צריכה דרך ברורה החוצה של הדגימה. הקש על 'מיקום גדר בית'.
- פתח את דלת הכניסה של המיקרוסקופ לשים את כיסוי הפלסטיק עם פתח 3 מ"מ על החלק העליון של החדר כדי למנוע אידוי.
הערה: אם רמת נוזל יורדת מתחתרמת ההדמיה, הניסוי יהיה בסכנה. - בדוק את פעימות הלב של העובר כמדד לבריאות כללית. אם הוא איטי מדי, השתמש מדגם אחר (השווה ביקורת ללא רכוב; ערכים ספציפיים תלויים בשלב ההתפתחותי). Switch to הגדרת הזום סופי ולתקן את המיקום של העובר.
5. הגדרת רכישה רבה ממדית
- פרמטרי רכישה
- עבור לכרטיסייה 'רכישה'. הגדר את נתיב האור כולל קווי לייזר, המטרה איתור, סינון חסימת לייזר, קרן splitter והמצלמות.
- הפעל את תיבת סימון סריקת ציר. קבע את ההגדרות רכישה אחרות כמו מעט עומק, פורמט התמונה, עובי גיליון אור ולבחור תאורה צדדית יחיד.
- לחץ 'רציף' ו בהתאם לעוצמת של התמונה המתקבל לשנות את חשיפת מצלמת כוח ליזר הזמן.
הערה: לקבלת התאמה כל הגדרות ההדמיה להשתמש less כוח לייזר (0.5% של לייזר 100 mW, 30 זמן חשיפה msec), מאשר עבור הניסוי בפועל, כדי למנוע נזק התמונה מיותר הדגימה.
- התאמת גיליון אור
- חלף אל 'התאורה הכפולה הצדדית' ו הפעל את תיבת הסימון 'Fusio'n סייד כפול באינטרנט. הפעל את 'Lightsheet כוונון אוטומטי אשף'. עקוב אחר הוראות צעד.
הערה: האשף מעביר את גיליון האור לתוך מטוס המוקד של מטרת האיתור, ולהבטיח כי הוא אינו מוטה והמותנים שלו הם במרכז שדה הראייה. לאחר שסיים את ההתאמה האוטומטית, את עמדותיהם של יריעות אור על ימין ועל שמאל מתעדכנים אוטומטית בתוכנה. שיפור איכות תמונה צריך עכשיו להיות ברור. הפעל את תיבת הסימון 'Z-ערימה'. - בדוק את התאמת גיליון אור על ידי בוחן את הסימטריה של הפונקציה התפשטות נקודה (כוחות הביטחון הפלסטינים) שניתן על ידי חרוזי ניאון XZ ו YZ נוף אורתו. אם אין זהסימטרי t, באופן ידני להתאים את מיקום פרמטר גיליון האור למעלה ולמטה עד להשגת PSF סימטרי בצורת שעון חול (איור 1 א).
- חלף אל 'התאורה הכפולה הצדדית' ו הפעל את תיבת הסימון 'Fusio'n סייד כפול באינטרנט. הפעל את 'Lightsheet כוונון אוטומטי אשף'. עקוב אחר הוראות צעד.
- הגדרות רכישה רבות ממדיות
- הגדר את Z- המחסנית עם 'Slice ראשית' והאפשרויות 'האחרונה Slice' ולהגדיר את צעד z עד 1 מיקרומטר.
הערה: גיליון אור מיקרוסקופ זה היא סטטית ואת חתך z מושגת על ידי הזזת מדגם דרך. השתמש תמיד באפשרות 'רציף הכונן' לרכישה מהירה יותר של Z- ערימות. - הפעל את תיבת הסימון "סדרות עתיות". הגדר את המספר הכולל של נקודות זמן ההפסקה ביניהם.
- הפעל את תיבת הסימון 'מרובה תצוגות'. מוסיפים את התצוגה הנוכחית לתוך הרשימה מרובה תצוגות, שבו x, y, z מידע וזווית מאוחסן. השתמש בבקר הבמה כדי לסובב את הנימים ולהגדיר את הדעות רצויות האחרות. הגדרת Z- מחסנית בכל הצגה להוסיף אותם לרשימה המרובה תצוגות.
הערה:תוכנה ממיינת את הדעות באופן סדרתי, כך הנימים מופעלות בכיוון אחד, ואילו התמונה היא רכש.
- הגדר את Z- המחסנית עם 'Slice ראשית' והאפשרויות 'האחרונה Slice' ולהגדיר את צעד z עד 1 מיקרומטר.
- תיקון וסחיפה, תחילת הניסוי
- עם השלמת הרכישה להגדיר הושלמה, לחכות 15-30 דקות לפני תחילת הניסוי בפועל.
הערה: המדגם בתחילה נסחף מיקרומטרים אחדים ב x, y ו- z, אבל צריך להפסיק תוך 30 דקות. אם המדגם שומר נסחף למשך זמן ארוך יותר, השתמש דוגמא נוספת או לעלות שוב. - עבור לכרטיסייה 'לתחזק' וב האפשרות "הזרימה" מגדירים כיצד הנתונים צריכים להישמר, למשל, קובץ אחד לכל נקודת זמן או בקובץ נפרד עבור כל אחד השקפת ערוץ. חזור אל הכרטיסייה 'רכישה', לחץ על 'התחל ניסוי "ולהגדיר את שם הקובץ, במקום בו הוא צריך להישמר ואת פורמט קובץ (שימוש .czi).
- שים לב רכישת הנקודה לראשונה כדי לאשר שהכל פועל ללא רבב. מיד להמשיך עם רישוםואיחוי של זמן הנקודה הראשונה כמתואר בשלבים 6 ו -7, כדי לאשר כי ניתן יהיה לעבד את הנתונים כולו.
- עם השלמת הרכישה להגדיר הושלמה, לחכות 15-30 דקות לפני תחילת הניסוי בפועל.
6. רישום מרובה תצוגות
- מרובה תצוגות שחזור יישומים
- בסוף הפגישה הדמיה, להעביר את הנתונים מהמחשב אחסון נתונים על המיקרוסקופ למחשב עיבוד הנתונים. השתמש 'מרובה התצוגות ReconstructionApplication '20,21,31 מיושם פיג'י 32 לעיבוד נתונים (איור 1B).
- גדר מערך נתונים
- עדכון פיג'י: פיג'י> עזרה> עדכון ImageJ ו פיג'י> עזרה> פיג'י Update. השתמש ImageJ הראשי ואתרי עדכון פיג'י.
- מעבירים את בסיס הנתונים כולו לתוך תיקייה אחת. התוצאות וקבצי ביניים של העיבוד יישמרו בתיקייה זו. הפעל את היישום לשיקום מרובה תצוגות: פיג'י> Plugins> מרובה תצוגות שחזור> MultiviEW שחזור יישומים.
- בחירה 'להגדיר מערך נתונים חדש ". כמו סוג של בסיס הנתונים בחר באפשרות meu "Zeiss Lightsheet Z.1 מערך נתונים (לוקוסים Bioformats)" וליצור שם עבור קובץ XML. לאחר מכן בחר את קובץ .czi הראשון של בסיס הנתונים (קובץ כלומר ללא מדד). הוא מכיל את נתוני התמונה, כמו גם את metadata של ההקלטה.
הערה: לאחר התכנית פותחת את קובץ .czi הראשון, מטה נטענים לתכנית. - אשר שמספר הזוויות, ערוצים, תאורות ולבחון את גודל voxel מן metadata. לאחר לחיצה על אישור, להתבונן שלושה חלונות נפרדים פתוחים (איור 1 ג): חלון יומן, מראה את ההתקדמות של העיבוד תוצאותיה, 'ViewSetup Explorer' וקונסולה, מראה הודעות שגיאה של פיג'י.
הערה: 'ViewSetup Explorer' היא ממשק ידידותי למשתמש שמראה כל תצוגה, ערוץ תאורה ומאפשר בחירה של הקבצים של עניין. בנוסף, 'ViewSetup Explorer' מאפשר היגוי משותף של כל מדרגות העיבוד. - בחר את הקבצים שצריכים להיות מעובד ולוחצים על הכפתור הימני של העכבר לתוך Explorer. שים חלון פתוח עם מדרגות עיבוד שונות (תרשים 1C).
- לאחר הגדרת בסיס הנתונים, להבחין כי בקובץ XML בתיקייה עם הנתונים נוצר.
הערה: קובץ זה מכיל את metadata כי אושרו לפני. - בפינה הימנית העליונה להתבונן 'המידע' שני לחצנים 'שמור'. לחיצה על 'מידע' מציגה סיכום של התוכן של קובץ XML. לחיצה על 'שמור' יציל את תוצאות העיבוד.
הערה: בעוד עיבוד של "הבקשה לשיקום המרובה תצוגות 'מדרגות העיבוד השונות צריכות להישמר לתוך .xml לפני סגירת פיג'י.
oad / 53,966 / 53966fig1.jpg "/>
איור 1: נקודת עבודה וריבית מרובה תצוגות שחזור זיהוי (א) יישור גיליון אור המבוסס על הדמית חרוז ניאון.. המערכת מיושרת (מרכז), כאשר התמונה החרוזה יש צורה של שעון חול סימטרית בתחזיות XZ ו YZ. הדוגמות של גיליון אור מיושר בשני כיוונים מוצגות על ימין ועל שמאל. תחזיות בעוצמה מקסימלית של חרוז 500 ננומטר XZ, צירים YZ ו XY מוצגים. ראוי לציין, כי היחס בין עוצמת השיא המרכזי של הדיסק האוורירי (ב XY) אל האונות בצד גדול, כאשר lightsheet מיושר לעומת כראוי למצב המיושר. תמונות צולמו עם 20X / 1.0 אובייקטיבי W ב 0.7 זום. סרגל קנה מידה מייצג 5 מיקרומטר. בסיס הנתונים (B) מוגדר ולאחר מכן resaved לפורמט HDF5. החרוזים מפולחים ולאחר מכן רשום. עבור סדרה עתית בכל נקודת זמן רשומה על נקודת זמן הפניה. הנתונים ולבסוף מתמזגות ויוצרותנפח איזוטרופיים יחיד. (C, למעלה) סייר ViewSetup מציג את שונה בנקודות זמן, זוויות, ערוצי צדדי תאורה של בסיס הנתונים. (C, בפינה שמאלית תחתונה) חלון BigDataViewer מציג את הדעה כי נבחרת Explorer ViewSetup. (C, נכון באמצע) קליק ימני לתוך Explorer ViewSetup פותח את אפשרויות עיבוד. (C, בפינה הימנית התחתונה) ההתקדמות ואת תוצאות הטיפול ב- מוצגים בקובץ היומן. (D ו- E) מטרת זיהוי למגזר כנקודות עניין רבות (חרוזים) עם זיהוי קטן כמו במדגם ככל האפשר כאן כפי שמוצג צילומי מסך מתוך פילוח החרוז האינטרקטיווי. (D ו- E, בפינה שמאלית עליונה) הפילוח מוגדר על ידי שני פרמטרים, ערכי הבדל-של-גאוס עבור סיגמא 1 ואת הסף. (ד) דוגמא זיהוי מוצלח עם גרסה מוגדלת של חרוז זוהה כהלכה. (E) פילוח עם תוצאות חיוביות שגויות רבות מדי לתגליות מרובות של חרוז אחד. סרגל קנה מידה (C) מייצג 50 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
- שמור מחדש מערך נתונים בפורמט HDF5
- כדי לשמור את הנתונים כולו, בחר את כל הקבצים עם Ctrl / אפל + a ו- קליק ימני. לאחר מכן בחר שמור מחדש במערך וכפי HDF5.
- יופיע חלון מוצג אזהרה שכל הנופים של בסיס הנתונים הנוכחיים יהיו resaved. לחץ כן.
הערה: התכנית תמשיך לשמור מחדש את קבצי .czi כדי hdf5 ידי פתיחת כל קובץ resaving רמות הרזולוציה השונות של פורמט hdf5. זה יאשר עם 'נעשה' עם השלמתו. Resaving usually לוקח כמה דקות לכל timepoint (ראה טבלה 1).
הערה: מאז הקבצים בפורמט hdf5 ניתן לטעון מהר מאוד, ניתן כיום כדי להציג את הנתונים הרשומים על ידי 'קליק הימני' לתוך חוקר החלפה 'תצוגת BigDataViewer (on / off)'. חלון BigDataViewer יופיע עם התצוגה שנבחרה (איור 1 ג). תפקידי הליבה של BigDataViewer 33 מוסברים בלוח 2 http://fiji.sc/BigDataViewer.
- זיהוי נקודות עניין
- בחר בכל נקודות הזמן עם Ctrl / אפל + a ו- קליק ימני ובחר לזהות נקודות עניין.
- ההבדל-של-גאוס בחר 34 עבור סוג של זיהוי נקודת עניין. מאז הרישום מבוסס החרוז משמש כאן, הקלד "חרוזים" בשדה נקודות עניין תווית. הפעל 'downsample תמונות לפני פילוח'.
- בחלון הבא, להתבונן detהגדרות שיקוף. עבור 'לוקליזציה subpixel' שימוש 'בכושר ריבועית 3 מימדי' 34 ולקבוע את ההבדל-של-גאוס ערכים ורדיוס לשימוש פילוח חרוז 'אינטראקטיבי' במפרט נקודת i'nterest '.
- לשימוש 'downsample XY' 'התאמה Z רזולוציה (פחות downsampling)' ועל 'downsample Z' השימוש 1 ×. גודל z הצעד גדול יותר מגודל XY פיקסל, ובכך פשוט למטה הדגים את XY כדי להתאים את רזולוצית z מספיקה. בחר "מחשב על המעבד (JAVA)". 'אישור' לחץ.
- בחלון קופץ למעלה, בחר בתצוגה אחת לבדיקת פרמטרים מן התפריט הנפתח. לאחר טעינת נוף, לכוונן את הבהירות והניגודיות של החלון עם פיג'י> תמונה> התאם> בהירות / ניגודיות או Ctrl + Shift + C. סמן את התיבה 'מבט על מקסימום (ירוק)' לגילוי חרוז.
- שים את הפילוח של הטבעות הירוקות 'viewSetup' כמו לאיזורד לתגליות כאשר מחפשים מקסימום ואדום ומינימום. הפילוח מוגדר על ידי שני פרמטרים, הבדל-של-גאוס ערכים עבור סיגמא 1 ואת הסף (איור 1D). התאם אותם לפלח כמה חרוזים סביב המדגם כפי כמה לתגליות חיוביות כוזבות בתוך המדגם ככל האפשר (1D איור). זיהוי כל חרוז פעם אחת בלבד ולא מספר פעמים (איור 1E). לאחר קביעת הפרמטרים האופטימליים, לחץ על 'לעשות'.
הערה: זיהוי מתחיל על ידי טעינת כל תצוגת פרט של נקודת זמן פילוח החרוזים. בקובץ יומן הרישום, תכנית פלטי מספר החרוזים זה זוהה לפי צפייה. הגילוי צריך להיעשות בעוד כמה שניות (ראה טבלה 1). - לחץ לחסוך כאשר הכמות לתגליות מתאימה (600 לכמה אלף לצפייה).
הערה: התיקייה תיווצר בספריית נתונים, אשר יכיל את information על הקואורדינטות של החרוזים זוהו.
- הירשם באמצעות נקודות עניין
- בחר בכל נקודות הזמן עם Ctrl / אפל + a, קליק ימני ובחר "הרשמה באמצעות נקודות עניין '.
- השתמש ב 'מהר hashing הגיאומטרי 3D (סיבוב משתנה)' לגילוי חרוז כמו 'אחת אלגוריתם ".
הערה: אלגוריתם זה מניח ידע מוקדם אודות הכיוון ומיצוב הדעות השונות ביחס זה לזה. - לפרטים והרשמה של נופים אחת על גבי השנייה, בחר 'הירשם timepoints בנפרד' כמו 'סוג של רישום ". עבור 'נקודות עניין' בערוץ הנבחר, התווית שצוינה קודם לכן עבור נקודות עניין אמור להיות מוצג כעת (כלומר "חרוזים").
- בחלון הבא, להשתמש בערכים המוגדרים מראש עבור רישום. תקן את הדעה הראשונה על ידי בחירת 'אריחי תקן: תקן אריחי שימוש ראשונים אל המפה בחזרה "(השתמש באפשרות זו אם tiles אינו קבוע) ב 'מפה בחזרה אריחים "הסעיף.
- השתמש "מודל שינוי מאוחד 'עם' הסדרה '.
הערה: השגיאה המותרת RANSAC תהיה 5px ו 'המשמעות עבור התאמה מתארת' תהיה 10. עבור 'הסדרה' להשתמש 'מודל נוקשה' עם למבדה של 0.10, כלומר השינוי הוא 10% נוקשה 90 % מאוחדים 35. לחץ על OK כדי להתחיל את ההרשמה.
הערה: כפי שמוצגות בחלון היומן, ראשון בכל תצוגה מותאמת עם כל התצוגות האחרות. ואז קונסנסוס המדגם האקראי (RANSAC) 36 בודק את התכתובות ולא כולל תוצאות חיוביות שגויות. עבור רישום חזק, ערך RANSAC צריך להיות גבוה מ -90%. כאשר מספר מספיק של מועמדים נכונים המתאימים בין שתי השקפות נמצאים, מודל שינוי חושב בין כל משחק עם התזוזה הממוצעת בפיקסלים. ואז העולמי אופטימיזציה איטרטיבי מתבצעת וכל צפיות רשומים על הנוף הקבוע. עם אחת מוצלח, מודל שינוי מחושב ומוצג עם דרוג שלה ואת העקירה בפיקסלים. השגיאה הממוצעת צריכה להיות אופטימלי מתחת ל -1 px ואת קנה המידה של השינוי הקרוב 1. הרישום מבוצע בשניות (ראה טבלה 1). - ודא שאין משמרת בין תצוגות שונות כפי שנצפה על מבנים בסדר בתוך המדגם, קרום התא למשל. לאחר מכן, שמור את השינוי עבור כל תצוגה לתוך קובץ XML.
הערה: עכשיו את הדעות הרשומות חופפים זה לזה BigDataViewer (איור 2 א) ואת התמונות החרוזות יש שכיסה גם (איור 2 ב). - הסר את טרנספורמציות על ידי בחירת נקודות הזמן נכונה ללחוץ עליהם ולאחר מכן בחר הסר טרנספורמציות> טרנספורמציה אחרונה / חדשות.
בתשובה לשאלה 2 "src =" / files / ftp_upload / 53,966 / 53966fig2.jpg "/>
איור 2:. תוצאות של שיקום מרובה תצוגות (א) מעולף נוף רשום, כל אחד בצבע שונה כדי להדגים את החפיפה ביניהם. (ב) יתגדל לאור מראה את החפיפה של PSFs של חרוזים צילמו מהתצוגות השונות. (C) תקריב של חרוז לאחר היתוך, כוחות הביטחון הפלסטינים הוא ממוצע של תצוגות שונות. (ד) כוחות הביטחון הפלסטינים של אותו חרוז כמו (C) לאחר deconvolution מרובה תצוגות מראה כי כוחות הביטחון הפלסטינים מתמוטט לתוך נקודה אחת. (E) xy סעיף ו (F) סעיף YZ של תצוגה אחת של שלפוחית אופטית, שבו ממברנות מסומנים עם שפלה מראה GFP של האות z עמוקה בתוך הרקמה. (G) סעיף XY ו- (H) סעיף YZ של אותה ההשקפה לאחר היתוך ממוצע משוקלל של 4 צפיות כ בנפרד 20 מעלות עם degra מעט יותררזולוציה XY ded הכוללת אך z-רזולוציה מוגברת. (I) xy סעיף ו (י) סעיף YZ של אותם נתונים לאחר deconvolution מרובה תצוגות, מראה גידול משמעותי הרזולוציה והחדות של האות הן XY וב z. תמונות ב (EJ) הם פרוסות אופטיות יחידות. סרגל קנה מידה מייצג 50 מיקרומטר (A, B, EJ) ו -10 מיקרומטר (C, D). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
- רישום זמן לשגות
- בחר את הזמן לשגות כולו, קליק ימני ובחר "הירשם באמצעות נקודות עניין 'כדי לייצב את הזמן לשגות לאורך זמן.
- ב 'חלון פרמטרי רישום בסיסיים לבחור התאמה נגד נקודה אחת בזמן הפניה (אין העולמית אופטימיזציה) עבור סוג של רישום ". Ke EP t היא גדרות שניות זהה ברישום של נקודות הזמן הנפרדות.
- בבאחלון, לבחור את נקודת הזמן לשמש כהפניה, בדרך כלל נקודת זמן באמצע הזמן לשגות. סמן את התיבה 'לשקול כל timepoint כיחידה נוקשה', מאז הנופים הבודדים בתוך כל נקודת זמן כבר רשמו על אחד את השני.
- סמן את התיבה 'סטטיסטיקת סדרות עתיות צג'. פרמטרי הרישום האחרים נשארים כמו קודם כולל ההסדרה. לחץ על אישור.
הערה: בחלון היומן, אותה התפוקה יוצגה ברישום הנקודה הבודד הזמן. אם הרשמת נקודות הזמן הנפרדות הייתה מוצלחת חזק, RANSAC עכשיו 99-100% וממוצעים, מינימום שגיאה מרבית היא בדרך כלל מתחת ל -1 px. שמור רישום המעשה לפני שאתם ממשיכים.
7. מרובה תצוגות Fusion
הערה: התמורות הנובעים צעדי הרישום משמשות כדי לחשב ערימה איזוטרופיים התמזגה מתוך התצוגות המרובות. חה מערך זהs גדל מספר פרוסות z לעומת הנתונים המקוריים, כי המרווח z הוא עכשיו שווה לגודל פיקסל המקורי XY. השילוב יכול להתבצע גם על ידי אמצעי היתוך מרובה תצוגות מבוססות תוכן 21,31 או deconvolution המרובה תצוגות מבוססות בייס 31, אשר מבוצעים הוא ביישום השיקום המרובה תצוגות.
- תיבה תוחמת
הערה: פיוז'ן הוא תהליך יקר מחשוב (ראה טבלה 1), ובכך להקטין את כמות נתונים על ידי הגדרת תיבה תוחמת מגבירה באופן משמעותי את מהירות העיבוד.- בחר בכל נקודות הזמן קליק ימני ובחר הגדר 'התיבה התוחמת'. השתמש ב 'גדר עם BigDataViewer' ובחר שם עבור התיבה התוחמת.
- הזז את המחוון עבור 'דק' ו 'מקסימום' בכל ציר כדי לקבוע את האזור של עניין ולאחר מכן לחץ על 'אישור'. הפרמטרים של התיבה התוחמת יוצגו.
הערה: התיבה התוחמת תכיל הכל בתוךאת הקופסה הירוקה כי נשכבת עם שכבת מגנטה שקופה.
- תוכן מבוסס Fusion מרובה תצוגות
הערה: היתוך מרובה תצוגות מבוססות תוכן 21 לוקח את ההבדלים באיכות תמונה את הערימה (כלומר שפלה של האות z) בחשבון ומחיל משקלות גבוהים יותר איכות תמונה טובה יותר במקום להשתמש מיצוע פשוט.- בחר את נקודת הזמן (ים) כי יש התמזגה ב 'Explorer ViewSetup', קליק ימני ובחר "תמונה Fusion / Deconvolution '.
- בחלון Fusion תמונה, בחר 'היתוך ממוצע משוקלל "מן התפריט הנפתח, ובחר' השתמש תיבה תוחמת מוגדרת מראש עבור התיבה תוחמת '. עבור הפלט של התמונה התמזגה בחר 'צרף פרויקט XML הנוכחי ", אשר כותב קבצים hdf5 חדשים את הקבצים קיימים hdf5 כבר ומאפשר באמצעות תצוגות unfused הרשומות והתמונה התמזגה יחד. 'אישור' לחץ.
- לאחר מכן, ב 'טרום להגדיר תיבה תוחמת & #39; צץ בחלון בחר בשם של התיבה התוחמת שהוגדרה בעבר ולחץ על 'אישור'.
- שים את הפרמטרים של התיבה התוחמת בחלון הבא. היתוך מהיר, להחיל דגימה למטה על בסיס הנתונים התמזגו.
הערה: אם המחסנית התמזגה היא מעל לגודל מסוים, התכנית תמליץ באמצעות יותר זיכרון יעיל 'ImageLib2 containe'r. החלף מ 'ArrayImg' ל 'PlanarImg (תמונות גדולות, קל להציג) או CellImg (תמונות גדולות)' מיכל, המאפשרים עיבוד של נתונים גדול. אחרת להשתמש בהגדרות המוגדרות מראש ולהחיל 'מיזוג ותוכן מבוסס היתוך ". המשך על ידי לחיצה על 'אישור'. - שים את הגדרות hdf5 בחלון הבא. השתמש פרמטרים מוגדרים מראש ולהתחיל בתהליך האיחוי. ודא פיג'י הקצתה מספיק זיכרון עריכה <אפשרויות <זיכרון & אשכולות.
- מרובה תצוגות Deconvolution
הערה: המרובה תצוגות Deconvolution 31 היא anotהטיפוס שלה של היתוך מרובה תצוגות. כאן גם אל ההיתוך, כוחות הביטחון הפלסטיני של מערכת ההדמיה נלקחים בחשבון כדי deconvolve ההחלטה גדלה תמונה ואת התשואה והניגודיות של האות (לעומת באיור 2C-J, איור 5 ו סרט 3).- בחר את נקודת הזמן (ים) להיות deconvolved, קליק ימני ולחץ על 'תמונת Fusion / Deconvolution'.
- הבחירה 'Deconvolution המרובה התצוגות' ושימוש 'התיבה התוחמת המוגדרת מראש לצרף לפרויקט XML הנוכחי ". בחר את התיבה התוחמת ולהמשיך.
הערה: הפרמטרים מוגדרים מראש עבור deconvolution הם נקודת התחלה טובה. לשימוש במשפט הראשון '20 חזרות 'ולהעריך את ההשפעה של deconvolution באמצעות "במצב Debug". לבסוף להגדיר את המחשב על כדי ב 512 x 512 x 512 בלוקים. - בחלון הבא, להשתמש בהגדרות שהוגדרו מראש. הגדר את 'מצב איתור באגים "כדי להציג את תוצאות כל' 5 ITEמנות '.
הערה: תפוקת deconvolution נתונים של 32 סיביות, אולם BigDataViewer תומכת כרגע רק נתונים של 16 סיביות. על מנת לצרף את הפלט של deconvolution אל בסיס הנתונים hdf5 הקיים, זה חייב להיות מומר 16 סיביות. - עבור ההמרה, לרוץ'תשתמשי מינימום / מקסימום של התמונה הראשונה (אולי להרוות עוצמות לאורך זמן) '.
הערה: deconvolution ואז יתחיל ידי טעינת תמונות והכנתם עבור deconvolution.
- BigDataServer
- על מנת לשתף את ה- XML גדולים מאוד / מערכי נתונים HDF5 להשתמש בשרת http BigDataServer 33. מבוא איך להתקין להתחבר לשרת כזה ניתן למצוא בכתובת http://fiji.sc/BigDataServer.
- כדי להתחבר BigDataServer הקיים פיג'י פתוח> Plugins> BigDataViewer> BrowseBigDataServer.
- הזן את כתובת האתר כולל הנמל לתוך החלון.
הערה: הסרטים המתוארים בפרסום זה הנם נגישים באמצעות הפרסומתשמלה: http://opticcup.mpi-cbg.de:8085 - שים חלון המאפשר בחירת הסרטים הזמינים. לחץ לחיצה כפולה כדי לפתוח את חלון BigDataViewer ולצפות בנתונים כפי שתואר לעיל.
רשימת תיוג של החומר הדרוש לפני תחילת: משלים
- עוברי דג הזברה / הזחלים להביע חלבוני ניאון (שמור את העוברים במדיום E3 דג הזברה ללא כחול מתילן. לקבלת בשלבים יותר מ -24 שעות לנטרל את פיגמנטציה על ידי הוספת PTU לריכוז סופי של 0.2 מ"מ.)
- סטריאוסקופ ניאון
- נימים (20 נפחים μl, עם סימן שחור) ו בוכנות מתאימות (אל תעשה שימוש חוזר הנימים. הבוכנות, ומצד שני, ניתן לעשות שימוש חוזרות במשך כמה ניסויים.)
- 1.5 מ"ל צינורות פלסטיק
- פינצטה חדה
- זכוכית (אש מלוטשת) או טפטפות פלסטיק (פלסטיק יכול לשמש למשך 24 שעות ועוברים מבוגרים)
- זכוכית או צלחות פלסטיק בקוטר 60 מ"מ (פלסטיק יכול להיותבשימוש למשך 24 שעות ועוברים מבוגרים)
- כוסות שני 100 מ"ל
- 50 מ"ל מזרק Luer-Lock עם צינור הארכה 150 ס"מ עירוי (צינור ומזרק צריך להישמר יבש לחלוטין בין הניסויים כדי למנוע זיהום על ידי מיקרואורגניזמים.)
- פְּלַסטֶלִינָה
- נקודת התכה נמוכה (LMP) agarose
- בינוני E3 (5 mM NaCl, KCl 0.17 מ"מ, 0.33 מ"מ 2 CaCl, 0.33 מ"מ MgSO 4)
- MS-222 (Tricaine)
- phenylthiourea (PTU)
- microspheres ניאון (כאן המכונה חרוזים)
- הכפולה המזוקקת H 2 O (DDH 2 O)
Representative Results
LSFM היא שיטה אידיאלית עבור הדמית תהליכים התפתחותיים ברחבי כף. מספר יישומים מופקים כאן מראים הדמיה קצרה וארוכה הן של מבנים תאיים, כמו גם תאים ורקמות כולו. גם דוגמאות אלו מראות כי LSFM הוא כלי שימושי בשלבים שונים של פיתוח עין מפני היווצרות כוס ראייה נוירוגנזה ברשתית. סרט 1 משמש המחשה של גישת LSFM הכללית, ראשון מראה נוף מוקטן של עובר שלמים מפני הטבעת גליל agarose ב brightfield ובהמשך מראה תצוגה מפורטת של הרשתית בערוץ פלואורסצנטי.
סרט 1:. LSFM של רשתית דג הזברה כדי להדגים את גישת LSFM, הסרט הזה מציג לראשונה brightfield כי העובר הוא צלם ללא פגע בתוך אgarose גליל לפני מעבר קרינה. מאוחר יותר הוא הראה כי השדה הרחב של תצוגה מאפשר תצפית של הרשתית כולה. לאחר מכן, הסרט מראה אזור קטן מוגדל של הרשתית כדי להדגיש את רזולוצית subcellular הטובה. Ath5: פער-GFP 37 עובר דג זברה מהונדס שמש הדמיה. transgene זו מסמנת נוירונים שונים ברשתית (בעיקר תאי גנגליון ומבשרי קולטי האור). חלק הקרינה של הסרט נתפס כתצוגה יחידה הקלטה עם תאורה כפולה צדדית באמצעות מטרת W 40X / 1.0 עם 5 מרווחי דקות. תחזית העצמה המקסימלית של הספר עב-כרס 30 מיקרומטר מוצגת. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
סרט 2 מדגים, כמה מהר מאוד אירועים תאיים יכול ליפול בפח עם רזולוציה גבוהה; במקרה זה את הצמיחה של microtubules בבתוספת שלהם מסתיימת ובתאים העצביים ברשתית. המידע הכלול בסרט מאפשר מעקב וכימות של צמיחת microtubule בתוספת הסוף.
סרט 2:. דינמיקת microtubule בתא בודד הסרט הזה לוכד גוברת טיפים בתוספת של microtubules שזכה על פי חלבון סמן פלוס טיפ EB3-GFP 38. החלבון מתבטא תאים ובתאים רשתית יחיד. Microtubules גדל בעיקר בכיוון מן הפסגה אל בסיס (מלמעלה למטה). המהירות הממוצעת של שביטים EB3 נמדדה כמו 0.28 ± 0.05 מיקרומטר / sec. נקודת האור בצד הפסגה של תא מפגין פעילות התגרענות microtubule הגבוה היא centrosome. העובר סוג הבר הזריק hsp70: EB3-GFP פלסמיד דנ"א. הסרט נרכש 4 שעות לאחר הלם חום (15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס) בסביבות 28 hrpost חומר דשןation (hpf) כתצוגה יחידה הקלטה עם תאורה צדדית יחידה באמצעות במרווחים אובייקטיבי W 63X / 1.0 ושעת 1 שניות. התא הבודד היה קצוץ מתוך שדה הראייה מכסה את הרוב של הרשתית. תחזית העצמה המקסימלית של שתי פרוסות מוצגת. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
איור 3 מראה, כיצד מבנים תאיים ניתן בעקבות במשך שעות רבות. כאן, centrosome בתוך translocating תאי הגנגליון ברשתית (RGCs) הוא נתפס.
איור 3:. לוקליזציה centrosome במהלך טרנסלוקציה תא גנגליון ברשתית מונטאז זה של ניסוי זמן לשגות מציגה את המיקום של centrosome ברחבי התא גנגליון ברשתית (RGC) התבגרות.בשנות ה אבות עצביים centrosome מותאמת קצה קצהו של תהליך הפסגה (1:00). במהלך חלוקת התא, שני centrosomes לשמש הקטבים עבור ציר mitotic (2:25). חלוקה זו התוצאה בתא בת אחת המבדיל לתוך RGC ו תא בת שני שהופך מבשר תא קולט אור. לאחר חלוקה, גוף התא של RGC translocates לצד הבסיס של הרשתית, ואילו תהליך הפסגה נשאר מחובר בצד הפסגה. לאחר RGC מגיע לצד הבסיס, תהליך הפסגה שלה מנתק ואת centrosome נוסע עם זה (06:15). Centrosome ניתן בעקבות בעוד חוזרת בה יחד בהדרגה עם תהליך הפסגה (6:50, 7:20, 8:10). בפריים האחרון (08:55) את תא גנגליון גדל האקסון מצד הבסיס שלה, בעוד centrosome עדיין מקומי apically. ביטוי הפסיפס הושג על ידי הזרקת DNA פלסמיד לתוך עובר סוג בר בשלב תא אחד. התאים הם דמיינו ידי Ath5: GFP-CAAX (ירוק) construct, אשר תוויות RGCs ו נוירונים אחרים. Centrosomes (ראשי חץ) מסומנים על ידי Centrin-tdTomato 29 הביטוי (מג'נטה). צד apical של הרשתית הוא בחלק העליון של התמונה ואת צד הבסיס בתחתית. תחזית העצמה המקסימלית של הספר עב-כרס 30 מיקרומטר מוצגת. התמונות היו קצוצות מסרט המכסה את הרשתית כולה. הסרט מתחיל ב הפריה סביב 34 שעות (hpf). ערימה z נרכשה כל 5 דקות במטרה W 40X / 1.0. זמן מוצג hh: mm. סרגל קנה מידה מייצג 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
באיור 4 הוא מוצג, איך ההתנהגות תא בודד יכול להיות מופק נתונים לכידת הרקמה כולה כמו סרט 1. טרנסלוקציה של RGC ניתן לעקוב בקלות תהליך apical ואת הבסיס שלהes אחריו.
איור 4:. טרנסלוקציה של תא גנגליון ברשתית יחיד טרנסלוקציה RGC מן הפסגה לצד הבסיס של הרשתית מתרחשת לאחר מיטוזה מסוף כמתואר באיור 3 RGC מסומן על ידי הביטוי של Ath5:. הפער-GFP 37 transgene. תחזית העצמה המקסימלית של הספר עב-כרס 30 מיקרומטר מוצגת. התמונות היו קצוצות מסרט המכסה את הרשתית כולה. הסרט מתחיל בסביבות 34 hpf. ערימה z נרכשה כל 5 דקות במטרה W 40X / 1.0. זמן מוצג hh: mm. סרגל קנה מידה מייצג 5 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5 מדגים את היכולת של LSFM מרובה תצוגות ללכוד רקמות SCתהליכים המוךפו"גנטי שהולכים אייל עם רזולוציה הסלולר על הדוגמא של morphogenesis כוס האופטי, שבמהלכה שלפוחית אופטית הופכת כוס אופטית. איכות התמונה ניתן לשפר במידה רבה על ידי הדמיה מרובה תצוגות, כאשר התמונה האחרונה בשילוב מן המידע מ- 5 תצוגות שונות (במקרה זה) לתוך ערימת z אחד עם רזולוציה איזוטרופיים. נתון זה ממחיש את השיפור באיכות תמונה לאחר היתוך משוקלל ורווח נוסף בניגוד תמונה ורזולוציה לאחר deconvolution המרובה תצוגות. האיור מציג שתי פרוסות אופטיות נטיות שונות באמצעות בסיס הנתונים. בנוסף, מונטאז 'מן הנתונים deconvolved מציג את morphogenesis הכוס האופטי לאורך זמן. כל נקודות הזמן אז מוצגות לצעוק 3.
איור 5: השוואה בין איכות תמונה בין תצוגה יחידה שתי שיטות multiview היתוך. (א) פרוסה אופטית אחד נתונים בתצוגה אחת לראות מן העין לרוחב (B) נוף הגבה. חפצי Stripe ושפלה של האות העמוק בתוך המדגם מורגשים. גם חלק של התמונה הגלויה בנתונים התמזגו (CF) לא נתפס לאור המסוים הזה. (C) אותן פרוסה אופטית, עכשיו כנתונים התמזגו מרובי תצוגות לראות מן העין לרוחב (D) הגבה נוף. שים לב חפצי פס מודחקים ומבנים עמוקים במדגם נפתרות טובים יותר. (E) אותן פרוסה אופטית חברה כפי מרובה תצוגות deconvolved נתונים המוצגים מן העין לרוחב (F) הגבה נוף. הערת הניגוד המוגבר החלטה כדי ממברנות התאים הבודדות הגרעינים יכולים להיות יפה מכובדות. ההחלטה אינה להתדרדר עמוק במיוחד בתוך המדגם. בסיס הנתונים נרכשו עם תאורה כפולה צדדים מ -5 נופים כ בנפרד 20 מעלות. ערימות z של abמתוך 100 מיקרומטר עם גודל 1.5 מיקרומטר צעד נרכשו בכל הנוף 10 מרווחי דקות במשך 10 שעות במטרה W 20X / 1.0. תמונות קלט עבור היתוך מרובה תצוגות ו deconvolution למטה נדגמו 2 × כדי לזרז את עיבוד התמונה. 15 חזרות של deconvolution מרובה תצוגות נוהלו. (ז) מונטאז מראה אזור חיתוך של הנוף הגבה מנתוני deconvolved כדי להדגיש את האירועים המוךפו"גנטי שהולכים במהלך התפתחות עין מוקדם מן השלפוחית האופטית לשלב כוס האופטית. שתי השכבות של השלפוחית האופטית, אשר בתחילה דומה epithelia עמודים, להתמיין אוכלוסיות תאים נפרדות. השכבה הדיסטלי הקרובה האפידרמיס הופכת neuroepithelium הרשתית (RN) ואת השכבה הפרוקסימלי קרובה הצינור העצבי הופכת אפיתל הפיגמנט ברשתית (RP). תאי RN להאריך ו invaginate כדי ליצור את הכוס האופטית (1:40 עד 5:00); באותו הזמן תאי RP לשטח. האאקטודרם המשטח מושרה להקים עדשה (01:40), מה עליי לעשותinvaginates ich מאוחר (5:00). הסרט מתחיל ב 17 hpf. זמן מוצג hh: mm. כל ממברנות התאים מסומנים על ידי אקטין β: ראס-GFP transgene וכל גרעינים מסומנים על ידי hsp70: transgene H2B-RFP. סרגל קנה מידה מייצג 30 מיקרומטר. FB מוח קדמי, עדשת LE, OP הרחת placode, neuroepithelium רשתית RN, RP הפיגמנט ברשתית האפיתל. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
סרט 3: morphogenesis כוס אופטיק מוצג עם תצוגה יחידה ושתי שיטות של היתוך מרובה תצוגות סרט הזמן לשגות ממחיש את התהליך השלם של morphogenesis כוס האופטי מן השלפוחית האופטית לשלב כוס האופטית.. זה מראה פרוסה אופטית בודדת מהתצוגה לרוחב (למעלה) ופרוסה אופטית בודדת מתצוגת הגבי (למטה). התאים של השלפוחית בפיתוח האופטית לעבור rearrangements המורכבת ולבסוף כדי ליצור את הכוס האופטית חצי כדור עם neuroepithelium ברשתית הפנימי אפיתל הפיגמנט ברשתית חיצוני. עדשה נוצרת מן האאקטודרם המשטח. זה invaginates יחד עם neuroepithelium ויושב הכוס האופטית. כל ממברנות התאים מסומנים על ידי ביטוי של אקטין β: ראס-GFP (ירוק) transgene ואת הגרעינים מסומנים עם hsp70: H2B-RFP (מג'נטה). הסרט מתחיל בסביבות 17 hpf. בסיס הנתונים נרכשו עם תאורה כפולה צדדים מ -5 נופים כ 20 מעלות זה מזה, az ערימות של כ -100 מיקרומטר נרכשו כל 10 דקות במטרת W 20X / 1.0. זמן מוצג hh: mm. סרגל קנה מידה מייצג 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
Discussion
1. צעדים ופתרון בעיות קריטיים עבור רכישת הנתונים
הגדרות ההדמיה האופייניות GFP ו RFP להביע מדגם ניתן למצוא בלוח 3. התקנת מיקרוסקופ תאר את גיליון האור הוא סטטי, שהוקמה על ידי עדשה גלילית. שני יעדי תאורת עדשות אוויר לבין מטרת הזיהוי היא עדשת מי טבילה. זום 1.0 עם 20X / 1.0 או 40X / 1.0 מטרות נותן 230 ננומטר גודל 115 ננומטר פיקסל שדה הראייה של 441 x 441 מיקרומטר או 221 x 221 מיקרומטר בהתאמה. מומלץ להשתמש עובי גיליון אור מחדל עם מרכז לגבול יחס 1: 2. עבור 20X / 1.0 עובי זה מתאים ל -4.5 מיקרומטר ועבור 40X / 1.0 ל 3.2 מיקרומטר במרכז. אם מהירות הדמיה אינה לצורך הראשוני, להשתמש מסלולים נפרדים במקרה של מדגם ססגוני להימנע crosstalk של פליטת קרינה בין הערוצים. המהירות של הרכישה הגבוהה ביותר לא תעלה על 50 msec לכל צעד z ידימהירות התנועה של נהג z. אם המטרה היא להשיג את מהירות הדמיה המרבית במקרה של, למשל, בשני מסלולים עם תאורה צדדית כפולה, זמן החשיפה צריך להיות מוגדרים כך שהסכום של כל התמונות שצולמו לכל צעד z הוא מתחת ל -50 מילים-שניות. מצד השני, אם תמונה אחת בלבד נרכשת לכל צעד z, זה לא מועיל כדי להגדיר את זמן חשיפה קצר מ -50 msec.
| גודל תמונה 1920 x 1920 |
| 16 סיביות |
| Pivot לסרוק על |
| תאורה צדדית כפולה עם פיוז'ן באינטרנט |
| מטרת תאורת 10X / 0.2 |
| 20X / 1.0 W המטרה זיהוי תוכנית-Apochromat |
| מסלול 1: עירור 488 ננומטר בדרך כלל 2% של 100 לייזר mW, 550 ננומטר מסנן פליטה SP |
| מסלול 2: עירור 561 ננומטר בדרך כלל 3% של 75 לייזר mW, 585 ננומטר מסנן פליטת LP |
| עד זמן חשיפה ל -100 מילי-שניות |
| עובי מחסנית Z 50-100 מיקרומטר |
| 1-1.5 מיקרומטר גודל צעד z במצב כונן z הרציף |
| דגירה על 28.5 ° C |
טבלה 3: הדמיה הגדרות.
בדיקת המדגם לאחר הניסוי
חשוב להבטיח כי הדגימה היא עדיין בריאה בסוף הניסוי. כתוצאת הודעה ראשונה, לבדוק את הדופק של הדגימה תחת stereoscope. עם זוג מלקחיים חדים המדגם ניתן לקחת מתוך agarose ועבר אל האינקובטור לפתח נוסף על מנת לבדוק אם הוא הושפע ההדמיה. לחלופין, הוא יכול להיות קבוע עבור מכתים נוגדן.
התקנה להיסחף
זה חיוני כדי לשמור על osmolarity של הים הקאמריolution קרוב osmolarity של agarose ההטבעה, אחרת נפיחות / מתכווץ של agarose וחוסר היציבות הבאה של המדגם יתרחש. לכן, להשתמש באותו פתרון (בינוני E3 ללא כחול מתילן) כדי למלא את התא ולהכין את aliquots נקודת התכה נמוכה agarose 1%. בנוסף, אל תשאירו את agarose בבלוק חימום C 70 מעלות במשך יותר מ 2 שעות, כפי שהוא יכול לאבד את המאפיינים gelling שלה.
אל תטמיע את הדג לתוך agarose החם מדי, כמו זה יכול להוביל לתגובת הלם חום או מוות של העובר. אם אינך בטוח לגבי ההשפעה של agarose החם על עובר, לבדוק כי הזנב לא מתכופף כי קצב הלב אינו להאט. במקרה זה, שימוש בעובר שונה עבור הניסוי.
שמור את אורכו הכולל של העמודה agarose עם מדגם קצר (כ -2 ס"מ) ואת הר דג הזברה עם הראש שלו מוטה קצה הבוכנה. כמו כן, גליל agarose הנמתח מן capillהאר"י צריך להישמר קצר ככל האפשר. צעדים אלה יבטיחו יציבות של המדגם לאורך כל הסרט. במקביל, בעמודת agarose צריכה להיות מספיק ארוכה כדי נימי הזכוכית עוצמה אינה מגיעות לתוך נתיב האור, כמו זה יגרום שבירה עיקרית והשתקפות.
הסחף הראשוני של המדגם נגרם על ידי השינויים בנפח של גליל agarose עצם. זזה של הבוכנה היא לא הסיבה לכך. לכן, זה לא עוזר לתקן את הבוכנה עם פלסטלינה או לק. העובר עשוי לשנות את עמדתה במהלך הסרט בשל הריבוי הטבעי שלה מדי. בהתאם לכך, רצוי למרכז את האזור של עניין באמצע שדה הראייה ולשמור קצת מקום בקצוות כדי להכיל תנועות אלה.
כמות מופחתת של מדיום מוטבע נתיב האור
המכוון את המדגם בצורה נכונה מסייע להשיג את איכות התמונה הטובה ביותר האפשרית 15. גֵןעצרת, עירור ופליטת אור צריכה לנסוע דרך רקמות קטנות כמו ומדיה גוברת ככל האפשר. הפתרון האופטימלי הוא הרכבת agarose חינם. זו הושגה למשל בתוך התקנת הדמיה ארבידופסיס לרוחב שורש 14, שבו השורש הראשי היה רכוב לתוך Phytagel ואת השורשים לרוחב ובהמשך הושכרו לצמוח מתוך טור ג'ל לחלוטין. הרכבת Agarose ללא גם פותחה עבור הדמיה של העובר המלא של חיפושית Tribolium במשך ימים 12. שיפור איכות תמונה לא היה מניע עיקרי במקרה זה. עוברים Tribolium פשוט אינם שורדים בתוך agarose מספיק זמן. הרכבת תקשורת ללא הטבעה בהחלט לא הושגה הדמיה לטווח ארוכה של דג זברה. ובכל זאת, אנחנו יכולים לנצל את העובדה שכאשר מתמצק agarose, רוב העוברים ממוקמים באלכסון הנימים עם עין אחת ממוקמת עמוק בתוך agarose והעין השנייה להיות קרוב לפני השטח של טור ההטבעה. Tהוא עין קרובה לפני השטח מספקת איכות תמונה מעולה ולכן צריך להיות צלמה מועדף.
ריכוז agarose והדמיה לטווח ארוך
ריכוז agarose עבור ההרכבה הוא פשרה בין היציבות של המדגם ואת האפשרות לענות על צרכי גידול של עובר דיפוזיה של חמצן אליו. אין רווח נוסף ביציבות המדגם בעת שימוש בריכוזים agarose גבוה מ -1%. כנקודת מוצא לייעול הניסויים אנו ממליצים agarose 0.6%, אשר מתאים גם עוברים מתחת לגיל 24 hpf כי הם עדינים מכדי להיות מותקן לתוך 1% agarose. כדי לטשטש עוברים מבוגרים וזחלים, ריכוז MS-222 ניתן להעלות עד 200 מיקרוגרם / מ"ל ללא תופעות לוואי 13.
במקרה עוברים בפיתוח הם צילמו במשך יותר ± 12 שעות, agarose הרכבה אינו מומלץ, מכיוון שהוא מגביל את הצמיחה של העובר ואת קאוסes עיוות זנב. בעיה זו נפתרה עבור דג זברה על ידי הרכבה עוברת לתוך צינורות פולימר FEP עם מקדם השבירה דומה להשקות 13,39. עוברי עכברים, מצד שני, יכול להיות משותקת בבלונים agarose חלול 40 או חורים של מוט אקרילי מצורף מזרק 41. למרות הרכבת צינור FEP אינה מומלצת כשיטת ברירת מחדל, כי הקיר של הצינור ומשגר את האור קצת יותר מ agarose.
יישור וכו 'אור
לקבלת איכות תמונה טובה הוא קריטי כדי לבצע יישור גיליון האור האוטומטי לפני כל ניסוי. במיוחד אם הגדרות הזום שונו, המטרות הוצאו, או נוזל אחר שימש בתא.
תְאוּרָה
סריקת הציר של גיליון האור תמיד צריכה להיות מופעלת. עבור דגימות גדולות פיזור, יש צורך להחיל את התאורה דו צדדית עם f מקווןusion להשיג אפילו תאורה ברחבי שדה הראייה. תאורה צדדית כפולה גם פוחתת בעיה ספציפית של הדמית העין, המהווה את השבירה של גיליון האור הנכנס על ידי העדשה של העובר. קטנות יותר, פחות דגימות פיזור ניתן הדמיה ביעילות באמצעות תאורה צדדית יחידה, מה שמקצר את זמן ההדמיה בחצי ויכול לגרום איכות תמונה מעט טובה יותר בהשוואת תאורה דו צדדית. הסיבה לכך היא כי שבילי האור עבור שתי זרועות התאורה הם תמיד שונים ואת האחד יעיל יותר יכול להיבחר. בנוסף, שתי יריעות האור המגיע מכל צד הם לא מושלמים במישור אחד, מה שגורם קל טשטוש לאחר ההיתוך. לאירועים תאיים מהר מאוד, כמו microtubules גדל (הסרט 2), התאורה דו הצדדית אינה מתאימה, שכן תמונות עם תאורה מימין ומהשמאל נרכשים ברצף, אשר עלול לגרום הצעה לטשטש.
photobleachingו phototoxicity
פחות photobleaching fluorophore לעתים קרובות מוזכר כיתרון העיקרי של LSFM. היינו טוענים כי המטרה צריכה להיות לא photobleaching בכלל. אם יש photobleaching מורגש בניסוי ההדמיה לחיות, הדגימה היא כנראה כבר מחוץ לטווח שלה הפיזיולוגי של חשיפת ליזר נסבלת. כאשר ההדמיה עוברי דג הזברה במיקרוסקופ הדיסק מסתובב, מניסיוננו, phototoxicity הגבוהה יכולה לעכב התפתחות העובר עוד לפני מלביני אות הניאון ניכר. לכן, הגדרות ההדמיה ב LSFM צריכים להיות מותאמות כך photobleaching מעט או ללא הוא ציין. למרות LSFM הוא עדין על מדגם, זה נבון להשתמש רק כמו הרבה כוח לייזר וזמן חשיפה ארוך יותר לפי הצורך כדי להשיג יחס אות לרעש מספיק לניתוח נתונים עוקבות.
Z- מחסנית, מרווחי זמן וגודל נתונים
את הקבצים שנוצרו על ידי LSFM הם בדרך כלל גדולים מאוד; לפעמים בטווח טרה. זה לעתים קרובות יש צורך לעשות פשרה בין איכות התמונה ואת גודל הנתונים. זהו במיוחד במקרה של ריווח z של ערימות ומרווחות ב רכישות הזמן לשגות. כדי להגדיר את מרווחי z, לחצן אופטימלית בכרטיסייה כלי Z- מחסנית רצוי לשמש, במיוחד אם הנתונים יהיו deconvolved מאוחר יותר. היא מחשבת את המרווח להשיג חפיפת 50% בין פרוסות אופטיות השכנות. ובכל זאת, קצת במרווחי z גדולים הם בדרך כלל מקובל. הם להפחית את הזמן הנדרש כדי לרכוש את מחסנית z וכן את גודל הקובץ הסופי. דגימת הזמן האופטימלית תלוי בתהליך של עניין. עבור עין הכולל במרווחי פיתוח 5-10 דקות הם בדרך כלל מקובל. אם חלק מהבנים הם להיות במעקב אוטומטי, נקודות הזמן עוקבות חייבות להיות דומות מספיק.
חרוזי פלורסנט
חרוזים פלורסנט לשרת בעיקר כסמנים fiducial לרישום תצוגות שונותשל מערך נתונים מרובי תצוגות אחת על גבי שני. תמיד מערבולת הפתרונים החרוזים ביסודיות לפני השימוש. אין לחמם את החרוזים כמו זה יכול להוביל לאובדן של צבע פלואורסצנטי. ריכוז החרוז האופטימלי עבור הרישום המרובה תצוגות צריך להיקבע באופן ניסיוני. התוסף תאר עובד הכי טוב עם כ -1,000 חרוזים זוהו במהלך כל נוף. גדולים יותר (500 ננומטר או 1,000 ננומטר) חרוזים מזוהים יותר וחסונים יותר קטנים (פחות מ -500 ננומטר) חרוזים. הסיבה לכך היא כי חרוזים גדולים בהירים והם קלים יותר קטע ללא לתגליות חיוביות כוזבות של מבנים במדגמים. החסרון של החרוזים הגדולים הוא שהם מאוד בולטים בתמונה התמזגה ו deconvolved הסופית. עבור כל בסמן פלורסנטי חדש, גודל החרוז המתאים פליטת קרינה צריכות להיות מותאם. כדי לתת דוגמא של מדגם מהתרשים 5 ו- Movie 3, 100 חרוזי פליטה ירוקים ננומטר נתנו יותר מדי לתגליות חיוביות כוזבות בערוץ הקרום-GFP, אבל 1,000 nפליטה מ אדומה חרוזים אותרו וחסונה בערוץ H2B-RFP עם לתגליות חיוביות מעט מאוד בתוך המדגם. אם זיהוי החרוז נכשל בערוץ עם בסמן פלורסנטי, ערוץ נפרד רק המכיל חרוזים ניתן לרכוש, אבל זה לא מאוד פרקטי. החרוזים בגודל תת ברזולוציה לתת readout ישיר של הפונקציה התפשטות נקודה (כוחות הביטחון הפלסטינים) של המיקרוסקופ, אשר ניתן להשתמש בהם עבור פישוט (איור 2 ג-ד). אם רישום ואיחוי עובד טוב יותר עם חרוזים גדולים (למשל 1,000 ננומטר), תמונה נפרדת של כוחות הביטחון הפלסטינים ניתן לרכוש עם רזולוציה משנה, למשל, 100 חרוזים ננומטר. באמצעות חרוזים ססגוניים מועיל במהלך הרישום של רכישה רבה ו לאימות שמכסה ערוצים מושלמים.
תוספת של חרוזי ניאון אינה הכרחית כאשר הדמיה מתצוגה יחידה ללא רישום מרובה תצוגות עוקבות ופיוז'ן. עם זאת, גם במקרים אלה חרוזים יכול להיות מועיל במהלך initiaהתאמת l גיליון אור, לבדיקת איכות הגיליון הקל ובאופן כללי לחשוף סטיות אופטיות. סטיות אופטיות כזה עשויות לנבוע ממקורות שונים כמו מטרות פגומות או מלוכלכים, חלונות מלוכלכים של החדר או הומגניות agarose. חרוזים יכולים לשמש גם עבור תיקון להיסחף על ידי הרישום המרובה תצוגות פיג'י תוסף 20.
מרובה תצוגות
לצורך השחזור המרובה תצוגות, עדיף לרכוש מספר אי זוגי של נוף 3, 5 וכן הלאה, אשר אינם מנוגדים זה לזה. זה משפר deconvolution מאז PSFs הם צילמו מכיוונים שונים. כמו כן, חשוב לאשר בתחילת רכישת הזמן לשגות כי קיימת חפיפה מספקת בין הנופים. זה נעשה הכי טוב אמפירי, כלומר, מייד המאשר שההשקפות בנקודה לראשונה ניתן לרשום בהצלחה. כאשר המטרה של הרכישה המרובה התצוגות היא להגדיל את הרזולוציהשל דימוי של דגימת פיזור גדולה, זה לא מומלץ לתדמית הדגימה כולו בכל תצוגה, אבל לעצור סביב מרכז המדגם, שם האות מידרדר. הרכישה באיכות הנמוכה מן המחצית השנייה של הדגימה לא הייתה מוסיפה מידע שימושי בשחזור המרובה התצוגות.
2. צעדים ופתרון בעיות קריטיים עבור עיבוד הנתונים
אולם, קיימות כיום מספר אפשרויות לעיבוד נתונים מרובים תצוגות מ מיקרוסקופ גיליון אור המתועדים היטב יחסית קל לאמץ. אנו להשתמש ביישום השיקום מרובה תצוגות, שהיא תוכנת קוד פתוח מיושם פיג'י 32 (סטפן Preibisch לא פורסם, 1a קישור ו Link1b ב רשימת חומרים). תוסף זה הוא לעצב מחדש עיקרי של תוסף רישום SPIM הקודם 20, ביקורתעל ידי שמייד et al. 42, שילוב BigDataViewer ו- XML שלה HDF5 בפורמט 33 עם עבודת רישום SPIM (איור 1B, קישור 2 , קישור 3 ). יישום זה יכול להיות גם מותאם אשכול מחשוב עתיר ביצועים, אשר מאיץ באופן משמעותי את העיבוד 43. בקשה לרישום מרובה תצוגות זו פותחה באופן פעיל נוספת שומרת שיפור. במקרה של בעיות או בקשות תכונות עבור התוכנה המתוארת, הגש בעיות בדפי GitHub בהתאמה ( קישור 4 עבור מרובה תצוגות לשיקום קישור 5 עבור BigDataViewer).
האפשרות השנייה היא להשתמש בתוכנה המסחרית הזמינה יחד עם מיקרוסקופ. פתרון זה עובד היטב ומעסיק אותו העיקרון של שימוש חרוזי ניאון לרשום את הדעות השונות. עם זאת, היא חסרה את האפשרות לדמיין את בסיס הנתונים כולו מהר כמו עם BigDataViewer. כמו כן התוכנה יכולה לא להיות מותאם באשכול ויתר על כן את אבני עיבוד המיקרוסקופ למשתמשים אחרים, אלא אם כן רישיון נוסף עבור התוכנה נרכש.
האפשרות השלישית, שהיא גם תוכנת קוד פתוחה, פורסמה לאחרונה על ידי מעבדת קלר 44 ומספקת מסגרת מקיפה לעיבוד וניתוח במורד זרם של נתוני גיליון האור. תוכנה זו היא באמצעות מידע מתוך המדגם לבצע היתוך מרובה תצוגות, ולכן היא אינה דורשת נוכחות של חרוזי ניאון סביב המדגם. אבל בעת ובעונה האחת הוא מניח אורינטציה מאונכת של נופי ההדמיה (מטרות), ולכן אינו יכול לשמש נתונים רכשו מזוויות שרירותיות 44.
דרישות חומרה
ntent "> החומרה המשמשת לעיבוד ניתן למצוא בטבלה 4. שם צריך להיות מספיק נפח אחסון וצנרת ברורה לעיבוד נתונים זמינה, לקראת הניסוי בפועל. רכישת התמונות מהירה יותר לניתוח שלאחר מכן והוא קל כדי לקבל מוצף נתונים לא מעובדים. זה בדרך כלל לא מציאותי כדי לאחסן את כל תמונות הגלם, אלא גרסה קצוצה או עיבוד תמונות כמו נוף התמזג, תחזיות בעצמה מקסימלית או תחזיות כדוריות 45.| מעבד | שני Intel Xeon Processor E5-2630 (Core שש, 2.30 Turbo GHz, 15 מגה בייט, 7.2 GT / sec) |
| זֵכֶר | 128 GB (16 × 8 GB) 1600 MHz DDR3 ECC RDIMM |
| דיסק קשיח | TB 4 × 4 ATA סידורי 3.5inch (7.200 סל"ד) כונן קשיח |
| בקר HDD | PERC H310 SATA / SAS Conטרולר עבור Precision של Dell |
| תצורת HDD | C1 SATA 3.5 אינץ ', 1-4 דיסקים קשיחים |
| גרָפִיקָה | Dual 2 GB NVIDIA Quadro 4000 (2 כרטיסי w / 2 DP & 1 DVI-I אחד) (2 DP-DVI & 2 מתאם DVI-VGA) (MRGA17H) |
| רֶשֶׁת | אינטל X520-T2 יציאה כפולה 10 GbE ממשק רשת כרטיס |
לוח 4: דרישות חומרה.
מהירות עיבוד נתונים
הזמן הנדרש לעיבוד נתונים תלוי הממדים הנתונים על החומרה בשימוש. בלוח 1, אנו מספקים סקירה של הזמן הנדרש עבור השלבים העיקריים בעיבוד מערכת נתונים מרובים תצוגות 8.6 למשל GB שכללו 1 נקודת זמן עם 4 תצוגות 2 ערוצים.
| עיבוד שלTEP | זְמַן | צעד פרוטוקול |
| שמור מחדש כמו HDF5 | 6 דקות 30 שניות | 6.3 |
| זיהוי נקודות עניין | 20 שניות | 6.4 |
| הירשם באמצעות נקודות עניין | 3 שניות | 6.5 |
| היתוך מרובה תצוגות מבוססות תוכן | 4 שעות | 7.2 |
| deconvolution מרובה תצוגות (CPU) | 8 שעות | 7.3 |
| deconvolution מרובה תצוגות (GPU) | 2 hr | 7.3 |
טבלה 1: זמן עיבוד נתונים.
תבניות נתונים קלט לשיקום מרובה תצוגות
השיקום מרובה תצוגות Plugin פיג'י יכול לתמוך .czi, .tif ותבניות ome.tiff. בשל מבנה הנתונים של פורמט .czi, מערכי נתונים רציפים אינםנתמך ללא עיבוד מראש. רציף כלומר ההקלטה הייתה צורך להפעיל מחדש (למשל לכוון מחדש את העמדות הנובעות מסטייה של המדגם). במקרה זה את הקבצים .czi צריך להיות resaved כמו tif. לקבלת .tif קבצים אחד נוף וכיוון תאורה צריך להיות נשמר כקובץ נפרד.
כיול של גודל פיקסל
תוכנת מיקרוסקופ-ההפעלה מחשבת את הכיול עבור גודל XY פיקסל המבוסס על המטרה שנבחרה. עם זאת, גודל פיקסל z מוגדר באופן עצמאי על ידי גודל הצעד. אם מטרה לא בסדר מצוין תוכנת XY יחס z שגוי ואת הרישום ייכשל.
רישום ראשוני
לאחר הגדרת בסיס הנתונים מספר האנשים הרשומים יהיה 1 ומספר נקודות עניין יהיה 0 בסייר ViewSetup. ההרשמה הראשונית מייצגת את הכיול של בסיס הנתונים. הוא מספר oרישומי f ונקודות ריבית יגדילו במהלך עיבוד.
למטה דגימה לאיתור נקודות עניין
באמצעות מטה דגימה מומלצת, מאז הטעינה של הקבצים ואת הפילוח יהיה הרבה יותר מהר. זה אולם חשוב לציין כי פרמטרי זיהוי ישתנו בהתאם הדגימה למטה, ובכך העברת הגדרות זיהוי בין הגדרות מדגמות למטה שונות אינו אפשרי.
איתור של נקודות עניין
רצוי לפלח כמה שיותר חרוזים נכון ככל האפשר בכל תצוגה, אפילו במחיר של בהשגת חלק לתגליות חיוביות כוזבות, כי הם לא לעכב את הרישום ניכר. לתגליות מזויפות, אם כמה במספרים, מודרים במהלך ההרשמה (ראה רישום של נקודות עניין). עם זאת, לתגליות חיוביות כוזבות מסיביות להוות בעיה לאלגוריתם. זה לא רק מקטין את ביצועים לאיתורהרישום, מאז זה לוקח הרבה זמן כדי לפלח את התמונה, כמו גם להשוות חרוזים אלה בין התצוגות, אבל זה גם מקטין את הדיוק של הרישום. זה יכול להיות ממוען באמצעות פרמטרי איתור מחמירים יותר. בנוסף, על פילוח של חרוזים (כלומר מספר לתגליות על 1E אחד חרוז איור) הוא מזיק על רישומו יש להימנע.
רישום של נקודות עניין
כדי לרשום את הנוף על אחד את השני, את המיקום של כל חרוז בכל תצוגה מתואר על ידי עמדתה בקשר לשלושת חרוזי השכנות הקרובים ביותר שלו. הכוכבים האלה מקימים מתאר גיאומטרי מקומי ולאפשר השוואה כל חרוז בין התצוגות. חרוזים תואמים מתאר בין שתי השקפות אז נחשבים התכתבויות מועמד. שים לב שזה עובד רק עבור חרוזים המתפזרים באופן אקראי, אשר המתארים המקומיים הם בדרך כלל ייחודיים עבור כל חרוז.אפשר להשתמש מבנים אחרים כגון גרעינים במדגם לרישום. עם זאת, על מנת לזהות גרעינים, אשר מופצים הלא אקראי במדגם, שיטות אחרות להחיל 20,21.
ההקבלות המועמדות אז נבדקות נגד RANSAC 36 כדי לכלול תוצאות חיוביות שגויות. כל התכתבות היא הצעת מודל שינוי עבור שכיסה את הדעות על אחד את השני. התכתבויות נכונות תסכמנה סביר לדגם טרנספורמציה אחד, ואילו חריגים היו כל נקודה לחשבון אחר. ההקבלות נכון אז משמשות לחישוב מודל שינוי מאוחד בין שתי ההשקפות בהשוואה. אופטימיזציה גלובלית עם אלגוריתם אופטימיזציה איטרטיבי מכן מתבצעת, שבמהלכה כל הצפיות רשומות אל הנוף הראשון במטרת תזוזה מינימאלית בין התצוגות 20,21.
רישום זמן לשגות
בשל לעבורment של התנועה המוטורית agarose ולא מדויקת של במת מיקרוסקופ, את המיקום של כל מחסנית משתנה באופן מתון לאורך זמן. בעוד הרישום של נקודת הזמן הבודדה מסיר את ההבדל בין התצוגות של נקודת זמן זו, הזמן לשגות גם צריכה להיות רשום בכללותה. לשם כך, בכל נקודת זמן בודדת רשומה על נקודת זמן הפניה.
נקודת זמן הפניה
אם סדרה עתית עם נקודות זמן רבות מעובד, בנקודת זמן נציג נבחרה כנקודת התייחסות בדרך כלל מאמצע סדרת הזמן מאז עוצמות החרוז יכולות לבזות לאורך זמן בשל לבן. על הפניה זו, הפרמטרים לגילוי נקודת עניין, רישום, תיבה תוחמת ואיחוי ניתן לקבוע. פרמטרים אלה לאחר מכן מוחלים על הזמן לשגות כולו לחשב מודל שינוי מבוקש עבור כל נקודת זמן בודדת. במעמד הרישום לאתר זמן לשגות בכל נקודות הזמן אחרים הם גם registered מרחבית על נקודת זמן הפניה זו. לפיכך פרמטרי התיבה התוחמת עבור ההקלטה השלמה תלוי בנקודת הזמן הספציפית הזו.
רישום רב תעלות
כאשר הדמית ערוצים מרובים, באופן אידיאלי באותו החרוזים ניאון צריכים להיות גלויים בכל הערוצים צלמו. האיתור והרישום אז יכולים להתבצע על כל ערוץ בנפרד, אשר לוקח בחשבון את השפעת אורכי הגל באור האחר את השינוי. לעתים קרובות הדבר אינו אפשרי, משום חרוזים אינם גלויים בכל הערוצים או חרוזים הם שולטים התמונה יותר מדי בערוץ אחד ו עמומים מדי בערוץ השני (ים). הפתרון הטיפוסי הוא להשתמש חרוזים גלויים רק ערוץ אחד עבור זיהוי והרישום ומודל טרנספורמציה רכש (כלומר לאחר זיהוי, רישום ורישום הזמן לשגות) מוחלים אז לערוצים האחרים על ידי פיג'י> Plugins> המרובה תצוגות Reconstruction> עיבוד אצווה> כלים> טרנספורמציות כפולים. בשנת התפריט הנפתח עבור החל טרנספורמציות של ערוץ בחר אחת לערוצים אחרים. בחלון הבא בחר XML ולחץ על אישור. אז בחר את הערוץ המכיל את החרוזים כערוץ מקור כערוץ יעד בחר בערוץ (ים) ללא חרוזים. עבור כפולים אשר טרנספורמציות להשתמש החליפו את כל התמורות והלחץ. התמורות אז מועתקים כל הערוצים האחרים והציל ב- XML. כדי לראות את טרנספורמציות חדש Explorer ViewSetup, הפעל מחדש את יישום שחזור מרובה תצוגות.
תיבה תוחמת
השילוב של תצוגות מרובות מחשוב מאוד אינטנסיבי. עם זאת, תמונות גדולות בדרך כלל נרכשות כדי להתאים לא רק את המדגם, אלא גם את החרוזים סביבו. לאחר פרמטר הרישוםהים מחולצים החרוזים, הם כבר לא שימושיים כחלק מהתמונה. לכן, כדי להגביר את היעילות של היתוך, רק את החלקים של ערימות התמונה המכיל המדגם צריך להיות התמזגו יחד. אזור של אינטרס (תיבה תוחמת) צריך להיות מוגדר להכיל המדגם קטן כמו של agarose שמסביב ככל האפשר. לצורך הדוגמא באיור 2 שילוב ממוצע משוקלל על כל הנפח עם 2229 × 2136 × 2106 פיקסלים ידרוש 38,196 מגה בייט של זיכרון RAM, ואילו עם תיבה תוחמת הנפח מצטמצם 1634 × 1746 × px 1632 ואת דרישות הזיכרון מופחתות כדי 17,729 מגה.
היתוך מרובה תצוגות מבוססות תוכן
אתגר פיוזינג נתונים מרובים תצוגות הוא שההשקפות בדרך כלל מסתיימות באופן חד ואינם מכילות את אותה איכות תמונה עבור אותה ווקסלים. מיצוע פשוט של הנופים ולכן היה להוביל חפצי ערבוב שפלת תמונה מיותרת. פו מרובה תצוגות מבוססות תוכן שיאון לוקח את שתי הבעיות הללו בחשבון. ראשית, הוא משלב את תצוגות שונות, שם תמונה אחת מסתיים והשני מתחיל והשני, הוא מעריך את איכות התמונה המקומי ומחיל משקלים גבוהים לאיכות תמונה גבוהה יותר היתוך 21. לעומת תצוגה יחידה חל שיפור של ההחלטה z עם שפלה קלה של האות ב XY (איור 2E-H, איור 5 א-ד).
deconvolution מרובה תצוגות
deconvolution המרובה תצוגות הוא גישה אחרת כדי להשיג את ההיתוך של הנופים. באמצעות שיטה זו גם PSFs של התצוגות השונות נלקח בחשבון על מנת לשחזר את התמונה כי כבר ומפותל ידי אופטיקה של המיקרוסקופ. שיטה זו באופן דרסטי משפר את איכות התמונה על ידי הסרת לטשטש תמונה והגדלת הרזולוציה והחדות של האות 31 (איור 2 ג-ד, איור 2I-J, איור 5E-G, סרט 3).
ve_content "> Deconvolution מחשוב מאוד אינטנסיבי (ראה טבלה 1), ובכך באמצעות GPU לעיבוד מגדיל את המהירות של התהליך הזה. זה יכול להיות גם צורך לבצע את deconvolution על נתונים מדגמיים למטה. כדי מדגם למטה, להשתמש פיג'י> שחזור מרובה תצוגות > עיבוד יצווה> כלים> החל טרנספורמציות. זה יחול מודל שינוי חדש על ההשקפות תישמרנה בקובץ xml.פורמט קובץ HDF5 עבור BigDataViewer ו BigDataServer
BigDataViewer 33 מאפשר הדמיה קלה של נתונים טרה בגודל. כיצד לשלוט על BigDataViewer מסוכמת בטבלה 2. צילום מסך של הפעולה הבסיסית של התכנית זמין גם כתוספת בפרסום המקורי 33. BigDataViewer מתמקדת בקובץ XML, אשר מכיל את metadata, ואת קובץ hdf5, המכיל את נתוני התמונה. נתוני הדמות הם presאף אוזן גרון בבית hdf5 ברמות רזולוציה מרובות בבלוקי 3D. רמות הרזולוציה המרובות מאפשרות לדמיין את הנתונים מהר יותר עם רזולוציה נמוכה יותר, לפני ברזולוציה המלאה היא טעונה. בלוקים בודדים נטענים לזיכרון רק בעת הצורך. לפיכך, פורמט התמונה hdf5 מאפשר הדמיה ישירה ומהירה של נתונים דרך BigDataViewer 33. זה גם מזרז עיבוד מאז הטעינה של הקבצים מתבצעת בצורה יעילה יותר. לכן, אנו ממליצים resaving בסיס הנתונים לפורמט הזה, על אף שהוא אינו נדרש להקפיד על עיבוד הנתונים. להסבר נוסף של הנתונים בפורמט, עיינו קישור 3 . בנוסף, מערכי הנתונים ניתן לשתף עם משתפי פעולה או לציבור באמצעות BigDataServer 33 ( הקישור 6 ).
| מַפְתֵחַ | |
| F1 | מציג את העזרה עם תיאור קצר של BigDataViewer ותפעול הבסיסי שלה |
| <> או גלגל העכבר | תנועת z |
| למעלה ולמטה | זום פנימה והחוצה |
| לחץ וגרור תקינים | נע מדגם במציג |
| לחץ וגרור שמאלה | מסתובב מדגם סביב הסמן |
| מחוון בתחתית של הצופה או כרטיסיית חץ שמאלה או ימינה | מהלכים על ציר הזמן |
| בנוסף לחיצה משמרת | תנועה או סיבוב מהיר לאורך כל ציר |
| חץ x ולאחר מכן שמאלה וימינה | מסתובב סביב ציר x |
| חץ y ולאחר מכן שמאלה וימינה | מסתובב סביב ציר y |
| z ואז חץ שמאלה-ימינה | מסתובב סביב ציר z |
| משמרת ו- x | מכוון את הנוף לאורך ציר x |
| משמרת ו- y | מכוון את הנוף לאורך ציר y |
| משמרת z | מכוון את הנוף לאורך ציר Z |
| אני | מתגים בין מצבי אינטרפולציה שונים (שכן הקרוב כלומר ו טריליניארי) |
| ים או הגדרות> בהירות וניגודיות | משנה את הצבע של הערוצים, הבהירות והניגודיות |
| F6 או הגדרות> ראות וקיבוץ | משנה את הקבוצות המוצגות, מאפשר קיבוץ כדי שכיסה קבוצות שונות וקוראים הקבוצות באמצעות מקשי הספרות |
| F10 או כלים> קלט סרט | רוכש סדרה עתית של הפרוסה המוצגת כעת |
טבלה 2: מציג נתונים ביג.
3. מגבלות על ביצוע המתואר של LSFM
תפוקה נמוכה
בניסוי LSFM אופייני רק דגימה אחת הניסוי צילמו. ובכל זאת, הניסיון שלנו, הרבה מידע שימושי יכול להיות מופק כי מדגם יחיד. הדמית תפוקה גבוהה של עוברים מרובים הושגה לאחרונה ב setups LSFM שנבנה באופן עצמאי 46-48, אם כי בדרך כלל על חשבון חופש מיצוב מדגם והסיבוב.
עמוק חדירה מספיק לרקמות
למרות עוברי דג זברה הם שקופים, איכות התמונה המתקבלת מתדרדרת במהירות כאשר הדמיה עמוקה ברקמה בשל פיזור וספיג. חלקית זה אפקט של פיזור וספיגה של הקרינה הנפלטת במדגם ולא ניתן לתקן את ההגדרה הנוכחית. מקור נוסף של איכות תמונה לא האחידה הוא בהארה הסדירה. Tהוא גיליון האור הוא האירוע מצד שמאל או ימין וכל עצם שנקרה בדרכו לשבור אותו, שתוצאתה חפצים פס לטשטש. היתוך תאורה מרובה תצוגות דו צדדי יכול לצמצם את החפצים בתמונה הסופית. לבסוף, את איכות התמונה נוטה להיות קצת יותר גרוע כלפי השולים של שדה הראייה עקב הגיאומטריה הטבעית של גיליון האור, אשר הופך עבה לכיוון הקצוות.
מניפולציה כימית מוגבלת
השימוש בתרופות או מעכבים נפוץ במחקר דג זברה. בשימוש במיקרוסקופ זה של תרופות הוא מוגבל, בשל הנפח הגדול של החדר המדגם ושיקולים של משתמשים אחרים של המכשיר, אשר חולקים את אותה לתא. באמצעות חדר נוסף מוקדש ניסויי תרופה יכולה לפתור את הבעיה. מילוי התא חלקי עם חרוזי זכוכית מפחית את נפח הנוזל נדרש.
אין עיבוד תמונה מגמתי
currently אין אפשרות של מניפולציה אופטית מקומית כמו photoconversion, או אבלציה ליזר מיקרוסקופ זה. אף על פי כן, setups שנבנה באופן עצמאי יכול לשמש עבור יישומים ספציפיים כאלה.
4. יישומי משמעויותיה בעתיד
LSFM היא השיטה הטובה ביותר קיימת עד כה הדמיה מהירה של כמויות גדולות של עובר לחיות. רוב הניסויים על הדעת על מיקרוסקופ confocal יכול גם להתבצע על מיקרוסקופ גיליון אור עם היתרונות הנ"ל. במקרה של הדמיה של התפתחות עין, מהירות LSFM אינה הפרמטר המכריע. במקום זאת, phototoxicity והגמישות הנמוכות במיצוב מדגם הם היתרונות המכריעים.
נתוני LSFM יש SNR גבוהה, אשר מסייעת להשיג תוצאות deconvolution טובות והוא גם מועיל לניתוח תמונה אוטומט אובייקט מעקב. לסיכום, LSFM הוא כלי נהדר ליצירת נתונים מדידים על התפתחות עוברית overaתא ל"ל מאפייני רקמות עבור מודלים עתידיים תיאורים פיסיים של התהליכים מדוברים.
Disclosures
פרסום מאמר וידאו זה נתמך על ידי Zeiss.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lightsheet Z.1 microscope | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Low melting point agarose | Roth | 6351.1 | |
| Low melting point agarose | Sigma | A4018 or A9414 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB/MS-222/Tricaine) | Sigma | E10521 | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma | P7629 | |
| 500 nm red fluorescent beads F-Y 050 | Millipore (Estapor) | 80380495 | |
| 20 μl (1 mm inner diameter, marked black) capilllaries | Brand | 701904 | sold as spare part for transferpettor |
| Teflon tip plungers for 20 μl capillaries | Brand | 701932 | sold as spare part for transferpettor |
| Circular glass coverslips diameter 18 mm, selected thickness 0.17 mm | Thermo scientific (Menzel-Glaser) | ||
| O-rings for chamber windows 17×1.5 mm | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Tweezers, style 55 | Dumont | 0209-55-PO | |
| 50 ml Luer-Lock syringes | Becton Dickinson | 300865 | |
| 150 cm extension cable for infusion compatible with Luer-Lock syringes | Becton Dickinson | 397400 | |
| Links | |||
| Link 1 Multiview reconstruction application | https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration http://fiji.sc/Multiview-Reconstruction |
||
| Link 2 BigDataViewer | https://github.com/bigdataviewer | ||
| Link 3 BigDataViewer | http://fiji.sc/BigDataViewer | ||
| Link 4 Multiview reconstruction application-issues | https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration/issues | ||
| Link 5 BigDataViewer-issues | https://github.com/bigdataviewer/bigdataviewer_fiji/issues | ||
| Link 6 BigDataServer | http://fiji.sc/BigDataServer |
References
- Pantazis, P., Supatto, W. Advances in whole-embryo imaging: a quantitative transition is underway. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (5), 327-339 (2014).
- Truong, T. V., Supatto, W. Toward high-content/high-throughput imaging and analysis of embryonic morphogenesis. Genesis. 49 (7), 555-569 (2011).
- Keller, P. J. Imaging Morphogenesis: Technological Advances and Biological Insights. Science. 340 (6137), 1234168-1234168 (2013).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens. J Microsc. 170 (Pt 3), 229-236 (1993).
- Jemielita, M., Taormina, M. J., DeLaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques. J Biophoton. 6 (11-12), 920-928 (2012).
- Stelzer, E. H. K. Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology. Nat Meth. 12 (1), 23-26 (2015).
- Chen, B. C., Legant, W. R., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998-1257998 (2014).
- Keller, P. J., Ahrens, M. B. Visualizing Whole-Brain Activity and Development at the Single-Cell Level Using Light-Sheet Microscopy. Neuron. 85 (3), 462-483 (2015).
- Pampaloni, F., Chang, B. -J., Stelzer, E. H. K. Light sheet-based fluorescence microscopy (LSFM) for the quantitative imaging of cells and tissues. Cell Tissue Res. 360 (1), 129-141 (2015).
- Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. Light sheet microscopy. Quantitative Imaging in Cell Biology. , Elsevier Inc. 193-215 (2014).
- Strobl, F., Stelzer, E. H. K. Non-invasive long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos. Development. 141 (11), 2361-2361 (2014).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
- Maizel, A., von Wangenheim, D., Federici, F., Haseloff, J., Stelzer, E. H. K. High-resolution live imaging of plant growth in near physiological bright conditions using light sheet fluorescence microscopy. Plant J. 68 (2), 377-385 (2011).
- Swoger, J., Muzzopappa, M., Lòpez-Schier, H., Sharpe, J. 4D retrospective lineage tracing using SPIM for zebrafish organogenesis studies. J Biophoton. 4 (1-2), 122-134 (2010).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).
- Wu, Y., Ghitani, A., et al. Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (43), 17708-17713 (2011).
- Sarov, M., Barz, C., et al. A genome-wide resource for the analysis of protein localisation in Drosophila. bioRxiv. , 028308 (2015).
- Amat, F., Lemon, W., et al. Fast, accurate reconstruction of cell lineages from large-scale fluorescence microscopy data. Nat Meth. 11 (9), 951-958 (2014).
- Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J., Tomancak, P. Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data. Nat Meth. 7 (6), 418-419 (2010).
- Preibisch, S., Rohlfing, T., Hasak, M. P., Tomancak, P. Mosaicing of single plane illumination microscopy images using groupwise registration and fast content-based image fusion. SPIEMed Imaging. 6914, 69140E (2008).
- Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nat Meth. 12 (1), 30-34 (2015).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Digital Scanned Laser Light-Sheet Fluorescence Microscopy (DSLM) of Zebrafish and Drosophila Embryonic Development. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (10), (2011).
- Pinto-Teixeira, F., Muzzopappa, M., Swoger, J., Mineo, A., Sharpe, J., Lòpez-Schier, H. Intravital imaging of hair-cell development and regeneration in the zebrafish. Front Neuroanat. , (2013).
- Keller, P. J. In vivo imaging of zebrafish embryogenesis. METHODS. , 1-11 (2013).
- Pitrone, P. G., Schindelin, J., et al. OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nat Meth. 10 (7), 598-599 (2013).
- Gualda, E. J., Vale, T., Almada, P., Feijò, J. A., Martins, G. G., Moreno, N. OpenSpinMicroscopy: an open-source integrated microscopy platform. Nat Meth. 10 (7), 599-600 (2013).
- Martinez-Morales, J. R., Rembold, M., et al. ojoplano-mediated basal constriction is essential for optic cup morphogenesis. Development. 136 (13), 2165-2175 (2009).
- Strzyz, P. J., Lee, H. O., Sidhaye, J., Weber, I. P., Leung, L. C., Norden, C. Interkinetic Nuclear Migration Is Centrosome Independent and Ensures Apical Cell Division to Maintain Tissue Integrity. Dev Cell. 32 (2), 203-219 (2015).
- Young, L. K., Jarrin, M., Saunter, C. D., Quinlan, R., Girkin, J. M. Using SPIM to track the development of the focal power of the zebrafish lens. SPIE BiOS. 9334, 933408 (2015).
- Preibisch, S., Amat, F., et al. Efficient Bayesian-based multiview deconvolution. Nat Meth. 11 (6), 645-648 (2014).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).
- Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets. Nat Meth. 12 (6), 481-483 (2015).
- Brown, M., Lowe, D. G. Invariant Features from Interest Point Groups. Proceedings of the British Machine Vision Conference. , BMVA Press. 23.1-23.10 (2002).
- Saalfeld, S., Fetter, R., Cardona, A., Tomancak, P. Elastic volume reconstruction from series of ultra-thin microscopy sections. Nat Meth. 9 (7), 717-720 (2012).
- Fischler, M. A., Bolles, R. C. Random sample consensus: a paradigm for model fitting with applications to image analysis and automated cartography. Commun ACM. 24 (6), 381-395 (1981).
- Zolessi, F. R., Poggi, L., Wilkinson, C. J., Chien, C. -B., Harris, W. A. Polarization and orientation of retinal ganglion cells in vivo. Neural Dev. 1 (1), 2 (2006).
- Stepanova, T., Slemmer, J., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). J Neurosci. 23 (7), 2655-2664 (2003).
- Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish. J Vis Exp. (84), e51119 (2014).
- Udan, R. S., Piazza, V. G., Hsu, C. W., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Quantitative imaging of cell dynamics in mouse embryos using light-sheet microscopy. Development. 141 (22), 4406-4414 (2014).
- Ichikawa, T., Nakazato, K., et al. Live imaging and quantitative analysis of gastrulation in mouse embryos using light-sheet microscopy and 3D tracking tools. Nat Protoc. 9 (3), 575-585 (2014).
- Schmied, C., Stamataki, E., Tomancak, P. Open-source solutions for SPIMage processing. Methods Cell Biol. 123, 505-529 (2014).
- Schmied, C., Steinbach, P., Pietzsch, T., Preibisch, S., Tomancak, P. An automated workflow for parallel processing of large multiview SPIM recordings. , Available from: http://arxiv.org/abs/1507.08575 (2015).
- Amat, F., Höckendorf, B., Wan, Y., Lemon, W. C., McDole, K., Keller, P. J. Efficient processing and analysis of large-scale light-sheet microscopy data. Nat Protoc. 10 (11), 1679-1696 (2015).
- Schmid, B., Shah, G., et al. High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics. Nat Commun. 4, 1-10 (2013).
- Gualda, E. J., Pereira, H., Vale, T., Estrada, M. F., Brito, C., Moreno, N. SPIM-fluid: open source light-sheet based platform for high-throughput imaging. Biomed Opt Express. 6 (11), 4447-4456 (2015).
- McGorty, R., Liu, H., Kamiyama, D., Dong, Z., Guo, S., Huang, B. Open-top selective plane illumination microscope for conventionally mounted specimens. Opt Express. 23 (12), 16142-16153 (2015).
- Jemielita, M., Taormina, M. J., et al. Spatial and Temporal Features of the Growth of a Bacterial Species Colonizing the Zebrafish Gut. mBio. 5 (6), e01751-14-8 (2014).
