Использование Light Sheet флуоресцентной микроскопии для изображения развития данио глаз

Introduction

Морфогенез это процесс, который формирует зародыш и вместе с ростом и дифференциацией приводит в движение онтогенеза из оплодотворенной яйцеклетки в зрелый многоклеточный организм. Морфогенетических процессы во время развития животных могут быть проанализированы с помощью лучших изображений неповрежденных живых образцов ^1-3. Это происходит потому, что такая вся эмбрион изображения сохраняет все компоненты, которые стимулируют и регулируют развитие, включая градиенты сигнальных молекул, внеклеточного матрикса, сосудистую, иннервации, а также механические свойства окружающих тканей. Для того, чтобы преодолеть весы, на которых происходит формообразование, быстрые субклеточных события должны быть захвачены в минуту масштабе времени в контексте развития всей ткани в течение нескольких часов или дней. Для того, чтобы выполнить все эти требования, была разработана современная реализация ⁴ ортогональной плоскости освещения микроскопа ^5. Первоначально он был назван Селективный Plane Освещение Микроскопия (SPIM) ^4; теперь всеобъемлющим термином Light Sheet флуоресцентной микроскопией (LSFM) обычно используется. LSFM позволяет съемку с высоким временным разрешением, в то время вызывая меньше фототоксичности , чем лазерное сканирование или вращающийся диск конфокальной микроскопов ^6,7. В настоящее время существует уже многие реализации основного принципа света листа освещения , и она была использована для изображения большое разнообразие образцов и процессов , которые ранее были недоступны для исследователей ^8-11.

Сначала мы хотели бы выделить несколько ключевых преимуществ по сравнению с традиционными LSFM подходов конфокальной микроскопии:

Для получения значимых результатов от живых изображений микроскопических экспериментов, важно, что наблюдение лишь в минимальной степени влияет на образец. Тем не менее, многие организмы, в том числе данио очень чувствительны к воздействию света лазера, что делает его сложным для изображения их в конфокальной микроскопии с высоким временным разрешением без фототоксичность эффекты , как застопорился или замедленным ^6,7 развития. LSFM в настоящее время метод флуоресцентной визуализации с наименее деструктивным воздействием на образце ^7. Так как тонкий лазерный луч лист освещает только часть образца, который проецируется в определенный момент времени, свет листовой микроскоп с использованием фотонов очень эффективно. Следовательно, низкая освещенность позволяет в течение длительного времени покадровой наблюдений здоровых образцов, например , ^12-17. Не Кроме того, благодаря минимальной инвазивности LSFM, количество получаемых изображений больше не продиктованы, сколько света образец может терпеть, но, скорее, сколько данных могут быть обработаны и сохранены.

Вдоль тех же самых линий поддержания образца в вблизи физиологических условиях, LSFM поставляется с альтернативными стратегиями крепления образца хорошо подходит для живых эмбрионов. В технике LSFM, эмбрионы, как правило, встроены в тонкой колонке низкий процент агарозы. Mountinг в агарозном цилиндров позволяет полную свободу вращения, поэтому образец можно наблюдать от идеального угла (в LSFM называют его) и из нескольких представлений одновременно. MultiView визуализации и последующего MultiView слияние выгодно особенно для больших, рассеивающих образцов и позволяет захватывать их с высоким изотропным разрешением. Краткая информация о других возможных стратегий LSFM монтажа можно найти в официальном руководстве по эксплуатации микроскопа, в главе, посвященной подготовке проб, написанной в лаборатории Э. Рейно. Это рекомендуется читать, особенно если цель состоит в том, чтобы изображения различных образцов, чем описано здесь.

Приобретение изображения в LSFM является широкое поле, камера на основе, в отличие от лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. Это приводит к более высоким отношением сигнал-шум (SNR) для полученных изображений и может быть очень быстро (от десятков до сотен кадров в секунду). Высокая чувствительность LSFM дополнительно обеспечивает визуализацию слабо флуоресцентного SAMPле, как факторы транскрипции , выраженные на эндогенных уровнях ¹⁸ или, в ближайшем будущем, эндогенные белки помечены использованием CRISPR / cas9. Высокое SNR также имеет важное значение для успешного анализа вниз по течению изображения. Высокая скорость требуется не только для захвата быстрых внутриклеточные процессы, но и к изображению весь эмбрион из нескольких представлений достаточно быстро. Бесшовная слияние нескольких представлений может быть достигнуто только, если наблюдаемое явление не меняется в процессе приобретения этих нескольких г стеков поступающих из отдельных представлений.

Преимущества LSFM обычно не приходят за счет качества изображения. Боковое разрешение LSFM немного хуже, чем разрешение конфокальной микроскопии. Это объясняется тем, что цели обнаружения, используемые в LSFM имеют более низкую числовую апертуру (обычно 1,0 или меньше) по сравнению с 1,2-1,3 целей воды или кремния погружения на стандартных конфокальной установках. Кроме того, в связи с широким обнаружения поля в LSFM (Absenв.п. из прокол), есть больше вне фокуса света по сравнению с конфокальной микроскопии. Количество вне фокуса света определяется толщиной светового листа. Тем не менее, эти недостатки компенсируются более высокой SNR в LSFM. На практике это приводит к схожего качества изображений по сравнению с, например , вращающийся диск конфокальной приобретение ^15. Следовательно, это обеспечивает надежное извлечение функций , таких как клеточные мембраны или ядер, например, для отслеживания клеточных клонов ^15,19.

Осевое разрешение LSFM определяется, в дополнение к цели обнаружения, за счет толщины светового листа. Осевое разрешение может LSFM в некоторых случаях превосходят разрешение конфокальной микроскопии. Во-первых, улучшение разрешения наступает тогда, когда свет лист тоньше, чем разрешение аксиального объектива обнаружения, которые, как правило, имеет место для больших образцов с целью изображаемых малом увеличении. Второй способ, как LSFM может ACHieve лучше осевое разрешение, является MultiView фьюжн, в котором информация разрешения высокой ху из разных взглядов объединены в один стек изображений. Полученный в результате слиты стек имеет изотропное разрешение приближающуюся значения разрешения в боковом направлении ^20,21. Стратегия для регистрации нескольких представлений друг на друга описанный в этой статье основана на использовании флуоресцентных гранул полистирола в качестве фидуциарных маркеров , встроенных в агарозном вокруг образца ^20,21.

В результате коммерциализации LSFM, этот метод теперь доступен для широкого сообщества ученых ^22. Таким образом, мотивация для написания этого протокола, чтобы сделать эту технологию доступной для онтогенетики, не имеющих практического опыта в LSFM и получить эти ученые начали использовать эту технологию с их образцами. Наш протокол использует коммерческий световой микроскоп лист, который представляет собой концептуально простой микроскоп тшляпа прост в эксплуатации. Дополнительно мы хотели бы упомянуть другие недавние протоколы для получения изображений данио с домашней работы LSFM установок, которые могут быть пригодны для ответа на конкретные вопросы ^23-25. Другой вариант входа в LSFM являются открытые платформы ^26,27, использующие принципы открытого доступа , чтобы принести свет лист микроскопии более широкой общественности. Документация как аппаратных средств и аспекты программного обеспечения можно найти на сайте http://openspim.org и https://sites.google.com/site/openspinmicroscopy/.

В этом протоколе, мы используем костистых данио в качестве модельной системы для изучения процессов развития с LSFM. Морфогенез данио глаз является примером, который подчеркивает многие из преимуществ LSFM. LSFM уже использовалась в прошлом , чтобы исследовать развитие глаз в оризии ²⁸ и в данио ^29,30. На ранней стадии развития глаз это сложно правильно ориентировать эмбриона для обычной микроскопии,как громоздкий желтка не позволяет эмбрион лежать на стороне с его глаз лицом к цели. Тем не менее, с LSFM установки в агарозном колонну, образец может быть воспроизводимо установлен. Кроме того, при переходе от глазного пузыря до стадии глазного бокала, глаз подвергается основные морфогенетические перестроек сопровождается ростом, который требует захвата большой стек г и большое поле зрения. Кроме того, для этих задач LSFM превосходит обычного конфокальной микроскопии. Процесс формирования глазного бокала трехмерно, поэтому трудно понять и визуализировать исключительно изображений с одной точки зрения. Это делает MultiView визуализации с изотропным разрешением полезным. После формирования глазного бокала, сетчатка становится все более чувствительным к лазерному воздействию. Таким образом, низкое фототоксичности, связанный с LSFM является одним из основных преимуществ для долгосрочного визуализации.

Здесь мы представляем оптимизированный протокол для работы с изображениями от одного до трех дней старых эмбрионов даниоЛичинки-й с акцентом на развитие глаз. Наш метод позволяет записывать покадровой фильмов, охватывающих до 12-14 часов с высоким пространственным и временным разрешением. Важно отметить, что мы также показывают трубопровод для обработки данных, что является важным шагом в LSFM, поскольку этот метод всегда создает большие наборы данных, часто в диапазоне терабайт.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Все для животных работа была проведена в соответствии с Европейским союзом (ЕС) директивы 2011/63 / ЕС и Закон о немецком благосостояния животных. Протокол призван следовать без остановки, от монтажа для получения изображения образца. В зависимости от практического опыта, это займет 2-3 ч, чтобы начать замедленную эксперимент. Обработка данных не входит в этот расчет времени. Все материалы, необходимые для эксперимента можно найти в контрольном списке необходимого материала перед началом, который предоставляется в качестве дополнительного документа. Носите неприпудренные перчатки во время стадий 1, 2, 3 и 4. Для этапов 2, 3, 4 и 5 Протокола также обратитесь к инструкции по эксплуатации официальным микроскопом.

1. Подготовительные работы Перед визуализации эксперимента

1. Флуоресцентные шарика маточного раствора
   1. Для этого протокола, используйте 500 или 1000 нм полистирола диаметром бусин (помеченный красным излучающей флуоресцентного красителя). Рабочее разбавление гранул 1: 4,000. Во-первых, вихревая шарик раствор в течение 1 мин. Развести 10 мкл шариков в 990 мкл DDH ₂ O. Храните раствор в темноте при 4 ° С и использовать этот разведение 1: 100 в качестве исходного раствора для дальнейшего разбавления в 1:40.
2. Подготовка раствора для пробы камеры
   1. В 100 мл химический стакан смеси 38,2 мл E3 среды без метиленовый синий, 0,8 мл 10 мМ N -phenylthiourea и 1 мл 0,4% МС-222. Полезно использовать фильтрованную среду E3, чтобы избежать мелких частиц пыли или нерастворимых кристаллов, плавающих в отборной камере позже.
3. Выбор Эмбрион люминесцентная Fish
   1. За несколько дней до начала эксперимента, подготовки эмбрионов, выражающие флуоресцентные белки. Непосредственно перед экспериментом, сортировать эмбрионов в люминесцентный стереоскопе, исходя из желаемой прочности флуоресцентного сигнала. Возьмите 5-10 здоровых эмбрионов и dechorionate их с помощью пинцета.
      Примечание: Этот протокол оптимизирован для 16-72 часов старыйэмбрионов.

2. Настройка камеры для проб

1. Сборка Три камерные окна
   1. Есть 4 окна в отборной камере, один для цели и три должны быть запечатаны с покровные (диаметром 18 мм, толщиной 0,17 выбранных мм). Храните эти покровные в 70% этаноле. Протирать их чистым перед использованием с эфиром: этанол (1: 4).
   2. Вставьте покровное в окно с помощью тонких щипцов и убедитесь, что она вписывается в самую маленькую канавку. Накройте его с 17 мм диаметр резинового кольца и винт в освещение переходное кольцо с помощью инструмента окна камеры. Повторите этот процесс для двух других окон.
2. Присоединение остальных частей Камерные
   1. Привинтить адаптер для соответствующей цели в четвертой остающейся стороне камеры. Вставьте 15 мм диаметр уплотнительного кольца в центр адаптера.
   2. Заверните белый адаптер Luer-Lock в нижний правый отверстие в тяmber и разъем серого цвета слив в верхнем левом отверстие. Блокировать все три оставшихся отверстия с черными заглушками.
   3. Прикрепите блок Пельтье и металлический ласточкин хвост слайд нижней части камеры с использованием шестигранного ключа. Присоединить шланг с 50 мл шприц с адаптером Luer-Lock. Вставьте датчик температуры в камере.
3. Установка цели и камеры в микроскоп
   1. Проверьте под стереоскоп, что все цели являются чистыми. Используйте цели освещения 10X / 0.2 и цель обнаружения Plan-Apochromat 20X / 1,0 Вт и убедитесь, что ее коэффициент коррекции индекса воротник устанавливается в 1,33 для воды. Привинтить цель обнаружения в микроскоп, сохраняя при этом освещающими цели охвачены.
   2. Удалите защитные пластиковые колпачки, покрывающие освещающими цели. Аккуратно вставьте камеру в микроскоп и затяните его с помощью крепежный винт.
   3. Подключение температуры пробыть и блок Пельтье с микроскопом.
      Примечание: две трубки, которые циркулируют охлаждающую жидкость для блока Пельтье совместимы с обоими разъемами. Они образуют функционирующую схему независимо от ориентации связи.
   4. Заполнить камеру через шприц с раствором, приготовленным на стадии 1.2 до верхнего края окна камер. Убедитесь, что камера не протекает.
   5. Запустите микроскоп, инкубации и контроля и хранения компьютеров. Запустите микроскоп-операционное программное обеспечение и установить температуру инкубации до 28,5 ° C.
      Примечание: Это займет 1 час, чтобы полностью уравновешиваться. Подготовка образца в то же время.

3. Подготовка образцов

1. Подготовка агарозы Mix
   1. 15 мин перед внесением в агарозном смеси, расплавить один 1 мл аликвоты 1% легкоплавкой агарозе (растворенный в E3 среде) в нагревательном блоке, установленной на 70 ° С. После агарозном полностью мольдесять, передача 600 мкл в свежую 1,5 мл пробирку, добавляют 250 мкл E3 среды 50 мкл 0,4% MS-222 и 25 мкл встряхивали бусинка маточного раствора.
      Примечание: Это делает 925 мкл смеси, в то время как дополнительные 75 мкл рассчитывается для жидкости, добавляемой позже вместе с эмбрионами.
   2. Держите трубку во втором блоке нагрева при 38-40 ° C, или гарантировать, что агароза очень близко к его желатинизации точке, прежде чем положить образец эмбрионов в него.
2. Монтаж эмбрионы
   1. Возьмите пять стеклянных капилляры объемом 20 мкл (с черной меткой, ~ 1 мм внутренний диаметр) и вставьте соответствующий Тефлон наконечник плунжеров в них. Нажмите на поршень через капилляр таким образом, чтобы кончик тефлон находится в нижней части капилляра.
   2. Передача пять эмбрионов (число, которое может быть установлено сразу) со стаканом или пластиковой пипеткой в ​​пробирку встряхивают 37 ° C теплой агарозном смеси.
      Примечание: Попробуйте перенести минимальный объем жидкости вместе остроумиеч эмбрионы.
   3. Вставьте капилляр в смесь и сосать одного эмбриона внутри, потянув плунжера вверх. Убедитесь в том, что глава эмбриона входит в капилляр до хвоста. Избегайте пузырьков воздуха между поршнем и образцом. Там должно быть ± 2 см выше агарозы эмбриона и ± 1 см ниже него. Повторите эти действия для оставшихся эмбрионов.
   4. Подождите, пока агароза не затвердеет полностью, что происходит в течение нескольких минут, а затем хранить образцы в E3 среде, прикрепляя их к стене стакан с пластилином или лентой. Нижнее отверстие капилляра должна висеть свободно в растворе, позволяя газообмен к образцу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Аналогичный протокол к разделам 3.1 и 3.2 можно также найти на странице OpenSPIM вики http://openspim.org/Zebrafish_embryo_sample_preparation~~pobj.

4. Пример позиционирования

1. Образец Ассамблеи держатель
   1. Вставьте 2 пластиковых рукава нужного размера (черные)друг против друга в держатель образца стебля. Их щели стороны должны быть обращены наружу. Прикрепите зажимной винт свободно, повернув его 2-3 раундов. Вставьте капиллярную трубку через зажим винт и толкать его через держатель, пока черный цвет полосы не станет видимым на другой стороне. Избегайте прикосновения к плунжеру.
   2. Затянуть зажимной винт. Нажмите избыток 1 см ниже агарозы зародыша из капилляра и разрезать его. Вставьте шток в держатель образца диска.
   3. Подтвердите в программном обеспечении, что столик микроскопа находится в положении нагрузки. Используйте направляющие рельсы, чтобы скользить весь держатель с образцом вертикально вниз в микроскоп. Включите его, таким образом, чтобы магнитный держатель дисков замков в рабочее положение.
2. Обнаружение капилляра
   1. С этого момента, контролировать позиционирование образца с помощью программного обеспечения. На вкладке Расположить выберите опцию Locate капиллярную и положение капилляра в х, у и г в фокус непосредственно над объектом обнаруженияАйв линзы. Используйте графическое представление в образце навигатора для руководства.
   2. Вставьте эмбрион аккуратно из капилляра до тех пор, пока перед учеником цели обнаружения.
      Примечание: "Найти капиллярный 'является единственным шагом в оставшемся протокола, в течение которого должна быть открыта верхняя крышка микроскопа и образец извлечена.
3. Нахождение образца
   1. Переход к опции 'Locate образец' и на 0,5 зума принести данио глаз в центре поля зрения. Поворот эмбриона, так, чтобы свет лист не будет проходить через любые высокорефрактивную или абсорбирующих частей образца, прежде чем он достигнет глаза. Точно так же, испускаемый флуоресцентный необходим четкий путь из образца. Нажмите на кнопку 'Установить исходное положение ".
   2. Откройте переднюю дверцу микроскопа и поставить пластиковую крышку с отверстием 3 мм на верхней части камеры, чтобы избежать испарения.
      Примечание: Если уровень жидкости опускается нижеуровень визуализации, эксперимент будет скомпрометирован.
   3. Проверьте сердцебиение эмбриона как прокси-сервер для общего состояния здоровья. Если это слишком медленно, используйте другой образец (по сравнению с не-смонтированный управления; конкретные значения зависят от стадии развития). Переход к окончательной настройки масштабирования и отрегулируйте положение эмбриона.

5. Настройка Multidimensional Приобретение

1. Параметры Приобретение
   1. Перейдите на вкладку "приобретения". Определить путь света, включая лазерные линии, цели обнаружения, лазерной блокирующий фильтр, расщепитель луча и камер.
   2. Активируйте флажок поворота сканирования. Определите другие параметры, такие как приобретение глубиной в битах, формат изображения, света толщины листа и выбрать односторонний освещение.
   3. Нажмите 'Непрерывный' и в зависимости от интенсивности получаемого изображения изменения мощности лазера и экспозиции камеры времени.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для настройки всех параметров визуализации используют леs мощность лазера (0,5% от 100 мВт лазер, 30 мс время экспозиции), чем для реального эксперимента, чтобы избежать ненужных повреждений фотографий к образцу.
2. Регулировка Light Sheet
   1. Переключитесь на "двухсторонний Illumination" и активировать опцию «Интернет Dual Side Fusio'n флажок. Запустите 'Lightsheet Автоопределение мастера. Следуйте инструкциям шаг за шагом.
      Примечание: Мастер перемещает световой лист в фокальной плоскости объектива обнаружения, и гарантирует, что оно не наклонена, и его талии находится в центре поля зрения. После завершения автоматической настройки положения левого и правого световых листов автоматически обновляются в программном обеспечении. Улучшение качества изображения теперь должно быть очевидно. Активируйте "Z-стека" флажок.
   2. Проверьте регулировки светового листа путем проверки симметрии функции рассеяния точки (ФРТ), задаваемый флуоресцентных шариков в XZ и уг зрения орто. Если нетт симметричны, вручную отрегулировать положение источника света параметров листа вверх и вниз до достижения формы PSF симметричной форме песочных часов (рис 1А).
3. Многомерные Настройки Приобретение
   1. Определим Z-стек с "First Slice" и варианты "Last Slice" и установите шаг г до 1 мкм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Световой лист в этом микроскоп является статическим и г секционирования достигается за счет перемещения образца через. Всегда используйте опцию "Непрерывный Drive" для более быстрого приобретения Z-стеки.
   2. Активировать флажок "Временные ряды". Определить общее количество временных точек и интервал между ними.
   3. Активируйте флажок "MultiView". Добавить текущую позицию в списке MultiView, где хранится информация о х, у, г и угол. Используйте контроллер стадии, чтобы повернуть капилляр и определить другие желаемые виды. Настройка Z-стек на каждом представлении и добавить их в список MultiView.
      Обратите вниманиеПрограммное обеспечение сортирует мнения в последовательном режиме, так что капиллярная повернута однонаправленно, а образ приобретается.
4. Дрейф Коррекция и запуск эксперимента
   1. После приобретения настройки завершена, подождите 15-30 минут до начала фактического эксперимента.
      Примечание: Образец первоначально дрейфует несколько микрометров в х, у и г, но должен остановиться в течение 30 мин. Если образец продолжает дрейфовать дольше, используйте другой образец или монтирование.
   2. Перейдите на вкладку "Ведение" и в опции 'ПОТОКОВОЕ' определить , каким образом данные должны быть сохранены, например, один файл на временную точку или отдельный файл для каждого вида и канала. Вернитесь на вкладку "приобретения", нажмите кнопку "Начать эксперимент" и определить имя файла, место, где он должен быть сохранен и формат файла (используйте .czi).
   3. Обратите внимание на приобретение первого момента времени, чтобы подтвердить, что все работает безупречно. Немедленно приступить к регистрациии слияние первого момента времени, как описано в пунктах 6 и 7, чтобы подтвердить, что можно будет обрабатывать весь набор данных.

6. Multiview Регистрация

1. Multiview Реконструкция приложений
   1. По окончании сеанса обработки изображений, передавать данные с компьютера для хранения данных на микроскоп для обработки данных компьютера. Используйте 'MultiView ReconstructionApplication ^'20,21,31 реализована на Фиджи ³² для обработки данных (Рисунок 1В).
2. Определение Dataset
   1. Обновление Фиджи: Фиджи> Справка> Обновление ImageJ и Фиджи> Справка> Обновить Фиджи. С помощью основной ImageJ и сайты обновления Фиджи.
   2. Передача весь набор данных в одну папку. Результаты и промежуточные файлы обработки будут сохранены в этой папке. Начало MultiView Реконструкция Применение: Фиджи> Плагины> MULTIVIEW Реконструкция> MultiviРЭБ Реконструкция приложений.
   3. Выберите 'определить новый набор данных. Как тип набора данных выберите опцию Meu "Цейс Lightsheet Z.1 Dataset (LOCI Bioformats)" и создать имя для файла .xml. Затем выберите первый .czi файл набора данных (т.е. файл без индекса). Он содержит данные изображения, а также метаданные записи.
      Примечание: После того как программа открывает первый файл .czi, метаданные загружаются в программу.
   4. Убедитесь, что число углов, каналов, заставками и наблюдать размер воксела из метаданных. После нажатия кнопки ОК, наблюдать три отдельные открытые окна (Рисунок 1C): окно журнала, показывающий ход обработки и ее результатов, "ViewSetup Проводник" и консоли, показывая сообщения об ошибках Фиджи.
      Примечание: 'ViewSetup Проводник' является удобный интерфейс, который показывает каждый вид, канал и освещение и обеспечивает выбор файлы интересов. Кроме того, 'ViewSetup Проводник' позволяет рулевого управления всех этапов обработки.
   5. Выберите файлы, которые должны быть обработаны и нажмите правую кнопку мыши в проводнике. Обратите внимание открыто окно с различными этапами обработки (рис 1C).
   6. При определении набора данных, заметим, что XML-файл в папке с данными создается.
      Примечание: Этот файл содержит метаданные, которые были подтверждены ранее.
   7. В правом верхнем углу наблюдать "информация" и две кнопки "Сохранить". Нажатие кнопки "Info" отображает краткую информацию о содержании файла .xml. Нажатие кнопки "Сохранить" сохранит результаты обработки.
      Примечание: В то время как обработка в "MultiView Реконструкция приложения" различные этапы обработки должны быть сохранены в .xml перед закрытием Фиджи.

OAD / 53966 / 53966fig1.jpg "/>
Рисунок 1: Multiview Реконструкция рабочих процессов и интерес точки обнаружения (A) Свет выравнивания листа на основе флуоресцентной визуализации шарика.. Система выравнивается (в центре), когда шарик изображение имеет симметричную форму песочных часов в YZ и хг проекций. Примеры Перекошенная светового листа в любом направлении, показаны слева и справа. Максимальные проекции интенсивности 500 нм шарика в XZ, YZ и XY оси показаны. Обратите внимание, что отношение интенсивности центрального пика диска Эйри (в ХУ) в боковых лепестков больше, когда lightsheet правильно выровнена по сравнению с Перекошенная ситуацией. Изображения были сделаны с 20X / 1.0 объектива Вт при 0,7 зумом. Шкала бар составляет 5 мкм. (В) Набор данных определяется , а затем повторно сохранены в формат HDF5. Гранулы сегментирован и затем регистрируется. Для временных рядов каждый раз, когда точка регистрируется на точку опорного времени. Данные окончательно слиты водиночный изотропным объем. (C, сверху) ViewSetup Проводник показывает различные моменты времени, углы, каналы и освещение стороны набора данных. (C, левый нижний угол) Окно BigDataViewer показывает вид , который выбран в ViewSetup Explorer. (C, средний справа) Щелкните правой кнопкой мыши в ViewSetup Explorer , открывает возможности обработки. (C, правый нижний угол) Прогресс и результаты обработки отображаются в файле журнала. (D и Е) Цель обнаружения является сегментом , как много точек интереса (гранулы) , с минимальным количеством обнаружения в образце , как это возможно , как показано здесь скриншотов с интерактивной сегментации борта шины. (D и Е, верхний левый угол) Сегментация определяется двумя параметрами, разница-оф-гауссовых значений для Sigma 1 и Threshold. (D) Пример успешного обнаружения с увеличенный вид правильно обнаруженным шарик. (E) Сегментация со слишком большим количеством ложных срабатываний и нескольких обнаружений одного борта. Шкала бар в (С) составляет 50 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

3. Пересохраните Dataset в HDF5 формате
   1. Для того, чтобы повторно сохранить весь набор данных, выберите все файлы с Ctrl / Apple + а и правой кнопкой мыши. Затем выберите пересохраните набор данных , и как HDF5.
   2. Появится окно отображения предупреждения, которые будут повторно сохранены все виды текущего набора данных. Пресс - да.
      Примечание: Программа будет продолжать повторно сохранить .czi файлы HDF5 путем открытия каждого файла и resaving различные уровни разрешения формата hdf5. Это подтвердит с "сделано" после завершения. Resaving usuallу занимает несколько мин на временной точке (см таблицу 1).
      Примечание: Так как файлы в формате hdf5 могут быть загружены очень быстро, теперь можно просматривать незарегистрированной наборе данных '' правой кнопкой мыши в проводнике и переключая 'дисплея в BigDataViewer (вкл / выкл). Окно BigDataViewer появится с выбранным видом (Рисунок 1С). Основные функции BigDataViewer ³³ описаны в таблице 2 и http://fiji.sc/BigDataViewer.
4. Обнаружение процентного пункта
   1. Выделить все моменты времени с помощью Ctrl / Apple + а и правой кнопкой мыши выбрать параметр Обнар процентных пунктов.
   2. Выберите Difference-оф-гауссовой ³⁴ для типа обнаружения процентных пункта. С момента регистрации шарика на основе здесь используется, типа "бусы" в поле для этикетки процентных пунктов. Активировать 'Downsample изображения до сегментации.
   3. В следующем окне, наблюдать йеНастройки. перегиба Для 'локализации субпикселей' использования '3-мерной квадратичной аппроксимации ^"34 и определить разницу-of-Gaussian значения и радиус для использования сегментации шарика" интерактивной "в точке спецификации i'nterest'.
   4. Для 'Downsample XY' использования 'Матч Z Разрешение (менее понижающей дискретизации)' и для использования 1 × 'Downsample Z'. Размер Z шаг больше, чем размер пикселя ху, таким образом, просто вниз выборки ху в соответствии с разрешением г достаточно. Выберите 'Compute на CPU (Java)'. Нажмите 'OK'.
   5. Во всплывающем окне выберите один вид для тестирования параметров из выпадающего меню. После того, как просмотреть нагрузок, регулировать яркость и контрастность окна с Фиджи> Image> Adjust> Brightness / Contrast или Ctrl + Shift + C. Поставьте галочку "искать максимумов (зеленый) 'для обнаружения шарика.
   6. Обратите внимание на сегментации в виде зеленых колец 'viewSetup' around обнаружений при поиске максимумов и минимумов для красного. Сегментация определяется двумя параметрами, разница-of-Gaussian значения для Sigma 1 и пороговое значение (рис 1D). Отрегулируйте их сегментов , как много шариков вокруг образца и , как несколько ложных срабатываний в образце , насколько возможно (рис 1D). Обнаружить каждый шарик только один раз , а не несколько раз (рис 1E). После определения оптимальных параметров, нажмите кнопку "Готово".
      Примечание: Обнаружение начинается с загрузки каждого отдельного вида в момент времени и сегментирования бусы. В файле журнала, программа выводит количество шариков он обнаруженных за просмотр. Обнаружение должно быть сделано в течение нескольких секунд (см таблицу 1).
   7. Нажмите сохранить , когда количество обнаружений подходит ( от 600 до нескольких тысяч за просмотр).
      Примечание: Папка будет создана в каталоге данных, которая будет содержать Информатиоп о координатах обнаруженных бусин.
5. Регистрация с помощью процентного пункта
   1. Выделить все моменты времени с помощью Ctrl / Apple + а, щелкните правой кнопкой мыши и выберите 'Register с использованием процентного пункта ".
   2. Используйте 'быстрая 3D геометрического хэширования (вращение инвариантным)' для обнаружения шарика как 'регистрации алгоритма'.
      Примечание: Этот алгоритм не принимает на себя никаких предварительных знаний об ориентации и позиционирования различных точек зрения по отношению друг к другу.
   3. Для регистрации взглядов друг на друга, выберите "зарегистрировать временные точки в индивидуальном порядке", как "тип регистрации". Для «точек интереса» в выбранном канале, ранее указанной метки для процентных пунктов теперь должен быть видимым (т.е. "шарики").
   4. В следующем окне, используйте предварительно установленные значения для регистрации. Закрепить первый взгляд, выбрав "приклеивать плитки: Fix первую плитку и использование Не карты обратно '(используйте этот параметр, если сезамэс не являются фиксированными) в разделе "Карта назад плитки".
   5. Используйте 'аффинное преобразование модели' с '' регуляризации.
      Примечание: допускается ошибка для RANSAC будет 5px и "значение для матча дескриптора 'будет 10. Для' 'регуляризация использовать" жесткую модель "с лямбда 0,10, что означает, что преобразование составляет 10% и 90 жесткой % аффинное ^35. Нажмите кнопку OK , чтобы начать регистрацию.
      Примечание: Как показано в окне журнала, сначала каждый вид сочетается со всеми другими видами. Тогда случайная выборка консенсус (RANSAC) ³⁶ проверяет соответствия и исключает ложные срабатывания. Для надежной регистрации, значение RANSAC должно быть выше, чем на 90%. Когда достаточное количество истинных кандидатов, соответствующих между двумя точками зрения встречаются, модель преобразования вычисляется между каждым матчем со средним смещением в пикселях. Тогда итерационный глобальная оптимизация осуществляется и все виды регистрируются на фиксированной точки зрения. При успешной регистрации, модель преобразования вычисляется и отображается с его масштабирования и перемещения в пикселях. Средняя погрешность должна быть оптимально ниже 1 точек и масштабирование преобразования близких к 1. регистрации выполняется в секундах (см таблицу 1).
   6. Убедитесь , что не существует сдвиг между различными видами , как это наблюдалось на тонких структур в образце, например , клеточные мембраны. Затем сохраните преобразование для каждого представления в файл .xml.
      Примечание: Теперь зарегистрированные мнения накладываются друг на друга в BigDataViewer (фиг.2А) и закраиной изображения должны быть накладывания , а также (Фигура 2В).
   7. Удалить преобразования путем выбора моментов времени, щелкните правой кнопкой мыши на них, а затем выберите Удалить Transformations> Последние / Новейшие трансформации.

Re 2 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 53966 / 53966fig2.jpg "/>

Рис . 2: Результаты реконструкции MultiView (A) , облицованная зарегистрированных взгляды, каждый в разные цвета , чтобы продемонстрировать перекрытие между ними. (В) Увеличенный вид , показывающий перекрытие PSFs из бисера изображаемых с различных точек зрения. (C) Крупным планом шарика после слияния, ФРТ представляет собой среднее из различных точек зрения. (D) , ФСФ того же шарика , как в (C) после того, как MultiView деконволюции , показывая , что ФРТ коллапс в одну точку. (Е) раздела ху и (F) уг сечение одного вида зрительного пузырька, в котором мембраны , меченных GFP показывает деградацию сигнала в г глубже в ткани. (G) раздел ху и (Н) уг сечение той же точки зрения после взвешенного среднего слияния 4 мнений примерно 20 градусов друг от друга с немного более DegraDed разрешение ху в целом, но увеличилась г-разрешение. (I) , раздел ху и (J) YZ часть одних и тех же данных , после того, как MULTIVIEW деконволюции, показывая значительное увеличение разрешающей способности и контрастности сигнала как в ху и в г. Изображения в (EJ) одиночные оптические срезы. Шкала бар представляет 50 мкм (A, B, EJ) и 10 мкм (C, D). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

6. Время покадровой регистрации
   1. Выделите весь промежуток времени, щелкните правой кнопкой мыши и выберите 'Register с помощью процентного пункта ", чтобы стабилизировать временной промежуток в течение долгого времени.
   2. В окне "Основные параметры регистрации выберите Матч против одного отсчета времени (без глобальной оптимизации) для типа регистрации. Ke ер он т другие параметры такие же , как при регистрации отдельных моментов времени.
   3. В следующийокно, выберите точку времени, которые будут использоваться в качестве ссылки, как правило, момент времени, в середине покадровой. Установите флажок "рассмотреть каждый момент времени в качестве жесткого блока ', так как отдельные виды в пределах каждой временной точки уже зарегистрированы друг на друга.
   4. Отметьте флажок "Показать статистику таймсерий". Остальные параметры регистрации остаются прежними, включая упорядочению. Нажмите кнопку OK.
      Примечание: В окне журнала, тот же результат будет отображаться как в индивидуальной точке регистрации времени. Если регистрация для отдельных моментов времени был успешным и надежным, то RANSAC теперь 99-100%, а среднее значение, минимальное и максимальная погрешность обычно ниже 1 пиксель. Сохранить эту регистрацию, прежде чем продолжить.

7. Multiview Fusion

Примечание: В результате преобразования из шагов регистрации используются для вычисления конденсированного изотропное стек из нескольких представлений. Этот стек гаувеличились число г ломтиков по сравнению с исходными данными, так как расстояние между Z теперь равна исходному размеру пикселя в ху. Слияние может быть выполнена либо в MULTIVIEW слияния содержимого на основе ^21,31 или байесовской основе MULTIVIEW деконволюции ^31, которые оба реализованы в приложении реконструкции MultiView.

1. Ограничительная рамка
   Примечание: Fusion является дорогостоящим процессом в вычислительном отношении (таблица 1), таким образом , уменьшая количество данных, задающего квадрат значительно увеличивает скорость обработки.
   1. Выделить все моменты времени правой кнопкой мыши и выберите Определить 'Bounding Box'. Используйте 'Определить с BigDataViewer' и выбрать имя для ограничительной рамки.
   2. Ползунком "мин" и "макс" в каждой оси, чтобы определить область интереса, а затем нажмите "OK". На экране будут отображены параметры ограничительной рамки.
      Примечание: Ограничительная рамка будет содержать все, что взеленый ящик, который накладывается с прозрачным пурпурного слоем.
2. Контент на основе Multiview Fusion
   Примечание: Содержимое на основе MultiView слитый ²¹ принимает качество изображения разницы над стеком (т.е. деградации сигнала в г) во внимание и применяет более высокие весовые коэффициенты для лучшего качества изображения вместо использования простого усреднения.
   1. Выберите точку времени (ы), которые должны быть слиты в "ViewSetup проводнике", щелкните правой кнопкой мыши и выберите "Image Fusion / Deconvolution '.
   2. В окне Fusion Image, выберите 'средневзвешенного слияние' из выпадающего меню, и выберите "Использовать предопределенные Bounding Box для ограничительной Box '. Для вывода конденсированного изображения выберите 'Append для текущего XML Project ", который записывает новые файлы HDF5 к уже существующим hdf5 файлов и позволяет использовать зарегистрированных Незакрепленное мнения и плавленого изображение вместе. Нажмите 'OK'.
   3. Тогда в "предопределить Bounding Box & #39; всплывающее окно выберите имя ранее определенной ограничительной рамки и нажмите "OK".
   4. Соблюдайте параметры ограничительной рамки в следующем окне. Для быстрого слияния, примените вниз выборки на плавленого наборе данных.
      Примечание: Если слиты стек выше определенного размера, программа рекомендуется использовать больше памяти эффективно 'ImageLib2 containe'r. Переход от 'ArrayImg' к 'PlanarImg (большие снимки, легко отобразить) или CellImg (большие изображения)' контейнеров, которые позволяют обрабатывать большие данные. В противном случае использовать предварительно определенные настройки и применить "смешивания и контента на основе синтеза». Продолжайте, нажав 'OK'.
   5. Соблюдайте параметры HDF5 в следующем окне. Используйте предопределенные параметры и начать процесс сварки. Убедитесь в том, что Фиджи присвоила достаточно памяти в Правка> Функции> Память и Темы.
3. Multiview Деконволюция
   Примечание: Multiview Деконволюция ³¹ anotее тип MULTIVIEW слияния. Здесь дополнительно к слиянию, ФРТ системы формирования изображения принимается во внимание для того , чтобы деконволюции изображения и выход увеличилось разрешение и контраст сигнала ( по сравнению на рисунке 2C-J Рисунок 5 и Movie 3).
   1. Выберите точку времени (ы) для деконволюции, щелкните правой кнопкой мыши и нажмите 'Image Fusion / Деконволюция'.
   2. Выберите 'Multiview Deconvolution' и использовать 'предустановленный рамку и добавить к текущему проекту XML'. Выберите рамку и продолжить.
      Примечание: Предварительно определенные параметры для деконволюции являются хорошей отправной точкой. Для первого пробного использования '20 итераций »и оценить влияние деконволюции с помощью" режим отладки ". Наконец установить вычислитель на в 512 х 512 х 512 блоков.
   3. В следующем окне, используйте предварительно заданные настройки. Установите "режим отладки", чтобы отобразить результаты каждого "5 итеРационы '.
      Примечание: Выход деконволюции 32-битные данные, однако BigDataViewer в настоящее время поддерживает только 16-разрядные данные. Для того, чтобы присоединить выход деконволюции к существующему набору данных hdf5, он должен быть преобразован в 16-бит.
   4. Для преобразования, запустите 'Использование мин / макс первого изображения (может насытить интенсивности с течением времени).
      ПРИМЕЧАНИЕ: деконволюции будет запускаться при загрузке изображений и подготовки их к деконволюции.
4. BigDataServer
   1. Для того , чтобы разделить очень большой XML / HDF5 наборы данных использовать HTTP - сервер BigDataServer ^33. Введение в том, как настроить и подключиться к такому серверу можно найти по адресу http://fiji.sc/BigDataServer.
   2. Для подключения к существующему BigDataServer открытым Фиджи> Плагины> BigDataViewer> BrowseBigDataServer.
   3. Введите URL-адрес, включая порт в окно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фильмы, описанные в данной публикации доступны через эту рекламуплатье: http://opticcup.mpi-cbg.de:8085
   4. Заметим, окно, которое позволяет выбрать доступные фильмы. Дважды щелкните, чтобы открыть окно BigDataViewer и просмотреть данные, как описано выше.

Дополнительно: Перечень материалов, необходимых Перед тем как начать

• данио эмбрионов / личинки экспрессирующих флуоресцентные белки (Keep эмбрионов в данио E3 среде без метиленового синего. Для стадий старше 24 ч противодействовать пигментацию путем добавления PTU до конечной концентрации 0,2 мМ.)
• люминесцентная стереоскоп
• Капилляры (20 мкл объема, с черной меткой) и соответствующих плунжеров (Не использовать повторно капилляры. толкатели, с другой стороны, могут быть повторно использованы в течение нескольких экспериментов.)
• 1,5 мл пластиковые трубки
• острые пинцет
• стекло (отожженной) или пластиковых пипеток (пластик может быть использован в течение 24 ч и более старых эмбрионов)
• стеклянные или пластиковые тарелки диаметром 60 мм (пластик может бытьиспользуется в течение 24 ч и более старых эмбрионов)
• два 100 мл мензурки
• 50 мл Луер-Лок шприц с 150 см удлинительный шланг для инфузий (шланг и шприц должен быть полностью сухим между экспериментами, чтобы избежать загрязнения микроорганизмами.)
• пластилин
• с низкой температурой плавления (LMP) агарозы
• E3 среда (5 мМ NaCl, 0,17 мМ KCl, 0,33 мМ CaCl _2, 0,33 мМ MgSO ₄₎
• MS-222 (Tricaine)
• фенилтиомочевину (PTU)
• флуоресцентные микросферы (здесь ссылаются как шарики)
• бидистиллированной H ₂ O (DDH ₂ O)

Representative Results

LSFM является идеальным методом для визуализации процессов развития в различных масштабах. Некоторые приложения собраны здесь, показывая как краткосрочные, так и долгосрочной визуализации внутриклеточных структур, а также клеток и целых тканей. Эти примеры также показывают , что LSFM является полезным инструментом на различных этапах развития глаз от формирования глазного бокала до нейрогенез в сетчатке. Фильм 1 служит иллюстрацией общего подхода LSFM, во- первых , показывающий Уменьшенном вид интактного эмбриона в встраивание в агарозном цилиндр в светлом поле, а затем, показывающий детальное представление сетчатки в канале флуоресценции.

Фильм 1:. LSFM из данио сетчатки Чтобы проиллюстрировать LSFM подход, этот фильм показывает первый в том , что светлое эмбрион изображаемого неповрежденной внутри аgarose цилиндр перед переключением на флуоресценции. В дальнейшем было показано, что большое поле зрения позволяет вести наблюдение всей сетчатки. Далее фильм показывает в увеличенном масштабе малую область сетчатки, чтобы выделить хорошую субклеточных разрешение. Ath5: разрыв-GFP ³⁷ трансгенной данио эмбрион был использован для работы с изображениями. Этот трансген этикетки различные нейроны в сетчатке (в основном ганглиозных клеток и фоторецепторов прекурсоров). Флуоресценция часть фильма был взят в плен в качестве одного вида записи с двойной двусторонней подсветкой с использованием W цели в 40X / 1.0 с 5-минутными интервалами. Максимальная интенсивность проекции толстого объемом 30 мкм показан. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить этот файл.

Фильм 2 демонстрирует, как очень быстро внутриклеточные события могут быть захвачены с высоким разрешением; В этом случае рост микротрубочек вих плюс заканчивается в сетчатке нервных клеток-предшественников. Информация, содержащаяся в фильме позволяет отслеживать и количественной оценки микротрубочек плюс конечного роста.

Фильм 2:. Микротрубочек динамика в одной ячейке Этот фильм захватывает растет плюс концы микротрубочек помеченное плюс наконечник маркера белка EB3-GFP ^38. Белок выражается в одной ретинальных клеток-предшественников. Микротрубочки растут преимущественно в направлении от верхушечный к базальной (сверху вниз). Средняя скорость EB3 комет измеряли как 0,28 ± 0,05 мкм / сек. Яркое пятно на апикальной стороне клетки, проявляющего нуклеации высокую активность микротрубочек является центросома. Дикого типа эмбрион вводили Hsp70: EB3-GFP плазмидной ДНК. Фильм был приобретен 4 ч после теплового шока (15 минут при 37 ° С) на уровне около 28 hrpost fertilizвания (ФВЧ) как единое представление записи с односторонним освещением с использованием W интервалов объективной и 1 сек времени 63X / 1.0. Одна клетка была обрезана из поля зрения, охватывающей большую часть сетчатки. Максимальная интенсивность проекции двух ломтиков показан. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить этот файл.

На рисунке 3 показана, как внутриклеточные структуры можно проследить в течение многих часов. Здесь центросома в пределах транслокации ганглиозных клеток сетчатки (ГКС) захватывается.

Рис . 3: Центросома локализация во время транслокации ганглиозных клеток сетчатки Этот монтаж покадровой эксперимент показывает положение центросоме по всей сетчатки ганглиозных клеток (RGC) созревания.В нейрональных клеток-предшественников центросома локализован в самом конце апикальной процесса (1:00). Во время клеточного деления, две центросомы служат в качестве опор для митотического веретена (2:25). Это разделение приводит к одной дочерней клетке, которая дифференцируется в RGC и вторую дочернюю клетку, которая становится предшественником фоторецепторов клеток. После разделения, тело клетки РГК транслоцирует к базальной стороне сетчатки, в то время как верхушечный процесс остается прикрепленным на апикальной стороне. После того, как RGC достигает базальной стороне, его верхушечный процесс отсоединяется и центросома путешествует с ним (6:15). Центросома может следовать, постепенно втягивая вместе с верхушечной процесса (6:50, 7:20, 8:10). В последнем кадре (8:55) ганглий клеток растет аксон от его базальной стороне, в то время как центросома все еще локализованы апикально. Мозаичный выражение было достигнуто за счет введения плазмидной ДНК в дикого типа эмбриона на одной клеточной стадии. Клетки визуализировали с помощью Ath5: GFP-caax (зеленый) Construct, какие метки РГК и другие нейроны. Центросомах (стрелки) помечены Centrin-tdTomato ²⁹ выражение (Magenta). Апикальной стороне сетчатки находится в верхней части изображения и базальной стороне в нижней части. Максимальная интенсивность проекции толстого объемом 30 мкм показан. Изображения были обрезаны из фильма, охватывающей всю сетчатку. Фильм начинается примерно 34 ч после оплодотворения (ФВЧ). Стек г был приобретен через каждые 5 мин с целью W от 40X / 1.0. Время отображается в формате чч: мм. Шкала бар составляет 10 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

На рисунке 4 отображается она, как одна ячейка поведение может быть извлечен из данных , захватывая всю ткань , например, в кино 1. Транслокации из RGC можно легко отследить и его апикальный и базальный процессэс последовал.

Рисунок 4:. Транслокация одной сетчатке ганглиозных клеток Транслокация ГКС с апикальнее базальной стороне сетчатки происходит после терминального митоза , как описано в Рисунок 3 ГКС помечена выражением: Ath5. Щелевого GFP ³⁷ трансгенов. Максимальная интенсивность проекции толстого объемом 30 мкм показан. Изображения были обрезаны из фильма, охватывающей всю сетчатку. Фильм начинается около 34 часов после оплодотворения. Стек г был приобретен через каждые 5 мин с целью W от 40X / 1.0. Время отображается в формате чч: мм. Шкала бар составляет 5 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5 демонстрирует способность MULTIVIEW LSFM для захвата ткани подкожноЭлевые морфогенетические процессы с ячеистой разрешением на примере глазного бокала морфогенеза, во время которого оптическая пузырек превращается в зрительном Кубка. Качество изображения может быть значительно улучшена за счет MULTIVIEW визуализации, когда конечное изображение сочетается с информацией из 5 различных видов (в данном случае) в один г стек с изотропным разрешением. Этот показатель иллюстрирует улучшение качества изображения после средневзвешенного слияния и дальнейшего усиления в контрастности изображения и разрешения после MULTIVIEW деконволюции. На рисунке показаны два оптических срезов в разных направлениях через набор данных. Кроме того, монтаж из деконволюции набора данных показывает глазного бокала морфогенез в течение долгого времени. Все моменты времени затем показаны в кино 3.

Рисунок 5: Сравнение качества изображения между одинарными зрения и двумя методами multivIEW фьюжн. (A) Один оптический срез отдельных данных вида , показанного от бокового зрения и (B) спинной стороны . Нашивки артефактов и деградации сигнала более глубокого внутри образца очевидны. Кроме того, часть изображения, видимого в расплавленных данных (CF) не был захвачен в данном представлении. (C) Тот же оптический срез, в настоящее время , как MultiView слиты данные показали , с боковым видом и (D) спинной стороны . Обратите внимание, что полоса артефакты подавляются и глубоких структур в образце лучше решены. (E) Тот же оптический срез теперь , как MultiView деконволюции данные , показанные с рассматривании сбоку и (F) спинной стороны . Обратите внимание на повышенную контрастность и разрешение таким образом, отдельные мембраны и ядра клеток могут быть хорошо различимы. Разрешение не ухудшается заметно глубже внутрь образца. Набор данных был приобретен с двойной односторонней подсветкой от 5 видами примерно 20 градусов друг от друга. Г стеки ABбыли приобретены из 100 мкм с шагом 1,5 мкм при каждом ракурсе с интервалом 10 мин в течение 10 часов с целью W в 20X / 1.0. Входные изображения для слияния MultiView и деконволюции были субдискретизируется 2 × ускорить обработку изображений. 15 итераций MULTIVIEW деконволюции запускались. (G) Сборку показывает обрезанную область спинной стороны от деконволюции данных для выделения морфогенетических событий во время раннего развития глаз от глазного пузыря до стадии глазного бокала. Два слоя глазного пузыря, которые изначально подобную столбчатый эпителий, дифференцируются в популяции различных клеток. Дистальный слой близко к эпидермис становится нейроэпителия сетчатки (RN) и ближний слой близко к нервной трубки становится Пигментный эпителий сетчатки глаза (RP). Клетки в RN удлиненными и инвагинировать для формирования глазного бокала (1:40 до 5:00); в то же время RP клетки сглаживаются. Поверхность эктодерма индуцируется с образованием линзы (1:40), ВГICH инвагинирует позже (5:00). Фильм начинается в 17 часов после оплодотворения. Время отображается в формате чч: мм. Все клеточные мембраны помечены бета-актина: RAS-GFP трансгенов и все ядра помечены Hsp70: Н2В-RFP трансгенов. Шкала бар представляет 30 мкм. FB переднего мозга, LE линзы, OP обонятельные плакоды, нейроэпителия RN сетчатки, Р.П. пигмент сетчатки глаза эпителий. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Фильм 3: Оптическая чашка морфогенез показано с одним видом и двумя методами MULTIVIEW плавки покадровой фильм иллюстрирует полный процесс глазного бокала морфогенеза от глазного пузыря до стадии глазного бокала.. Это показывает единственный оптический срез от бокового зрения (сверху) и одного оптического среза от спинной стороны (снизу), Клетки развивающегося оптическим пузырьком подвергаются сложным перегруппировок, чтобы окончательно сформировать полусферический оптическую чашку с внутренним нейроэпителии сетчатки и наружного пигментного эпителия сетчатки. Линза образована из поверхностной эктодермы. Он инвагинирует вместе с нейроэпителии и сидит в зрительном чашку. Все клеточные мембраны помечены путем экспрессии бета-актина: Ras-GFP (зеленый) трансгена и ядра помечены Hsp70: Н2В-RFP (Magenta). Фильм начинается около 17 часов после оплодотворения. Набор данных был приобретен с двойной односторонней подсветкой от 5 видами примерно 20 градусов друг от друга, и аз штабеля около 100 мкм были приобретены через каждые 10 мин с целью W от 20X / 1.0. Время отображается в формате чч: мм. Шкала бар составляет 50 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить этот файл.

Discussion

1. Основные этапы и способы их устранения для сбора данных

Типичные параметры получения изображения для GFP и RFP , выражающей образец можно найти в таблице 3. В описываемой установке микроскопа свет лист является статическим, образованной цилиндрической линзой. Эти две цели освещения являются воздушные линзы и цель обнаружения представляет собой водно-окунанием линзы. Увеличение 1.0 с 20X / 1.0 или 40X / 1.0 цели дает 230 нм и 115 нм размер пикселя и поле зрения 441 х 441 мкм или 221 х 221 мкм соответственно. Рекомендуется использовать легкую толщину листа по умолчанию с центром до границы соотношении 1: 2. Для 20X / 1.0 эта толщина соответствует 4,5 мкм, а для 40X / 1,0 до 3,2 мкм в центре. Если скорость формирования изображения не является основным приоритетом, использовать отдельные дорожки в случае образца многоцветной, чтобы избежать перекрестных помех излучения флуоресценции между каналами. Самая высокая скорость приобретения ограничена 50 мс за г шаг заскорость перемещения по оси Z водителя. Если цель состоит в том, чтобы достичь максимальной скорости формирования изображения в случае, например, две дорожки с двойным двусторонней подсветкой, время экспозиции должно быть установлено таким образом , чтобы сумма всех снимков , сделанных на стадии г ниже 50 мс. С другой стороны, если только одно изображение приобретается за г шаг, это не выгодно, чтобы установить время короткой экспозиции 50 мс.

размер 1920 x 1920 Изображение

16-разрядный

Pivot просканировать

Двухсторонний освещение с онлайн-фьюжн

Цель / 0,2 освещение 10X

20X цель обнаружения / 1.0 W Plan-Apochromat

Трек 1: Возбуждение 488 нм обычно 2% от 100 мВт лазер, 550 нм эмиссионный фильтр SP

Трек 2: 561 нм Возбуждение обычно 3% от 75 мВт лазер, 58эмиссионный фильтр LP 5 нм

Выдержка времени до 100 мс

Z толщина стека 50-100 мкм

1-1.5 мкм г размер шага в режиме непрерывного привода г

Инкубация при 28,5 ° C

Таблица 3: Визуализация параметров.

Осмотр образца после эксперимента

Важно, чтобы убедиться, что образец по-прежнему здоровым в конце эксперимента. В качестве первого отсчета, проверьте биение образца под стереоскоп. С парой острых щипцов образец может быть выведен из агарозы и переехал в инкубатор для дальнейшего развития, чтобы проверить, если он пострадал от изображения. В качестве альтернативы, он может быть закреплен на меченых антител.

Монтаж и дрейф

Крайне важно, чтобы держать осмолярность камеры сспособность по близко к осмолярности вложению агарозы, в противном случае набухание / сокращение агарозы и последующей нестабильности образца будет происходить. Таким образом, использовать один и тот же раствор (E3 среда без метиленового синего), чтобы заполнить камеру и подготовить 1% с низкой температурой плавления агарозы аликвот. Кроме того, не оставляйте агарозы в блоке C нагрева 70 ° в течение более 2 часов, так как он может потерять свои желирующие свойства.

Не внедряйте рыбу в слишком горячей агарозы, так как это может привести к теплового шока ответ или гибели эмбриона. Если вы не уверены о влиянии теплой агарозы на эмбрионах, убедитесь, что хвост не сгибать и что частота сердечных сокращений не замедляется. Если это происходит, используйте другой эмбрион для эксперимента.

Держите общую длину агарозном колонки с образцом короткого (около 2 см) и установите данио с его головкой, ориентированной на кончик плунжера. Аналогично, агарозы цилиндр выдавливается из capillичных должны быть настолько короткими, насколько это возможно. Эти меры позволят обеспечить стабильность образца на протяжении всего фильма. В то же время, столбец агарозы должен быть достаточно длинным, так что сам стеклянный капилляр не доходит на пути света, так как это может привести к значительному преломление и отражение.

Первоначальный дрейф образца обусловлено изменением объема самого агарозном цилиндра. Скольжение поршня не является причиной для этого. Таким образом, это не помогает зафиксировать поршень с пластилином или лака для ногтей. Эмбрион может изменить свою позицию во время фильма из-за его естественного роста тоже. Соответственно, желательно, чтобы центр области интереса в середине поля зрения и сохранить некоторую комнату на краях, чтобы приспособить эти движения.

Уменьшение количества вложению среды в пути прохождения света

Ориентирование образец правильно помогает добиться наилучшего качества изображения ^15. Генралли, возбуждение и излучение света должно проходить через как мало ткани и монтажа средств массовой информации, как это возможно. Оптимальное решение агарозы свободной монтаж. Это было достигнуто, например , в установке для Arabidopsis бокового корня изображения ^14, в котором главный корень был установлен в phytagel и боковые корни были впоследствии позволить расти из колонки гель полностью. Агарозном свободной монтаж также был разработан для работы с изображениями полного эмбриогенеза Tribolium жука в течение двух дней ^12. Улучшение качества изображения не является основным мотивом в этом случае. Tribolium эмбрионы просто не выживают внутри агарозы достаточно долго. Абсолютно вложение средств массовой информации, свободной от монтажа не было достигнуто для длительного визуализации в данио. Тем не менее, мы можем воспользоваться тем фактом, что когда агарозном затвердевает, большинство эмбрионов расположены по диагонали в капилляре с одним глазом, расположенный глубоко в агарозы и второй глаз быть близко к поверхности колонны вложения. Tон глаз ближе к поверхности обеспечивает превосходное качество изображения и, следовательно, должны быть отображены преимущественно.

Агарозном концентрация и долгосрочных изображений

Концентрация агарозы для крепления представляет собой компромисс между стабильностью образца и возможность приспособиться к росту зародыша и диффузии кислорода к нему. Там нет дополнительного усиления в стабильности образца при использовании агарозных концентрации выше, чем на 1%. В качестве отправной точки для оптимизации экспериментов мы рекомендуем 0,6% агарозы, который также подходит для эмбрионов моложе 24 HPF, которые являются слишком деликатная для монтажа в 1% агарозы. Для анестезировать старых эмбрионов и личинок, концентрация MS-222 может быть увеличена до 200 мкг / мл без побочных эффектов ^13.

В случае развивающихся эмбрионов изображаются дольше, чем ± 12 ч, агарозы монтажа не рекомендуется, так как он ограничивает рост зародыша и Causэс хвост деформации. Эта проблема была решена путем установки данио эмбрионов в полимерные пробирки FEP с показателем преломления , сходных с водой ^13,39. Мышиные эмбрионы, с другой стороны, может быть иммобилизован в полых агарозном цилиндров ⁴⁰ или в отверстия акрилового стержня , прикрепленного к шприцу ^41. монтаж трубки FEP не рекомендуется в качестве метода по умолчанию, хотя, потому что стенка трубки преломляет свет чуть больше, чем агарозы.

Свет выравнивания листа

Для получения хорошего качества изображения чрезвычайно важно для выполнения автоматического выравнивания светового листа перед каждым экспериментом. Особенно, если были изменены параметры масштаба, цели были вынуты, или другая жидкость была использована в камере.

освещение

Стержень сканирование светового листа всегда должна быть активирована. Для больших образцов рассеяния, необходимо применить двухсторонний освещение с онлайн-Fusion достичь равномерное освещение по всему полю зрения. Двухсторонний освещение также уменьшает конкретную проблему визуализации глаз, который является преломление входящего светового листа линзой эмбриона. Более мелкие, меньше образцов рассеяния могут быть эффективно визуализируют с помощью односторонней подсветки, которая сокращает время обработки изображений в два раза и может привести к небольшому улучшению качества изображения по сравнению с двойной односторонней подсветкой. Это происходит потому, что пути прохождения света для освещения двух рук всегда разные и тем более эффективно можно выбирать. Кроме того, два световых листы, поступающие от каждой стороны никогда не идеально в одной плоскости, что вызывает легкое размывание после слияния. Для очень быстрых внутриклеточных событий, как растущих микротрубочек (Movie 2), двухсторонний освещение не подходит, так как изображение с подсветкой слева и справа приобретаются последовательно, что может привести к размытость.

фотообесцвечиванияи фототоксичности

Менее Флуорофор фотообесцвечивание часто упоминается как основное преимущество LSFM. Мы утверждаем, что цель должна быть не фотообесцвечивание вообще. Если есть заметные фотообесцвечивание в эксперименте живого изображения, образец, вероятно, уже из своего физиологического диапазона переносимой лазерного воздействия. При визуализации данио эмбрионов в прядильный диск микроскопа, по нашему опыту, высокой фототоксичности может затормозить развитие эмбриона еще до флуоресцентных отбеливателей сигнала заметно. Таким образом, параметры обработки изображений в LSFM должна быть отрегулирована таким образом, что наблюдается мало или нет фотообесцвечивание. Даже если LSFM нежен к образцу, разумно использовать только как много мощности лазера и время облучения, сколько необходимо для достижения отношения сигнала к шуму, достаточном для последующего анализа данных.

Z-стек, временные интервалы и размер данных

Файлы, генерируемые LSFM, как правило, очень большой; иногда в диапазоне терабайт. Часто бывает необходимо сделать компромисс между качеством изображения и размером данных. Это особенно касается расстояния между г стеков и интервалов в покадровой приобретения. Для определения интервалов Z, в идеале следует использовать кнопку Оптимальное в закладке инструмента Z-стека, особенно если набор данных будет деконволюции позже. Он вычисляет расстояние до достижения 50% перекрытие между соседними оптическими ломтиков. Тем не менее, несколько большие интервалы г, как правило, приемлемы. Они уменьшают время, необходимое для получения стека г, а также конечный размер файла. Оптимальное время выборки зависит от интересующего нас процесса. Для общего развития глаз 5-10 мин интервалы, как правило, приемлемы. Если какие-то структуры будут автоматически отслеживаются, последующие моменты времени должны быть достаточно похожи.

Флуоресцентные шарики

Флуоресцентные шарики в первую очередь служат координатные маркеры для регистрации различных мненийиз MULTIVIEW набора данных друг на друга. Всегда вихре шарик решения перед использованием. Не нагревать бусинки, поскольку это может привести к потере флуоресцентного красителя. Оптимальная концентрация шарика для регистрации MULTIVIEW должна быть определена экспериментально. Описанный плагин лучше всего работает с около 1000 обнаруженных шариков в течение каждого вида. Более крупные (500 нм или 1000 нм) шарики обнаруживаются более надежно, чем меньше (менее 500 нм) бусин. Это потому, что более крупные шарики ярче и легче сегмента без ложных срабатываний структур в образце. Недостатком больших шариков является то, что они очень заметны в окончательном плавленого и деконволюции изображения. Для каждого нового флуоресцентным маркером, соответствующий размер гранул и флуоресцентное излучение должны быть оптимизированы. Чтобы дать пример образца из рисунка 5 и Movie 3, 100 нм зеленые шарики излучения дали слишком много ложных срабатываний в мембране-GFP канала, но 1000 пм шарики красного излучения были обнаружены робастно в Н2В-RFP канала с очень мало положительных обнаружений внутри образца. Если обнаружение шарика терпит неудачу в канале с флуоресцентным маркером, отдельный канал только содержащий гранулы могут быть получены, но это не очень практично. Шлихтованные бусин суб разрешением дают прямое считывание функции рассеяния точки (ФРТ) микроскопа, который может быть использован для деконволюции (рис 2C-D). Если регистрация и слияние работает лучше с более крупными бусинами (например , 1000 нм), отдельное изображение PSF могут быть приобретены с суб-разрешением, например, 100 нм бусинами. Использование многоцветные бусы полезно при регистрации приобретения многоканальным и проверки того, что каналы наложения отлично.

Добавление флуоресцентных шариков не является необходимым при визуализации из единого представления без последующего MULTIVIEW регистрации и слияния. Тем не менее, даже в тех случаях, шарики могут быть полезными во время Первол регулировка света листа для проверки качества светового листа и в целом, чтобы выявить оптические аберрации. Такие оптические аберрации могут происходить из различных источников, таких как поврежденные или грязных целей, грязные окна камеры или неоднородности в агарозы. Шарики могут быть также использованы для коррекции дрейфа по MULTIVIEW регистрации Фиджи плагин ^20.

Multiview

С целью реконструкции MultiView, то лучше приобрести нечетное число просмотров 3, 5 и так далее, которые не противостоящих друг другу. Это улучшает деконволюции поскольку PSFs изображаются с разных направлений. Важно также, чтобы подтвердить в начале приобретения покадровой времени, что имеется достаточное перекрытие между видами. Это лучше всего делать эмпирически, то есть, сразу подтверждая , что мнения в первый момент времени может быть успешно зарегистрирован. Когда цель приобретения MULTIVIEW является увеличить разрешениеобраза большого образца рассеяния, не рекомендуется, чтобы изображение всего образца в каждом ракурсе, но останавливаться вокруг центра образца, где ухудшает сигнал. Низкое качество сбора со второй половины образца не добавило бы полезную информацию для реконструкции MultiView.

2. Основные этапы и способы их устранения для обработки данных

В настоящее время существует несколько возможностей для обработки данных MultiView из легкого листового микроскопа, которые хорошо документированы и относительно легко принять. Мы используем приложение реконструкции MultiView, который является источником открытого программного обеспечения реализована на Фиджи ³² (Stephan Preibisch неопубликованные, Link 1a и Link1b в список материалов). Этот плагин является одним из основных редизайн предыдущего SPIM регистрации плагин ^20, обзорот Шмид и др. , ^42, интегрируя BigDataViewer и его XML и формат HDF5 ³³ с регистрации SPIM рабочего процесса (рис 1B, ссылка 2 , ссылка 3 ). Данное приложение может быть также адаптирован для высокопроизводительных вычислений кластера, что значительно ускоряет обработку ^43. Эта регистрация MultiView приложение активно развивается дальше и продолжает улучшаться. В случае возникновения проблем или особенностей запросов для описанного программного обеспечения, пожалуйста , файл вопросов на соответствующих страницах GitHub ( ссылка 4 для Multiview реконструкции и Link 5 для BigDataViewer).

Второй вариант заключается в использовании коммерческого программного обеспечения, доступного вместе с микроскопом. Это решение хорошо работает, и работает тот же принцип использования флуоресцентных бусин, чтобы зарегистрировать различные точки зрения. Тем не менее, ему не хватает возможность визуализировать весь набор данных быстро, как с BigDataViewer. Кроме того, программное обеспечение не может быть адаптирована к кластеру, а тем более блоков обработки микроскоп для других пользователей, если дополнительные лицензии на программное обеспечение не закуплен.

Третий вариант, который также является программное обеспечение с открытым исходным кодом, была недавно опубликована в лаборатории Keller ⁴⁴ и обеспечивает всеобъемлющие рамки для обработки и вниз по течению анализа световых данных листа. Это программное обеспечение использует информацию, в образце для выполнения множественного синтеза, поэтому она не требует присутствия флуоресцентных бусин вокруг образца. Но в то же время он предполагает ортогональную ориентацию взглядов изображений (цели), поэтому он не может быть использован для данных , полученных от произвольных углов ^44.

требования к оборудованию

ntent "> Оборудование , используемое для обработки можно найти в таблице 4. Там должна быть достаточной емкости для хранения и четкий трубопровод для обработки имеющихся данных, впереди реального эксперимента. Приобретение изображений происходит быстрее , чем последующий анализ и легко чтобы залита необработанными данными. часто бывает нереально хранить все исходные изображения, а обрезанную версию или обработанные изображения , как плавленых видом, максимальные интенсивности проекций или сферических выступов ^45.

процессор	Два процессора Intel Xeon E5-2630 (Шесть Core, 2,30 ГГц Turbo, 15 МБ, 7,2 GT / сек)
Память	128 ГБ (16 × 8 ГБ) 1600 МГц DDR3 ECC RDIMM
Жесткий диск	4 × 4 TB 3.5inch Serial ATA (7,200 оборотов в минуту) жесткий диск
контроллер HDD	PERC H310 SATA / SAS Conтроллер для Dell Precision
Конфигурация HDD	C1 SATA 3,5 дюйма, 1-4 Жесткие диски
Графика	Двойной 2 Гб NVIDIA Quadro 4000 (2 карты W / 2 DP & 1 DVI-I каждый) (2 DP-DVI и 2 переходника DVI-VGA) (MRGA17H)
сеть	Intel X520-T2 двухпортовый 10 GbE карты сетевого интерфейса

Таблица 4: Требования к оборудованию.

Скорость обработки данных

Время, необходимое для обработки данных зависит от размеров данных и от используемого аппаратного обеспечения. В таблице 1 мы приводим краткий обзор времени , необходимого для ключевых шагов в обработке GB пример набора данных множественного 8.6 , который состоял из 1 временной точки с 4 - мя видами и 2 каналами.

Обработка sТЭП	Время	шаг протокола
Пересохраните, как HDF5	6 мин 30 сек	6.3
Обнаружение процентного пункта	20 сек	6.4
Регистрация с использованием процентных пунктов	3 сек	6.5
Контент на основе MultiView фьюжн	4 ч	7.2
Multiview деконволюции (CPU)	8 ч	7.3
Multiview деконволюции (GPU)	2 ч	7.3

Таблица 1: Данные времени обработки.

Форматы входных данных для MULTIVIEW реконструкции

Фиджи Плагин Multiview Реконструкция может поддерживать .czi, TIF и форматы ome.tiff. Из-за структуры данных .czi формата, прерывистые наборы данных не являютсяподдерживается без предварительной обработки. Прерывистое означает , что запись должна была быть перезапущен (например , чтобы скорректировать свои позиции из - за дрейфа образца). В этом случае .czi файлы должны быть повторно сохранены в качестве .tif. Для .tif файлов каждый вид и направление освещения должно быть сохранено в виде отдельного файла.

Калибровка размера пикселя

Микроскоп-операционное программное обеспечение вычисляет калибровки для размера ху пикселя в зависимости от выбранной цели. Тем не менее, размер пикселя в Z определяется независимо от размера шага. Если неправильная цель задается в программном обеспечении ху для г соотношение неверно и регистрация будет выполнена.

Первичная регистрация

После определения набора данных количество регистраций будет 1 , и число процентных пунктов будет равен 0 в ViewSetup Explorer. Первоначальная регистрация представляет собой калибровку набора данных. Как число OF регистраций и процентные пункты будут увеличиваться во время обработки.

Вниз выборки для выявления процентного пункта

Использование вниз выборки рекомендуется, так как загрузка файлов и сегментации будет намного быстрее. Важно, однако, отметить, что параметры обнаружения будет меняться в зависимости от выборки вниз, таким образом, передавая параметры обнаружения между различными настройками вниз образца не представляется возможным.

Обнаружение процентного пункта

Желательно, чтобы сегмент как много истинных шариков, как это возможно в каждом ракурсе, даже по цене получения некоторых ложных положительных обнаружений, потому что они не препятствуют регистрации значительно. Ложные обнаружений, если их мало чисел, исключаются при регистрации (См регистрации процентных пунктов). Тем не менее, массовые ложноположительных обнаружений создают проблему для алгоритма. Это не только снижает производительность для обнаружения ирегистрация, так как она занимает гораздо больше времени для сегментации изображения, а также сравнить эти шарики между видами, но и снижает точность регистрации. Эту проблему можно решить, используя более строгие параметры обнаружения. Кроме того, более сегментации гранул (например , несколько на вирусах и вредоносных одном бортовом фиг.1Е) губительно для регистрации и его следует избегать.

Регистрация процентных пунктов

Для регистрации взглядов друг на друга, местоположение каждого шарика в каждом ракурсе описывается ее положение относительно трех ближайших соседних бусин. Эти созвездия формируют локальный геометрический дескриптор и позволяют сравнивать каждую бусинку между видами. Бусинки с совпадающими описатель между двумя видами затем рассматриваются в качестве кандидатов соответствий. Обратите внимание, что это работает только для случайно распределенных шариков, для которых локальные дескрипторы, как правило, уникальны для каждого шарика.Можно использовать и другие структуры, такие, как ядер в образце для регистрации. Тем не менее, для того , чтобы обнаружить ядра, которые распределены не случайным образом в образце, другие методы применяются ^20,21.

Кандидаты соответствиями затем тестировали против RANSAC ^36, чтобы исключить ложные срабатывания. Каждая переписка указывает модель преобразования для наложения взглядов друг на друга. Правда соответствия, скорее всего, согласятся на одной модели трансформации, тогда как останцы бы каждый пункт другой. Истинные соответствиями затем используются для вычисления аффинного преобразования модели между двумя сравниваемыми видом. Глобальная оптимизация с помощью алгоритма итеративного оптимизации Затем проводят, в течение которого все виды регистрируются на первый взгляд , с целью минимального перемещения между видами ^20,21.

Время регистрации замедленной

Из-за перемещениятвом в агарозном геле и неточной двигателя движения предметный столик микроскопа, положение каждого стека изменяется умеренно в течение долгого времени. В то время как регистрация отдельного момента времени устраняет разницу между взглядами этого момента времени, то заданный промежуток времени также должен быть зарегистрирован в целом. С этой целью, каждый отдельный момент времени регистрируется на контрольной точке времени.

пункт Ориентировочное время

Если временной ряд с большим количеством моментов времени обработки, изображающую точку времени выбирается в качестве ссылки, как правило, с середины временного ряда, так как интенсивность шарик может деградировать с течением времени из-за отбеливания. На этой ссылке, параметры для обнаружения процентных пункта, регистрации, ограничивающего параллелепипеда и слияния может быть определена. Затем эти параметры применяются ко всему промежутка времени, чтобы вычислить конкретную модель преобразования для каждой отдельной точки времени. Во время регистрации в заданный промежуток времени все другие моменты времени также REGISTERed пространственно на этот опорный момент времени. Таким образом, параметры ограничивающая коробка для всей записи зависят от этой конкретной точке времени.

Многоканальная регистрация

При визуализации нескольких каналов, в идеале одни и те же флуоресцентные шарики должны быть видны во всех отображенных каналах. Обнаружение и регистрация может быть выполнена индивидуально для каждого канала, который учитывает влияние различных длин волн света на трансформацию. Зачастую это невозможно, так как гранулы не видны во всех каналах или шарики доминирующий изображение слишком много в одном канале, и слишком тусклым в другом канале (ах). Типичное решение заключается в использовании бус видимые только в одном канале для обнаружения и регистрации и модели приобретенного преобразования (т.е. после обнаружения, регистрации и регистрации в заданный промежуток времени) затем применяется к другим каналам Фиджи> Плагины> Multiview Reconstrед ен ие> Пакетная обработка> Инструменты> Повторяющиеся Трансформации. В раскрывающемся меню для параметра Применить преобразование выбора одного канала на другие каналы. В следующем окне выберите XML и нажмите кнопку OK. Затем выберите канал, содержащий бусинки в качестве исходного канала и в качестве целевого канала выберите канал (ы) без шариков. Для получения дубликата , которые преобразования используют Заменить все преобразования и нажмите OK. Преобразования затем копируются на все другие каналы и сохраняются в XML. Чтобы увидеть новые преобразования в ViewSetup проводнике, перезапустить MultiView Реконструкция приложения.

Ограничительная рамка

Слияние нескольких представлений является вычислительно очень интенсивно. Тем не менее, большие изображения, как правило, приобрели для размещения не только образец, но и бусинки вокруг него. После регистрации параметраs извлекаются из гранул, то они больше не являются полезными в качестве части изображения. Поэтому, чтобы увеличить эффективность слияния, только те части изображения стеки, содержащих образец должен быть сплавлены друг с другом. Область интереса (ограничивающего параллелепипеда) должен быть определен, чтобы содержать образец и как мало окружающих агарозы, насколько это возможно. Для примера на рисунке 2 средневзвешенным слитый на всем объеме с 2229 × 2136 × 2106 точек потребуется 38,196 Мб оперативной памяти, в то время как с коробкой , ограничивающей объем уменьшается до 1634 × 1746 × 1632 точек и требования к памяти снижаются до 17,729 МБ.

Контент на основе MultiView фьюжн

Проблема в фьюзинг данных множественного является то, что мнения, как правило, заканчиваются резко и не содержат одинаковое качество изображения для одних и тех же вокселей. Поэтому простое усреднение мнений приведет к наложения артефактов и ненужного ухудшения качества изображения. Контент на основе MultiView фу Sion принимает обе эти проблемы во внимание. Во- первых, он смешивает различные точки зрения, где одно изображение заканчивается , а другой начинается , и во- вторых, он оценивает местное качество изображения и применяет более высокие весовые коэффициенты для более высокого качества изображения в слиянии ^21. По сравнению с одним видом есть улучшение резолюции в г с небольшим ухудшением сигнала в ху (рис 2E-H, Рисунок 5A-D).

Multiview деконволюции

Multiview деконволюции другой подход для достижения слияния взглядов. С помощью этого метода также PSFs различных взглядов принимаются во внимание для того, чтобы восстановить изображение, которое было свернут по оптике микроскопа. Этот метод значительно улучшает качество изображения путем удаления размытость изображения и повышения разрешающей способности и контрастности сигнала ³¹ (рис 2C-D, Рисунок 2I-J, Рис 5E-G, Movie 3).

ve_content "> Деконволюция вычислительно очень интенсивно (см таблицу 1), при этом с помощью GPU для обработки увеличивает скорость этого процесса. Кроме того , может быть необходимо для выполнения деконволюции вниз выборку данных. вниз образца, используйте Реконструкция Фиджи> MULTIVIEW > Пакетная обработка> Инструменты> нанести трансформации. Это будет применяться новая модель преобразования на представления , которые будут сохранены в файле .xml.

HDF5 формат файла для BigDataViewer и BigDataServer

BigDataViewer ³³ позволяет легко визуализировать данные терабайт размера. Как контролировать BigDataViewer представлены в таблице 2. В демо основной работы программы также доступна в качестве дополнения в его первоначальной публикации ^33. BigDataViewer сосредоточен на файл .xml, который содержит метаданные, и файл hdf5, который содержит данные изображения. Данные изображения являются Presлор в HDF5 в нескольких уровнях разрешения в 3D-блоков. Многочисленные уровни разрешения позволяют визуализировать данные быстрее, с более низким разрешением, до полного разрешения загружен. Отдельные блоки только загружаются в память, когда это необходимо. Таким образом, формат hdf5 изображения позволяет устанавливать прямую и быструю визуализацию данных через BigDataViewer ^33. Она также ускоряет обработку, так как загрузка файлов осуществляется более эффективно. Поэтому мы рекомендуем resaving набор данных в этот формат, хотя это не является строго обязательным для обработки. Для более подробного объяснения формата данных, пожалуйста , обратитесь к Ссылка 3 . Кроме того, наборы данных могут использоваться совместно с сотрудниками или общественности с помощью BigDataServer ³³ ( ссылка 6 ).

эффект

ключ
F1	показывает справку с кратким описанием BigDataViewer и его основной операции
<> Или колесо мыши	движение в г
стрелок вверх и вниз	увеличивать и уменьшать масштаб
правой кнопкой мыши и перетащить	перемещает образец в зрителя
щелкните левой кнопкой мыши и перетащите	вращается вокруг образца курсора
ползунок в нижней части зрителя или Tab и стрелку влево или вправо	движется по оси времени
дополнительно нажав сдвиг	быстрее движение или вращение по любой оси
х, а затем влево и вправо стрелка	вращается вокруг оси х
у, а затем влево и вправо стрелка	вращается вокруг оси у
г, а затем влево и вправо стрелка	вращается вокруг оси г
сдвиг и х	ориентирует вид вдоль оси х
сдвиг и у	ориентирует вид вдоль оси у
сдвиг и г	ориентирует вид вдоль оси г
я	переключение между различными режимами интерполяции (т.е. ближайшего соседа и трилинейные)
s или Настройки> Яркость и Контраст	изменяет цвет каналов, яркость и контрастность
F6 или Настройки> Видимость и группировка	изменяет отображаемые группы, позволяет группировать для наложения различных групп и вызова групп с помощью цифровых клавиш
F10 или Инструменты> Запись фильма	приобретает временные ряды отображаемой в данный момент среза

Таблица 2: Big Data Viewer.

3. Ограничения описанной реализации LSFM

Низкая пропускная способность

В типичном эксперименте LSFM только один образец на эксперимент визуализируется. Тем не менее, по нашему опыту, много полезной информации можно извлечь из этого единого образца. Высокая производительность визуализации нескольких эмбрионов было недавно достигнуто в домах , построенных LSFM установок ^46-48, хотя , как правило , за счет свободы позиционирования образца и вращения.

глубокое проникновение в вашем тканях

Несмотря на то, данио эмбрионы являются полупрозрачными, полученное качество изображения ухудшается быстро при визуализации глубже в ткани из-за рассеяния и поглощения. Частично это эффект рассеяния и поглощения излученной флуоресценции образца и не могут быть исправлены в текущей настройке. Другим источником неравномерного качества изображения является неравномерное освещение. Tон свет лист падает с левой или с правой стороны и любые объекты на своем пути преломлять его, что приводит к полоской артефактов и размытости. Двухсторонний освещение и MultiView слияние может уменьшить артефакты в окончательном изображении. И, наконец, качество изображения имеет тенденцию быть немного хуже, в направлении к краю поля зрения из-за естественной геометрии светового листа, которая становится толще по направлению к краям.

Ограниченная химическая обработка

Употребление наркотиков или ингибиторов широко распространена в данио исследования. В этом микроскопе употребление наркотиков сдерживается из-за большого объема камеры образца и соображений других пользователей инструмента, которые разделяют ту же самую камеру. Использование дополнительной камеры предназначен для проведения экспериментов с наркотиками может решить эту проблему. Заполнения камеры частично со стеклянными шариками уменьшает объем жидкости, который требуется.

Нет photomanipulation

CurrenTLY нет никакой возможности локализованного оптическое манипулирование как фотоконверсии или лазерной абляции в этом микроскопом. Тем не менее, дом, построенный установки могут быть использованы для таких специфических применений.

4. Значение и будущих приложений

LSFM является лучшим методом, доступным на сегодняшний день для быстрой визуализации больших объемов живых эмбрионов. Большинство экспериментов мыслимых на конфокальной микроскопии может быть также выполнена на светлом листе микроскопа с вышеупомянутыми преимуществами. В случае визуализации развития глаза, скорость LSFM не является критическим параметром. Вместо этого, низкая фототоксичности и гибкость в позиционировании образца являются решающими преимущества.

Данные LSFM имеют высокое SNR, который помогает достичь хороших результатов деконволюции, а также полезно для анализа изображения в автоматическом режиме и слежение за объектом. В заключение LSFM является отличным инструментом для генерирования поддающихся количественной оценке данных о эмбриональном развитии и OveraLL клеток и характеристики ткани для последующего моделирования и физических описаний рассматриваемых процессов.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lightsheet Z.1 microscope	Carl Zeiss Microscopy
Low melting point agarose	Roth	6351.1
Low melting point agarose	Sigma	A4018 or A9414
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB/MS-222/Tricaine)	Sigma	E10521
N-Phenylthiourea (PTU)	Sigma	P7629
500 nm red fluorescent beads F-Y 050	Millipore (Estapor)	80380495
20 μl (1 mm inner diameter, marked black) capilllaries	Brand	701904	sold as spare part for transferpettor
Teflon tip plungers for 20 μl capillaries	Brand	701932	sold as spare part for transferpettor
Circular glass coverslips diameter 18 mm, selected thickness 0.17 mm	Thermo scientific (Menzel-Glaser)
O-rings for chamber windows 17×1.5 mm	Carl Zeiss Microscopy
Tweezers, style 55	Dumont	0209-55-PO
50 ml Luer-Lock syringes	Becton Dickinson	300865
150 cm extension cable for infusion compatible with Luer-Lock syringes	Becton Dickinson	397400
Links
Link 1 Multiview reconstruction application			https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration http://fiji.sc/Multiview-Reconstruction
Link 2 BigDataViewer			https://github.com/bigdataviewer
Link 3 BigDataViewer			http://fiji.sc/BigDataViewer
Link 4 Multiview reconstruction application-issues			https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration/issues
Link 5 BigDataViewer-issues			https://github.com/bigdataviewer/bigdataviewer_fiji/issues
Link 6 BigDataServer			http://fiji.sc/BigDataServer