Usando folha de luz microscopia de fluorescência para Imagem Desenvolvimento Zebrafish Eye

Introduction

Morfogénese é o processo que molda o embrião e em conjunto com o crescimento e a diferenciação dirige a ontogenia a partir de um ovo fertilizado num organismo multicelular madura. Os processos morfogenéticos durante o desenvolvimento animal pode ser analisado melhor por imagem dos espécimes vivos intactos ^1-3. Isto é porque tais imagiologia embrião inteiro preserva todos os componentes que conduzem e regulam o desenvolvimento, incluindo gradientes de moléculas de sinalização, matriz extracelular, vasculatura, inervação bem como as propriedades mecânicas do tecido circundante. Para colmatar as escamas, no qual a morfogénese ocorre, os eventos subcelulares rápidos tem que ser capturado numa escala de tempo minutos no contexto do desenvolvimento de todo o tecido ao longo de horas ou dias. Para cumprir todos estes requisitos, a aplicação moderna ⁴ do ortogonal microscópio avião iluminação ⁵ foi desenvolvido. Originalmente, ele foi nomeado o Selective Avião Illumination Microscopy (SPIM) ^4; agora é um termo abrangente folha de luz microscopia de fluorescência (LSFM) é normalmente usado. LSFM permite imagens em resolução de tempo de alta, enquanto induz menos fototoxicidade de varredura a laser ou disco giratório microscópios confocal ^6,7. Hoje em dia, já existem muitas implementações do princípio básico folha de luz de iluminação e que tem sido utilizado para a imagem uma grande variedade de amostras e os processos anteriormente inacessíveis aos investigadores ^8-11.

Nós primeiro lugar gostaria de destacar várias vantagens importantes de LSFM sobre as abordagens de microscopia confocal convencionais:

Para obter resultados significativos a partir de imagens ao vivo experiências microscópicas, é importante que a observação afecta apenas minimamente a amostra. No entanto, muitos organismos, incluindo peixes-zebra são muito suscetíveis a exposição à luz laser, tornando-se um desafio para a imagem-los em um microscópio confocal com resolução temporal alta sem ef fototoxicidadefects como ^6,7 desenvolvimento parado ou atrasado. LSFM é atualmente a técnica de imagem de fluorescência com o mínimo de efeitos perturbadores sobre a amostra ^7. Uma vez que a folha fina de luz laser ilumina apenas a parte do espécime que é criada uma imagem num ponto de tempo específico, a folha de microscópio de luz é usando fótons de forma muito eficiente. Consequentemente, a exposição pouca luz permite observações de lapso de tempo mais longos de espécimes saudáveis, por exemplo, ^12-17. Além disso, graças à capacidade de invasão mínima de LSFM, o número de imagens adquiridas já não é ditada pela quantidade de luz na amostra pode tolerar, mas sim pela quantidade de dados que podem ser processados ​​e armazenados.

Na mesma linha de manter a amostra em condições fisiológicas perto, LSFM vem com a montagem de amostras estratégias alternativas bem adequado para embriões vivos. Em técnicas LSFM, os embriões são tipicamente incorporado dentro de uma coluna fina de baixa porcentagem de agarose. o mounting em cilindros de agarose permite a total liberdade de rotação, de modo que a amostra pode ser observado a partir do ângulo perfeito (em LSFM referido como vista) e a partir de vários pontos de vista simultaneamente. A imagem multiview e subsequente fusão multiview é benéfico especialmente para grandes amostras, espalhando e permite capturá-los com alta, resolução isotrópica. Um resumo das outras estratégias de montagem LSFM possíveis pode ser encontrada no manual de instruções do microscópio oficial, no capítulo sobre a preparação da amostra escrito pelo laboratório de E. Reynaud. É uma leitura recomendada, especialmente se o objetivo é imagem amostras diferentes do que o descrito aqui.

A aquisição de imagem em LSFM é um campo largo, baseado em câmera, ao contrário de varredura a laser do microscópio confocal. Isto resulta num sinal-para maior ruído (SNR) de imagens adquiridas e pode ser extremamente rápido (dezenas a centenas de quadros por segundo). A alta sensibilidade do LSFM ainda permite que imagens de samp fracamente fluorescenteles, como fatores de transcrição expressos em níveis endógenos ¹⁸ ou, no futuro próximo, proteínas endógenas marcado usando CRISPR / Cas9. A elevada SNR também é importante para a análise de imagem a jusante bem sucedida. A alta velocidade é necessário não só para capturar processos intracelulares rápidos, mas também a imagem de todo o embrião a partir de vários pontos de vista suficientemente rápido. A fusão perfeita dos múltiplos pontos de vista só pode ser alcançado, se o fenômeno observado não muda durante a aquisição destas várias pilhas z provenientes de pontos de vista distintos.

As vantagens de LSFM não normalmente vêm em detrimento da qualidade da imagem. A resolução lateral de LSFM é ligeiramente pior do que a resolução de um microscópio confocal. Isto é porque os objectivos de detecção utilizados em LSFM têm menor abertura numérica (normalmente 1,0 ou menos) em relação aos objectivos 1,2-1,3 de água ou imersão em silício configurações padrão confocal. Além disso, devido à ampla detecção de campo na LSFM (AbsenCE de um buraco de agulha), não há mais a luz para fora de foco em comparação com um microscópio confocal. A quantidade de luz fora do foco é determinada pela espessura da folha de luz. No entanto, estas desvantagens são compensadas pela maior SNR em LSFM. Na prática, isto resulta em imagens de qualidade semelhante em comparação com, por exemplo, girando disco de aquisição confocal ^15. Consequentemente, isso permite a extração confiável de recursos como membranas celulares ou núcleos, por exemplo, para a linhagem celular de rastreamento ^15,19.

A resolução axial da LSFM é determinada, para além do objectivo de detecção, pela espessura da folha de luz. A resolução axial pode LSFM em alguns casos, ultrapassar a resolução de microscópios confocal. Em primeiro lugar, a melhoria na resolução ocorre quando a folha de luz é mais fina do que a resolução axial da objectiva de detecção, o que ocorre tipicamente para grandes espécimes fotografada com uma objectiva de baixa ampliação. A segunda maneira, como o LSFM pode achIEVE melhor resolução axial, é a fusão multiview, em que a informação de alta resolução xy a partir de diferentes pontos de vista é combinado em uma pilha de imagens. A pilha fundida resultante tem uma resolução isotrópica aproximando-se dos valores de resolução no sentido lateral ^20,21. A estratégia para registrar as múltiplas vistas para o outro descrito neste artigo é baseado no uso de esferas de poliestireno fluorescentes como marcadores fiduciárias embutidos na agarose em torno da amostra ^20,21.

Como resultado da comercialização LSFM, esta técnica está agora disponível para uma ampla comunidade de cientistas ^22. Portanto, a motivação para escrever este protocolo é o de tornar esta tecnologia acessível a biólogos do desenvolvimento sem experiência prática em LSFM e para obter estes cientistas começaram a usar essa tecnologia com suas amostras. Nosso protocolo usa o microscópio folha de luz comercial, o que constitui um microscópio conceitualmente simples tchapéu é fácil de operar. Gostaríamos, adicionalmente, gostaria de mencionar outros protocolos recentes para geração de imagens de peixe-zebra com configurações LSFM construídos em casa, o que pode ser adequado para responder a determinadas perguntas ^23-25. Outra opção de entrada para LSFM são as plataformas abertas ^26,27, que utilizam os princípios de acesso aberto para trazer microscopia folha de luz para uma comunidade mais ampla. A documentação, tanto do hardware e os aspectos de software podem ser encontradas em http://openspim.org e https://sites.google.com/site/openspinmicroscopy/.

Neste protocolo, usamos o peixe-zebra teleósteos como um sistema modelo para estudar processos de desenvolvimento com LSFM. Morfogênese do olho de peixe-zebra é um exemplo que sublinha muitos dos benefícios de LSFM. LSFM já tenha sido utilizado no passado para investigar o desenvolvimento do olho em medaka ²⁸ e no peixe-zebra ^29,30. Na fase inicial de desenvolvimento do olho é complicado para orientar correctamente o embrião para microscopia convencional,como a gema de volumoso não permite que o embrião para deitar de lado com o olho voltado para o objetivo. No entanto, com LSFM de montagem para uma coluna de agarose, a amostra pode ser posicionado de forma reprodutível. Além disso, durante a transição da vesícula óptica com a fase cálice óptico, o olho sofre grandes rearranjos morfogenéticas acompanhados de crescimento, o que requer a captura de um grande pilha Z e um grande campo de visão. Também para estes desafios LSFM é superior à imagem confocal convencional. O processo de formação cálice óptico é tridimensional, portanto, é difícil de compreender e visualizar apenas pela imagem de um ponto de vista. Isso faz com que imagem multiview com resolução isotrópica benéfico. Após a formação do cálice óptico, a retina torna-se cada vez mais sensíveis à exposição a laser. Assim, a baixa fototoxicidade associada com LSFM é uma grande vantagem para a imagem latente a longo prazo.

Aqui apresentamos um protocolo otimizado para a imagem latente de um a três dias de peixe-zebra de idade embriões alarvas nd com foco no desenvolvimento do olho. Nosso método permite a gravação de filmes de lapso de tempo, cobrindo até 12-14 h com alta resolução espacial e temporal. Importante, que também mostram uma conduta para o processamento de dados, que é um passo essencial na LSFM, como esta técnica gera invariavelmente grandes conjuntos de dados, frequentemente na gama de terabytes.

Protocol

NOTA: Todos os trabalhos animal foi realizada de acordo com União Europeia (UE) Directiva 2011/63 / UE e do alemão Animal Welfare Act. O protocolo destina-se a ser seguido, sem interrupção, a partir de montagem para imagiologia da amostra. Dependendo da experiência prática, vai demorar 2-3 horas para iniciar um experimento de lapso de tempo. processamento de dados não está incluída neste cálculo tempo. Todo o material necessário para a experiência pode ser encontrada na lista de material necessário antes de iniciar que é fornecido como um documento complementar. Use luvas sem pó durante as etapas 1, 2, 3 e 4. Para obter as etapas 2, 3, 4 e 5 do protocolo consulte também o manual de instruções do microscópio oficial.

1. trabalho preparatório antes do Experimento de imagem

1. Fluorescente grânulo Stock Solution
   1. Para este protocolo, utilize os 500 ou 1.000 nm esferas de poliestireno (diâmetro marcadas com vermelho emissor de corante fluorescente). A diluição de trabalho dos grânulos é de 1: 4,000. Em primeiro lugar, a solução estoque vórtice talão durante 1 min. Diluir 10 ml de contas em 990 mL de DDH ₂ O. Armazenar a solução no escuro a 4 ° C e usar esta diluição a 1: 100 enquanto a solução estoque para posterior diluição em 1:40.
2. Preparar Solução para a câmara de Amostra
   1. Numa proveta de 100 ml de mistura de 38,2 ml de meio E3 sem azul de metileno, 0,8 ml de 10 mM N -phenylthiourea e 1 ml de 0,4% de MS-222. É benéfico para usar o meio E3 filtrada, para evitar pequenas partículas de pó ou cristais não dissolvidos que flutuam na câmara de amostra mais tarde.
3. A seleção do embrião de peixe fluorescente
   1. Nos dias antes do ensaio, preparar embriões que expressam proteínas fluorescentes. Logo antes do experimento, classificar os embriões sob o estereoscópio fluorescente para a força desejável do sinal fluorescente. Leve 5-10 embriões saudáveis ​​e dechorionate-los usando uma pinça.
      NOTA: Este protocolo é otimizado para 16-72 horas de idadeembriões.

2. Configurar a câmara de amostra

1. Montagem da Câmara três Windows
   1. Existem 4 janelas na câmara de amostras, um para o objectivo e três para ser selada com as lamelas (18 mm de diâmetro, seleccionados espessura 0,17 milímetros). Armazenar estas lamelas em 70% de etanol. Limpe-os antes do uso com éter: etanol (1: 4).
   2. Insira a lamela para a janela usando uma pinça fina e verifique se ele se encaixa no menor groove. Cubra-o com a 17 milímetros de borracha diâmetro O-ring e parafuso no anel adaptador de iluminação utilizando a ferramenta janela de câmara. Repetir o processo para as outras duas janelas.
2. Colocar as peças da câmara Restantes
   1. Dane-se o adaptador para um objetivo adequado para o quarto lado restante da câmara. Inserir os 15 mm de diâmetro O-ring para o centro do adaptador.
   2. Aparafusar o adaptador branco Luer-Lock na abertura inferior direito na chamber e o conector de drenagem cinzento na abertura superior esquerdo. Bloquear todas as três aberturas restantes com os tampões pretos.
   3. Fixe o bloco Peltier eo slide de fundo metálica cauda de andorinha da câmara utilizando uma chave Allen. Anexar a mangueira com a 50 ml seringa ao adaptador Luer-Lock. Insira a sonda de temperatura dentro da câmara.
3. Inserindo os Objectivos e da Câmara para o Microscópio
   1. Verifique sob o estereoscópio que todos os objetivos estão limpos. Use os objectivos de iluminação 10X / 0.2 e com o objectivo de detecção de Plan-Apochromat 20X / 1.0 W e certifique-se de que a sua refração colar de correcção índice é fixado em 1,33 para a água. Dane-se o objectivo de detecção no microscópio, mantendo os objectivos de iluminação cobertos.
   2. Retire as tampas de plástico de proteção que abrangem os objectivos de iluminação. Deslize cuidadosamente a câmara no microscópio e aperte-o com o parafuso de fixação.
   3. Ligue o pro temperaturae ser o bloco de Peltier com o microscópio.
      NOTA: Os dois tubos que circulam o líquido de arrefecimento para o bloco de Peltier são compatíveis com ambos os conectores. Formam um circuito funcionando independentemente da orientação da ligação.
   4. Encher a câmara através da seringa com a solução preparada no passo 1.2 até à extremidade superior das janelas da câmara. Verifique se a câmara não está vazando.
   5. Inicie o microscópio, a incubação e os computadores de controlo e de armazenamento. Inicie o software operacional microscópio e ajustar a temperatura de incubação a 28,5 ° C.
      NOTA: Vai demorar 1 hora para equilibrar completamente. Preparar a amostra no mesmo período.

Preparação 3. Amostra

1. Preparação da mistura de agarose
   1. 15 min antes de fazer a mistura de agarose, derreter uma alíquota de 1 ml de 1% de agarose de baixo ponto de fusão (dissolvido em meio E3) num bloco de aquecimento configurado para 70 ° C. Uma vez que a agarose é completamente moldez, transferir 600 ul para um novo tubo de 1,5 ml, adicionar 250 uL de meio E3, 50 ul de 0,4% de MS-222 e 25 ul de solução de reserva do grânulo vórtice.
      NOTA: Este faz 925 ul da mistura, ao mesmo tempo adicional de 75 uL é calculado para o líquido adicionado mais tarde em conjunto com os embriões.
   2. Manter o tubo em um segundo bloco de aquecimento a 38-40 ° C ou garantir que a agarose é muito próximo ao seu ponto de gelificação antes de colocar embriões de exemplo para ele.
2. Montagem do Embriões
   1. Tome cinco capilares de vidro de volume de 20 mL (com uma marca preta, ~ 1 mm de diâmetro interno) e inserir os êmbolos ponta Teflon correspondência para eles. Empurrar o êmbolo através do capilar de forma que a ponta de teflon está na parte inferior do tubo capilar.
   2. Transferência de cinco embriões (um número que pode ser montado de uma só vez) com um copo ou pipeta de plástico para dentro do tubo de vórtice 37 ° C mix agarose quente.
      NOTA: Tente realizar ao longo de um volume mínimo de sagacidade juntos líquidoh os embriões.
   3. Inserir o capilar na mistura e chupar um embrião dentro puxando o êmbolo para cima. Certifique-se de que a cabeça do embrião entra no capilar antes da cauda. Evitar quaisquer bolhas de ar entre o êmbolo e a amostra. Deve haver ± 2 cm de agarose acima do embrião e ± 1 cm abaixo dela. Repita o procedimento para os embriões restantes.
   4. Aguardar até que a agarose solidificar completamente, o que acontece dentro de alguns minutos e, em seguida, armazenar as amostras em meio de E3, colando-os à parede de um recipiente com plasticina ou fita. A abertura inferior do capilar deve ser pendurado livre na solução, permitindo a troca gasosa para a amostra.
      NOTA: Um protocolo semelhante ao dos pontos 3.1 e 3.2 também pode ser encontrado na http://openspim.org/Zebrafish_embryo_sample_preparation página wiki OpenSPIM.

Posicionamento 4. Amostra

1. Assembléia Porta-amostra
   1. Insira 2 mangas de plástico do tamanho certo (preto)um contra o outro na haste do suporte de amostras. Os seus lados de fenda têm que enfrentar para o exterior. Fixe o parafuso de fixação livremente rodando-o 2-3 rodadas. Inserir o capilar por meio do parafuso de fixação e empurrá-lo através do suporte até que a banda cor preta torna-se visível no outro lado. Evite tocar o êmbolo.
   2. Aperte o parafuso de fixação. Empurre o excesso de 1 cm de agarose abaixo do embrião fora do capilar e cortá-la. Inserir a haste para dentro do disco de suporte de amostras.
   3. Confirmar que o software na platina do microscópio está na posição de carga. Use trilhos de guia para deslizar todo o suporte com a amostra verticalmente para baixo para o microscópio. Transformá-lo, de modo que os magnéticos fechaduras disco titular na posição.
2. Localizando o Capilar
   1. A partir de agora, controlar o posicionamento da amostra pelo software. No separador Localizar escolher a opção capilar localizar e posicionar o capilar em x, y e z em foco logo acima do objecto a detecçãolente ive. Use a representação gráfica no navegador de amostra para orientação.
   2. Empurrar o embrião suavemente para fora do capilar até que esteja em frente da pupila do objectivo de detecção.
      NOTA: O 'capilar Localizar' é o único passo no protocolo restantes, durante o qual a tampa superior do microscópio deve ser aberto e a amostra empurrado para fora.
3. Colocar a amostra
   1. Mudar para a opção "Localizar sample 'e 0,5 zoom trazer o olho de peixe-zebra para o centro do campo de visão. Rodar o embrião, de modo que a folha de luz não passará através de quaisquer partes altamente refracção ou absorção do espécime antes de chegar ao olho. Do mesmo modo, a fluorescência emitida precisa de um caminho desobstruído para fora da amostra. Clique em 'Definir posição inicial'.
   2. Abra a porta da frente do microscópio e colocar a tampa de plástico com uma abertura 3 mm na parte superior da câmara, para evitar a evaporação.
      NOTA: Se o nível de líquido cai abaixoo nível de imagem latente, o experimento será comprometida.
   3. Verifique o batimento cardíaco do embrião como um proxy para a saúde global. Se ele for muito lento, use uma outra amostra (compare aos controles não-montado; valores específicos dependem da fase de desenvolvimento). Mudar para ajuste de zoom final e reajustar a posição do embrião.

5. Criação de uma Aquisição Multidimensional

1. parâmetros de aquisição
   1. Alterne para a guia 'Aquisição'. Definir o caminho da luz, incluindo linhas de laser, objectivo a detecção, filtro de laser de bloqueio, divisor de feixe e as câmeras.
   2. Ative a caixa de verificação de pivô. Defina as outras configurações de aquisição como a profundidade de bits, formato de imagem, espessura folha de luz e escolha iluminação face única.
   3. Pressione "Contínuo" e dependendo da intensidade da imagem obtida alterar o tempo de potência de laser e a exposição da câmara.
      NOTA: Para ajustar todas as configurações de imagem usar lespotência do laser s (0,5% de laser de 100 mW, tempo de exposição de 30 ms), que para a experiência real para evitar danos desnecessários foto à amostra.
2. Ajuste folha de luz
   1. Alterne para a 'Iluminação dupla face "e activar a 'caixa de seleção on-line dupla Side Fusio'n. Inicie o 'Assistente Lightsheet Auto-ajuste'. Siga as instruções passo a passo.
      NOTA: O assistente move a folha de luz no plano focal da objectiva de detecção, e garante que não é inclinado e sua cintura é no centro do campo de visão. Depois de terminar o ajuste automático, as posições das folhas de luz esquerdo e direito são automaticamente atualizadas no software. Uma melhoria na qualidade da imagem deverá agora ser aparente. Ative a caixa de seleção 'Z-stack'.
   2. Verifique o ajuste folha de luz, inspecionando a simetria da função de dispersão (PSF) dada pelas partículas fluorescentes no XZ e YZ vista orto. Se não houvert simétrica, ajustar manualmente a posição de parâmetro folha de luz para cima e para baixo até alcançar um PSF em forma de ampulheta simétrica (Figura 1A).
3. Configurações de Aquisição multidimensionais
   1. Definir o z-stack com o "First Slice" e opções "última fatia" e defina o passo z a 1 mm.
      NOTA: A folha de luz neste microscópio é estático e o seccionamento Z é conseguido movendo a amostra através de. Sempre use a opção 'Drive contínua "para a aquisição rápida de z-stacks.
   2. Ative a caixa de verificação 'Série Time'. Definir o número total de pontos de tempo e o intervalo entre eles.
   3. Ative a caixa de seleção 'Multiview'. Adicionar a visão atual na lista multiview, onde a informação x, y, z e o ângulo é armazenado. Use o controlador palco para girar o capilar e definir os outros pontos de vista desejados. Configurar um z-stack em cada vista e adicioná-los à lista de multiview.
      Note osoftware ordena os pontos de vista de uma forma de série, de modo a que o capilar está ligado unidireccionalmente, enquanto a imagem é adquirida.
4. Correção deriva e iniciar o experimento
   1. Uma vez que a aquisição configurar é completa, espere 15-30 minutos antes de iniciar a experiência real.
      NOTA: A amostra foi inicialmente deriva de alguns micrômetros de x, y e z, mas deve parar dentro de 30 min. Se a amostra mantém à deriva por mais tempo, use outra amostra ou remontar.
   2. Alterne para a guia 'Manter' e na opção de 'streaming' definir como os dados devem ser guardados, por exemplo, um arquivo por ponto de tempo ou arquivo separado para cada vista e canal. Volte para a página 'Aquisição', pressione 'Start Experiment' e definir o nome do arquivo, local onde deve ser guardado eo formato de arquivo (use .czi).
   3. Observe a aquisição do primeiro ponto de tempo para confirmar que tudo está funcionando perfeitamente. proceder imediatamente com o registoe fusão do primeiro ponto de tempo, tal como descrito nas etapas 6 e 7, para confirmar que será possível para processar todo o conjunto de dados.

6. Registro Multiview

1. Multiview Aplicação Reconstrução
   1. No fim da sessão de imagem, transferir os dados a partir do computador de armazenamento de dados ao microscópio para um computador de processamento de dados. Use o 'MultiView ReconstructionApplication ^'20,21,31 implementado em Fiji ³² para processamento de dados (Figura 1B).
2. definir Dataset
   1. Atualizar Fiji: Fiji> Ajuda> Atualização ImageJ e Fiji> Ajuda> Atualização Fiji. Use o ImageJ principal e sites de atualização Fiji.
   2. Transferir todo o conjunto de dados em uma pasta. Os resultados e arquivos intermediários do processamento será guardada nessa pasta. Inicie a Aplicação de Reconstrução MultiView: Fiji> Plugins> Multiview Reconstrução> Multiview Aplicação Reconstrução.
   3. Selecione 'definir um novo conjunto de dados'. Como tipo de conjunto de dados, selecione a opção meu "Zeiss Lightsheet Z.1 Dataset (LOCI Bioformats)" e criar um nome para o arquivo .xml. Em seguida, selecione o primeiro arquivo .czi do conjunto de dados (arquivo ou seja, sem índice). Ele contém os dados de imagem, bem como os metadados da gravação.
      NOTA: Uma vez que o programa abre o primeiro arquivo .czi, os metadados são carregados no programa.
   4. Confirmam que o número das cantoneiras, iluminações e observe o tamanho do voxel a partir dos metadados. Ao pressionar OK, observar três janelas separadas abertas (Figura 1C): uma janela de log, mostrando o progresso do tratamento e seus resultados, o 'ViewSetup Explorer' e um console, mostrando mensagens de erro de Fiji.
      NOTA: O 'ViewSetup Explorer' é uma interface amigável que mostra cada ponto de vista, canal e iluminação e permite a selecção de os arquivos de interesse. Além disso, o 'ViewSetup Explorer' permite a direção de todas as etapas de processamento.
   5. Selecione os arquivos que precisam ser processados ​​e pressione o botão direito do mouse no explorador. Observar uma janela aberta com diferentes etapas de processamento (Figura 1C).
   6. Após a definição do conjunto de dados, observa-se que um arquivo .xml na pasta com os dados é criado.
      NOTA: Este arquivo contém os metadados que foram confirmados antes.
   7. No canto superior direito observar 'info' dois botões e 'salvar'. Pressionando 'info' exibe um resumo do conteúdo do arquivo .xml. Clicando no botão "salvar" salvará os resultados do processamento.
      NOTA: Enquanto o processamento no 'MultiView Reconstrução aplicativo' as diferentes etapas de processamento precisam ser salvos no .xml antes de fechar Fiji.

oad / 53966 / 53966fig1.jpg "/>
Figura 1: Multiview Reconstrução de detecção de fluxo de trabalho e ponto de interesse (A) O alinhamento folha de luz baseada em imagens de talão fluorescente.. O sistema está alinhado (centro), quando a imagem talão tem uma forma de ampulheta simétricos em projecções XZ e YZ. Os exemplos de folha de luz desalinhada em qualquer direção são mostrados na esquerda e direita. As projeções de intensidade máxima de um cordão de 500 nm em xz, eixos YZ e XY são mostrados. Note-se que a razão entre a intensidade do pico central do disco Airy (em xy) dos lóbulos secundários é maior, quando a lightsheet está correctamente alinhada em relação à situação desalinhada. As imagens foram tiradas com 20X / 1.0 objetivo W em 0,7 zoom. A barra de escala representa 5 um. (B) O conjunto de dados está definido e, em seguida, salva novamente para o formato HDF5. As contas são segmentados e, em seguida, registrado. Para uma série de tempo cada ponto de tempo é registada para um ponto de tempo referência. Os dados são finalmente fundidos numavolume de isotrópico única. (C, em cima) O ViewSetup Explorer mostra os diferentes pontos de tempo, ângulos, canais e os lados de iluminação do conjunto de dados. (C, mais baixo canto esquerdo) A janela BigDataViewer mostra a visão de que está selecionado na ViewSetup Explorer. (C, médio direito), clique com o botão direito no ViewSetup Explorer abre as opções de processamento. (C, canto inferior direito) O progresso e os resultados do processamento são exibidas no arquivo de log. (D e E) O objectivo da detecção é segmentar o máximo de pontos de interesse (contas) com o mínimo de detecção na amostra quanto possível aqui como screenshots da segmentação do grânulo interativo. (D e E, canto superior esquerdo) A segmentação é definida por dois parâmetros, os valores Difference of-Gauss para Sigma 1 eo Threshold. (D) Um exemplo de uma detecção com sucesso com uma vista ampliada de um grânulo correctamente detectado. (E) Segmentação com muitos falsos positivos e múltiplas detecções de uma única pérola. Barra de escala em (C) representa 50 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Salve novamente Dataset em HDF5 Format
   1. Para salvar novamente todo o conjunto de dados, selecione todos os arquivos com Ctrl / Apple + a e clique direito. Em seguida, selecione conjunto de dados Resave e como HDF5.
   2. Uma janela aparecerá exibindo um aviso de que todos os pontos de vista do conjunto de dados atual será salva novamente. Imprensa sim.
      NOTA: O programa continuará a salvar novamente os arquivos .czi para hdf5 abrindo cada arquivo e salvando novamente os diferentes níveis de resolução do formato hdf5. Ele vai confirmar com "feito" após a conclusão. resaving usually leva um min poucos por ponto de tempo (ver Tabela 1).
      NOTA: Uma vez que os arquivos no formato hdf5 pode ser carregado muito rápido, que agora é possível visualizar o conjunto de dados não-registrado, "clique direito" no explorador e alternando 'display em BigDataViewer (on / off)'. Uma janela BigDataViewer aparecerá com a exibição selecionada (Figura 1C). As funções principais do BigDataViewer ³³ são explicados na Tabela 2 e http://fiji.sc/BigDataViewer.
4. Detectar Pontos de Interesse
   1. Selecione todos os pontos temporais com Ctrl / Apple + a e clique direito, selecione detectar pontos de interesse.
   2. Select Difference-de-Gaussian ³⁴ para o tipo de detecção de pontos de interesse. Desde o registo à base de talão é usado aqui, o tipo de "pérolas" no campo de pontos de interesse rótulo. Ative 'downsample imagens antes da segmentação'.
   3. Na próxima janela, observar o detconfigurações exão. Para 'subpixel localização "utilização" ajuste quadrático 3-dimensional ^"34 e para determinar os valores Difference-de-Gaussian e raio para uso talão segmentação' interativa 'na especificação ponto i'nterest'.
   4. Para 'Downsample XY "utilização" Jogo resolução Z (menos downsampling)' e de utilização 1 × 'Downsample Z'. O tamanho z passo é maior do que o tamanho do pixel xy, assim, simplesmente para baixo amostragem da xy para corresponder à resolução z é suficiente. Selecione "computação na CPU (JAVA) '. Prima 'OK'.
   5. Em uma janela pop-up, selecione uma vista para testar os parâmetros do menu drop-down. Uma vez que as cargas de vista, ajustar o brilho eo contraste da janela com Fiji> Image> Adjust> Brightness / Contrast ou Ctrl + Shift + C. Marque a caixa de "olhar para maxima (verde)" para a detecção do grânulo.
   6. Observe a segmentação em anéis como verdes do 'viewSetup' around as detecções quando se olha para maxima e vermelho para mínimos. A segmentação é definida por dois parâmetros, os valores Difference-de-Gaussian para Sigma 1 eo limiar (Figura 1D). Ajuste-a do segmento como muitas contas em torno da amostra e o menor número de detecções de falsos positivos dentro da amostra quanto possível (Figura 1D). Detectar cada conta apenas uma vez e não várias vezes (Figura 1E). Depois de determinar os parâmetros ideais, pressione 'feito'.
      NOTA: A detecção começa por carregar cada vista individual do ponto de tempo e segmentar as contas. No arquivo de log, o programa emite o número de contas-lo detectados per view. A detecção deve ser feito em poucos segundos (ver Tabela 1).
   7. Imprensa salvar quando a quantidade de detecções é apropriado (600 a vários milhares per view).
      NOTA: A pasta será criada no diretório de dados, que irá conter o information sobre as coordenadas dos grânulos detectados.
5. Registre Usando Pontos de Interesse
   1. Selecione todos os pontos temporais com Ctrl / Apple + um, clique direito e selecione "Register usando Pontos de Interesse '.
   2. Use 'hashing rápido 3d geométrico (rotação invariante)' para a detecção de talão como 'algoritmo de registro ".
      NOTA: Este algoritmo assume qualquer conhecimento prévio sobre a orientação e posicionamento dos pontos de vista diferentes uns em relação aos outros.
   3. Para o registro das vistas para o outro, selecione 'registar timepoints individualmente "como" Tipo de registo ». Por "pontos de interesse" no canal selecionado, o rótulo especificado anteriormente para os pontos de interesse deve ser agora visíveis (ou seja, "contas").
   4. Na janela seguinte, use os valores definidos pré para registro. Fixar a primeira lista escolhendo 'telhas CORRECÇÃO: corrigir primeiro painel e utilização Não mapear back' (usar isso se tiles não são fixos) no "mapa de volta telhas 'seção.
   5. Use um "modelo de transformação afim 'com' regularização '.
      NOTA: O erro permitido será RANSAC 5px e o "significado para um jogo descritor 'será de 10. Para' regularização 'utilizar um" modelo rígido' com um lambda de 0,10, o que significa que a transformação é de 10% e 90 rígida % afim ^35. Pressione OK para iniciar o registro.
      NOTA: Como exibido na janela de log, em primeiro lugar cada exibição é combinado com todos os outros pontos de vista. Em seguida, o consenso amostra aleatória (RANSAC) ³⁶ testa as correspondências e exclui falsos positivos. Para um registo robusto, o valor RANSAC deve ser superior a 90%. Quando um número suficiente de verdadeiros candidatos correspondentes entre duas visões são encontrados, um modelo de transformação é calculada entre cada jogo com o deslocamento médio em pixels. Em seguida, a otimização global iterativa é realizado e todos os pontos de vista são registrados para a vista fixa. Com o registro bem sucedido, um modelo de transformação é calculada e exibida com o seu dimensionamento e o deslocamento em pixels. O erro médio deve ser de forma otimizada abaixo de 1 px e descamação da transformação perto de 1. O registo é executado em segundos (ver Tabela 1).
   6. Confirmar que não há nenhuma mudança entre os diferentes pontos de vista, como observado em estruturas finas dentro da amostra, por exemplo, as membranas celulares. Em seguida, salve a transformação para cada vista para o arquivo .xml.
      NOTA: Agora os pontos de vista registados são sobrepostos uns aos outros na BigDataViewer (Figura 2A) e as imagens do grânulo deveria ser sobreposta assim (Figura 2B).
   7. Retirar as transformações selecionando os pontos temporais clique direito sobre eles e, em seguida, selecione Remover Transformações> Últimas / Mais novo Transformação.

re 2 "src =" / files / ftp_upload / 53966 / 53966fig2.jpg "/>

Figura 2:. Os resultados da reconstrução multivista (A) coberto vistas se, cada um com uma cor diferente para demonstrar a sobreposição entre eles. (B) Magnified vista que mostra a sobreposição dos PSFs de contas fotografada a partir de diferentes pontos de vista. (C) Close up de um cordão após a fusão, o PSF é uma média dos diferentes pontos de vista. (D) PSF do mesmo grânulo como em (C), após o multivista desconvolução mostrando que o PSF colapsa num único ponto. (E) a secção XY e (f) secção yz de uma única visão de uma vesícula óptica, no qual as membranas são marcadas com GFP que mostra a degradação do sinal em Z mais profundo no tecido. (G) seção xy e (H) seção yz do mesmo ponto de vista após a fusão médio ponderado de 4 visualizações aproximadamente 20 graus de separação com um pouco mais degraresolução xy ded global, mas aumentou-resolução z. (I) seção xy e (J) seção yz dos mesmos dados após deconvolução multiview, mostrando um aumento significativo na resolução e contraste do sinal, tanto em xy e em z. Imagens em (EJ) são fatias ópticos individuais. Barra de escala representa 50 mm (A, B, EJ) e 10 mm (C, D). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

6. Registro de lapso de tempo
   1. Selecione todo o lapso de tempo, clique direito e escolha "Registo usando Interesse Pontos" para estabilizar o lapso de tempo ao longo do tempo.
   2. Na "janela Parâmetros registo de base seleccionar partida contra um ponto de tempo de referência (sem otimização global) para o tipo de registo». Ke ep t ele outras definições da mesma forma que no registro de pontos de tempo individuais.
   3. Na próximajanela, selecionar o ponto de tempo para ser usado como uma referência, tipicamente, um ponto de tempo no meio do lapso de tempo. Marque a caixa "considerar cada ponto no tempo como uma unidade rígida ', uma vez que os pontos de vista individuais dentro de cada ponto de tempo já está registrado para o outro.
   4. Marque a caixa "Mostrar TimeSeries estatísticas '. Os outros parâmetros de registro permanecem como antes, incluindo a regularização. Pressione OK.
      NOTA: Na janela de log, a mesma saída será exibida como no registro ponto de tempo individual. Se o registo para os pontos de tempo individuais foi bem-sucedida e robusto, o RANSAC agora é 99-100% ea média, mínima e máxima de erro é geralmente abaixo de 1 px. Salvar este registro antes de prosseguir.

7. Multiview Fusão

NOTA: As transformações resultantes das etapas de registro são usados ​​para calcular uma pilha isotrópico fundido fora dos múltiplos pontos de vista. Esta ha pilhas número de fatias Z em comparação com o aumento de dados original, porque o espaçamento Z é agora igual ao tamanho do pixel original no XY. A fusão pode ser realizada por qualquer um com base em conteúdo de fusão multivista ^21,31 ou desconvolução multivista Bayesiana à base ^31, os quais são ambos implementados na aplicação reconstrução multivista.

1. Caixa delimitadora
   NOTA: A fusão é um processo dispendioso computacionalmente (ver Tabela 1), reduzindo assim a quantidade de dados, definindo uma caixa delimitadora aumenta de forma significativa a velocidade de processamento.
   1. Selecione todos os pontos temporais com o botão direito e selecione Definir 'Caixa delimitadora ". Use 'Definir com BigDataViewer' e escolher um nome para a caixa delimitadora.
   2. Mova o controle deslizante para 'min' e 'max' em cada eixo para determinar a região de interesse e, em seguida, pressione 'OK'. Os parâmetros da caixa delimitadora será exibida.
      NOTA: A caixa delimitadora conterá tudo dentroa caixa verde que é coberta com uma camada magenta transparente.
2. -Conteúdo baseado Multiview Fusão
   NOTA: fusão multiview baseado no conteúdo ²¹ leva as diferenças de qualidade de imagem sobre a pilha (ou seja, de degradação do sinal em z) em conta e aplica pesos mais elevados para uma melhor qualidade de imagem em vez de usar uma média simples.
   1. Selecione o ponto (s) tempo que deve ser fundido no 'ViewSetup Explorer', clique direito e selecione "Imagem de fusão / Deconvolution '.
   2. Na janela de fusão de imagens, selecione "da média ponderada fusão" do menu drop-down e selecione 'Use caixa delimitadora pré-definido para a caixa delimitadora'. Para a saída da imagem fundida selecione 'Anexar ao Projeto XML atual', que grava novos arquivos HDF5 para os arquivos já existentes hdf5 e permite utilizar os pontos de vista não fundidos registrados e a imagem fundidos. Prima 'OK'.
   3. Em seguida, no "Pré-definir caixa delimitadora & #39; janela pop-up, selecione o nome da caixa delimitadora previamente definido e pressione "OK".
   4. Observe os parâmetros da caixa delimitadora na próxima janela. Para a fusão rápida, aplique uma amostragem para baixo no conjunto de dados fundidos.
      NOTA: Se a pilha fundida está acima de um determinado tamanho, o programa irá recomendar usando uma memória mais eficiente 'containe'r ImageLib2. Mudar de 'ArrayImg' para os 'PlanarImg (imagens grandes, fáceis de visualizar) ou CellImg (imagens grandes)' contentores, que permitem o tratamento de dados maiores. Caso contrário, use as configurações predefinidas e aplicar "fusão de mistura e com base em conteúdo". Prossiga pressionando "OK".
   5. Observe as configurações HDF5 na próxima janela. Use os parâmetros predefinidos e iniciar o processo de fusão. Certifique-se de que Fiji tem atribuído memória suficiente no Editar> Opções> Memória & Threads.
3. Multiview Deconvolution
   NOTA: Multiview Deconvolution ³¹ é anotseu tipo de fusão multiview. Aqui, adicionalmente, para a fusão, a PSF do sistema de imagem é tomada em consideração, a fim de deconvoluir a resolução da imagem e contraste e rendimento aumentado do sinal (em comparação na Figura 2C-J, Figura 5 e Filme 3).
   1. Selecione o ponto de tempo (s) a ser deconvolved, clique direito e pressione 'Imagem Fusão / Deconvolution'.
   2. Selecione 'Multiview Deconvolution' e use 'a caixa delimitadora pré-definido e anexar ao projeto XML atual. Selecione a caixa delimitadora e continuar.
      NOTA: Os parâmetros pré-definidos para a deconvolução são um bom ponto de partida. Para o primeiro uso experimental '20 iterações 'e avaliar o impacto da deconvolução utilizando o' modo de depuração '. Finalmente definir a computação em a em 512 x 512 x 512 blocos.
   3. Na janela seguinte, use as configurações pré-definidas. Defina o "modo de depuração" para exibir os resultados a cada "5 iterações ".
      NOTA: A saída da desconvolução é de dados de 32 bits, no entanto, o BigDataViewer actualmente apenas suporte dados de 16 bits. A fim de acrescentar a saída do conjunto de dados de desconvolução para o hdf5 existente, tem que ser convertido para 16 bits.
   4. Para a conversão, execute 'Use min / max da primeira imagem (pode saturar intensidades ao longo do tempo)'.
      NOTA: A deconvolução, então, começar por carregar as imagens e preparando-os para a deconvolução.
4. BigDataServer
   1. A fim de compartilhar a grande XML / conjuntos de dados HDF5 usar o servidor http BigDataServer ^33. Uma introdução sobre como configurar e conectar a este servidor podem ser encontradas em http://fiji.sc/BigDataServer.
   2. Para ligar a um BigDataServer existente aberta Fiji> Plugins> BigDataViewer> BrowseBigDataServer.
   3. Digite o URL incluindo a porta para a janela.
      NOTA: Os filmes descritos nesta publicação são acessíveis através deste anúnciovestido: http://opticcup.mpi-cbg.de:8085
   4. Observe uma janela que permite selecionar os filmes disponíveis. Dê um duplo clique para abrir a janela BigDataViewer e visualizar os dados como descrito anteriormente.

Suplementar: Lista de verificação de material necessário antes de iniciar

• embriões de peixe-zebra / larvas expressando proteínas fluorescentes (Manter os embriões em meio E3 peixe-zebra, sem azul de metileno. Para estágios com mais de 24 horas combater a pigmentação adicionando PTU a uma concentração final de 0,2 mM).
• estereoscópio fluorescente
• capilares (volume de 20 ul, com uma marca negra) e êmbolos apropriados (não reutilizar os capilares. Os êmbolos, por outro lado, pode ser reutilizado para várias experiências).
• 1,5 ml de tubos de plástico
• pinças afiadas
• vidro (fogo polido) ou pipetas de plástico (de plástico pode ser usado durante 24 horas e os embriões mais velhos)
• de vidro ou placas de plástico de 60 mm de diâmetro (de plástico pode serusado durante 24 horas e os embriões mais velhos)
• dois copos de 100 ml
• 50 ml Luer-Lock seringa com mangueira de extensão 150 cm para perfusão (A mangueira e seringa deve ser mantida completamente seco entre experimentos para evitar a contaminação por microorganismos).
• plasticina
• baixo ponto de fusão (LMP) agarose
• Médio (NaCl a 5 mM, KCl 0,17 mM, _CaCl2 0,33, 0,33 mM de MgSO ₄₎ E3
• MS-222 (tricaina)
• feniltioureia (PTU)
• microesferas fluorescentes (aqui referidos como contas)
• dupla _H2O destilada _(ddH2O)

Representative Results

LSFM é um método ideal para imagiologia processos de desenvolvimento através de escalas. Várias aplicações são compilados aqui mostrando imagens tanto de curto e longo prazo de estruturas intracelulares, bem como as células e tecidos inteiros. Estes exemplos também demonstram que LSFM é uma ferramenta útil em vários estágios de desenvolvimento do olho de formação copo óptica a neurogénese na retina. Filme 1 serve como uma ilustração da abordagem geral LSFM, primeiro que mostra uma vista ampliada de um embrião intacto no incorporação do cilindro de agarose em campo claro e depois mostra uma vista detalhada da retina no canal de fluorescência.

Filme 1:. LSFM da retina zebrafish Para ilustrar a abordagem LSFM, este filme mostra pela primeira vez no campo claro que o embrião é imaginada intacta dentro do umgarose cilindro antes de mudar para fluorescência. Mais tarde, é mostrado que o grande campo de visão permite a observação de toda a retina. Em seguida, o filme mostra uma pequena região ampliada da retina para destacar a boa resolução subcelular. Um Ath5: gap-GFP ³⁷ transgênico embrião de peixe-zebra foi usada para geração de imagens. Este transgene rótulos diferentes neurônios na retina (principalmente células ganglionares e precursores fotorreceptoras). A parte de fluorescência do filme foi capturado como uma visão única gravação com iluminação dupla face usando a objetiva de 40X / 1.0 W com intervalos de 5 min. A projeção de intensidade máxima de um volume de espessura 30 mm é mostrado. Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.

Filme 2 demonstra, como os eventos intracelulares muito rápidas podem ser capturadas com alta resolução; Neste caso, o crescimento dos microtúbulos emsua mais termina nas células progenitoras neuronais da retina. As informações contidas no filme permite rastreamento e quantificação do crescimento dos microtúbulos mais fim.

Filme 2:. Dinâmica dos microtúbulos em uma única célula Este filme capta crescente dicas além de microtúbulos marcados pela mais ponta proteína marcadora EB3-GFP ^38. A proteína é expressa em uma única célula progenitora da retina. Os microtúbulos são predominantemente crescente na direcção a partir apical para basal (de cima para baixo). A velocidade média dos cometas EB3 foi medida como sendo de 0,28 ± 0,05 ^ M / seg. O ponto brilhante no lado apical da célula que exibe actividade de nucleação alta microtúbulos é o centrossoma. O tipo selvagem embrião foi injectado com Hsp70: EB3-GFP plasmídeo de ADN. O filme foi adquirida 4 horas após o choque térmico (15 minutos a 37 ° C) em cerca de 28 FERTILIZ hrpostção (hpf) como uma visão única gravação com iluminação face única usando os intervalos de tempo objetiva e 1 seg W 63X / 1.0. A única célula foi colhido a partir de um campo de visão que cobre a maior parte da retina. A intensidade máxima de projeção de duas fatias é mostrado. Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.

A Figura 3 mostra, como estruturas intracelular pode ser seguido ao longo de muitas horas. Aqui, o centrossoma dentro translocação células ganglionares da retina (RGCs) é capturado.

Figura 3:. Centrossoma localização durante a translocação células ganglionares da retina Esta montagem de um experimento de lapso de tempo mostra a posição do centrossoma em toda a maturação das células ganglionares da retina (RGC).Nos progenitores neuronais do centrossoma é localizada na ponta do processo apical (01:00). Durante a divisão celular, os dois centrossomas servir como pólos para o fuso mitótico (2:25). Esta divisão resulta em uma célula filha, que se diferencia em uma das CGR e uma segunda célula filha que torna-se um precursor das células fotorreceptoras. Após a divisão, o corpo celular do RGC transloca-se para o lado basal da retina, enquanto o processo apical permanece ligado ao lado apical. Uma vez que o RGC atinge o lado basal, apical seu processo separa o centrossoma e desloca com ela (06:15). O centrossoma pode ser seguido ao gradualmente de retracção em conjunto com o processo de apical (06:50, 07:20, 08:10). No último quadro (08:55) a células ganglionares está crescendo um axônio do seu lado basal, enquanto o centrossoma ainda está localizada no ápice. A expressão mosaico foi conseguida por injecção do ADN de plasmídeo do tipo selvagem em embriões em uma fase celular. As células são visualizados pela Ath5: GFP-CAAX (verde) construct, que rotula RGCs e outros neurônios. Os centrossomas (setas) são rotulados por Centrin-tdTomato ²⁹ expressão (magenta). O lado apical da retina está na parte superior da imagem e o lado da base, na parte inferior. A projeção de intensidade máxima de um volume de espessura 30 mm é mostrado. As imagens foram cortadas de um filme que abrange toda a retina. O filme começa em torno de 34 h após a fertilização (hpf). Uma pilha z foi obtida a cada 5 minutos com o objectivo de 40X / 1,0 W. O tempo é mostrado na hh: mm. Barra de escala representa 10 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Na Figura 4 é exibido, como único comportamento célula pode ser extraída a partir dos dados da captação de todo o tecido, tal como em um filme. Translocação de um RGC podem ser facilmente rastreados e seu processo apical e basalES seguido.

Figura 4:. A translocação de uma única célula do gânglio retinal A translocação de RGC apical para o lado basal da retina ocorre após a mitose terminal como descrito na Figura 3 A é RGC marcadas por expressão do Ath5:. ^GAP-37 GFP transgene. A projeção de intensidade máxima de um volume de espessura 30 mm é mostrado. As imagens foram cortadas de um filme que abrange toda a retina. O filme começa em cerca de 34 hpf. Uma pilha z foi obtida a cada 5 minutos com o objectivo de 40X / 1,0 W. O tempo é mostrado na hh: mm. Barra de escala representa 5 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A Figura 5 demonstra a capacidade de LSFM multivista para capturar o tecido SCprocessos morfogenéticos ale com resolução de celular no exemplo da morfogênese cálice óptico, durante o qual vesícula óptica transforma em um cálice óptico. A qualidade da imagem pode ser muito melhorado por imagem multiview, quando a imagem final é combinado a partir das informações de 5 pontos de vista diferentes (neste caso) em uma pilha z com resolução isotrópica. Esta figura ilustra a melhoria na qualidade da imagem após a fusão médio ponderado e mais ganho de contraste de imagem e resolução após deconvolução multiview. A figura mostra duas fatias ópticos em diferentes orientações através do conjunto de dados. Além disso, uma montagem do conjunto de dados deconvolved mostra a morfogênese cálice óptico ao longo do tempo. Todos os pontos de tempo são mostrados no Movie 3.

Figura 5: Comparação da qualidade de imagem entre visão única e dois métodos de multivfusion iew. (A) Uma fatia óptica de dados visão única mostrados do ponto de vista lateral e (B) vista dorsal. artefatos listra e degradação do sinal mais profundo dentro da amostra são aparentes. Também uma parte da imagem visível nos dados fundidos (CF) não foi capturados neste ponto de vista particular. (C) A mesma fatia óptico, agora como dados multivistas fundido mostrado da vista lateral e (D) vista dorsal. Note-se que artefatos de banda são suprimidas e estruturas profundas na amostra são melhores resolvidos. (E) A mesma fatia óptica agora como multiview deconvolved dados mostrados do ponto de vista lateral e (F) vista dorsal. Observe o aumento do contraste e resolução para que as membranas de células individuais e núcleos pode ser bem distinto. A resolução não se deteriora notavelmente mais profundo dentro da amostra. O conjunto de dados foi adquirido com iluminação de dupla face de 5 visualizações aproximadamente 20 graus de separação. As pilhas z de aba 100 mm com 1,5 mm tamanho do passo foram adquiridas em cada vista em intervalos de 10 min por 10 horas com o objetivo 20X / 1.0 W. imagens de entrada para a fusão multiview e deconvolução foram amostrados para baixo 2 × para acelerar o processamento de imagem. 15 iterações do deconvolução multiview foram executados. (G) A montagem mostra uma área recortada da vista dorsal a partir dos dados deconvolved para destacar os eventos morfogenéticos durante o desenvolvimento do olho no início da vesícula óptica para o palco cálice óptico. As duas camadas da vesícula óptica, que são epitélio colunar inicialmente semelhante, diferenciam-se em populações de células distintas. A camada mais afastada perto da epiderme se torna o neuroepitélio da retina (RN) e a camada proximal perto do tubo neural torna-se o epitélio pigmentado da retina (RP). As células na alongado RN e invaginado para formar a cúpula óptica (01:40 - 05:00); ao mesmo tempo as células RP achatar. A ectoderme superfície é induzida de modo a formar uma lente (01:40), whinvagina ich mais tarde (5:00). O filme começa em 17 hpf. O tempo é mostrado na hh: mm. Todas as membranas celulares são rotulados pela β-actina: transgene GFP-ras e todos os núcleos são rotulados pela hsp70: H2B-RFP transgene. A barra de escala representa 30 um. FB cérebro anterior, lente LE, OP plac�io olfativa, RN neuroepitélio da retina, epitélio pigmentar da retina RP. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Filme 3: Copo de morfogênese Optic mostrado com visão única e dois métodos de fusão multiview O filme de lapso de tempo ilustra o processo completo de morfogênese cálice óptico da vesícula óptica para o palco cálice óptico.. Ele mostra uma única fatia óptica a partir da visão lateral (superior) e uma única fatia óptica do ponto de vista dorsal (parte inferior). As células da vesícula óptica desenvolvimento de sofrer rearranjos complexos para finalmente formar o copo óptica hemisférica, com o neuroepitélio da retina interna e externa epitélio pigmentar da retina. A lente é formada a partir da ectoderme superfície. Ele invagina juntamente com o neuroepitélio e senta-se no cálice óptico. Todas as membranas celulares são rotulados pela expressão da β-actina: ras-transgene GFP (verde) e os núcleos são rotulados com Hsp70: H2B-RFP (magenta). O filme começa em cerca de 17 hpf. O conjunto de dados foi adquirido com iluminação de dupla face de 5 visualizações aproximadamente 20 graus uns dos outros e az pilhas de cerca de 100 um foram adquiridos a cada 10 minutos com o objetivo 20X / 1.0 W. O tempo é mostrado na hh: mm. Barra de escala representa 50 um. Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.

Discussion

1. As etapas críticas e solução de problemas para a aquisição de dados

As configurações de imagem típicos para uma GFP e RFP expressando amostra pode ser encontrada na Tabela 3. No microscópio configuração descrita a folha de luz é estático, formada por uma lente cilíndrica. Os dois objectivos de iluminação são lentes de ar e o objetivo de detecção é uma lente de água-dipping. Aumentar com 20X 1,0 / 1,0 ou 40X / 1.0 objectivos dá 230 nm e 115 nm, tamanho de pixel e um campo de vista de 441 x 441 x 221 uM ou 221 uM, respectivamente. Recomenda-se usar a espessura folha de luz padrão com o centro para as bordas proporção de 1: 2. Para 20X / 1.0 esta espessura corresponde a 4,5 uM e para 40X / 1,0-3,2 uM no centro. Se a velocidade de imagem não é a prioridade primária, usar faixas separadas no caso de uma amostra multicolor para evitar a interferência de emissão de fluorescência entre os canais. A maior velocidade de aquisição é limitada a 50 ms por z passo pelavelocidade de movimento do z-piloto. Se o objectivo é atingir a velocidade máxima de imagem no caso de, por exemplo, duas faixas com iluminação de dupla face, o tempo de exposição deve ser definido de modo que a soma de todas as imagens obtidas por Z etapa é abaixo de 50 mseg. Por outro lado, se apenas uma única imagem é adquirida por Z passo, não é benéfico para definir o tempo de exposição mais curto do que 50 ms.

tamanho 1920 x 1920 imagem

16 bits

Pivot digitalizar na

iluminação de dupla face com a fusão on-line

10X objetivo / 0,2 iluminação

20X objetivo de detecção / 1.0 W Plan-Apochromat

Pista 1: Excitação 488 nm, tipicamente de 2% dos 100 mW do laser, 550 nm filtro de emissão SP

Faixa 2: Excitação 561 nm tipicamente 3% de 75 a laser mW, 58filtro de emissão de 5 nm LP

Tempo de exposição até 100 ms

espessura de resma Z 50-100 mm

1-1,5 mm tamanho z etapa no modo de z unidade contínua

A incubação a 28,5 ° C

Tabela 3: Geração de Configurações.

Inspecionando a amostra após o experimento

É importante assegurar que a amostra ainda está saudável no final da experiência. Como uma primeira leitura, verificar o batimento cardíaco do espécime sob um estereoscópio. Com um par de pinças cortantes, a amostra pode ser levado para fora da agarose e transferidos para a incubadora de continuar a desenvolver, a fim de verificar se ele foi afectada pela imagiologia. Alternativamente, ele pode ser fixado para a coloração do anticorpo.

Montagem e deriva

É essencial para manter a osmolaridade do s câmaraOlution perto da osmolaridade da incorporação de agarose, caso contrário, inchaço / encolhimento da agarose e subsequente instabilidade da amostra vai ocorrer. Portanto, use a mesma solução (médio E3 sem azul de metileno) para encher a câmara e para preparar as alíquotas ponto de agarose a 1% de baixo ponto de fusão. Além disso, não deixe a agarose no 70 ° bloco de aquecimento C por mais de 2 horas, uma vez que podem perder suas propriedades gelificantes.

Não incorpore o peixe em agarose quente demais, pois isso pode levar a resposta ao choque térmico ou morte do embrião. Se não tiver certeza sobre o efeito de agarose quente sobre os embriões, verifique se a cauda não se dobra e que a frequência cardíaca não abrandar. Se isto ocorrer, usar um embrião diferentes para a experiência.

Manter o comprimento total da coluna de agarose com a amostra curto (cerca de 2 cm) e montar o peixe-zebra com a cabeça orientada para a ponta do êmbolo. Da mesma forma, o cilindro de agarose extrudido do capillary deve ser mantido o mais curto possível. Estas medidas irão garantir a estabilidade da amostra durante todo o filme. Ao mesmo tempo, a coluna de agarose deve ser suficientemente longo para que o próprio capilar de vidro não atingir no caminho da luz, como esta causaria maior refracção e reflexão.

O desvio inicial da amostra é causado pelas alterações no volume do próprio cilindro de agarose. Deslizamento do êmbolo não é a razão para isso. Portanto, isso não ajuda a fixar o êmbolo com plasticina ou unha polonês. O embrião pode mudar a sua posição durante o filme, devido ao seu crescimento natural também. Por conseguinte, é aconselhável para o centro da região de interesse no meio do campo de vista e manter algum espaço nas extremidades para acomodar esses movimentos.

quantidade reduzida de meio de incorporação no caminho da luz

Orientando a amostra corretamente ajuda a alcançar a melhor qualidade de imagem possível ^15. Generali, excitação e emissão de luz deve viajar através de tão pouco tecido e meios de montagem possível. A solução ideal é a montagem de agarose-free. Isto foi conseguido, por exemplo, em uma instalação para geração de imagens de Arabidopsis raízes laterais ^14, em que a raiz principal foi montado em Phytagel e as raízes laterais foram subsequentemente deixar a crescer para fora da coluna de gel completamente. Montagem sem-agarose foi também desenvolvido para a imagem latente da embriogênese completa de Tribolium do besouro em dois dias ^12. melhora a qualidade da imagem não era a principal motivação nesse caso. embriões Tribolium simplesmente não sobrevivem dentro do agarose tempo suficiente. Uma montagem sem meios absolutamente incorporação não foi alcançado para a imagem latente a longo prazo em peixes-zebra. Ainda assim, podemos tirar vantagem do facto de que quando os solidifica de agarose, a maioria dos embriões estão posicionados na diagonal no capilar com uma ocular localizada no fundo da agarose e o segundo olho estar perto da superfície da coluna de embebimento. Tele olho mais próximo à superfície proporciona uma qualidade de imagem superior e, portanto, deve ser trabalhada preferencialmente.

concentração de agarose e imagiologia de longo prazo

A concentração de agarose para a montagem é um compromisso entre a estabilidade da amostra e a possibilidade de acomodar o crescimento do embrião e difusão do oxigénio a ele. Não há nenhum ganho adicional na estabilidade da amostra quando se utiliza concentrações de agarose superiores a 1%. Como ponto de partida para a optimização das experiências recomendamos 0,6% de agarose, que também é adequado para os embriões mais jovens do que 24 HPF que são muito delicado para ser montado em 1% de agarose. Para anestesiar os embriões mais velhos e larvas, a concentração de MS-222 pode ser aumentada para 200 ug / ml, sem efeitos laterais ^13.

No caso de embriões em desenvolvimento são gravadas por mais de ± 12 hr, a montagem de agarose não é recomendado, porque restringe o crescimento do embrião e causES cauda deformação. Este problema foi resolvido por peixe-zebra através da montagem de embriões em tubos de polímero de FEP com índice de refração semelhante ao regar ^13,39. Embriões de ratinho, por outro lado, pode ser imobilizada em agarose cilindros ocos ⁴⁰ ou em furos de uma haste de acrílico ligado a uma seringa ^41. FEP montagem em tubo não é recomendada como método padrão no entanto, porque a parede do tubo reflecte a luz ligeiramente mais de agarose.

alinhamento folha de luz

Para uma boa qualidade de imagem é fundamental para realizar o alinhamento folha de luz automático antes de cada experimento. Especialmente se as definições de zoom foram alteradas, os objectivos foram tiradas, ou um líquido diferente foi usado na câmara.

Iluminação

A digitalização pivot da folha de luz deve ser sempre activado. Para grandes amostras de dispersão, é necessário aplicar a iluminação de dupla face com f on-lineusion para conseguir uma iluminação uniforme em todo o campo de vista. iluminação de dupla face diminui também um problema específico da imagem do olho, que é a refracção da folha de luz recebida pela lente do embrião. , espécimes de espalhamento menos menores podem ser eficientemente fotografada usando iluminação de um único lado, o qual encurta o tempo de imagiologia por meio e pode resultar em pouco melhor qualidade da imagem em comparação com a iluminação de dupla face. Isto é porque os percursos de luz para os dois braços de iluminação são sempre diferentes e a uma mais eficiente pode ser escolhido. Além disso, as duas folhas de luz provenientes de cada lado nunca está perfeitamente no mesmo plano, o que provoca ligeira desfocagem após a fusão. Para eventos intracelulares muito rápido, como os microtúbulos crescimento (Filme 2), a iluminação de dupla face não é apropriado, uma vez que as imagens com iluminação de esquerda e direita são adquiridos sequencialmente, o que poderia resultar no borrão de movimento.

fotodegradaçãoe fototoxicidade

Menos fotobranqueamento fluoróforo é muitas vezes mencionado como uma vantagem principal do LSFM. Poderíamos argumentar que o objetivo não deve ser fotodegradação em tudo. Se houver fotodegradação perceptível na experiência de imagem ao vivo, o espécime é, provavelmente, já está fora de sua faixa fisiológica de exposição à radiação laser tolerado. Quando imagiologia os embriões de peixe-zebra no microscópio disco giratório, em nossa experiência, alta fototoxicidade pode parar o desenvolvimento do embrião, mesmo antes de os branqueadores de sinais fluorescentes acentuadamente. Portanto, as configurações de imagem no LSFM deve ser ajustada de modo que pouco ou nenhum fotobranqueamento é observado. Mesmo que LSFM é suave para a amostra, é prudente usar apenas a quantidade de tempo a potência do laser e da exposição, conforme necessário para alcançar uma relação sinal-ruído suficiente para a análise de dados subsequente.

Z-stack, intervalos de tempo e tamanho de dados

Os arquivos gerados pelo LSFM são geralmente muito grande; às vezes na faixa terabyte. Muitas vezes, é necessário fazer um compromisso entre qualidade de imagem e tamanho de dados. Este é particularmente o caso para z espaçamento das pilhas e intervalos nas aquisições de lapso de tempo. Para definir os intervalos de Z, o botão óptimo no separador ferramenta Z-pilha devem, idealmente, ser utilizada, especialmente se o conjunto de dados será deconvolved mais tarde. Ele calcula o espaçamento para alcançar 50% de sobreposição entre fatias ópticos vizinhos. Ainda assim, um pouco maiores intervalos z são geralmente aceitáveis. Eles reduzem o tempo necessário para adquirir a pilha Z, bem como o tamanho do ficheiro final. O tempo óptimo de amostragem depende do processo de interesse. Por olho geral intervalos desenvolvimento 5-10 min são geralmente aceitável. Se algumas estruturas estão a ser automaticamente rastreadas, os pontos de tempo subsequentes deve ser suficientemente semelhante.

As contas fluorescentes

partículas fluorescentes servem principalmente como marcadores fiduciais para registrar pontos de vista diferentesde um conjunto de dados multivista uns sobre os outros. Sempre vortex as soluções talão antes de usar. Não aquecer os grânulos como esta pode levar à perda do corante fluorescente. A concentração ideal do grânulo para o registo multivista tem que ser determinada experimentalmente. O plugin descrito funciona melhor com cerca de 1.000 contas de detectados ao longo de cada vista. Maiores (500 nm ou 1000 nm) grânulos são detectados de forma mais enérgica do que menores (menos de 500 nm) esferas. Isto é porque os grânulos maiores são mais brilhantes e são mais fáceis de segmento sem detecções falsas positivas de estruturas presentes na amostra. A desvantagem das contas maiores é que eles são muito proeminentes na imagem fundida e deconvolved final. Para cada novo marcador fluorescente, o tamanho do grânulo e a emissão de fluorescência apropriado tem que ser optimizado. Para dar um exemplo de amostra a partir da Figura 5 e do filme 3, 100 nm de emissão grânulos verdes deu muitas detecções falsas positivas no canal de membrana-GFP, mas n 1000grânulos de emissão vermelha m foram robustamente detectado no canal H2B-RFP com muito poucas detecções positivas dentro da amostra. Se falhar a detecção do grânulo no canal com o marcador fluorescente, um canal separado contendo apenas grânulos podem ser adquiridos, mas este não é muito prática. Os grânulos de tamanho sub-resolução dar uma leitura directa da função de dispersão (PSF) do microscópio, o qual pode ser utilizado para desconvolução (Figura 2C-D). Se o registo e fusão funciona melhor com grânulos maiores (por exemplo, 1.000 nm), uma imagem separada do PSF podem ser adquiridos com o sub-resolução, por exemplo, 100 nm esferas. Usando grânulos multicolor é útil durante o registo de aquisição multicanal e por verificar que a sobreposição de canais perfeitamente.

A adição de partículas fluorescentes não é necessário quando imagiologia de uma única visão sem registro multiview posterior e fusão. No entanto, mesmo nos casos em que os grânulos podem ser úteis durante a Initial ajuste folha de luz para verificar a qualidade da folha de luz e, em geral, para revelar as aberrações ópticas. Tais aberrações ópticas podem ser provenientes de várias fontes, como objetivos danificadas ou sujas, janelas sujas da câmara ou falta de homogeneidade na agarose. Contas também pode ser usado para a correção de deriva pelo registo multiview Fiji plug-in ^20.

Multiview

Para efeitos de reconstrução multiview, é melhor para adquirir um número ímpar de visualizações 3, 5 e assim por diante, que não são opostos entre si. Isso melhora a deconvolução desde os PSFs são gravadas a partir de diferentes direções. Também é importante para confirmar no início da aquisição do lapso de tempo que não é suficiente sobreposição entre os pontos de vista. Este é o melhor feito de forma empírica, ou seja, imediatamente confirmando que as vistas no primeiro ponto de tempo pode ser registrado com êxito. Quando o objetivo da aquisição multiview é aumentar a resoluçãode uma imagem de um grande espécime de espalhamento, não é aconselhável a imagem inteira da amostra em cada ponto de vista, mas para parar em torno do centro da amostra, em que o sinal se deteriora. A aquisição de baixa qualidade a partir da segunda metade da amostra não acrescentaria informações úteis para a reconstrução multiview.

2. As etapas críticas e solução de problemas para o processamento de dados

Actualmente, existem diversas possibilidades para o processamento de dados a partir de um microscópio multivistas folha de luz que estão bem documentados e relativamente fáceis de adoptar. Nós usamos a aplicação reconstrução multiview, que é um software de código aberto implementada em Fiji ³² (Stephan Preibisch inédito, Ligação 1a e Link1b na Lista de Materiais). Este plugin é uma grande reformulação do SPIM anterior plug-in de registro ^20, revisadapor Schmied et al. ^42, integrando o formato HDF5 ³³ com o fluxo de trabalho de registro SPIM (Figura 1B, BigDataViewer e seu XML e Link 2 , ligação 3 ). Esta aplicação pode também ser adaptado para cluster de computação de alto desempenho, o que acelera significativamente o processamento de ^43. Este pedido de registro multiview está ativamente desenvolvido e continua melhorando. Em caso de problemas ou pedidos de funcionalidades para o software descrito, envie questões sobre as respectivas páginas GitHub ( Fazer a ligação 4 para Multiview Reconstrução e Fazer a ligação 5 para BigDataViewer).

A segunda opção é usar o software comercial disponível em conjunto com o microscópio. Esta solução funciona bem e emprega o mesmo princípio da utilização de partículas fluorescentes para registrar os diferentes pontos de vista. No entanto, ela não tem a opção de visualizar todo o conjunto de dados rápido como com o BigDataViewer. Além disso, o software não pode ser adaptada ao cluster e, além disso, os blocos de processamento do microscópio para outros utilizadores, a menos que licença adicional para o software é comprado.

A terceira opção, que também é um software de código aberto, foi recentemente publicado pelo laboratório de Keller ⁴⁴ e fornece um quadro abrangente para processamento e análise a jusante dos dados folha de luz. Este software está a utilizar informações a partir de dentro da amostra para realizar a fusão multivista, por conseguinte, não requer a presença de partículas fluorescentes à volta da amostra. Mas, ao mesmo tempo que assume a orientação ortogonal dos planos de corte (objetivos), de modo que não pode ser usado para dados adquiridos a partir de ângulos arbitrários ^44.

Os requisitos de hardware

ntent "> O hardware utilizado para o processamento podem ser encontradas na Tabela 4. Tem que haver capacidade de armazenamento suficiente e um oleoduto claro para o processamento de dados disponíveis, antes da experiência real. aquisição das imagens é mais rápido do que a análise subsequente e é fácil para se inundado com dados não processados. Muitas vezes, é irrealista para armazenar todas as imagens cruas, mas sim uma versão colhida ou imagens processadas como vistas fundidas, projeções de intensidade máxima ou projeções esféricas ^45.

Processador	Dois processadores Intel Xeon E5-2630 (Six Core, 2.30 GHz Turbo, 15 MB, 7.2 GT / s)
Memória	128 GB (16 × 8 GB) 1600 MHz DDR3 ECC RDIMM
Disco rígido	4 × 4 TB Serial ATA de 3.5 polegadas (7.200 rpm) Hard Drive
HDD controlador	PERC H310 SATA / SAS Controller para Dell Precision
Configuração HDD	C1 SATA de 3,5 polegadas, 1-4 discos rígidos
Gráficos	Dual 2 GB NVIDIA Quadro 4000 (2 cartões w / 2 DP & 1 DVI-I cada) (2 DP-DVI e 2 adaptador DVI-VGA) (MRGA17H)
Rede	Intel X520-T2 de porta dupla 10 GbE Network Interface Card

Tabela 4: Requisitos de hardware.

velocidade de processamento de dados

O tempo necessário para o processamento de dados depende das dimensões dos dados e do hardware utilizado. Na Tabela 1, apresentamos uma visão geral do tempo necessário para os principais passos no processamento de um exemplo 8.6 GB multiview conjunto de dados que consistia em 1 ponto de tempo com 4 pontos de vista e 2 canais.

processamento step	Tempo	etapa Protocolo
Salve novamente como HDF5	6 min 30 seg	6.3
Detectar Pontos de Interesse	20 seg	6.4
Cadastre-se o uso de pontos de interesse	3 seg	6.5
fusion multiview baseada em conteúdo	4 hr	7.2
deconvolução Multiview (CPU)	8 hr	7.3
deconvolução Multiview (GPU)	2 hr	7.3

Tabela 1: Dados tempo de processamento.

formatos de dados de entrada para a reconstrução multiview

O Fiji Plugin Multiview Reconstrução pode suportar .czi, .tif e formatos ome.tiff. Devido à estrutura de dados do formato .czi, conjuntos de dados não são descontínuossuportado sem pré-tratamento. Descontínua significa que a gravação teve de ser reiniciado (por exemplo, para reajustar as posições devido à deriva da amostra). Neste caso, os ficheiros .czi precisa ser resaved como tif. Para .tif cada visão e direção de iluminação precisa ser salva como um arquivo separado.

A calibração do tamanho do pixel

O software calcula microscópio de operação de calibração para o tamanho do pixel XY com base no objectivo seleccionado. No entanto, o tamanho do pixel em Z é independentemente definido pelo tamanho do passo. Se um objetivo errado está especificado no software do xy à relação z é incorreto e o registro falhará.

O registro inicial

Depois de definir o conjunto de dados o número de inscrições será 1 eo número de pontos de interesse será 0 no ViewSetup Explorer. O registro inicial representa a calibração do conjunto de dados. Tanto o número oinscrições f e pontos de interesse vai aumentar durante o processamento.

Abaixo de amostragem para detecção de pontos de interesse

Utilizando-se a amostragem é recomendada, uma vez que o carregamento dos ficheiros e a segmentação será muito mais rápido. No entanto, é importante notar que os parâmetros de detecção vai mudar dependendo da amostragem para baixo, transferindo assim definições de detecção entre diferentes configurações para baixo da amostra não é possível.

A detecção de pontos de interesse

É aconselhável segmento como muitas pérolas verdadeiras quanto possível em cada ponto de vista, mesmo ao preço de obtenção de algumas detecções de falsos positivos, porque eles não dificultar consideravelmente o registro. detecções falsas, se poucos em números, são excluídos durante o registro (Veja Registro de pontos de interesse). No entanto, enormes detecções falsas positivas representar um problema para o algoritmo. Ele não só reduz o desempenho da detecção eo registro, uma vez que leva muito mais tempo para o segmento de imagem, bem como comparar essas contas entre os pontos de vista, mas também reduz a precisão do registro. Este pode ser tratado usando os parâmetros de detecção mais rigorosas. Além disso, sobre a segmentação dos grânulos (isto é, detecções múltiplas sobre um grânulo Figura 1E) é prejudicial para o registo e deve ser evitado.

Registro de pontos de interesse

Para registrar as vistas para o outro, a localização de cada talão em cada exibição é descrita por sua posição em relação às suas três esferas vizinhos mais próximos. Essas constelações estão formando um descritor geométrica local e permitem comparar cada grânulo entre os pontos de vista. Beads combinando com descritor entre dois pontos de vista são então consideradas como correspondências candidatos. Note que isto só funciona para grânulos distribuídos aleatoriamente, para os quais os descritores locais normalmente são exclusivos para cada talão.Pode-se usar outras estruturas, tais como núcleos na amostra para registro. No entanto, a fim de detectar os núcleos, que são distribuídas aleatoriamente para não na amostra, outros métodos aplicáveis ^​​20,21.

As correspondências candidatos são então testados contra RANSAC ^36, a fim de excluir os falsos positivos. Cada correspondência é que sugere um modelo de transformação para sobrepor as vistas para o outro. correspondências verdadeiras provavelmente concordam em um modelo de transformação, enquanto que valores discrepantes faria cada ponto para um diferente. Os verdadeiros correspondências são então utilizados para calcular um modelo de transformação afim entre as duas vistas comparados. A otimização global com um algoritmo de otimização iterativo é então realizada, durante o qual todos os pontos de vista são registrados na primeira vista com o objectivo de deslocamento mínimo entre as visões ^20,21.

Registro de Time-lapse

Devido a movermento do movimento do motor de agarose e imprecisa da platina do microscópio, a posição de cada pilha varia moderadamente ao longo do tempo. Considerando que o registo do ponto de tempo individual remove a diferença entre os pontos de vista deste ponto de tempo, o lapso de tempo também precisa ser registrado como um todo. Para este efeito, cada ponto de tempo indivíduo é registado para o ponto de tempo de referência.

ponto de tempo de referência

Se uma série temporal com muitos pontos de tempo é processado, um ponto de tempo representativo é seleccionado como referência geralmente a partir do meio das séries de tempo uma vez que as intensidades de grânulo podem degradar ao longo do tempo devido ao branqueamento. Nesta referência, podem ser determinados os parâmetros para detecção de pontos de interesse, o registo, a caixa delimitadora e fusão. Estes parâmetros são, em seguida, aplicada a todo o lapso de tempo para calcular um modelo de transformação específica para cada ponto de tempo individual. Durante o registro de lapso de tempo todos os outros pontos de tempo são também registrado espacialmente até este ponto de tempo de referência. Assim, os parâmetros da caixa delimitadora para toda a gravação estão dependendo de este ponto de tempo específico.

registro de multicanal

Quando imagiologia múltiplos canais, de preferência as mesmas partículas fluorescentes deve ser visível em todos os canais com imagens. A detecção e o registo pode então ser realizada em cada canal individualmente, o que leva em conta a influência dos diferentes comprimentos de onda de luz sobre a transformação. Muitas vezes, isto não é possível, porque os grânulos não são visíveis em todos os canais ou os grânulos são domina a imagem muito em um canal e são muito fraca no outro canal (s). A solução típica é a utilização de grânulos visíveis apenas em um canal para a detecção e registo e o modelo de transformação adquirida (ou seja, após a detecção, registo e registro de lapso de tempo) é então aplicada a outros canais de Fiji> Plugins> Multiview Reconstruction> Processamento em lote> Ferramentas> duplicados Transformations. No menu drop-down para aplicar a transformação de selecionar um canal para outros canais. Na janela seguinte, selecione o XML e clique em OK. Em seguida, selecione o canal que contém as contas como canal Fonte e como canal alvo selecionar o canal (s) sem esferas. Para Duplicate que transformações usar Substituir todas as transformações e pressione OK. As transformações são depois copiados para todos os outros canais e salvo no XML. Para ver as novas transformações na ViewSetup Explorer, reiniciar o Aplicação de Reconstrução MultiView.

caixa delimitadora

A fusão de vários pontos de vista é computacionalmente muito intensiva. No entanto, grandes imagens são normalmente adquiridas a acomodar não só a amostra, mas também os grânulos em torno dele. Uma vez que o parâmetro de registos são extraídos a partir das pérolas, elas já não são úteis como parte da imagem. Por conseguinte, para aumentar a eficiência da fusão, apenas as partes das pilhas de imagens contendo a amostra deve ser fundidos em conjunto. Uma região de interesse (caixa delimitadora) deve ser definido para conter a amostra e tão pouco da agarose circundante quanto possível. Para o exemplo na Figura 2 uma fusão média ponderada em todo o volume com 2229 × 2136 × 2106 px exigiria 38,196 MB de RAM, enquanto que com uma caixa delimitadora o volume é reduzido para 1634 × 1746 × 1632 px e os requisitos de memória são reduzidos para 17,729 MB.

fusion multiview baseada em conteúdo

O desafio de fundir dados multiview é que os pontos de vista geralmente terminam abruptamente e não contêm a mesma qualidade de imagem para os mesmos voxels. média simples dos pontos de vista, portanto, levar a mistura artefatos e degradação da imagem desnecessário. fu multiview baseada em conteúdo Sion leva esses dois problemas em consideração. Primeiro, ele combina os diferentes pontos de vista, onde uma imagem termina ea outra começa e, segundo, que avalia a qualidade de imagem local e aplica pesos mais elevados para maior qualidade de imagem na fusão ^21. Em comparação com um único ponto de vista não é uma melhoria da resolução em Z com uma ligeira degradação do sinal em XY (Figura 2E-H, A Figura 5A-D).

Multiview deconvolução

desconvolução multivista é uma outra abordagem para conseguir a fusão dos pontos de vista. Com este método também as PSFs dos diferentes pontos de vista são tomadas em consideração, a fim de recuperar a imagem que foi convolvido pelo sistema óptico do microscópio. Este método melhora drasticamente a qualidade de imagem através da remoção de desfocagem da imagem e aumentando a resolução e contraste do sinal ³¹ (Figura 2C-D, Figura 2I-J, Figura 5E-G, Filme 3).

ve_content "> Deconvolution é computacionalmente muito intensiva (ver Tabela 1), utilizando-se, assim, uma GPU para processamento aumenta a velocidade deste processo. Também pode ser necessário realizar a deconvolução em dados abaixo amostrados. Para amostra para baixo, use Fiji> Multiview Reconstrução > Processamento em lote> Ferramentas> aplicar transformações. Isto irá aplicar um novo modelo de transformação sobre os pontos de vista que serão guardados no arquivo .xml.

formato de arquivo HDF5 para BigDataViewer e BigDataServer

O BigDataViewer ³³ permite fácil visualização de dados de terabytes,. Como controlar o BigDataViewer é resumido na Tabela 2. Um screencast da operação básica do programa também está disponível como um suplemento na sua publicação original ^33. O BigDataViewer está centrada num ficheiro XML, que contém os metadados, e um ficheiro hdf5, que contém os dados de imagem. Os dados de imagem são present na hdf5 em níveis de resolução múltiplas em blocos 3D. Os níveis de resolução múltiplos permitem visualizar os dados mais rapidamente com resolução mais baixa, antes da resolução total é carregado. blocos individuais só são carregados na memória quando necessário. Assim, o formato de imagem hdf5 permite a visualização direta e rápida dos dados através do BigDataViewer ^33. É também acelera o processamento uma vez que o carregamento dos ficheiros é realizada de forma mais eficiente. Portanto, recomendamos resaving o conjunto de dados para este formato, embora não seja estritamente necessário para o processamento. Para obter mais explicações sobre o formato de dados, consulte a ligação 3 . Além disso, os conjuntos de dados podem ser compartilhados com colaboradores ou ao público utilizando o BigDataServer ³³ ( Ligação 6 ).

efeito

chave
F1	Mostra a ajuda com uma breve descrição do BigDataViewer e sua operação básica
<> Ou roda do mouse	Z em movimento
cima e para baixo seta	zoom in e out
Botão direito do mouse e arraste	move amostra no visualizador
clique esquerdo e arraste	gira amostra em torno do cursor
controle deslizante na parte inferior do visualizador ou Tab e seta para a esquerda ou para a direita	movimentos no eixo do tempo
Além disso pressionando shift	movimento mais rápido ou rotação em qualquer eixo
x e flecha, em seguida, esquerda e direita	gira em torno do eixo x
seta y e depois à esquerda e à direita	gira em torno do eixo y
z e depois à esquerda e seta para a direita	gira em torno do eixo Z
turno e x	orienta a vista ao longo do eixo x
turno e y	orienta a vista ao longo do eixo y
turno e z	orienta a vista ao longo do eixo z
Eu	alterna entre os diferentes modos de interpolação (ou seja, vizinho mais próximo e trilineares)
s ou Configurações> Brilho e Contraste	modifica a cor do canais, brilho e contraste
F6 ou Configurações> Visibilidade e agrupamento	muda os grupos apresentados, permite o agrupamento de sobreposição de grupos diferentes e chamando os grupos através das teclas numéricas
F10 ou Ferramentas> Gravar filme	adquire uma série de tempo da fatia exibida atualmente

Tabela 2: Big Data Viewer.

3. Limites da aplicação descrita de LSFM

baixa taxa de transferência

Em um experimento LSFM típico só uma amostra por experiência é trabalhada. Ainda assim, na nossa experiência, a uma grande quantidade de informação útil pode ser extraído daquela única amostra. Imagem de elevado rendimento de várias embriões foi recentemente conseguida em casa construída configurações LSFM ^46-48, embora normalmente à custa de liberdade de posicionamento da amostra e rotação.

penetração profunda insuficiente para os tecidos

Apesar de embriões de peixe-zebra são translúcidas, a qualidade da imagem obtida é deteriorar-se rapidamente quando imagiologia mais profundo no tecido devido à dispersão e absorção. Parcialmente isto é um efeito de dispersão e absorção da fluorescência emitida pela amostra e não pode ser corrigida na configuração corrente. Outra fonte de a qualidade da imagem irregular é a iluminação irregular. Tele folha de luz é incidente a partir do lado esquerdo ou direito e quaisquer objetos em seu caminho refratam-lo, o que resulta em artefatos da listra e borrão. A iluminação e multiview fusão de dupla face pode diminuir os artefatos na imagem final. Por último, a qualidade da imagem tende a ser um pouco pior no sentido da margem do campo de visão, devido à geometria natural da folha de luz, que é cada vez mais espessa em direcção as bordas.

manipulação química limitada

O uso de drogas ou inibidores é generalizada na investigação peixe-zebra. Neste uso de microscópio de drogas é limitado, devido ao grande volume da câmara de amostra e considerações de outros usuários do instrumento, que partilham a mesma câmara. Usando uma câmara adicional dedicada a experimentos com drogas pode resolver este problema. Enchendo a câmara parcialmente com esferas de vidro reduz o volume de líquido que é necessária.

Sem photomanipulation

Currently não há nenhuma possibilidade de manipulação óptica localizada como fotoconversão, ou ablação a laser no presente microscópio. No entanto, casa construída configurações podem ser usadas para tais aplicações específicas.

4. Os pedidos de significado e futuros

LSFM é o melhor método disponível no momento para a imagem latente rápida de grandes volumes de embriões vivos. A maioria das experiências concebíveis em um microscópio confocal também pode ser realizada em um microscópio de luz com folha vantagens acima mencionadas. No caso da imagiologia de desenvolvimento do olho, a velocidade de LSFM não é o parâmetro crucial. Em vez disso, a baixa fototoxicidade e flexibilidade no posicionamento da amostra são os benefícios decisivos.

Os dados LSFM têm um elevado SNR, o que ajuda a conseguir bons resultados de desconvolução e também é benéfico para análise de imagem automatizado e seguimento de objectos. Em conclusão, LSFM é uma grande ferramenta para a geração de dados quantificáveis ​​sobre o desenvolvimento embrionário e overacelular ll e as características do tecido para a modelagem subseqüente e descrições físicas dos processos em questão.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lightsheet Z.1 microscope	Carl Zeiss Microscopy
Low melting point agarose	Roth	6351.1
Low melting point agarose	Sigma	A4018 or A9414
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB/MS-222/Tricaine)	Sigma	E10521
N-Phenylthiourea (PTU)	Sigma	P7629
500 nm red fluorescent beads F-Y 050	Millipore (Estapor)	80380495
20 μl (1 mm inner diameter, marked black) capilllaries	Brand	701904	sold as spare part for transferpettor
Teflon tip plungers for 20 μl capillaries	Brand	701932	sold as spare part for transferpettor
Circular glass coverslips diameter 18 mm, selected thickness 0.17 mm	Thermo scientific (Menzel-Glaser)
O-rings for chamber windows 17×1.5 mm	Carl Zeiss Microscopy
Tweezers, style 55	Dumont	0209-55-PO
50 ml Luer-Lock syringes	Becton Dickinson	300865
150 cm extension cable for infusion compatible with Luer-Lock syringes	Becton Dickinson	397400
Links
Link 1 Multiview reconstruction application			https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration http://fiji.sc/Multiview-Reconstruction
Link 2 BigDataViewer			https://github.com/bigdataviewer
Link 3 BigDataViewer			http://fiji.sc/BigDataViewer
Link 4 Multiview reconstruction application-issues			https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration/issues
Link 5 BigDataViewer-issues			https://github.com/bigdataviewer/bigdataviewer_fiji/issues
Link 6 BigDataServer			http://fiji.sc/BigDataServer