Utilización de hojas de luz de microscopía de fluorescencia a la imagen de ojo de pez cebra Desarrollo

Introduction

La morfogénesis es el proceso que da forma el embrión y, junto con el crecimiento y la diferenciación impulsa la ontogenia de un huevo fecundado en un organismo multicelular maduro. Los procesos morfogenéticos durante el desarrollo de los animales se pueden analizar mejor mediante imágenes de los especímenes vivos intactos ^1-3. Esto es porque tal formación de imágenes embrión entero conserva todos los componentes que generan y regulan el desarrollo, incluyendo los gradientes de moléculas de señalización, matriz extracelular, vasculatura, inervación, así como propiedades mecánicas del tejido circundante. Para salvar las escalas, en las que se produce la morfogénesis, los acontecimientos subcelulares rápidas tienen que ser capturado en una escala temporal minutos en el contexto del desarrollo de todo el tejido durante horas o días. Para cumplir con todos estos requisitos, se ha desarrollado una aplicación moderna ⁴ de la ortogonal microscopio plano de iluminación ^5. Originalmente, fue nombrado el plano de iluminación selectiva de Microscopía (SPIM) ^4; ahora una hoja de luz que todo lo abarca término microscopía de fluorescencia (LSFM) se utiliza normalmente. LSFM permite obtener imágenes en alta resolución en el tiempo, mientras que induce menos fototoxicidad de escaneo láser o disco giratorio microscopios confocales ^6,7. Hoy en día, ya hay muchas implementaciones del principio básico de hoja de luz de iluminación y se ha utilizado para la imagen una gran variedad de muestras y procesos que antes eran inaccesibles para los investigadores ^8-11.

En primer lugar, quisiéramos destacar varias ventajas clave de LSFM sobre los enfoques de microscopía confocal convencionales:

Para obtener resultados significativos a partir de imágenes en vivo experimentos microscópicas, es importante que la observación sólo afecta mínimamente la muestra. Sin embargo, muchos organismos incluyendo el pez cebra son muy susceptibles a la exposición a la luz láser, por lo que es difícil de imagen en un microscopio confocal de alta resolución de tiempo sin ef fototoxicidaddefectos como ^6,7 estancamiento del desarrollo o retraso. LSFM es actualmente la técnica de imágenes de fluorescencia con los menores efectos perturbadores en la muestra ^7. Dado que la hoja delgada luz láser ilumina sólo la parte de la muestra que se forma la imagen en un punto de tiempo determinado, el microscopio de lámina de luz es el uso de fotones de manera muy eficiente. En consecuencia, la baja exposición a la luz para observaciones con lapso de tiempo más largos de los especímenes más sanos, por ejemplo ^12-17. Por otra parte, gracias a la mínima invasividad de LSFM, el número de imágenes adquiridas ya no está dictada por la cantidad de luz que la muestra puede tolerar, sino más bien por la cantidad de datos pueden ser procesados ​​y almacenados.

En la misma línea de mantener la muestra en condiciones fisiológicas cerca, LSFM viene con el montaje de la muestra estrategias alternativas muy adecuados para los embriones vivos. En las técnicas de LSFM, los embriones se insertan típicamente dentro de una delgada columna de agarosa de bajo porcentaje. el mounting en cilindros de agarosa permite la completa libertad de rotación, por lo que la muestra se puede observar desde el ángulo perfecto (en LSFM denomina vista) y desde varios puntos de vista al mismo tiempo. La proyección de imagen de múltiples vistas y la fusión de múltiples vistas posterior es beneficioso sobre todo para grandes muestras de dispersión, y permite la captura de ellos con alta resolución, isotrópico. Un resumen de otras estrategias posibles de montaje LSFM se puede encontrar en el manual oficial de explotación del microscopio, en el capítulo sobre la preparación de la muestra escrito por el laboratorio de E. Reynaud. Es una lectura recomendable, especialmente si el objetivo es a diferentes muestras de imagen que se describe aquí.

La adquisición de imágenes en LSFM es de gran campo, basado en cámaras, a diferencia de escaneo láser confocal microscopio. Esto resulta en una señal a una mayor relación de ruido (SNR) de las imágenes adquiridas y puede ser extremadamente rápido (decenas a cientos de cuadros por segundo). La alta sensibilidad de LSFM permite además de imágenes de samp débilmente fluorescenteles, como factores de transcripción expresados ​​en los niveles endógenos o ^18, en el futuro cercano, las proteínas endógenas etiquetados utilizando CRISPR / Cas9. La alta SNR también es importante para el éxito de análisis de imágenes aguas abajo. Se requiere que la alta velocidad no sólo para capturar procesos intracelulares rápidas, sino también a la imagen de todo el embrión desde múltiples puntos de vista suficientemente rápido. Una fusión perfecta de las varias vistas sólo se puede lograr, si el fenómeno observado no cambia durante la adquisición de estas varias pilas z procedentes de vistas separadas.

Las ventajas de LSFM no vienen típicamente a expensas de la calidad de imagen. La resolución lateral de LSFM es ligeramente peor que la resolución de un microscopio confocal. Esto se debe a los objetivos de detección utilizados en LSFM tienen una menor apertura numérica (generalmente 1,0 o menos) en comparación con 1/2 a 1/3 de los objetivos de agua o la inmersión de silicio sobre la instalación de confocal estándar. Además, debido a la amplia detección de campos en LSFM (Absence de un agujero de alfiler), hay más luz fuera de foco en comparación con un microscopio confocal. La cantidad de luz fuera de foco es determinado por el espesor de la lámina de luz. Sin embargo, estas desventajas se compensan por el mayor SNR en LSFM. En la práctica, esto se traduce en imágenes de calidad similar en comparación con, por ejemplo, girando el disco de adquisición confocal ^15. En consecuencia, esto permite la extracción fiable de características como las membranas celulares o núcleos, por ejemplo, por linaje de células rastreo ^15,19.

La resolución axial de LSFM se determina, además del objetivo de detección, por el espesor de la lámina de luz. La resolución axial de LSFM puede en algunos casos supera la resolución de los microscopios confocal. En primer lugar, la mejora en la resolución viene cuando la lámina de luz es más fina que la resolución axial del objetivo de detección, que se produce normalmente para grandes especímenes fotografiados con un objetivo bajo aumento. La segunda forma, cómo el LSFM puede ACHIEVE mejor resolución axial, es la fusión de múltiples vistas, en la que la información de alta resolución xy desde diferentes puntos de vista se combina en una sola imagen de pila. La pila fusionado resultante tiene una resolución isotrópica acercarse a los valores de la resolución en la dirección lateral ^20,21. La estrategia para el registro de los múltiples puntos de vista sobre la otra se describe en este artículo se basa en el uso de perlas de poliestireno fluorescentes como marcadores fiduciarios embebidos en la agarosa alrededor de la muestra ^20,21.

Como resultado de la comercialización LSFM, esta técnica ya está disponible para una amplia comunidad de científicos ^22. Por lo tanto, la motivación para escribir este protocolo es que esta tecnología sea accesible para los biólogos del desarrollo que carecen de experiencia práctica en LSFM y para obtener estos científicos empezaron a utilizar esta tecnología con sus muestras. Nuestro protocolo utiliza el microscopio ficha técnica de iluminación comercial, lo que constituye un microscopio conceptualmente simple tsombrero es fácil de operar. Además, nos gustaría hablar de otros protocolos recientes para obtener imágenes de pez cebra con configuraciones LSFM de fabricación casera, que podrían ser adecuados para responder a determinadas preguntas ^23-25. Otra opción de entrada a LSFM son las plataformas abiertas ^26,27, que utilizan los principios de libre acceso para traer la microscopía de lámina de luz a una comunidad más amplia. La documentación tanto del hardware y los aspectos del software se puede encontrar en http://openspim.org y https://sites.google.com/site/openspinmicroscopy/.

En este protocolo, se utiliza el pez cebra teleósteos como un sistema modelo para estudiar los procesos de desarrollo con LSFM. La morfogénesis del ojo de pez cebra es un ejemplo que pone de manifiesto muchos de los beneficios de LSFM. LSFM ya se ha utilizado en el pasado para investigar el desarrollo del ojo en medaka ²⁸ y en el pez cebra ^29,30. En la etapa temprana de desarrollo del ojo que es complicado para orientar el embrión correctamente para microscopía convencional,como la yema voluminosos no permite que el embrión se encuentran en el lado con su ojo hacia el objetivo. Sin embargo, con LSFM de montaje en una columna de agarosa, la muestra puede ser reproducible posicionado. Además, durante la transición de la vesícula óptica a la etapa de copa óptica, el ojo se somete a grandes reordenamientos morfogenéticas acompañadas de crecimiento, lo que requiere la captura de una gran pila z y un gran campo de visión. También para estos desafíos LSFM es superior a la imagen confocal convencional. El proceso de formación copa óptica es tridimensional, por lo tanto es difícil de comprender y visualizar únicamente por formación de imágenes de una vista. Esto hace que las imágenes multivista con la resolución isotrópica beneficioso. Después de la formación copa óptica, la retina se vuelve cada vez más sensibles a la exposición al láser. Por lo tanto, la baja fototoxicidad asociado con LSFM es una ventaja importante para la formación de imágenes a largo plazo.

Aquí presentamos un protocolo optimizado para la imagen de uno a tres días de edad embriones de pez cebra unalarvas nd con enfoque en el desarrollo del ojo. Nuestro método permite la grabación de películas a intervalos que cubren hasta 12-14 h con alta resolución espacial y temporal. Es importante destacar que, también mostramos una tubería para el procesamiento de datos, que es un paso esencial en LSFM, ya que esta técnica invariablemente genera grandes conjuntos de datos, a menudo en el rango terabyte.

Protocol

NOTA: Todos los trabajos de los animales se realizó de acuerdo con la directiva de la Unión Europea (UE) 2011/63 / UE y la Ley de Protección de los Animales alemán. El protocolo está destinado a ser seguido sin interrupción, desde la formación de imágenes de montaje a la muestra. En función de la experiencia práctica, que se llevará a 2-3 horas para iniciar un experimento de lapso de tiempo. Procesamiento de datos no está incluido en este cálculo de tiempo. Todo el material necesario para el experimento se puede encontrar en la lista de comprobación de material necesario antes de comenzar que se proporciona como un documento suplementario. Use guantes libres de polvo durante los pasos 1, 2, 3 y 4. Para los pasos 2, 3, 4 y 5 del protocolo también se refiere a las instrucciones de manejo del microscopio oficial.

1. El trabajo preparatorio antes del experimento Imaging

1. Fluorescente del grano de la Solución
   1. Para este protocolo, utilizar los 500 o 1.000 nm de diámetro perlas de poliestireno (marcados con colorante fluorescente que emite rojo). La dilución de trabajo de las perlas es de 1: 4,000. En primer lugar, el vórtice solución de bolas acción para 1 min. Diluir 10 l de perlas en 990 l de _ddH2O Guardar la solución en la oscuridad a 4 ° C y utilizar esta dilución 1: 100 como la solución de reserva para ser diluido en 1:40.
2. Solución para la preparación de la cámara de muestras
   1. En un vaso de precipitados de 100 ml de la mezcla 38,2 ml de medio sin E3 azul de metileno, 0,8 ml de 10 mM N -phenylthiourea y 1 ml de 0,4% de MS-222. Es beneficioso utilizar medio E3 filtrada para evitar las pequeñas partículas de polvo o cristales sin disolver flotando en la cámara de muestra más adelante.
3. Selección de embriones de pez fluorescente
   1. En los días antes del experimento, preparar embriones que expresan proteínas fluorescentes. Justo antes del experimento, ordenar los embriones bajo el estereoscopio fluorescente para la fuerza deseable de la señal fluorescente. Tome 5-10 embriones sanos y dechorionate ellas con unas pinzas.
      NOTA: Este protocolo está optimizado para 16-72 horas de edadembriones.

2. Configuración de la cámara de muestras

1. Montaje de la Cámara Tres Ventanas
   1. Hay 4 ventanas en la cámara de muestras, una para el objetivo y tres para ser sellado con el cubreobjetos (18 mm de diámetro, espesor de 0,17 mm seleccionados). Almacenar estos cubreobjetos en 70% de etanol. Límpielos antes de su uso con éter: etanol (1: 4).
   2. Inserte el cubreobjetos en la ventana utilizando unas pinzas finas y asegurarse de que encaja en la ranura más pequeña. Cubrirlo con el caucho de diámetro junta tórica 17 mm y el tornillo en el anillo adaptador de luz utilizando la herramienta de ventana de la cámara. Repita el proceso para las otras dos ventanas.
2. Montaje de las piezas restantes de la Cámara
   1. Atornille el adaptador para un objetivo apropiado en el cuarto lado restante de la cámara. Insertar el diámetro junta tórica 15 mm en el centro del adaptador.
   2. Tornillo en el blanco adaptador Luer-Lock en la abertura inferior derecha en el chambre y el conector de drenaje gris en la abertura superior izquierda. Bloquear todas las tres aberturas restantes con los tapones ciegos negros.
   3. Coloque el bloque de Peltier y el fondo de diapositivas de cola de milano de metal de la cámara usando una llave Allen. Conecte la manguera con la jeringa de 50 ml al adaptador Luer-Lock. Inserte la sonda de temperatura en la cámara.
3. Inserción de los Objetivos y la Cámara en el microscopio
   1. Revisar bajo el estereoscopio que todos los objetivos están limpias. Usa los objetivos de iluminación 10X / 0.2 y el objetivo de detección de Plan-Apocromático 20X / 1.0 W y asegúrese de que su collar de corrección del índice de refracción se establece en 1,33 para el agua. Atornille el objetivo de detección en el microscopio, manteniendo los objetivos que iluminan cubiertos.
   2. Retire las tapas de plástico que protegen los objetivos que iluminan. deslice con cuidado la cámara en el microscopio y apretarlo con el tornillo de fijación.
   3. Conecte la temperatura proser y el bloque de Peltier con el microscopio.
      NOTA: Los dos tubos que circulan el líquido de refrigeración para el bloque Peltier son compatibles con ambos conectores. Ellos forman un circuito que funciona independientemente de la orientación de la conexión.
   4. Llenar la cámara a través de la jeringa con solución preparada en el paso 1.2 hasta el borde superior de las ventanas de la cámara. Compruebe que la cámara no tenga fugas.
   5. Iniciar el microscopio, la incubación y los ordenadores que controlan y almacenamiento. Ejecutar el software de microscopio de funcionamiento y fijar la temperatura de incubación a 28,5 ° C.
      NOTA: Se llevará a 1 hora para equilibrar por completo. Preparar la muestra en el ínterin.

Preparación de la muestra 3.

1. Preparación de la mezcla de agarosa
   1. 15 min antes de hacer la mezcla de agarosa, se funden una alícuota de 1 ml de 1% de agarosa de bajo punto de fusión (disuelto en medio de E3) en un bloque de calentamiento se establece en 70 ° C. Una vez que la agarosa es completamente moldiez, transferir 600 l en un tubo nuevo de 1,5 ml, añadir 250 l de medio E3, 50 l de 0,4% MS-222 y 25 l de solución de bolas Stock vórtex.
      NOTA: Esto hace 925 l de la mezcla, mientras que 75 l adicionales se calculan para el líquido añadido más tarde junto con los embriones.
   2. Mantenga el tubo en un segundo bloque de calentamiento a 38-40 ° C o asegurarse de que la agarosa está muy cerca de su punto de gelificación antes de colocar los embriones de muestra en ella.
2. Montaje de los embriones
   1. Tomar cinco capilares de vidrio de un volumen de 20 l (con un punto negro, ~ 1 mm de diámetro interior) e insertar los émbolos de punta de teflón a juego en ellos. Empuje el émbolo a través del capilar de modo que la punta de teflón es en la parte inferior del capilar.
   2. Transferencia de cinco embriones (un número que se puede montar a la vez) con un vaso o pipeta de plástico en el tubo de vórtex 37 ° C cálida mezcla de agarosa.
      NOTA: Trate de llevar a lo largo de un volumen mínimo de ingenio juntos líquidah los embriones.
   3. Insertar el capilar en la mezcla y succionar un embrión dentro tirando el émbolo hacia arriba. Asegúrese de que la cabeza del embrión entra en el capilar antes de la cola. Evitar las burbujas de aire entre el émbolo y la muestra. No debe haber ± 2 cm por encima de agarosa al embrión y ± 1 cm por debajo de ella. Repita para los embriones restantes.
   4. Esperar hasta que la agarosa se solidifica completamente, lo que sucede dentro de unos pocos minutos y a continuación, almacenar las muestras en medio E3, pegándose a la pared de un vaso de precipitados con plastilina o cinta. La abertura inferior del capilar debe estar colgando libre en la solución que permite el intercambio de gases a la muestra.
      NOTA: Un protocolo similar a las secciones 3.1 y 3.2 también se puede encontrar en la página wiki OpenSPIM http://openspim.org/Zebrafish_embryo_sample_preparation.

Posicionamiento 4. Muestra

1. Asamblea Contenedor de muestras
   1. Insertar 2 fundas de plástico del tamaño adecuado (negro)uno contra el otro en el vástago de soporte de la muestra. Sus lados de ranura tienen que mirar hacia fuera. Fije sin apretar el tornillo de fijación girándolo 2-3 rondas. Insertar el capilar a través el tornillo de fijación y empujarlo a través del soporte hasta que la banda de color negro se hace visible en el otro lado. Evitar tocar el émbolo.
   2. Apretar el tornillo de fijación. Empuje el exceso de agarosa al 1 cm por debajo del embrión fuera del capilar y cortarlo. Insertar el vástago en el disco de soporte de la muestra.
   3. Confirmar en el software que la platina del microscopio está en la posición de carga. Utilice carriles de guía para deslizarse todo el soporte con la muestra verticalmente hacia abajo en el microscopio. Convertirlo, de modo que las cerraduras magnéticas de discos titular en su posición.
2. Localizar el capilar
   1. A partir de ahora, controlar el posicionamiento de la muestra por el software. En la pestaña Localiza elegir la opción capilar Localizar y situar el capilar en x, y, z en el foco justo por encima del objeto de detecciónive lente. Utilice la representación gráfica en el navegador de modelo indicativo.
   2. Empuje suavemente el embrión fuera del capilar hasta que se encuentra frente a la pupila del objetivo de detección.
      NOTA: El 'Localiza capilares' es el único paso en el protocolo restante, durante el cual se debe abrir la tapa superior del microscopio y la muestra empujado fuera.
3. Colocar la muestra
   1. Cambiar a la opción "Localizar la muestra 'y en el 0,5 zoom llevar el ojo de pez cebra en el centro del campo de visión. Girar el embrión, de manera que la lámina de luz no pasará a través de las piezas de gran refracción o absorción de la muestra antes de que alcance el ojo. Del mismo modo, la fluorescencia emitida necesita un camino claro de la muestra. Haga clic en "Establecer Posición de inicio '.
   2. Abra la puerta delantera del microscopio y poner la tapa de plástico con una abertura de 3 mm en la parte superior de la cámara para evitar la evaporación.
      NOTA: Si el nivel de líquido desciende por debajoel nivel de formación de imágenes, se pondrá en peligro el experimento.
   3. Comprobar el latido del corazón del embrión como un indicador de la salud general. Si es demasiado lento, utilizar otra muestra (comparar con los controles no montado; valores específicos dependen de la etapa de desarrollo). Cambiar al ajuste de zoom final y reajustar la posición del embrión.

5. La creación de un Multidimensional Adquisición

1. Los parámetros de adquisición
   1. Cambie a la pestaña 'Adquisición'. Definir la trayectoria de la luz láser, incluyendo líneas objetivo la detección, filtro de bloqueo de láser, divisor de haz y las cámaras.
   2. Active la casilla de verificación de exploración de pivote. Definir los otros ajustes de adquisición como la profundidad de bits, formato de imagen, el grosor de lámina de luz y elegir la iluminación de una sola cara.
   3. Pulse 'continua' y dependiendo de la intensidad de la imagen obtenida cambiar el tiempo de la potencia del láser y la exposición de la cámara.
      NOTA: Para ajustar todos los ajustes de imágenes utilizan lespotencia del láser s (0,5% de 100 mW láser, el tiempo de exposición de 30 ms), que para el experimento real para evitar daños innecesarios foto de la muestra.
2. Ajuste Hoja Luz
   1. Cambiar a la 'iluminación de doble cara' y active la casilla de verificación "línea lateral dual Fusio'n. Comienza la 'Lightsheet Ajuste automático asistente'. Siga las instrucciones paso a paso.
      Nota: El asistente mueve la hoja de la luz en el plano focal del objetivo de la detección, y se asegura de que no se inclina y su cintura se encuentra en el centro del campo de vista. Después de terminar el ajuste automático, las posiciones de las hojas de luz izquierdo y derecho se actualizan automáticamente en el software. Una mejora en la calidad de la imagen debería ser ahora aparente. Active la casilla de verificación 'pila Z'.
   2. Compruebe el ajuste de lámina de luz mediante la inspección de la simetría de la función de dispersión de punto (PSF) determinada por las perlas fluorescentes en la XZ e YZ vista orto. Si no es det simétrica, ajustar manualmente la posición de parámetros de lámina de luz hacia arriba y abajo hasta conseguir una forma de reloj de arena PSF simétrica (Figura 1A).
3. Ajustes de adquisición multidimensionales
   1. Definir el z-pila con la "primera rebanada 'y las opciones de" último corte "y ajustar el paso de Z a 1 micra.
      NOTA: La hoja de la luz en este microscopio es estático y el seccionamiento z se logra moviendo la muestra a través. Siempre utilice la opción 'Drive continua' para la adquisición más rápida de z-pilas.
   2. Active la casilla de verificación "Time Series '. Definir el número total de puntos de tiempo y el intervalo entre ellos.
   3. Active la casilla de verificación "Multiview '. Añadir la vista actual en la lista de multiview, donde se almacena la información de x, y, z y el ángulo. Utilice el controlador de la etapa de girar el capilar y definir las otras vistas deseadas. Configurar una pila Z en cada vista y añadirlos a la lista de múltiples vistas.
      NOTA: Lasoftware ordena los puntos de vista de una manera en serie, de modo que el capilar se gira unidireccionalmente, mientras que la imagen se adquiere.
4. Corrección de la deriva e inicio del experimento
   1. Una vez que la adquisición establecido se haya completado, espere 15-30 minutos antes de comenzar el experimento real.
      NOTA: La muestra se desplaza inicialmente unos pocos micrómetros en x, y y z, pero debe detenerse dentro de 30 min. Si la muestra se mantiene a la deriva durante más tiempo, utilizar otra muestra o volver a montar.
   2. Cambiar a la pestaña "mantener" y en la opción 'Streaming' definen cómo se deben guardar los datos, por ejemplo, un archivo por cada punto de tiempo o un archivo separado para cada vista y el canal. Volver a la pestaña 'Adquisición', pulse 'Start Experimento' y definir el nombre del archivo, la ubicación donde debe ser guardado y el formato de archivo (uso .czi).
   3. Observar la adquisición del primer punto de tiempo para confirmar que todo está funcionando sin problemas. Inmediatamente proceder al registroy la fusión de la primera punto de tiempo como se describe en los pasos 6 y 7, para confirmar que será posible procesar el conjunto de datos.

6. Registro de Multiview

1. Aplicación Reconstrucción Multiview
   1. Al final de la sesión de formación de imágenes, transferir los datos desde el equipo de almacenamiento de datos en el microscopio a un equipo de procesamiento de datos. Utilice el 'MultiView ReconstructionApplication ^'20,21,31 implementado en Fiji ³² para el procesamiento de datos (Figura 1B).
2. definir conjunto de datos
   1. Actualizar Fiji: Fiji> Ayuda> Actualización de ImageJ y Fiji> Ayuda> Actualización de Fiji. Utilice el ImageJ principal y sitios de actualización Fiji.
   2. Transferir todo el conjunto de datos en una carpeta. Los resultados y los archivos intermedios del procesamiento se guardarán en esta carpeta. Iniciar la aplicación Reconstrucción MultiView: Fiji> Plugins> Multiview Reconstrucción> MultiviAplicación Reconstrucción ew.
   3. Seleccione 'definir un nuevo conjunto de datos'. Como tipo de conjunto de datos seleccione la opción meu "Zeiss Lightsheet Z.1 conjunto de datos (LOCI Bioformats)" y crear un nombre para el archivo .xml. A continuación, seleccione el primer archivo .czi del conjunto de datos (es decir, sin archivo de índice). Contiene los datos de imagen, así como los metadatos de la grabación.
      NOTA: Una vez que el programa se abre el primer archivo .czi, los metadatos se cargan en el programa.
   4. Confirmar que el número de los ángulos, canales, iluminaciones y observar el tamaño del voxel de los metadatos. Al pulsar OK, observar tres ventanas separadas abiertas (Figura 1C): una ventana de registro, que muestra el progreso del tratamiento y sus resultados, el 'ViewSetup Explorer "y una consola, que muestra mensajes de error de Fiji.
      NOTA: El 'ViewSetup Explorer "es una interfaz fácil de usar que muestra cada vista, el canal y la iluminación y permite la selección de los archivos de interés. Además, el 'ViewSetup Explorer "permite la dirección de todos los pasos del proceso.
   5. Seleccione los archivos que necesitan ser procesados ​​y pulse el botón derecho del ratón en el explorador. Observar una ventana abierta con diferentes etapas de tratamiento (Figura 1C).
   6. Al definir el conjunto de datos, observe que se crea un archivo .xml en la carpeta con los datos.
      NOTA: Este archivo contiene los metadatos que se confirmó antes.
   7. En la esquina superior derecha observar 'info' dos botones y 'guardar'. Al pulsar 'info' muestra un resumen del contenido del archivo .xml. Al presionar "Guardar" guardará los resultados del tratamiento.
      NOTA: Mientras que el procesamiento en la "Solicitud de Reconstrucción Multi Vista 'las diferentes etapas de procesamiento deben ser guardados en el .xml antes de cerrar Fiji.

OAD / 53966 / 53966fig1.jpg "/>
Figura 1: Reconstrucción Multiview flujo de trabajo y puntos de interés de detección (A) La alineación de la hoja de luz basado en la imagen de bolas fluorescentes.. El sistema está alineado (centro), cuando la imagen de talón tiene una forma de reloj de arena simétrica en las proyecciones XZ e YZ. Los ejemplos de lámina de luz en cualquier dirección desalineada se muestran a la izquierda y la derecha. Las proyecciones de máxima intensidad de un cordón de 500 nm en xz, se muestran los ejes YZ y XY. Tenga en cuenta que la proporción de intensidad del pico central del disco de Airy (en xy) a los lóbulos laterales es mayor, cuando la lightsheet está alineado correctamente respecto a la situación desalineados. Las imágenes fueron tomadas con 20X / 1.0 objetivo zoom W a 0,7. La barra de escala representa 5 micras. (B) El conjunto de datos se define a continuación, vuelve a guardar en el formato HDF5. Las cuentas se dividen en segmentos y luego registrados. Por una serie de tiempo cada punto de tiempo se ha registrado en un punto de tiempo de referencia. Los datos son finalmente fundidos en unaisotrópico volumen único. (C, arriba) El Explorador de ViewSetup muestra los diferentes puntos de tiempo, ángulos, canales y partes de iluminación del conjunto de datos. (C, esquina inferior izquierda) La ventana BigDataViewer muestra la vista que se ha seleccionado en el Explorador de ViewSetup. (C, centro derecha) Haga clic derecho en el Explorador de ViewSetup abre las opciones de proceso. (C, esquina inferior derecha) El progreso y los resultados del tratamiento se muestran en el archivo de registro. (D y E) El objetivo de la detección es segmentar tantos puntos de interés (perlas) con el menor de detección en la muestra como sea posible aquí se muestra como capturas de pantalla de la segmentación del grano interactiva. (D y E, en la esquina superior izquierda) La segmentación se define por dos parámetros, los valores de diferencia de gaussianas para Sigma 1 y el umbral. (D) Un ejemplo de una detección con éxito con una vista ampliada de un cordón detectado correctamente. (E) Segmentación con demasiados falsos positivos y múltiples detecciones de una única perla. La barra de escala en (C) representa el 50 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Vuelva a guardar conjunto de datos en formato HDF5
   1. Para volver a guardar todo el conjunto de datos, seleccionar todos los archivos con Ctrl / de Apple + a y haga clic derecho. A continuación, seleccione el conjunto de datos Volver a guardar y como HDF5.
   2. Aparecerá una ventana que muestra una advertencia de que se pueden volver a guardar todas las vistas del conjunto de datos actual. Presione sí.
      NOTA: El programa continuará para volver a guardar los archivos .czi a hdf5 mediante la apertura de todos los archivos y volver a guardar los diferentes niveles de resolución del formato hdf5. Se confirmará con el "hecho" al finalizar. Al volver a guardar usually tarda unos pocos minutos por punto de tiempo (véase la Tabla 1).
      NOTA: Dado que los archivos en el formato hdf5 se pueden cargar muy rápido, ahora es posible ver el conjunto de datos no registrados por "click derecho" en el explorador y alternar 'exhibición en BigDataViewer (on / off) ". Una ventana aparecerá BigDataViewer con la vista seleccionada (Figura 1C). Las funciones básicas de la BigDataViewer ³³ se explican en la Tabla 2 y http://fiji.sc/BigDataViewer.
4. Detectar Puntos de interés
   1. Seleccionar todos los puntos de tiempo con Ctrl / de Apple + a la derecha y haga clic en seleccionar detectar los puntos de interés.
   2. Seleccione Diferencia-de-Gaussian ³⁴ para el tipo de detección de puntos de interés. Desde el registro basado en perlas se usa aquí, el tipo de "perlas" en el campo de los puntos de interés de la etiqueta. Activar 'Downsample imágenes antes de la segmentación'.
   3. En la siguiente ventana, observar el detajustes exión. Para 'de subpíxeles de localización "uso" ajuste cuadrático de 3 dimensiones ^"34 y para determinar los valores de diferencia-de-Gauss y radio para el uso de cuentas de segmentación" interactivo "en la especificación punto i'nterest'.
   4. Para 'Downsample XY "uso" de ajuste de Z Resolución (menos la disminución de resolución)' y de 'Downsample Z' 1 × uso. El tamaño z paso es más grande que el tamaño de pixel xy, por lo tanto el muestreo simplemente por la xy para que coincida con la resolución de z es suficiente. Seleccione 'computación en la CPU (JAVA)'. Presiona OK'.
   5. En una ventana pop-up, seleccione una vista para probar los parámetros del menú desplegable. Una vez cargada la visión, ajustar el brillo y el contraste de la ventana con Fiji> Imagen> Ajustar> Brillo / Contraste o Ctrl + Shift + C Marque la casilla 'look para maxima (verde)' para la detección de perlas.
   6. Observar la segmentación en los anillos verdes como el 'viewSetup' todas partes del mundod las detecciones en la búsqueda de los máximos y los mínimos de rojo para. La segmentación es definida por dos parámetros, los valores de diferencia-de-Gauss para Sigma 1 y el umbral (Figura 1D). Ajustarlos a los segmentos que sean muchas perlas alrededor de la muestra y el menor número de detecciones de falsos positivos dentro de la muestra como sea posible (Figura 1D). Detectar cada cuenta sólo una vez y no varias veces (Figura 1E). Después de determinar los parámetros óptimos, pulse 'hecho'.
      NOTA: La detección se inicia mediante la carga de cada vista individual del punto de tiempo y la segmentación de las perlas. En el archivo de registro, el programa emite el número de cuentas se detectó por visión. La detección debe realizarse en unos pocos segundos (ver Tabla 1).
   7. Pulse Guardar cuando la cantidad de detecciones es apropiado (600 a varios miles por visión).
      NOTA: Una carpeta se crea en el directorio de datos, que contendrá la información sobre las coordenadas de los granos detectados.
5. Register El uso de puntos de interés
   1. Seleccionar todos los puntos de tiempo con Ctrl / de Apple + a, clic derecho y seleccionar "Registrar el uso de Puntos de interés '.
   2. Use 'hash rápido 3d geométrica (rotación invariante)' para la detección de perlas como "algoritmo de registro '.
      NOTA: Este algoritmo no asume ningún conocimiento previo acerca de la orientación y el posicionamiento de los diferentes puntos de vista con respecto a la otra.
   3. Para el registro de los puntos de vista sobre la otra, seleccione "registro puntos de tiempo individual" como "tipo de registro '. Por "puntos de interés" en el canal seleccionado, la etiqueta especificada anteriormente para los puntos de interés ahora debe ser visible (es decir, "perlas").
   4. En la siguiente ventana, utilice los valores prefijados para el registro. Fijar la primera vista seleccionando 'azulejos: Reparado primera baldosa y el uso No asigne a favor' (utilizar esto si tilES no son fijos) en la sección "Mapa de vuelta azulejos '.
   5. Use un "modelo de transformación afín" con "regularización".
      NOTA: El error permitido para RANSAC será 5px y el "significado para un partido de descriptor 'será 10. Para' regularización 'utilizar un" modelo rígido' con un lambda de 0,10, lo que significa que la transformación es del 10% y 90 rígido ^35% afín. Pulse OK para iniciar el registro.
      NOTA: Como se muestra en la ventana de registro, primero cada vista se corresponde con todos los otros puntos de vista. A continuación, el consenso muestra aleatoria (RANSAC) ³⁶ pone a prueba las correspondencias y excluye los falsos positivos. Para un registro robusto, el valor RANSAC debe ser mayor que 90%. Cuando se encontró un número suficiente de candidatos verdaderos correspondientes entre dos puntos de vista, un modelo de transformación se calcula entre cada partido con el desplazamiento medio en píxeles. A continuación, la optimización global iterativo se lleva a cabo y todas las vistas están registrados en la vista fija. Con el registro con éxito, un modelo de transformación se calcula y se muestra con su escala y el desplazamiento en píxeles. El error promedio debería ser de manera óptima por debajo de 1 px y la descamación de la transformación cerca de 1. El registro se ejecuta en segundo (ver Tabla 1).
   6. Confirmar que no hay cambio entre diferentes puntos de vista como se observa en las estructuras finas dentro de la muestra, por ejemplo, las membranas celulares. A continuación, guarde la transformación para cada vista en el archivo .xml.
      NOTA: Ahora las vistas registrados se solapan entre sí en la BigDataViewer (Figura 2A) y las imágenes de talón deben superponiendo así (Figura 2B).
   7. Retire las transformaciones mediante la selección de la derecha los puntos de tiempo, haga clic en ellos y luego seleccione Eliminar Transformaciones> Últimas / más nueva transformación.

RE 2 "src =" / files / ftp_upload / 53966 / 53966fig2.jpg "/>

Figura 2:. Los resultados de la reconstrucción multiview (A) superpone vistas registrados, cada uno en un color diferente para demostrar la superposición entre ellas. (B) vista ampliada que muestra la superposición de los PSF de cuentas fotografiadas desde los diferentes puntos de vista. (C) Cerca de un grano después de la fusión, el PSF es un promedio de los diferentes puntos de vista. (D) PSF del mismo grano como en (C) después de deconvolución multiview mostrando que la PSF colapsa en un solo punto. (E) la sección xy y la sección yz (F) de una sola vista de una vesícula óptica, en el que las membranas están etiquetados con GFP que muestra la degradación de la señal en z más profundo en el tejido. (G) sección xy y la sección (H) yz de la misma vista después de la fusión ponderado promedio de 4 puntos de vista de aproximadamente 20 grados de separación, con poco más degraResolución XY ded en general, pero el aumento de z-resolución. Sección xy (I) y la sección (J) yz de los mismos datos después de deconvolución multiview, mostrando un aumento significativo de la resolución y el contraste de la señal tanto en xy y en z. Imágenes en (EJ) son rebanadas ópticos individuales. La barra de escala representa 50 micras (A, B, EJ) y 10 m (C, D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

6. Registro de lapso de tiempo
   1. Seleccionar todo el lapso de tiempo, haga clic derecho y seleccione 'Register usando Puntos de Interés' para estabilizar el lapso de tiempo en el tiempo.
   2. En la "ventana Parámetros de registro de base seleccione Partido contra un punto de tiempo de referencia (sin optimización global) para el tipo de registro '. Ke ep L os otros ajustes de la misma que en el registro de los puntos de tiempo individuales.
   3. En el proximoventana, seleccionar el punto de tiempo para ser utilizado como una referencia, por lo general un punto de tiempo en el medio de la de lapso de tiempo. Marcar la casilla 'considerar cada punto de tiempo como unidad rígida', desde los puntos de vista individuales dentro de cada punto de tiempo ya están registrados unos sobre otros.
   4. Marcar la casilla de 'Mostrar estadísticas de series de tiempo. Los demás parámetros de registro se mantienen como antes de incluir la regularización. Pulse OK.
      NOTA: En la ventana de registro, el mismo resultado se mostrará como en el Registro del punto de tiempo individual. Si el registro de los puntos de tiempo individuales se ha realizado correctamente y robusto, el RANSAC es ahora 99 a 100%, y el medio, mínimo y máximo error es por lo general por debajo de 1 px. Guardar este registro antes de proceder.

7. Fusión Multiview

NOTA: Las transformaciones resultantes de los pasos de registro se utiliza para calcular una pila isótropa fusionado de los múltiples puntos de vista. Esto ha pilas aumento del número de z rebanadas en comparación con los datos originales, debido a la separación z es ahora igual al tamaño original del pixel en xy. La fusión se puede realizar por cualquiera de una fusión multiview basado en el contenido o ^21,31 deconvolución multiview basado en Bayesiano ^31, que son a la vez implementado en la aplicación reconstrucción multivista.

1. Cuadro delimitador
   NOTA: La fusión es un proceso caro computacionalmente (véase la Tabla 1), lo que reduce la cantidad de datos mediante la definición de un cuadro delimitador aumenta significativamente la velocidad de procesamiento.
   1. Seleccione el derecho de todos los puntos de tiempo, haga clic y elija Definir 'Cuadro delimitador'. Use 'Definir con BigDataViewer' y elegir un nombre para el cuadro delimitador.
   2. Mueva el control deslizante de 'min' y 'max' en cada eje para determinar la región de interés y pulse 'Aceptar'. Se mostrarán los parámetros del cuadro delimitador.
      NOTA: El cuadro delimitador contendrá todo dentro dela caja verde que se recubrió con una capa de color magenta transparente.
2. basado en el contenido Multiview Fusión
   NOTA: fusión multiview basado en contenido ²¹ realiza las diferencias de calidad de imagen más de la pila (es decir, degradación de la señal en z) en cuenta y se aplica pesos más altos para una mejor calidad de imagen en lugar de utilizar un simple promedio.
   1. Seleccione el punto (s) de tiempo que debe ser fusionado en el 'ViewSetup Explorer ", haga clic derecho y seleccione' fusión de imágenes / Deconvolución '.
   2. En la ventana de fusión de imágenes, seleccione 'de la media ponderada de fusión' desde el menú desplegable, y seleccione 'utilizar cuadro delimitador predefinido para el cuadro delimitador'. Para la salida de la imagen fusionada seleccione 'anexar al proyecto XML actual', que escribe nuevos archivos HDF5 a los archivos ya existentes hdf5 y permite el uso de los puntos de vista no fusionadas registradas y la imagen fusionada juntos. Presiona OK'.
   3. Luego, en el "Pre-definir cuadro delimitador & #39; ventana emergente seleccione el nombre del cuadro de límite previamente definido y pulse 'Aceptar'.
   4. Respeto de los parámetros del cuadro delimitador en la siguiente ventana. Para la fusión rápida, aplicar un muestreo hacia abajo en el conjunto de datos fusionado.
      NOTA: Si la pila fusionado está por encima de un cierto tamaño, el programa recomienda el uso de una forma más eficiente de la memoria 'containe'r ImageLib2. Cambie de 'ArrayImg' a los 'PlanarImg (imágenes grandes, fáciles de visualizar) o CellImg (imágenes grandes)' de contenedores, que permiten el procesamiento de datos más grandes. De lo contrario usar los ajustes predefinidos y aplicar 'la fusión y mezcla basada en el contenido'. Continúe pulsando "OK".
   5. Observe la configuración HDF5 en la siguiente ventana. Utilice los parámetros predefinidos e iniciar el proceso de fusión. Asegúrese de que Fiji ha asignado suficiente memoria en Editar> Opciones> Memoria y Temas.
3. Multiview deconvolución
   NOTA: Multiview Deconvolución ³¹ es anotsu tipo de fusión de múltiples vistas. Aquí, además, a la fusión, la PSF del sistema de imagen se tiene en cuenta con el fin de deconvoluir la resolución de imagen y el rendimiento aumentado y el contraste de la señal (en comparación en la Figura 2C-J, la Figura 5 y la película 3).
   1. Seleccione el punto (s) de tiempo para ser deconvolved, haga clic derecho y pulse 'fusión de imágenes / Deconvolución'.
   2. Seleccione 'Multiview Deconvolución' y el uso 'del cuadro de límite predefinido y anexar al proyecto XML actual'. Seleccione el cuadro de límite y continuar.
      NOTA: Los parámetros predefinidos para la deconvolución son un buen punto de partida. Para el primer uso de prueba '20 iteraciones 'y evaluar el impacto de la deconvolución utilizando el "modo de depuración". Por último establecer el cómputo en el 512 x 512 x 512 bloques.
   3. En la siguiente ventana, utilice los ajustes predefinidos. En la opción 'modo de depuración "para mostrar los resultados de todos los' 5 iteraciones '.
      NOTA: La salida de la deconvolución es datos de 32 bits, sin embargo el BigDataViewer actualmente sólo admite datos de 16 bits. Con el fin de añadir la salida de la deconvolución para el conjunto de datos hdf5 existente, que tiene que ser convertido en 16 bits.
   4. Para la conversión, ejecute 'Use min / max de la primera imagen (podría saturar intensidades en el tiempo)'.
      NOTA: La deconvolución continuación, se iniciará mediante la carga de las imágenes y prepararlos para la deconvolución.
4. BigDataServer
   1. Con el fin de compartir la gran XML / HDF5 conjuntos de datos utilizan el servidor http BigDataServer ^33. Una introducción a cómo configurar y conectar al servidor de este tipo se puede encontrar en http://fiji.sc/BigDataServer.
   2. Para conectarse a un BigDataServer existente abierta Fiji> Plugins> BigDataViewer> BrowseBigDataServer.
   3. Introduce la URL que incluye el puerto en la ventana.
      NOTA: Las películas que se describen en esta publicación son accesibles a través de este anunciovestido: http://opticcup.mpi-cbg.de:8085
   4. Observar una ventana que permite seleccionar las películas disponibles. Haga doble clic para abrir la ventana BigDataViewer y ver los datos como se ha descrito anteriormente.

Complementario: Lista de comprobación del material necesario antes de

• embriones de pez cebra / larvas expresan proteínas fluorescentes (Mantener los embriones en el medio E3 pez cebra sin el azul de metileno. Para los estadios mayores de 24 hr contrarrestan la pigmentación mediante la adición de la PTU a una concentración final de 0,2 mM).
• estereoscopio fluorescente
• capilares (volumen de 20 l, con un punto negro) y los émbolos apropiados (No vuelva a utilizar los capilares. Los émbolos, por el contrario, pueden ser reutilizados por varios experimentos.)
• Tubos de 1,5 ml de plástico
• pinzas cortantes
• vidrio (pulidas al fuego) o pipetas de plástico (plástico se puede utilizar durante 24 horas y embriones de más edad)
• vidrio o placas de plástico de 60 mm de diámetro (de plástico puede serutilizado durante 24 horas y embriones de más edad)
• dos vasos de precipitados de 100 ml
• jeringa de 50 ml Luer-Lock con manguera de extensión de 150 cm para perfusión (La manguera y la jeringa debe mantenerse completamente secas entre experimentos para evitar la contaminación por microorganismos.)
• arcilla de moldear
• bajo punto de fusión (LMP) de agarosa
• Medio (NaCl 5 mM, KCl 0,17 mM, 0,33 mM CaCl _2, 0,33 mM MgSO ₄₎ E3
• MS-222 (Tricaína)
• feniltiourea (PTU)
• microesferas fluorescentes (aquí se hace referencia como perlas)
• la doble H ₂ O destilada _(ddH2O)

Representative Results

LSFM es un método ideal para obtener imágenes de los procesos de desarrollo a través de escalas. Varias aplicaciones se compilan aquí que muestra imágenes a corto y largo plazo de las estructuras intracelulares, así como células y tejidos enteros. Estos ejemplos también demuestran que LSFM es una herramienta útil en diversas etapas de desarrollo de los ojos de la formación de copa óptica de la neurogénesis en la retina. Película 1 sirve como una ilustración de la orientación general LSFM, primero que muestra una vista ampliada de un embrión intacto en el la incrustación de cilindro de agarosa en campo claro y más tarde que muestra una vista detallada de la retina en el canal de fluorescencia.

Película 1:. LSFM de la retina del pez cebra Para ilustrar el enfoque LSFM, esta película muestra por primera vez en el campo claro que el embrión se forma la imagen intacta dentro de la unagarose cilindro antes de cambiar a la fluorescencia. Más adelante se muestra que el gran campo de visión permite la observación de toda la retina. A continuación, la película muestra una pequeña región ampliada de la retina para destacar la buena resolución subcelular. Un Ath5: diferencia-GFP ³⁷ embrión de pez cebra transgénico se utilizó para la imagen. Este transgén etiquetas de diferentes neuronas en la retina (principalmente células ganglionares y precursores fotorreceptoras). La parte de la fluorescencia de la película fue capturado como un único punto de vista de grabación con iluminación de doble cara mediante el objetivo 40X / 1.0 W con intervalos de 5 minutos. Se muestra la proyección de intensidad máxima de un grueso volumen de 30 micras. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Película 2 demuestra, cómo los eventos intracelulares muy rápidas se pueden capturar con alta resolución; en este caso el crecimiento de los microtúbulos ensu plus termina en las células progenitoras neuronales de la retina. La información contenida en la película permite el seguimiento y cuantificación de los microtúbulos más extremo crecimiento.

Película 2:. Dinámica de los microtúbulos en una sola célula Esta película capta cada vez más consejos de microtúbulos marcados por la punta, más proteína marcadora EB3-GFP ^38. La proteína se expresa en una única célula progenitora de la retina. Los microtúbulos están creciendo predominantemente en la dirección de apical a basal (de arriba abajo). La velocidad media de los cometas EB3 se midió como 0,28 ± 0,05 m / seg. El punto brillante en la parte apical de la célula que presenta actividad de nucleación de microtúbulos alta es el centrosoma. El embrión de tipo salvaje fue inyectado con Hsp70: plásmido ADN EB3-GFP. La película fue adquirido 4 horas después del choque de calor (15 minutos a 37 ° C) en alrededor de 28 fertiliz hrpostación (HPF) como una sola grabación con iluminación a una cara vista usando los intervalos de tiempo objetiva y 1 seg 63X / 1.0 W. La célula solo fue recortada a partir de un campo de visión que cubre la mayor parte de la retina. La intensidad máxima se muestra la proyección de dos rebanadas. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

La figura 3 muestra, cómo las estructuras intracelulares pueden ser seguidos durante muchas horas. Aquí, el centrosoma en la translocación de las células ganglionares de la retina (CGR) es capturado.

Figura 3:. Localización Centrosoma durante la translocación de células ganglionares de la retina Este montaje de un experimento de lapso de tiempo muestra la posición del centrosoma durante toda la maduración de las células ganglionares de la retina (RGC).En los progenitores neuronales del centrosoma se localiza en la punta del proceso apical (1:00). Durante la división celular, los dos centrosomas sirven como postes para el huso mitótico (2:25). Esta división da lugar a una célula hija que se diferencia en una de las CGR y una segunda célula hija que se convierte en un precursor de las células fotorreceptoras. Después de la división, el cuerpo celular de la RGC se transloca a la parte basal de la retina, mientras que el proceso apical permanece unido en el lado apical. Una vez que el RGC alcanza la parte basal, su proceso apical y se separa el centrosoma viaja con él (6:15). El centrosoma se puede seguir mientras se retrae gradualmente junto con el proceso apical (6:50, 7:20, 8:10). En el último cuadro (08:55) las células ganglionares está creciendo un axón de su parte basal, mientras que el centrosoma está aún localizada apicalmente. El mosaico de expresión se logró mediante la inyección de plásmido ADN en embriones de tipo salvaje en una etapa de células. Las células se visualizaron mediante la Ath5: GFP-CAAX (verde) constRUCT, que las etiquetas de las CGR y otras neuronas. Los centrosomas (puntas de flecha) son etiquetados por ^Centrin-29 tdTomato expresión (magenta). El lado apical de la retina es en la parte superior de la imagen y el lado basal en la parte inferior. Se muestra la proyección de intensidad máxima de un grueso volumen de 30 micras. Las imágenes fueron recortadas de una película que cubre toda la retina. La película comienza en alrededor de 34 horas después de la fecundación (HPF). Una pila z fue adquirido cada 5 min con el objetivo de 40X / 1,0 W. El tiempo se muestra en el formato hh: mm. La barra de escala representa 10 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En la Figura 4 se muestra, cómo el comportamiento de una sola célula se puede extraer de los datos de captura de todo el tejido, tal como en la película 1. Translocación de un RGC puede ser fácilmente rastreado y su proceso apical y basalES seguidos.

Figura 4:. Translocación de una sola célula ganglionar de la retina La translocación RGC de apical a lado basal de la retina se produce después de la mitosis terminal como se describe en la Figura 3 La RGC está marcado por la expresión de la Ath5:. GAP-GFP ³⁷ transgén. Se muestra la proyección de intensidad máxima de un grueso volumen de 30 micras. Las imágenes fueron recortadas de una película que cubre toda la retina. La película comienza en alrededor de 34 HPF. Una pila z fue adquirido cada 5 min con el objetivo de 40X / 1,0 W. El tiempo se muestra en el formato hh: mm. La barra de escala representa 5 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La Figura 5 demuestra la capacidad de LSFM multiview para capturar tejido scprocesos morfogenéticos Ale con celulares de resolución en el ejemplo de la morfogénesis copa óptica, durante el cual vesícula óptica se transforma en una copa óptica. La calidad de la imagen se puede mejorar enormemente por imágenes multivista, cuando la imagen final se combina de la información de 5 puntos de vista diferentes (en este caso) en una pila de z con la resolución isotrópica. Esta figura ilustra la mejora en la calidad de la imagen después de la fusión promedio ponderado y más ganancia en la imagen de contraste y resolución después de deconvolución multivista. La figura muestra dos rebanadas ópticos en diferentes orientaciones a través del conjunto de datos. Además, un montaje del conjunto de datos deconvolved muestra la morfogénesis copa óptica con el tiempo. Todos los tiempos se muestran a continuación en la película 3.

Figura 5: Comparación de la calidad de imagen entre visión única y dos métodos de MultiVoie fusión. (A) Una rebanada óptica de datos de vista individuales que se muestran desde la vista lateral y (B) vista dorsal. artefactos de banda y la degradación de la señal más profundo dentro de la muestra son evidentes. También una parte de la imagen visible en los datos fusionados (CF) no fue capturado en esta vista particular. (C) El mismo corte óptico, ahora como datos multiview fusionado muestran desde la vista lateral y (D) vista dorsal. Tenga en cuenta que los artefactos de la raya y se suprimen las estructuras profundas en la muestra están mejor resueltos. (E) El mismo corte óptico ahora como multiview deconvolved datos que se muestran desde la vista lateral y (F) vista dorsal. Tenga en cuenta el aumento del contraste y resolución para las membranas de las células individuales y los núcleos pueden ser bien distinguida. La resolución no se deteriora notablemente más profundo dentro de la muestra. El conjunto de datos fue adquirido con la iluminación de dos caras a partir de 5 puntos de vista de aproximadamente 20 grados. Las pilas de z abfuera 100 m con 1,5 micras tamaño de paso se adquirieron en cada vista en intervalos de 10 min durante 10 horas con el objetivo 20X / 1,0 W. imágenes de entrada para la fusión multiview y deconvolución se muestrearon abajo 2 × para acelerar el procesamiento de imágenes. se llevaron a cabo 15 iteraciones de la deconvolución de múltiples vistas. (G) El montaje muestra un área recortada de la vista dorsal partir de los datos deconvolved para resaltar los eventos morfogenéticos durante el desarrollo del ojo temprano de la vesícula óptica a la etapa de copa óptica. Las dos capas de la vesícula óptica, que son epitelios columnar inicialmente similares, se diferencian en las poblaciones de células distintas. La capa distal cerca de la epidermis se convierte en el neuroepitelio de la retina (RN) y la capa proximal cerca del tubo neural se convierte en el epitelio pigmentario de la retina (RP). Las células en la alargado RN y invaginate para formar la copa óptica (1:40-5:00); al mismo tiempo, las células se aplanan RP. El ectodermo de superficie es inducida para formar una lente (01:40), whinvagina ich tarde (5:00). La película empieza a las 17 HPF. El tiempo se muestra en el formato hh: mm. Todas las membranas celulares son etiquetados por la β-actina: transgén ras-GFP y todos los núcleos están etiquetados por la Hsp70: H2B-RFP transgén. La barra de escala representa 30 micras. FB cerebro anterior, la lente LE, OP placoda olfativa, RN neuroepitelio de la retina, el epitelio pigmentario de la retina RP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Película 3: Óptica taza de morfogénesis muestra con vista única y dos métodos de fusión multiview La película de lapso de tiempo ilustra el proceso completo de la morfogénesis copa óptica de la vesícula óptica a la etapa de copa óptica.. Muestra una sola rebanada óptica de la vista lateral (arriba) y una sola rebanada óptica de la vista dorsal (parte inferior). Las células de la vesícula óptica en desarrollo experimentan reordenamientos complejos para formar finalmente la copa óptica hemisférica con el neuroepitelio retiniana interna y el epitelio pigmentario de la retina externa. Una lente se forma a partir del ectodermo superficie. Se invagina junto con el neuroepitelio y se sienta en la copa óptica. Todas las membranas celulares se etiquetan mediante la expresión de la β-actina: GFP-ras transgén (verde) y los núcleos se etiquetan con Hsp70: H2B-RFP (magenta). La película comienza en alrededor de 17 HPF. El conjunto de datos fue adquirido con la iluminación de doble cara a partir de 5 puntos de vista de aproximadamente 20 grados de separación y az pilas de alrededor de 100 micras fueron adquiridas cada 10 minutos con el objetivo 20X / 1.0 W. El tiempo se muestra en el formato hh: mm. La barra de escala representa 50 micras. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

1. Los pasos críticos y reparación para la adquisición de datos

Los ajustes de imagen típicos para una GFP y RFP que expresan muestra se pueden encontrar en la Tabla 3. En la configuración del microscopio se describe la lámina de luz es estática, formada por una lente cilíndrica. Los dos objetivos de iluminación son lentes de aire y el objetivo es la detección de una lente de inmersión en agua. Zoom 1,0 con 20X / 1.0 o 40X / 1.0 objetivos da 230 nm y 115 nm de tamaño de píxel y un campo de visión de 441 x 441 micras o 221 x 221 micras, respectivamente. Se recomienda utilizar el espesor de la lámina de luz por defecto con el centro a frontera relación de 1: 2. Para 20X / 1.0 este espesor corresponde a 4,5 micras y 40X / 1,0 a 3,2 micras en el centro. Si la velocidad de formación de imágenes no es la prioridad principal, utilice pistas separadas en caso de una muestra multicolor para evitar la diafonía de la emisión de fluorescencia entre los canales. La velocidad más alta de la adquisición está limitada a 50 ms por z paso por elvelocidad de movimiento de la z-conductor. Si el objetivo es lograr la velocidad máxima de formación de imágenes en el caso de, por ejemplo, dos pistas con iluminación doble cara, el tiempo de exposición se deben establecer de modo que la suma de todas las imágenes tomadas por z paso es inferior a 50 ms. Por otro lado, si sólo una única imagen se adquiere por z paso, no es beneficiosa para establecer el tiempo de exposición más corto que 50 ms.

tamaño de la imagen 1920 x 1920

16-bit

Pivote de análisis bajo

iluminación de doble cara con la fusión en línea

10X objetivo / 0,2 iluminación

20X / 1.0 W Plan-Apocromático objetivo de detección

Pista 1: Excitación 488 nm típicamente 2% de 100 mW láser, 550 nm filtro de emisión SP

Pista 2: Excitación 561 nm normalmente de 3% del láser 75 mW, 58filtro de emisión LP 5 nm

Tiempo de exposición hasta 100 mseg

espesor pila Z 50 a 100 micras

1-1,5 micras tamaño de paso z z en el modo de accionamiento continuo

La incubación a 28,5 ° C

Tabla 3: Proyección de imagen Configuración.

La inspección de la muestra después del experimento

Es importante asegurarse de que la muestra es todavía saludable al final del experimento. En una primera lectura, comprobar el latido del corazón de la muestra en un estereoscopio. Con un par de pinzas cortantes la muestra se puede sacar de la agarosa y se trasladó a la incubadora para desarrollar aún más con el fin de comprobar si se ve afectada por la formación de imágenes. Alternativamente, se puede fijar para la tinción de anticuerpos.

El montaje y la deriva

Es esencial para mantener la osmolaridad de la cámara sOlution cerca de la osmolaridad de la agarosa incrustación, de lo contrario inflamación / encogimiento de la agarosa y la posterior inestabilidad de que ocurrirá la muestra. Por lo tanto, utilizar la misma solución (E3 medio sin el azul de metileno) para llenar la cámara y preparar las alícuotas de bajo punto de fusión punto de agarosa al 1%. Además, no deje que la agarosa en el bloque de calentamiento de 70 ° C durante más de 2 horas, ya que puede perder sus propiedades gelificantes.

No incrustar el pescado en agarosa demasiado caliente, ya que esto puede conducir a la respuesta de choque térmico o la muerte del embrión. Si no está seguro sobre el efecto de agarosa caliente en los embriones, compruebe que la cola no se dobla y que la frecuencia cardíaca no ralentiza. Si esto ocurre, utilizar un embrión diferente para el experimento.

Mantenga la longitud total de la columna de agarosa con la muestra corto (alrededor de 2 cm) y montar el pez cebra con su cabeza orientada hacia la punta del émbolo. Del mismo modo, el cilindro de agarosa extruye a partir de la capillary debe ser lo más corto posible. Estas medidas garantizar la estabilidad de la muestra a lo largo de la película. Al mismo tiempo, la columna de agarosa debe ser lo suficientemente largo como para que el propio capilar de vidrio no llega a la trayectoria de la luz, ya que esto causaría gran refracción y reflexión.

La deriva inicial de la muestra está causado por los cambios de volumen de la propia cilindro de agarosa. Deslizante del émbolo no es la razón para ello. Por lo tanto, no ayuda a solucionar el émbolo con plastilina o esmalte de uñas. El embrión podría cambiar su posición durante la película debido a su crecimiento natural también. Por consiguiente, es aconsejable para centrar la región de interés en el centro del campo de vista y tener algo de espacio en los bordes para adaptarse a estos movimientos.

Reducción de la cantidad de medio de inclusión en la trayectoria luminosa

La orientación de la muestra correctamente ayuda a conseguir la mejor calidad de imagen posible ^15. Generally, la excitación y la emisión de luz debe viajar a través menor cantidad de tejido y de los medios de montaje como sea posible. La solución óptima es un montaje libre de agarosa. Esto se logró por ejemplo en una configuración para imágenes Arabidopsis raíz lateral ^14, en la que la raíz principal se montó en fitagel y las raíces laterales fueron posteriormente deja de crecer hacia fuera de la columna de gel completamente. Montaje sin agarosa también se desarrolló para obtener imágenes de la embriogénesis completa de Tribolium escarabajo durante dos días ^12. mejora de la calidad de la imagen no era una motivación primaria en ese caso. embriones Tribolium simplemente no sobreviven dentro de la agarosa tiempo suficiente. Un montaje sin medios absolutamente incrustación no se ha logrado para la imagen a largo plazo en el pez cebra. Aún así, podemos aprovechar el hecho de que cuando se solidifica la agarosa, la mayoría de los embriones se colocan en diagonal en el capilar con un ojo, situada en pleno agarosa y el segundo ojo de estar cerca de la superficie de la columna de la incrustación. Tque el ojo más cerca de la superficie proporciona una calidad de imagen superior y por lo tanto debe ser reflejado preferentemente.

la concentración de agarosa y de imagen a largo plazo

La concentración de agarosa para el montaje es un compromiso entre la estabilidad de la muestra y la posibilidad de acomodar el crecimiento del embrión y la difusión de oxígeno a la misma. No hay ganancia adicional en la estabilidad de la muestra utilizando las concentraciones de agarosa superiores al 1%. Como punto de partida para la optimización de los experimentos se recomienda 0,6% de agarosa, que también es adecuado para los embriones más jóvenes que 24 HPF que son demasiado delicado para ser montado en 1% de agarosa. Para anestesiar embriones de más edad y larvas, la concentración de MS-222 puede ser elevado a 200 mg / ml sin efectos secundarios ^13.

En el caso de los embriones en desarrollo se crean imágenes durante más de ± 12 horas, no se recomienda el montaje de agarosa, ya que restringe el crecimiento del embrión y causes la deformación de la cola. Este problema fue resuelto por el pez cebra mediante el montaje de los embriones en tubos de polímero FEP con índice de refracción similar al agua ^13,39. Los embriones de ratón, por otra parte, se pueden inmovilizar en cilindros de agarosa hueco ⁴⁰ o en los agujeros de una varilla de acrílico unida a una jeringa ^41. el montaje de tubo FEP no se recomienda como método por defecto, sin embargo, debido a que la pared del tubo refracta la luz un poco más de agarosa.

la alineación de lámina de luz

Para una buena calidad de imagen es fundamental para llevar a cabo la alineación automática de lámina de luz antes de cada experimento. Sobre todo si se han cambiado los ajustes de zoom, se tomaron los objetivos, o un líquido diferente se utilizó en la cámara.

Iluminación

La exploración de giro de la hoja de la luz siempre debe ser activado. Para especímenes grandes de dispersión, es necesario aplicar la iluminación doble cara con f líneausion para lograr una iluminación uniforme en todo el campo de visión. iluminación de doble cara también disminuye un problema específico de la formación de imágenes del ojo, que es la refracción de la lámina de luz entrante por la lente del embrión. Más pequeño, menos muestras de dispersión se pueden obtener imágenes de manera eficiente el uso de la iluminación de una sola cara, lo que reduce el tiempo de formación de imágenes por medio y puede resultar en un poco mejor calidad de imagen en comparación con la iluminación doble cara. Esto es porque las trayectorias de la luz para los dos brazos de iluminación son siempre diferentes y el más eficiente puede ser elegido. Además, las dos láminas de luz procedentes de cada lado nunca son perfectamente en un plano, lo que hace que leve desenfoque después de la fusión. Para eventos intracelulares muy rápidos, como los microtúbulos en crecimiento (Película 2), la iluminación de doble cara no es adecuada, ya que las imágenes con la iluminación de la izquierda y la derecha se adquieren de forma secuencial, lo que podría resultar en el desenfoque de movimiento.

photobleachingy fototoxicidad

Menos photobleaching fluoróforo se menciona a menudo como una de las principales ventajas de la LSFM. Podríamos argumentar que el objetivo debe ser no photobleaching en absoluto. Si hay photobleaching notable en el experimento de formación de imágenes en vivo, la muestra es probable que ya fuera de su rango fisiológico de la exposición al láser tolerada. Cuando imágenes de los embriones de pez cebra en el microscopio de disco giratorio, en nuestra experiencia, alta fototoxicidad puede detener el desarrollo del embrión, incluso antes de que los blanqueadores fluorescentes de señal notablemente. Por lo tanto, la configuración de imagen en el LSFM deben ajustarse de modo que se observa poco o ningún photobleaching. A pesar de que LSFM es suave para la muestra, es prudente utilizar sólo la cantidad de tiempo de la potencia del láser y la exposición, según sea necesario para lograr una relación de señal a ruido suficiente para el subsiguiente análisis de datos.

Z-pila, intervalos de tiempo y tamaño de los datos

Los archivos generados por LSFM suelen ser muy grandes; a veces en el rango terabyte. A menudo es necesario para hacer un compromiso entre calidad de imagen y tamaño de los datos. Este es particularmente el caso para z espacio de la pila y los intervalos en las adquisiciones de lapso de tiempo. Para definir los intervalos z, el botón óptima en la pestaña de herramienta Z-pila ideal sería que se utiliza, sobre todo si el conjunto de datos se deconvolved más tarde. Se calcula la distancia para alcanzar el 50% de solapamiento entre las rebanadas ópticos vecinos. Sin embargo, los intervalos de z algo más grandes son generalmente aceptables. Reducen el tiempo necesario para adquirir la pila z, así como el tamaño del archivo final. El muestreo de tiempo óptimo depende del proceso de interés. Para la vista en general el desarrollo intervalos de 5-10 min son generalmente aceptables. Si algunas estructuras han de ser rastreado de forma automática, los puntos de tiempo posteriores deben ser suficientemente similares.

perlas fluorescentes

perlas fluorescentes sirven principalmente como marcadores fiduciales para el registro de diferentes puntos de vistade un conjunto de datos de múltiples vistas sobre la otra. Siempre agite las soluciones de talón a fondo antes de su uso. No calentar los granos ya que esto puede conducir a la pérdida del colorante fluorescente. La concentración óptima del grano para el registro multiview tiene que determinarse experimentalmente. El plug-in se ha descrito funciona mejor con alrededor de 1.000 cuentas detectadas a través de cada punto de vista. Más grandes (500 nm o 1000 nm) perlas se detectan con mayor fuerza de perlas (de menos de 500 nm) más pequeños. Esto es porque los granos más grandes son más brillantes y son más fáciles de segmento sin detecciones de falsos positivos de estructuras en la muestra. La desventaja de las perlas más grandes es que son muy prominente en la imagen fusionada y deconvolved final. Para cada nuevo marcador fluorescente, el tamaño de grano apropiado y emisión de fluorescencia tienen que ser optimizada. Para dar un ejemplo de muestra de la Figura 5 y la película 3, 100 bolas verdes de emisión nm dieron demasiadas falsas detecciones positivas en el canal de membrana-GFP, pero 1.000 nm perlas de emisión de color rojo se detectaron con fuerza en el canal H2B-RFP con muy pocas detecciones positivas dentro de la muestra. Si la detección del grano falla en el canal con el marcador fluorescente, un canal separado solamente contiene perlas puede ser adquirida, pero esto no es muy práctico. Las perlas de tamaño sub-resolución dan una lectura directa de la función de dispersión de punto (PSF) del microscopio, que puede ser utilizado para la deconvolución (Figura 2C-D). Si el registro y la fusión funciona mejor con los granos más grandes (por ejemplo, 1000 nm), una imagen separada de la PSF se puede adquirir con el sub-resolución, por ejemplo, 100 nm perlas. El uso de granos multicolores es útil durante el registro de la adquisición de múltiples canales y de verificar que la superposición de canales perfectamente.

La adición de perlas fluorescentes no es necesaria cuando se generan imágenes de una sola vista sin registro multiview posterior y la fusión. Sin embargo, incluso en aquellos casos en los granos pueden ser útiles durante el initial ajuste de lámina de luz para comprobar la calidad de la hoja de la luz y, en general, para revelar las aberraciones ópticas. Tales aberraciones ópticas pueden provenir de diversas fuentes como objetivos dañados o sucios, ventanas sucias de la cámara o de la falta de homogeneidad en la agarosa. Cuentas también se pueden utilizar para la corrección de la deriva por el registro de múltiples vistas Fiji plug-in ^20.

Multiview

Para los fines de reconstrucción multiview, es mejor para adquirir un número impar de vistas 3, 5 y así sucesivamente, que no se oponen entre sí. Esto mejora la deconvolución desde los PSF se crean imágenes desde diferentes direcciones. También es importante confirmar al comienzo de la adquisición de lapso de tiempo que existe suficiente superposición entre las vistas. Esto se hace mejor empíricamente, es decir, lo que confirma que las opiniones de inmediato en el primer punto de tiempo se pueden registrar con éxito. Cuando el objetivo de la adquisición multiview es aumentar la resoluciónde una imagen de un espécimen grande de dispersión, no es aconsejable imagen completa de la muestra en cada vista, pero para detener alrededor del centro de la muestra, donde la señal se deteriora. La adquisición de baja calidad a partir de la segunda mitad de la muestra no añadiría información útil para la reconstrucción de múltiples vistas.

2. Los pasos críticos y reparación para el procesamiento de datos

En la actualidad, existen varias posibilidades para el procesamiento de datos de un microscopio multivisión de lámina de luz que están bien documentadas y relativamente fácil de adoptar. Utilizamos la aplicación de reconstrucción de múltiples vistas, que es un software de código abierto implementado en Fiji ³² (Stephan Preibisch inédito, Enlace 1a y Link1b en la Lista de Materiales). Este plugin es un importante rediseño del plugin de registro SPIM ²⁰ anterior, revisadopor Schmied et. al ^42, la integración de la BigDataViewer y su formato XML y HDF5 ³³ con el flujo de trabajo de registro SPIM (Figura 1B, Enlace 2 , Enlace 3 ). Esta aplicación puede ser también adaptado para cluster de computación de alto rendimiento, lo que acelera significativamente el procesamiento de ^43. Esta solicitud de registro multiview se desarrolla de forma activa más allá y sigue mejorando. En caso de problemas o peticiones de características para el software que se describe, por favor presentar problemas en las páginas respectivas de GitHub ( Enlace 4 de Multiview la Reconstrucción y el enlace 5 para BigDataViewer).

La segunda opción es utilizar el software comercial disponible junto con el microscopio. Esta solución funciona bien y da empleo el mismo principio de la utilización de perlas fluorescentes para registrar los diferentes puntos de vista. Sin embargo, carece de la opción de visualizar todo el conjunto de datos rápida como con la BigDataViewer. También el software no se puede adaptar a la agrupación y, además, los bloques de procesamiento del microscopio para otros usuarios, a menos que se compra licencia adicional para el software.

La tercera opción, que es también un software de código abierto, ha sido publicado recientemente por el laboratorio Keller ⁴⁴ y proporciona un marco global para el procesamiento y análisis de aguas abajo de los datos de la hoja de luz. Este software está utilizando información desde dentro de la muestra para llevar a cabo la fusión multiview, por lo tanto, no requiere la presencia de perlas fluorescentes alrededor de la muestra. Pero, al mismo tiempo que asume la orientación ortogonal de los puntos de vista de formación de imágenes (objetivos), por lo que no se puede utilizar para los datos adquiridos de ángulos arbitrarios ^44.

Requisitos de hardware

ntent "> El hardware utilizado para el procesamiento puede ser encontrado en la Tabla 4. Tiene que haber suficiente capacidad de almacenamiento y una tubería clara para el procesamiento de los datos disponibles, por delante del experimento real. La adquisición de las imágenes es más rápido que el análisis posterior y es fácil a inundarse con los datos sin procesar. a menudo es poco realista para almacenar todas las imágenes en bruto, sino más bien un recorte o imágenes procesadas como vistas fusionadas, proyecciones de máxima intensidad o proyecciones esféricas ^45.

Procesador	Dos procesador Intel Xeon E5-2630 (Six Core, 2,30 GHz Turbo, 15 MB, 7,2 GT / s)
Memoria	128 GB (16 × 8 GB) de 1600 MHz DDR3 ECC RDIMM
Disco duro	4 × 4 TB Serial ATA de 3,5 pulgadas (7.200 rpm) de disco duro
controlador de disco duro	PERC H310 SATA / SAS de Concontrolador para Dell Precision
Configuración del disco duro	C1 SATA de 3,5 pulgadas, 1-4 unidades de disco duro
Gráficos	Dual 2 GB Quadro 4000 (2 cartas w / DP 2 y 1 DVI-I cada uno) (2 DP-DVI y 2 adaptador DVI-VGA) (MRGA17H)
Red	Tarjeta de interfaz de red Intel X520-T2 de doble puerto 10 GbE

Tabla 4: Requisitos de hardware.

la velocidad de procesamiento de datos

El tiempo necesario para el procesamiento de datos depende de las dimensiones de los datos y del hardware utilizado. En la Tabla 1, se proporciona un resumen del tiempo requerido para las etapas clave en el procesamiento de un ejemplo 8,6 GB de datos de múltiples vistas que consistía en 1 punto temporal con 4 puntos de vista y 2 canales.

procesamiento step	Hora	Protocolo de paso
Vuelva a guardar como HDF5	6 min 30 seg	6.3
Detectar Puntos de interés	20 sec	6.4
Regístrese utilizando puntos de interés	3 seg	sesenta y cinco
multiview fusión basada en el contenido	4 horas	7.2
deconvolución Multiview (CPU)	8 hr	7.3
deconvolución Multiview (GPU)	2 horas	7.3

Tabla 1: Datos Tiempo de procesamiento.

formatos de datos de entrada para la reconstrucción multiview

El Plugin Multiview Reconstrucción Fiji puede soportar .czi, .tif y formatos ome.tiff. Debido a la estructura de datos del formato de .czi, conjuntos de datos no son discontinuosapoyado sin tratamiento previo. Discontinua significa que la grabación tuvo que ser renovadas (por ejemplo, volver a ajustar las posiciones debido a la deriva de la muestra). En este caso, los archivos .czi necesitan volver a guardar como .tif. Para .tif cada vista y dirección de la iluminación tiene que ser guardado como un archivo separado.

La calibración del tamaño de píxel

El software microscopio de operación calcula la calibración para el tamaño xy pixel basado en el objetivo seleccionado. Sin embargo, el tamaño de píxel en z se define de forma independiente por el tamaño del paso. Si se especifica un objetivo equivocado en el software de la xy al cociente z es incorrecta y el registro fallará.

El registro inicial

Después de definir el conjunto de datos el número de registros será 1 y el número de puntos de interés será 0 en el Explorador de ViewSetup. El registro inicial representa la calibración del conjunto de datos. Tanto el número of registros y puntos de interés aumentarán durante el procesamiento.

El muestreo para la detección de puntos de interés

El uso de abajo de muestreo se recomienda, ya que la carga de los archivos y la segmentación será mucho más rápido. Sin embargo, es importante tener en cuenta que los parámetros de detección cambiará en función de la toma de muestras abajo, transfiriendo así la configuración de detección entre los diferentes ajustes de muestra abajo no es posible.

La detección de puntos de interés

Es aconsejable segmento de tantas perlas verdaderas como sea posible en cada vista, incluso al precio de la obtención de algunas detecciones de falsos positivos, debido a que no obstaculicen el registro considerablemente. detecciones falsas, si pocos en número, se excluyen durante el registro (Consulte Registro de puntos de interés). Sin embargo, las detecciones de falsos positivos masivas plantean un problema con el algoritmo. No sólo reduce el rendimiento para la detección yel registro, ya que toma mucho más tiempo para segmentar la imagen, así como comparar estas perlas entre los puntos de vista, sino que también reduce la exactitud del registro. Esto puede ser abordado mediante el uso de parámetros de detección más estrictas. Además, durante la segmentación de las perlas (es decir, múltiples detecciones en un único cordón Figura 1E) es perjudicial para el registro y debe ser evitado.

El registro de puntos de interés

Para registrar los puntos de vista sobre la otra, la ubicación de cada perla en cada vista se describe por su posición con respecto a sus tres vecinos más cercanos perlas. Estas constelaciones están formando un descriptor geométrica local y permiten la comparación de cada perla entre los puntos de vista. Perlas a juego con el descriptor entre dos puntos de vista son, por consiguiente correspondencias candidatos. Tenga en cuenta que esto sólo funciona para los granos distribuidos al azar, para lo cual los descriptores locales suelen ser único para cada cuenta.Uno puede usar otras estructuras tales como núcleos de la muestra para el registro. Sin embargo, con el fin de detectar los núcleos, que se distribuyen al azar no en la muestra, otros métodos se aplican ^20,21.

Las correspondencias candidatos se prueban contra RANSAC ³⁶ con el fin de excluir falsos positivos. Cada correspondencia sugiere un modelo de transformación para superponer los puntos de vista sobre la otra. correspondencias verdaderas probablemente estarían de acuerdo en un modelo de transformación, mientras que los valores atípicos haría cada punto a otro diferente. Los verdaderos correspondencias se utilizan entonces para calcular un modelo de transformación afín entre las dos vistas en comparación. Una optimización global con un algoritmo de optimización iterativo se lleva a cabo entonces, durante el cual todos los puntos de vista están registrados en la primera vista con el objetivo de desplazamiento mínimo entre las vistas de ^20,21.

el registro de lapso de tiempo

Debido a moverción del movimiento motor de agarosa e impreciso de la platina del microscopio, la posición de cada pila varía moderadamente con el tiempo. Mientras que el registro del punto de tiempo individual elimina la diferencia entre los puntos de vista de este punto de tiempo, el lapso de tiempo también tiene que ser registrado como un todo. Con este fin, cada punto de tiempo individual se ha registrado en el punto de tiempo de referencia.

Punto de referencia temporal

Si se procesa una serie de tiempo con muchos puntos de tiempo, un punto de tiempo representativo se selecciona como referencia por lo general desde la mitad de la serie de tiempo ya que las intensidades de talón pueden degradar con el tiempo debido a la decoloración. En esta referencia, los parámetros para la detección de puntos de interés, el registro, el cuadro delimitador y la fusión se puede determinar. Estos parámetros se aplican a todo el lapso de tiempo para calcular un modelo de transformación específico para cada punto de tiempo individual. Durante el registro de lapso de tiempo todos los otros puntos temporales también son registEred espacialmente en este momento el punto de referencia. De este modo los parámetros del cuadro delimitador para toda la grabación dependen de este punto de tiempo específico.

registro multicanal

Cuando la formación de imágenes de múltiples canales, idealmente las mismas perlas fluorescentes deben ser visibles en todos los canales de imágenes. La detección y el registro a continuación se pueden realizar en cada canal de forma individual, que tiene en cuenta la influencia de las diferentes longitudes de onda de luz en la transformación. A menudo esto no es posible, debido a que los granos no son visibles en todos los canales o las perlas están dominando demasiado la imagen en un canal y son demasiado tenue en el otro canal (s). La solución típica es utilizar granos visibles sólo en un canal para la detección y el registro y el modelo de transformación adquirida (es decir, después de la detección, el registro y el registro de lapso de tiempo) se aplica luego a los otros canales por Fiji> Plugins> Multiview Reconstrucción> Procesamiento por lotes> Herramientas> Duplicar Transformaciones. En el menú desplegable para Aplicar transformación de seleccione un canal a otros canales. En la siguiente ventana seleccione el archivo XML y haga clic en OK. A continuación, seleccione el canal que contiene las perlas como Canal de origen y de destino como canal de seleccionar el canal (s) sin granos. Para Duplicar los cuales utilizan transformaciones Reemplazar todas las transformaciones y pulse OK. Las transformaciones se copian a todos los otros canales y se guardan en el archivo XML. Para ver las nuevas transformaciones en el Explorador de ViewSetup, reinicie la aplicación Reconstrucción MultiView.

Cuadro delimitador

La fusión de múltiples puntos de vista es computacionalmente muy intensivo. Sin embargo, grandes imágenes se adquieren para acomodar no sólo la muestra, sino también las perlas de alrededor de ella. Una vez que el parámetro de registros se extraen de los granos, que ya no son útiles como parte de la imagen. Por lo tanto, para aumentar la eficacia de la fusión, sólo las partes de las pilas de imágenes que contienen la muestra deben ser fusionados. Una región de interés (cuadro delimitador) debe definirse para contener la muestra y tan poco de la agarosa circundante como sea posible. Para el ejemplo de la Figura 2 una fusión medio ponderado de todo el volumen con el de 2229 × 2136 × 2106 px requeriría 38,196 MB de RAM, mientras que con un cuadro de límite del volumen se reduce al de 1634 × 1746 × 1632 px y se reducen los requisitos de memoria a 17,729 MB.

multiview fusión basada en el contenido

El reto de la fusión de datos de múltiples vistas es que los puntos de vista por lo general terminan abruptamente y no contienen la misma calidad de imagen para las mismas voxels. un simple promedio de los puntos de vista sería, por tanto, dar lugar a artefactos de mezcla y degradación de la imagen innecesaria. basado en el contenido fu multiview Sion toma ambos problemas en cuenta. En primer lugar, se mezcla los diferentes puntos de vista, donde una imagen termina y comienza el otro y en segundo lugar, se evalúa la calidad de la imagen local y aplica un mayor peso a una mayor calidad de imagen en la fusión ^21. En comparación con un solo punto de vista no es una mejora de la resolución en z con una ligera degradación de la señal en xy (Figura 2E-H, la Figura 5A-D).

deconvolución Multiview

deconvolución Multiview es otro enfoque para conseguir la fusión de los puntos de vista. Con este método también los PSFs de las diferentes vistas se tienen en cuenta con el fin de recuperar la imagen que ha sido convolucionada por la óptica del microscopio. Este método mejora drásticamente la calidad de imagen mediante la eliminación de borrosidad de la imagen y el aumento de la resolución y el contraste de la señal ³¹ (Figura 2C-D, Figura 2I-J, Figura 5E-G, Película 3).

ve_content "> deconvolución es computacionalmente muy intensiva (ver Tabla 1), por lo tanto con una GPU para el procesamiento aumenta la velocidad de este proceso. También puede ser necesario realizar la deconvolución de los datos de muestreo reducido. Para muestra abajo, utilizar Reconstrucción Fiji> Multiview > Procesamiento por lotes> Herramientas> aplicar transformaciones. Esto se aplicará un nuevo modelo de transformación en las opiniones que se guardarán en el archivo .xml.

formato de archivo para HDF5 BigDataViewer y BigDataServer

El BigDataViewer ³³ permite una fácil visualización de los datos de terabytes. Cómo controlar el BigDataViewer se resume en la Tabla 2. Un screencast de la operación básica del programa también está disponible como un suplemento en su publicación original ^33. El BigDataViewer se centra en un archivo .xml, que contiene los metadatos, y un archivo hdf5, que contiene los datos de la imagen. Los datos de imagen son present en el hdf5 en múltiples niveles de resolución en 3D bloques. Los múltiples niveles de resolución permiten la visualización de los datos más rápido con menor resolución, antes de la resolución completa está cargado. Los bloques individuales sólo se cargan en la memoria cuando sea necesario. Por lo tanto, el formato de imagen hdf5 permite la visualización directa y rápida de los datos a través del BigDataViewer ^33. También acelera el procesamiento ya que la carga de los archivos se lleva a cabo de manera más eficiente. Por lo tanto, se recomienda volver a guardar el conjunto de datos en este formato, aunque no es estrictamente necesario para el procesamiento. Para una explicación más detallada del formato de datos, por favor refiérase a Link 3 . Además, los conjuntos de datos pueden ser compartidos con colaboradores o al público mediante el BigDataServer ³³ ( Enlace 6 ).

efecto

llave
F1	muestra la Ayuda con una breve descripción de la BigDataViewer y su funcionamiento básico
<> O la rueda del ratón	movimiento en z
flechas arriba y abajo	acercar y alejar
botón derecho del ratón y arrastre	mueve la muestra en el visor
clic izquierdo y arrastre	gira en torno a la muestra el cursor
control deslizante en la parte inferior del visor o el tabulador y la flecha hacia la izquierda o hacia la derecha	mueve en el eje de tiempo
además, presionando shift	un movimiento más rápido o rotación a lo largo de cualquier eje
x y luego la flecha izquierda y derecha	gira alrededor del eje x
flecha Y y luego a la izquierda y la derecha	gira alrededor del eje Y
z y luego a la izquierda y flecha derecha	gira alrededor del eje z
turno y x	orienta la vista a lo largo del eje x
turno ey	orienta la vista a lo largo del eje Y
turno y z	orienta la vista a lo largo del eje z
yo	Cambia entre los diferentes modos de interpolación (es decir vecino más cercano) y trilineales
s o Ajustes> Brillo y contraste	modifica el color de los canales, brillo y contraste
F6 o Configuración> Visibilidad y agrupación	cambia los grupos que se muestran, permite agrupar a la superposición de diferentes grupos y llamando a los grupos a través de las teclas numéricas
F10 o Herramientas> grabación de película	adquiere una serie temporal de la división mostrada en ese momento

Tabla 2: Big visor de datos.

3. Limitaciones de la aplicación descrita de LSFM

bajo rendimiento

En un experimento típico LSFM solamente se forma la imagen de una muestra por experimento. Aún así, en nuestra experiencia, una gran cantidad de información útil puede extraerse de esa sola muestra. Formación de imágenes de alto rendimiento de múltiples embriones se ha logrado recientemente en casa construida configuraciones LSFM ^46-48, aunque normalmente a costa de la libertad de posicionamiento de la muestra y la rotación.

Insuficiente penetración profunda en los tejidos

A pesar de embriones de pez cebra son transparentes, la calidad de la imagen obtenida se deteriora rápidamente cuando se generan imágenes más profundo en el tejido debido a la dispersión y absorción. Parcialmente esto es un efecto de dispersión y absorción de la fluorescencia emitida por la muestra y no se puede corregir en la configuración actual. Otra fuente de la calidad de imagen uniforme es la iluminación irregular. Tél lámina de luz incide desde el lado izquierdo o derecho y cualesquiera objetos en su camino refractar, lo que da lugar a artefactos de la raya y la falta de definición. La iluminación y multivista de doble cara de fusión puede disminuir los artefactos en la imagen final. Por último, la calidad de la imagen tiende a ser ligeramente peor hacia el margen del campo de visión debido a la geometría natural de la lámina de luz, que es cada vez más gruesa hacia los bordes.

manipulación química limitada

El uso de fármacos o inhibidores está muy extendido en la investigación de pez cebra. En este uso del microscopio de fármacos se ve limitado, debido a la gran volumen de la cámara de muestras y las consideraciones de otros usuarios del instrumento, que comparten la misma cámara. El uso de una cámara adicional dedicado a experimentos con drogas puede resolver este problema. Llenado de la cámara parcialmente con perlas de vidrio reduce el volumen de líquido que se requiere.

sin photomanipulation

Currently no hay posibilidad de manipulación óptica localizada como fotoconversión, o ablación por láser en este microscopio. Sin embargo, las configuraciones de casa construida se pueden utilizar para tales aplicaciones específicas.

4. Las solicitudes de significación y futuras

LSFM es el mejor método disponible hasta la fecha para imágenes rápidas de grandes volúmenes de embriones vivos. La mayoría de los experimentos concebibles en un microscopio confocal también se puede realizar en un microscopio de lámina de luz con las ventajas antes mencionadas. En el caso de obtención de imágenes de desarrollo del ojo, la velocidad de LSFM no es el parámetro crucial. En cambio, la baja fototoxicidad y la flexibilidad en el posicionamiento de la muestra son las ventajas decisivas.

Los datos LSFM tienen una alta SNR, que ayuda a lograr buenos resultados de deconvolución y también es beneficioso para el análisis automatizado de imágenes y seguimiento de objetos. En conclusión, LSFM es una gran herramienta para la generación de datos cuantificables sobre el desarrollo embrionario y overall celular y las características del tejido para el modelado subsiguiente y descripciones físicas de los procesos en cuestión.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lightsheet Z.1 microscope	Carl Zeiss Microscopy
Low melting point agarose	Roth	6351.1
Low melting point agarose	Sigma	A4018 or A9414
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB/MS-222/Tricaine)	Sigma	E10521
N-Phenylthiourea (PTU)	Sigma	P7629
500 nm red fluorescent beads F-Y 050	Millipore (Estapor)	80380495
20 μl (1 mm inner diameter, marked black) capilllaries	Brand	701904	sold as spare part for transferpettor
Teflon tip plungers for 20 μl capillaries	Brand	701932	sold as spare part for transferpettor
Circular glass coverslips diameter 18 mm, selected thickness 0.17 mm	Thermo scientific (Menzel-Glaser)
O-rings for chamber windows 17×1.5 mm	Carl Zeiss Microscopy
Tweezers, style 55	Dumont	0209-55-PO
50 ml Luer-Lock syringes	Becton Dickinson	300865
150 cm extension cable for infusion compatible with Luer-Lock syringes	Becton Dickinson	397400
Links
Link 1 Multiview reconstruction application			https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration http://fiji.sc/Multiview-Reconstruction
Link 2 BigDataViewer			https://github.com/bigdataviewer
Link 3 BigDataViewer			http://fiji.sc/BigDataViewer
Link 4 Multiview reconstruction application-issues			https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration/issues
Link 5 BigDataViewer-issues			https://github.com/bigdataviewer/bigdataviewer_fiji/issues
Link 6 BigDataServer			http://fiji.sc/BigDataServer