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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

Mit Lichtblatt Fluoreszenzmikroskopie Bild Zebrabärbling Augenentwicklung

Published: April 10, 2016 doi: 10.3791/53966
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1,2,3, 1
1Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics, 2HHMI Janelia Research Campus, 3Berlin Institute of Medical Systems Biology of the Max Delbrück Center
* These authors contributed equally

Introduction

Morphogenese ist der Prozess, den Embryo und zusammen mit Wachstums- und Differenzierungsformen treibt die Ontogenese aus einer befruchteten Eizelle zu einem reifen vielzelligen Organismus. Die morphogenetischen Prozesse während der Entwicklung der Tiere können durch die Abbildung von intakten lebenden Proben 1-3 analysiert am besten. Dies ist, weil eine solche ganze embryo Abbildungs ​​bewahrt alle Komponenten, die Entwicklung, einschließlich Gradienten von Signalmolekülen, extrazelluläre Matrix, Gefßsystem, Innervation sowie mechanischen Eigenschaften des umgebenden Gewebes treiben und zu regeln. Um die Skalen überbrücken, an der Morphogenese auftritt, haben die schnellen subzelluläre Ereignisse auf eine Minute Zeitskala im Zusammenhang mit der Entwicklung des gesamten Gewebes über Stunden oder Tage erfasst werden. Um all diese Anforderungen zu erfüllen, eine moderne Umsetzung 4 der orthogonalen Ebene Beleuchtung Mikroskop 5 wurde entwickelt. Ursprünglich war es das Selective Plane Illumination Microscopy (SPI benanntM) 4; nun eine allumfassende Begriff Lichtblatt Fluoreszenzmikroskopie (LSFM) wird in der Regel eingesetzt. LSFM ermöglicht Bildgebung mit hoher Zeitauflösung, während Induktion weniger als Phototoxizität Laser - Scanning oder Drehscheiben - konfokale Mikroskope 6,7. Heutzutage gibt es bereits viele Implementierungen der Grundlichtbogen Beleuchtungsprinzip , und es hat 8-11 eine Vielzahl von Proben und Verfahren zur Bild bisher unzugänglichen Forscher verwendet.

Wir würden zunächst einige wesentliche Vorteile von LSFM gegenüber herkömmlichen konfokalen Mikroskopie Ansätze hervorheben:

Um aussagekräftige Ergebnisse aus Live-Bildgebung mikroskopische Experimente zu erwerben, ist es wichtig, dass die Beobachtung nur minimal die Probe beeinflusst. Allerdings sind viele Organismen Zebrabärbling einschließlich sehr anfällig für Laserlicht ausgesetzt werden, ist es schwierig zu Bild machen sie in einem konfokalen Mikroskop mit hoher Zeitauflösung ohne Phototoxizität effekte wie ins Stocken geraten oder Entwicklung 6,7 verzögert. LSFM ist derzeit der Fluoreszenz - Imaging - Technik mit den am wenigsten störenden Auswirkungen auf die Probe 7. Da das dünne Blech Laserlicht nur den Teil der Probe beleuchtet, die zu einem bestimmten Zeitpunkt abgebildet wird, ist das Lichtblatt-Mikroskop Photonen sehr effizient zu nutzen. Folglich ermöglicht die geringe Lichtbelastung für längere Zeitraffer Beobachtungen von gesünderen Proben, zB 17.12. Darüber hinaus dank der minimalen Invasivität LSFM, die Anzahl der erfassten Bilder wird nicht mehr durch diktiert, wie viel Licht die Probe tolerieren kann, sondern durch, wie viele Daten verarbeitet und gespeichert werden.

In die gleiche Richtung von der Probe in der Nähe von physiologischen Bedingungen zu halten, kommt LSFM mit alternativen Probenmontagestrategien gut geeignet für Live-Embryonen. In LSFM Techniken werden die Embryonen typischerweise innerhalb einer dünnen Säule von niedrigen Prozentsatz Agarose eingebettet. Die mounting in Agarose Zylindern ermöglicht die vollständige Rotationsfreiheit, so kann die Probe aus dem perfekten Winkel beobachtet werden (in LSFM als Ansicht bezeichnet) und aus mehreren Ansichten gleichzeitig. Die Multi-View-Bildgebung und die anschließende Multi-View-Fusion ist von Vorteil, besonders für große, Verstreuen Proben und ermöglicht es ihnen, mit hohen, isotropen Auflösung zu erfassen. Eine Zusammenfassung der anderen möglichen LSFM Montagestrategien können im offiziellen Mikroskop Betriebsanleitung zu finden, in dem Kapitel über die Vorbereitung durch das Labor von E. Reynaud geschrieben Probe. Es ist eine Lese empfohlen, insbesondere wenn das Ziel zur Bild verschiedenen Proben als hier beschrieben.

Die Bilderfassung in LSFM ist weites Feld, kamerabasierte, als konfokales Mikroskop zu Laser-Scanning-Gegensatz. Dies führt zu einem höheren Signal-zu-Rausch-Verhältnis (SNR) für die erfassten Bilder und können sehr schnell (zehn bis hundert Bilder pro Sekunde) betragen. Die hohe Empfindlichkeit von LSFM ermöglicht eine weitere Abbildung von schwach fluoreszierenden samples, wie Transkriptionsfaktoren an die endogenen Spiegel 18 zum Ausdruck gebracht oder in naher Zukunft, endogenen Proteinen unter Verwendung von CRISPR / Cas9 markiert. Die hohe SNR ist auch wichtig für eine erfolgreiche nachgeschalteter Bildanalyse. Die hohe Geschwindigkeit ist nicht erforderlich, nur eine schnelle intrazelluläre Vorgänge zu erfassen, sondern auch auf Bild, um das gesamte Embryo aus mehreren Ansichten schnell genug. Eine nahtlose Verschmelzung der mehreren Ansichten kann nur erreicht werden, wenn das beobachtete Phänomen während der Erfassung dieser verschiedenen z-Stacks nicht aus getrennten Ansichten kommenden ändern.

Die Vorteile der LSFM typischerweise nicht auf Kosten der Bildqualität kommen. Die laterale Auflösung von LSFM ist etwas schlechter als die Auflösung eines konfokalen Mikroskops. Dies liegt daran, die Erkennungsziele in LSFM niedrigeren numerischen Apertur verwendet (in der Regel 1,0 oder weniger) im Vergleich zu 1,2-1,3 Wasser oder Silizium Tauchziele auf Standard-konfokalen Setups. Zusätzlich aufgrund der breiten Felderkennung in LSFM (Absence eines Pinholes), gibt es mehr out-of-focus Licht im Vergleich zu einem konfokalen Mikroskop. Die Menge an out-of-focus Licht wird durch die Lichtbogendicke bestimmt. Dennoch werden diese Nachteile durch die höhere SNR in LSFM kompensiert. In der Praxis führt dies in ähnlicher Qualität Bilder im Vergleich zu beispielsweise sich drehende Scheibe konfokalen Nahme 15. Folglich ermöglicht diese zuverlässige Extraktion von Merkmalen wie Zellmembranen oder Zellkerne, beispielsweise für die Zelllinie 15,19 Tracing.

Die axiale Auflösung von LSFM bestimmt wird, zusätzlich zu dem Erfassungsziel, durch die Lichtbogendicke. Die axiale Auflösung von LSFM kann in einigen Fällen übertreffen die Auflösung der konfokalen Mikroskope. Zuerst kommt die Verbesserung der Auflösung, wenn die Lichtbogen dünner als die axiale Auflösung des Detektionsziel ist, die typischerweise für große Proben mit geringer Vergrößerung Ziel abgebildet auftritt. Der zweite Weg, wie die LSFM ach kannIEVE bessere axiale Auflösung ist die Multi-View-Fusion, bei der die hohe xy Auflösung von Informationen aus verschiedenen Ansichten in einem Bildstapel kombiniert wird. Die sich ergebende zusammen Stapel weist eine isotrope Auflösung 20,21 die Werte der Auflösung in der seitlichen Richtung nähern. Die Strategie zur Registrierung der mehrere Ansichten auf einander in diesem Artikel beschrieben wird , basiert auf der Verwendung fluoreszierenden Polystyrol - Kügelchen als Treuhänder in der Agarose eingebettete Marker um die Probe 20,21.

Als Ergebnis der LSFM Kommerzialisierung Diese Technik ist jetzt zu einer breiten Gemeinschaft von Wissenschaftlern 22 zur Verfügung. Daher ist die Motivation, dieses Protokoll zu schreiben diese Technologie zugänglich Entwicklungsbiologen praktische Erfahrung in LSFM fehlt zu machen und diese Wissenschaftler zu erhalten begonnen mit dieser Technologie mit ihren Proben. Unser Protokoll verwendet das kommerzielle Lichtblatt-Mikroskop, das eine vom Konzept her einfach Mikroskop t darstelltHut ist leicht zu bedienen. Wir möchten zusätzlich andere neue Protokolle zu erwähnen , für die Abbildung Zebrabärbling mit selbstgebauten LSFM Setups, die geeignet sein könnten , insbesondere Fragen 23-25 ​​zu beantworten. Ein weiterer Eintrag Option LSFM sind die offenen Plattformen 26,27, die die Open - Access - Prinzipien verwenden Lichtblatt - Mikroskopie zu einer breiteren Gemeinschaft zu bringen. Die Dokumentation sowohl der Hardware als auch die Software-Aspekte können bei http://openspim.org und https://sites.google.com/site/openspinmicroscopy/ finden.

In diesem Protokoll verwenden wir das Teleostier Zebrabärbling als Modellsystem Entwicklungsprozesse mit LSFM zu studieren. Morphogenese des Zebrabärbling Auge ist ein Beispiel, das viele der Vorteile von LSFM unterstreicht. LSFM hat bereits in der Vergangenheit verwendet worden 29,30 Augenentwicklung in Medaka 28 und in Zebrabärbling zu untersuchen. In einem frühen Stadium der Entwicklung des Auges ist es kompliziert, den Embryo richtig für konventionelle Mikroskopie zu orientieren,wird als sperrig yolk nicht der Embryo erlauben, auf der Seite mit dem Auge, das Ziel zu liegen gegenüber. Jedoch mit LSFM in eine Agarose-Säule Befestigungs kann die Probe reproduzierbar positioniert werden. Zusätzlich wird während des Übergangs von Augenblase zur Exkavation Stufe erfährt das Auge Haupt morphogenetic durch Wachstum begleitet Umlagerungen, die eine große z-Stack und einen großen Sichtfeld erfordert die Erfassung. Auch für diese Herausforderungen ist LSFM überlegen gegenüber herkömmlichen konfokalen Bildgebung. Der Prozess der Exkavation Bildung ist dreidimensional, daher ist es schwer, durch Abbilden von einer Ansicht allein zu erfassen und zu visualisieren. Dies macht Multi-View-Bildgebung mit isotropen Auflösung von Vorteil. Nach Augenbecher Bildung, wird die Netzhaut-Laserbelichtung zunehmend empfindlich. Somit ist die geringe Phototoxizität assoziiert mit LSFM ein großer Vorteil für die Langzeitbildgebung.

Hier präsentieren wir ein optimiertes Protokoll für die Bildgebung von ein bis drei Tage alten Zebrafischembryonen einnd Larven mit Schwerpunkt auf der Entwicklung des Auges. Unsere Methode ermöglicht die Aufnahme von Zeitraffer-Filme auf 12-14 h mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung zu verdecken. Wichtig ist, zeigen wir auch eine Pipeline für die Datenverarbeitung, die ein wesentlicher Schritt in LSFM ist, da diese Technik immer große Datensätze erzeugt, die oft im Terabyte-Bereich.

Protocol

HINWEIS: Bei allen Tier Arbeit wurde in Übereinstimmung mit der Europäischen Union (EU) Richtlinie 2011/63 / EU und dem deutschen Tierschutzgesetz durchgeführt. Das Protokoll ist gemeint, ohne Unterbrechung folgen, von der Montage des Probe-Bildgebung. In Abhängigkeit von der praktischen Erfahrung, dauert es 2-3 Stunden ein Zeitraffer-Experiment zu starten. Die Datenverarbeitung erfolgt in dieser Zeit nicht mitgerechnet. Das gesamte Material für das Experiment erforderlich ist, kann in der Checkliste des Materials gefunden werden musste, bevor das als Zusatzdokument vorgesehen ist. Tragen Sie puderfreie Handschuhe während der Stufen 1, 2, 3 und 4 die Schritte 2, 3, 4 und 5 des Protokolls auch auf der offiziellen Mikroskop Bedienungsanleitung entnehmen.

1. Vorbereitende Arbeiten Vor dem Imaging Experiment

  1. Fluorescent Bead-Stammlösung
    1. Für dieses Protokoll mit den 500 oder 1000 nm Durchmesser Polystyrolkügelchen (mit rot emittierenden Fluoreszenzfarbstoff markiert). Die Arbeitsverdünnung der Perlen ist 1: 4,000. Zunächst Wirbel der Wulst-Stammlösung für 1 min. Verdünnen Sie 10 ul Perlen in 990 & mgr; l ddH 2 O. Die Lösung im Dunkeln bei 4 ° C und verwenden Sie diese Verdünnung 1: 100 als Stammlösung zur weiteren Verdünnung in 01.40.
  2. Vorbereiten Lösung für die Probenkammer
    1. In einem 100 ml Becherglas Mischung 38,2 ml E3 Medium ohne Methylenblau, 0,8 ml 10 mM N -phenylthiourea und 1 ml 0,4% MS-222. Es ist vorteilhaft, filtriert E3 Medium zu verwenden, in der Probenkammer schwimmenden kleinen Staubteilchen oder ungelösten Kristalle später zu vermeiden.
  3. Fluoreszierende Fischembryoauswahl
    1. In den Tagen vor dem Versuch, bereiten Embryonen exprimieren fluoreszierende Proteine. Kurz vor dem Experiment sortieren die Embryonen unter dem Fluoreszenz Stereoskop für wünschenswerte Stärke des Fluoreszenzsignals. Nehmen Sie 5-10 gesunde Embryonen und dechorionate sie mit einer Pinzette.
      HINWEIS: Dieses Protokoll ist für 16 bis 72 Stunden alt ist optimiertEmbryonen.

2. Einrichten der Probenkammer

  1. Montage des Drei-Kammer-Fenster
    1. Es sind 4 Fenster in der Probenkammer, eine für das Ziel und drei mit den Deckgläsern (18 mm Durchmesser, Dicke 0,17 mm gewählt) abgedichtet werden. Bewahren Sie diese Deckgläser in 70% Ethanol. Wischen Sie sie sauber vor dem Gebrauch mit Ether: Ethanol (1: 4).
    2. Legen Sie das Deckglas in das Fenster einer feinen Pinzette mit und stellen Sie sicher, dass es in die kleinste Nut passt. Decken Sie sie mit dem 17 mm Durchmesser Gummi-O-Ring und Schraube im Beleuchtungsadapterring mit dem Kammerfenster Werkzeug. Wiederholen Sie den Vorgang für die anderen beiden Fenstern.
  2. Anbringen der Restkammerteile
    1. Schrauben Sie den Adapter für eine entsprechende Ziel in die vierte verbleibende Seite der Kammer. Legen Sie die 15 mm Durchmesser O-Ring in der Mitte des Adapters.
    2. Schrauben Sie in den weißen Luer-Lock-Adapter in die rechte untere Öffnung im chamber und der graue Ablaufstutzen in der linken oberen Öffnung. Blockieren Sie alle drei verbleibenden Öffnungen mit den schwarzen Blindstopfen.
    3. Bringen Sie den Peltier-Block und der Metallschwalbenschwanzführung Boden der Kammer mit einem Inbusschlüssel. Befestigen Sie den Schlauch mit dem 50-ml-Spritze mit dem Luer-Lock-Adapter. Legen Sie die Temperatursonde in die Kammer.
  3. Einsetzen der Ziele und die Kammer in das Mikroskop
    1. Überprüfen Sie unter dem Stereoskop, dass alle Ziele sauber sind. Verwenden Sie die 10X / 0.2 Beleuchtung Ziele und den Plan-Apochromat 20x / 1,0 W Erfassungs Ziel und stellen Sie sicher, dass ihr Brechungsindex Korrekturring auf 1,33 für Wasser gesetzt. Schrauben Sie das Detektionsobjektiv in das Mikroskop, während die Beleuchtung Ziele bedeckt zu halten.
    2. Entfernen Sie die Plastikschutzkappen, die die Beleuchtungs Ziele. Schieben Sie vorsichtig die Kammer in das Mikroskop und ziehen Sie es mit der Befestigungsschraube.
    3. Schließen Sie das Temperaturprofilund das Peltier-Block mit dem Mikroskop.
      HINWEIS: Die beiden Rohre, die die Kühlflüssigkeit für die Peltier-Block kompatibel sind mit beiden Anschlüssen zirkulieren. Sie bilden eine funktionierende Schaltung unabhängig von der Ausrichtung der Verbindung.
    4. Füllen der Kammer durch die Spritze mit der Lösung, hergestellt in Schritt 1.2 bis zum oberen Rand der Kammerfenster. Überprüfen Sie, ob die Kammer undicht.
    5. Starten Sie das Mikroskop, die Inkubation und die Steuer- und Speicher Computern. Starten Sie das Mikroskop-Betriebssoftware und stellen Sie die Inkubationstemperatur auf 28,5 ° C.
      HINWEIS: Es wird 1 Stunde dauern vollständig ausgleichen. Bereiten Sie die Probe in der Zwischenzeit.

3. Probenvorbereitung

  1. Vorbereitung der Agarose Mix
    1. 15 min vor der Agarose-Mix zu machen, in der Schmelze ein 1 ml aliquote Menge von 1% mit niedrigem Schmelzpunkt Agarose (in E3 Medium gelöst) in einem Heizblock auf 70 ° C eingestellt. Nachdem die Agarose vollständig molzehn, Transfer 600 ul in ein frisches 1,5-ml-Röhrchen, 250 ul E3 Medium, 50 ul 0,4% MS-222 und 25 ul verwirbelt Perle Stammlösung hinzufügen.
      ANMERKUNG: Dies macht 925 ul der Mischung, während zusätzliche 75 & mgr; l für die Flüssigkeit später zusammen mit den Embryonen zugegeben wird berechnet.
    2. Halten Sie das Rohr in einem zweiten Heizblock bei 38-40 ° C oder stellen Sie sicher, dass die Agarose zu seinem Gelpunkt sehr nahe ist, bevor die Probe Embryonen in sie setzen.
  2. Montage des Embryos
    1. Nehmen Sie sich fünf Glaskapillaren von 20 & mgr; l Volumen (mit einer schwarzen Markierung, ~ 1 mm Innendurchmesser) und die passenden Teflon Spitze Kolben in sie einfügen. Drücken Sie den Kolben durch die Kapillare, so daß das Teflon Spitze am unteren Ende der Kapillare ist.
    2. Transfer fünf Embryonen (eine Zahl, die auf einmal montiert werden kann) mit einer Glas- oder Kunststoffpipette in das Rohr von verwirbelten 37 ° C warmen Mischung Agarose.
      HINWEIS: Versuchen Sie, eine Mindestmenge an Flüssigkeit zusammen Witz zu übertragenh die Embryonen.
    3. Legen Sie die Kapillare in die Mischung und saugen einen Embryo im Inneren durch den Kolben nach oben ziehen. Stellen Sie sicher, dass der Kopf des Embryos tritt in die Kapillare vor dem Schwanz. Vermeiden Sie Luftblasen zwischen dem Kolben und der Probe. Es sollte über dem Embryo und ± 1 cm darunter ± 2 cm Agarose sein. Wiederholen Sie für die verbleibenden Embryonen.
    4. Warten, bis die Agarose vollständig erstarrt, die in wenigen Minuten passiert, und dann Speichern der Proben in E3 Medium, indem sie an der Wand eines Bechers mit Plastilin oder Klebeband kleben. Die Bodenöffnung der Kapillare sollte in der Lösung frei hängen Gasaustausch zu der Probe ermöglicht wird.
      HINWEIS: Ein ähnliches Protokoll in den Abschnitten 3.1 und 3.2 können auch auf der Wiki-Seite OpenSPIM http://openspim.org/Zebrafish_embryo_sample_preparation finden.

4. Probenpositionierung

  1. Probenhalter Montage
    1. Legen Sie 2 Kunststoffhülsen in der richtigen Größe (schwarz)gegeneinander in die Probenhalterschaft. Ihre Schlitz Seiten haben nach außen zu stellen. Bringen Sie die Klemmschraube lose von 2-3 Runden drehen. Legen Sie die Kapillare durch die Klemmschraube und schieben Sie es durch die Halterung, bis die schwarze Farbe Band auf der anderen Seite sichtbar wird. Vermeiden Sie den Kolben zu berühren.
    2. Ziehen Sie die Klemmschraube. Schieben Sie die überschüssige 1 cm von Agarose unter der Embryo aus der Kapillare und schneiden Sie es. Führen Sie den Stiel in den Probenhalter Scheibe.
    3. Bestätigen Sie in der Software, die die Mikroskoptisch in der Ladeposition ist. Verwenden Sie Führungsschienen den gesamten Halter mit der Probe zu gleiten senkrecht nach unten in das Mikroskop. Drehen Sie es, so dass die magnetischen Haltescheibe einrastet.
  2. Auffinden der Kapillar
    1. Von nun an, steuern die Probenpositionierung durch die Software. Auf der Registerkarte Suchen Sie die Kapillare Option Suchen wählen und die Kapillare in x, y und z in den Fokus knapp oberhalb der Nachweisobjekt positionierenive Linse. Verwenden Sie die grafische Darstellung in der Probe Navigator zur Orientierung.
    2. Schieben Sie den Embryo sanft aus der Kapillare, bis er vor der Pupille des Detektionsobjektivs ist.
      HINWEIS: Die "Locate Kapillare 'ist der einzige Schritt in dem verbleibenden Protokoll, bei dem der obere Deckel des Mikroskops geöffnet werden soll, und die Probe herausgedrückt.
  3. Auffinden der Probe
    1. Wechseln Sie auf 'Suchen Probe', und bei 0,5 Zoom bringen den Zebrabärbling Auge in der Mitte des Sichtfeldes. Drehen Sie den Embryo, so dass das Licht Blatt nicht durch irgendwelche hochbrechenden oder absorbierenden Teile der Probe passieren wird, bevor es das Auge reicht. Ebenso muss die emittierte Fluoreszenz einen freien Weg von der Probe. Klicken Sie auf 'Set Home Position'.
    2. Öffnen Sie die vordere Tür des Mikroskops und setzen die Kunststoffabdeckung mit einem 3-mm-Öffnung auf der Oberseite der Kammer zu vermeiden Verdunstung.
      HINWEIS: Wenn der Flüssigkeitspegel unter fälltdie Bilderzeugungsstufe, wird das Experiment beeinträchtigt.
    3. Überprüfen Sie den Herzschlag des Embryos als Proxy für die allgemeine Gesundheit. Wenn es zu langsam ist, verwenden Sie eine andere Probe (vergleiche nicht montierten Kontrollen, spezifische Werte sind abhängig von Entwicklungsstadium). Wechseln Sie in den endgültigen Zoomeinstellung und korrigieren die Position des Embryos.

5. Einrichten eines Mehrdimensionale Bildaufnahme

  1. Aufnahmeparameter
    1. Wechseln Sie in den "Erwerb" Tab. Definieren Sie den Lichtweg einschließlich Laserlinien, Detektionsobjektiv, Laser-Sperrfilter, Strahlteiler und die Kameras.
    2. Aktivieren Sie die Pivot-Scan-Option. Definieren Sie die anderen Akquisitions Einstellungen wie die Bit-Tiefe, Bildformat, Licht Blechdicke und wählen Sie einseitige Beleuchtung.
    3. Drücken Sie "Continuous" und in Abhängigkeit von der Intensität des erhaltenen Bildes die Zeit Laserleistung und Belichtung der Kamera ändern.
      HINWEIS: Zum Einstellen der alle Abbildungseinstellungen verwenden, less Laserleistung (0,5% von 100 mW Laser, 30 ms Belichtungszeit), als für die eigentliche Experiment unnötige Foto Schäden an der Probe zu vermeiden.
  2. Lichtblatt Adjustment
    1. Wechseln Sie auf die "Dual-Sided Illumination" und die 'Online Dual-Side Fusio'n Checkbox aktivieren. Starten Sie die 'Lightsheet Auto-Adjust-Assistenten ". Folgen Sie den Anweisungen Schritt für Schritt.
      HINWEIS: Der Assistent bewegt das Lichtblatt in die Fokusebene des Detektionsobjektivs, und stellt sicher, dass es nicht gekippt wird und seine Taille ist in der Mitte des Sichtfeldes. Nach der automatischen Anpassung Abschluss werden die Positionen der linken und rechten Lichtbögen automatisch in der Software aktualisiert. Eine Verbesserung der Bildqualität sollte nun offensichtlich sein. Aktivieren Sie die "Z-Stack 'Checkbox.
    2. Überprüfen Sie die Lichtblatt Einstellung durch die Symmetrie der Punktbildfunktion Inspektion (PSF) von den fluoreszierenden Kügelchen in der XZ gegeben und yz ortho-Ansicht. Wenn es nichtt symmetrisch, eine manuelle Einstellung der Lichtbogen Parameter Position nach oben und nach unten , bis eine symmetrische sanduhrförmigen PSF zu erzielen (Abbildung 1A).
  3. Mehrdimensionale Bildaufnahme-Einstellungen
    1. Definieren Sie den Z-Stapel mit den 'First-Scheibe "und" letzte Scheibe "Optionen und stellen Sie die z Schritt bis 1 um.
      HINWEIS: Die Lichtbogen in diesem Mikroskop ist statisch und die z Sektionierung wird durch Bewegen der Probe durch erreicht. Verwenden Sie immer die "Continuous Drive" Option für eine schnellere Aufnahme von Z-Stacks.
    2. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen "Time Series". Definieren die Gesamtzahl von Zeitpunkten und das Intervall zwischen ihnen.
    3. Aktivieren Sie die "Multiview" Checkbox. Fügen Sie die aktuelle Ansicht in die Multi-View-Liste, in der die x, y, z und Winkelinformation gespeichert ist. Verwenden Sie den Stufenregler die Kapillare und definieren Sie die anderen gewünschten Ansichten zu drehen. Stellen Sie einen Z-Stapel in jeder Ansicht und fügen Sie sie in die Multi-View-Liste.
      Beachten Sie dasSoftware sortiert die Ansichten in einer seriellen Art und Weise, so dass die Kapillare unidirektional gedreht wird, während das Bild aufgenommen wird.
  4. Driftkorrektur und Starten des Experiment
    1. Sobald der Erwerb eingerichtet abgeschlossen ist, warten 15-30 Minuten vor dem eigentlichen Experiment zu starten.
      HINWEIS: Die Probe wird zunächst driftet wenige Mikrometer in x, y und z, sollte aber innerhalb von 30 Minuten zu stoppen. Wenn die Probe für länger hält treiben, eine andere Probe oder remount verwenden.
    2. Wechseln Sie auf die 'pflegen' Reiter und im "Streaming" Option festlegen , wie die Daten gespeichert werden sollen, zum Beispiel eine Datei pro Zeitpunkt oder separate Datei für jede Ansicht und Kanal. Zurück zum "Erwerb" Tab, drücken Sie "Start Experiment" und definieren Sie den Dateinamen, Speicherort, an dem sie gespeichert werden soll und das Dateiformat (Verwendung .czi).
    3. Beachten Sie die Erfassung des ersten Zeitpunkt, um zu bestätigen, dass alles einwandfrei läuft. Unmittelbar mit der Registrierung fortfahrenund Verschmelzen des ersten Zeitpunkt, wie in den Schritten 6 und 7 beschrieben wurde, um zu bestätigen, dass es möglich sein wird, die gesamte Datenmenge zu verarbeiten.

6. Multiview- Registrierung

  1. Multiview- Wiederaufbau Anwendung
    1. Am Ende der Bildgebungssitzung, übertragen die Daten von dem Datenspeicher Computer am Mikroskop auf ein Datenverarbeitungscomputer. Verwenden Sie die "Multiview ReconstructionApplication '20,21,31 in Fiji 32 für Datenverarbeitung (1B) umgesetzt.
  2. definieren Sie Dataset
    1. Aktualisieren Fidschi: Fidschi> Hilfe> Update ImageJ und Fidschi> Hilfe> Update Fidschi. Verwenden Sie die wichtigsten ImageJ und Fidschi Update-Sites.
    2. Übertragen Sie den gesamten Datensatz in einem Ordner. Die Ergebnisse und Zwischendateien der Verarbeitung wird in diesem Ordner gespeichert werden. Starten Sie den Multiview Wiederaufbau Anwendung: Fiji> Plugins> Multiview- Wiederaufbau> Multiview Wiederaufbau Anwendung.
    3. Wählen Sie "einen neuen Datensatz definieren". Als Typ des Datensatzes die meu Option "Zeiss Lightsheet Z.1 Dataset (LOCI Bioformats)" wählen und einen Namen für die XML-Datei erstellen. Wählen Sie dann die erste .czi Datei des Datensatzes (dh Datei ohne Index). Es enthält die Bilddaten sowie die Metadaten der Aufnahme.
      HINWEIS: Sobald das Programm die erste .czi Datei öffnet, werden die Metadaten in das Programm geladen.
    4. Bestätigen Sie, dass die Anzahl der Winkel, Kanäle, Illuminationen und beobachten aus den Metadaten der Voxelgröße. Nach dem Drücken von OK beobachten drei separaten Fenster zu öffnen (Abbildung 1C): ein Protokollfenster, zeigt den Fortschritt der Verarbeitung und die Ergebnisse, die "ViewSetup Explorer 'und einer Konsole, zeigt Fehlermeldungen von Fidschi.
      HINWEIS: Die "ViewSetup Explorer" ist eine benutzerfreundliche Oberfläche, die jede Ansicht, Kanal und Beleuchtung zeigt und ermöglicht die Auswahl von die Dateien von Interesse. Zusätzlich erlaubt die "ViewSetup Explorer 'für die Lenkung aller Verarbeitungsschritte.
    5. Wählen Sie die Dateien, die verarbeitet werden müssen, und drücken Sie die rechte Maustaste in den Explorer. Beachten Sie ein Fenster geöffnet mit verschiedenen Verarbeitungsschritte (Abbildung 1C).
    6. Bei den Datensatz zu definieren, beachten Sie, dass eine XML-Datei in den Ordner mit den Daten erstellt wird.
      HINWEIS: Diese Datei enthält die Metadaten, die vor bestätigt wurden.
    7. In der oberen rechten Ecke beobachten zwei Knöpfe 'info' und 'Speichern'. 'Info' drücken, wird eine Zusammenfassung des Inhalts der XML-Datei. Durch Drücken von "Speichern" werden die Verarbeitungsergebnisse speichern.
      HINWEIS: Während der Verarbeitung in der "Multiview Reconstruction Application" müssen die verschiedenen Verarbeitungsschritte in die .xml vor dem Schließen Fidschi gespeichert werden.

OAD / 53966 / 53966fig1.jpg "/>
Abbildung 1: Multiview- Wiederaufbau Workflow und Interesse Punkterkennung (A) Ausrichtung Lichtbogen basierend auf Fluoreszenz Perle Bildgebung.. Das System ist (Mitte) ausgerichtet ist, wenn der Wulst Bild eine symmetrische Sanduhr-Form in xz und yz Vorsprünge. Die Beispiele für falsch ausgerichtete Lichtbogen in beiden Richtungen sind auf der linken und rechten Seite angezeigt. Die maximale Intensität Projektionen einer 500 nm Perle in xz sind yz und xy Achsen gezeigt. Man beachte, dass das Verhältnis der Intensität des zentralen Spitze der Scheibe Airy (in xy) an den Seitenlappen ist größer, wenn die lightsheet korrekt gegenüber dem fehlausgerichteten Lage ausgerichtet ist. Die Bilder wurden mit 0,7-Zoom mit 20X / 1.0 W Ziel genommen. Maßstabsbalken repräsentiert 5 um. (B) Der Datensatz wird definiert und dann erneut gespeichert in das HDF5 Format. Die Perlen sind segmentiert und dann registriert. Für eine Zeitreihe wird jeder Zeitpunkt auf einen Referenzzeitpunkt registriert. Die Daten werden schließlich in einen ankondensiertenSingle isotropen Volumen. (C, oben) Der ViewSetup Explorer zeigt die verschiedenen Zeitpunkte, Winkel, Kanäle und Beleuchtung Seiten des Datensatzes. (C, linke untere Ecke) Das BigDataViewer Fenster die Ansicht zeigt, die in der ViewSetup Explorer ausgewählt ist. (C, Mitte rechts) Rechtsklick in den ViewSetup Explorer öffnet die Verarbeitungsoptionen. (C, rechte untere Ecke) Der Fortschritt und die Ergebnisse der Verarbeitung werden in der Protokolldatei angezeigt. (D und E) Das Ziel der Erkennung ist zu segmentieren , so viele Punkte von Interesse (Perlen) mit so wenig Nachweis in der Probe wie möglich hier Screenshots von der interaktiven Perle Segmentierung gezeigt. (D und E, obere linke Ecke) Die Segmentierung durch zwei Parameter definiert ist, wird die Differenz-of-Gaussian Werte für Sigma 1 und der Schwelle. (D) Ein Beispiel für eine erfolgreiche Detektion mit einer vergrößerten Ansicht eines korrekt erkannt bead. (E) Segmentation mit zu vielen falsch - positive und mehrere Erkennungen von einem einzelnen Kügelchen. Maßstabsbalken in (C) steht für 50 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

  1. Resave Dataset in HDF5 Format
    1. Um den gesamten Datensatz erneut speichern, wählen Sie alle Dateien mit Strg / Apfel + ein und klicken Sie rechts. Wählen Sie dann Resave - Datensatz und als HDF5.
    2. Ein Fenster erscheint eine Warnung angezeigt wird, dass alle Ansichten des aktuellen Datensatzes werden erneut gespeichert werden. Drücken Sie ja.
      HINWEIS: Das Programm wird auch weiterhin die .czi Dateien hdf5 erneut zu speichern, indem sie jede Datei und die Datei speichern, die verschiedenen Auflösungsstufen des hdf5 Format zu öffnen. Es wird mit bestätigen nach Abschluss auf "Fertig". resaving usually dauert ein paar Minuten pro Zeitpunkt (siehe Tabelle 1).
      Hinweis: Da die Dateien im Format hdf5 kann sehr schnell geladen werden, ist es nun möglich, den nicht registrierten Daten-Set von "Rechtsklick" in den Explorer und die Umstellung von "Anzeige in BigDataViewer (on / off)" zu sehen. Ein BigDataViewer Fenster mit der gewählten Ansicht (Abbildung 1C) erscheinen. Die Kernfunktionen des BigDataViewer 33 sind in Tabelle 2 und http://fiji.sc/BigDataViewer erläutert.
  2. Ermitteln Sie Interesse Points
    1. Wählen Sie alle Punkte mit Strg / Apfel + a und Rechtsklick wählen Sie erfassen Interesse Punkte.
    2. Wählen Sie Difference-of-Gaussian 34 für die Art der Verzinsung Punkterkennung. Da der Wulst-basiert Anmeldung benutzt hier, Typ "Perlen" in das Feld für den Etiketten Interesse Punkte. Aktivieren Sie "Downsample Bilder vor der Segmentierung".
    3. Im nächsten Fenster, beobachten die detection Einstellungen. Für "Subpixel - Lokalisierung" Verwendung "3-dimensionale quadratische Anpassung '34 und die Differenz-of-Gaussian Werte und Radius für Korn Segmentierung Verwendung" interaktive "im i'nterest Punkt Spezifikation" zu bestimmen.
    4. Für 'Auflösungsverringerung XY "Verwendung" Spiel Z - Auflösung (weniger Downsampling)' und 'Auflösungsverringerung Z' Verwendung 1 ×. Die z-Schrittgröße größer als die xy Pixelgröße, also einfach nach unten der XY Abtasten der z Auflösung übereinstimmen ausreicht. Wählen Sie 'berechnen auf CPU (JAVA)'. Drücke OK'.
    5. In einem Pop-up-Fenster, wählen Sie eine Ansicht für die Prüfung der Parameter aus dem Dropdown-Menü. Sobald die Ansicht Lasten, die Helligkeit und den Kontrast des Fensters mit Fidschi> Bild> Anpassen> Helligkeit / Kontrast oder Strg + Shift + C Markieren Sie das Kästchen "Look für Maxima (grün) 'für Wulst Erkennung.
    6. Beachten Sie die Segmentierung in der als grüne Ringe 'viewSetup' around die Erfassungen, wenn für Maxima und rot für Minima suchen. Die Segmentierung wird durch zwei Parameter definiert, die Differenz-of-Gaussian Werte für Sigma 1 und der Threshold (1D). Passen sie auf Segment so viele Perlen um die Probe und so wenig falsch positiven Erkennungen innerhalb der Probe wie möglich (Abbildung 1D). Erkennen jeder Wulst nur einmal und nicht mehrfach (Abbildung 1E). Nachdem die optimalen Parameter zu bestimmen, drücken Sie auf "Fertig".
      HINWEIS: Die Erfassung beginnt, indem jede einzelne Ansicht des Zeitpunkts Laden und die Perlen segmentieren. In der Protokolldatei gibt das Programm die Anzahl der Perlen es pro Ansicht erkannt. Die Detektion sollte in wenigen Sekunden (siehe Tabelle 1) durchgeführt werden.
    7. Drücken Sie sparen , wenn die Menge der Erkennungen geeignet ist (600 bis mehrere tausend pro Ansicht).
      HINWEIS: Ein Ordner wird im Datenverzeichnis erstellt werden, was die informatio enthaltenn über die Koordinaten der erfassten Perlen.
  3. Registrieren Sie Interesse Points verwenden
    1. Wählen Sie alle Punkte mit Strg / Apfel + a, rechts klicken und wählen Sie "Register mit Interesse Points '.
    2. Verwenden Sie "schnelle 3D - geometrischen Hashing (Rotation invariant) 'für Wulst Erkennung als" Registrierungsalgorithmus'.
      HINWEIS: Dieser Algorithmus setzt keine Vorkenntnisse über die Ausrichtung und die Positionierung der verschiedenen Ansichten in Bezug zueinander.
    3. Für die Registrierung der Blick auf einander, wählen Sie "Zeitpunkte registrieren einzeln" als "Art der Anmeldung". Für das Interesse der Punkte "in den gewählten Kanal, der zuvor angegebenen Bezeichnung für die interessanten Punkte sollten nun sichtbar (zB" Perlen ") sein.
    4. Im nächsten Fenster, benutzen Sie die voreingestellten Werte für die Registrierung. Befestigen Sie den ersten Blick durch die Auswahl "Fix-Fliesen: Fix erste Kachel und verwenden Sie keine Karte zurück" (verwenden Sie diese Option, wenn tiles sind nicht festgelegt) in der "Karte zurück Fliesen" Abschnitt.
    5. Verwenden Sie ein 'affine Transformation Modell "mit" Regularisierung ".
      HINWEIS: Der zulässige Fehler für RANSAC wird 5px sein und die "Bedeutung für eine Beschreibung Spiel" wird 10. Für "Regularisierung" verwenden, um einen "starren Modell" sein mit einem Lambda von 0,10, was bedeutet, dass die Umwandlung von 10% starr ist und 90 % affine 35. Drücken Sie auf OK , um die Registrierung zu starten.
      HINWEIS: Wie im Log-Fenster angezeigt, zunächst jede Ansicht ist mit allen anderen Ansichten abgestimmt. Dann wird die Stichprobe Konsens (RANSAC) 36 prüft die Korrespondenzen und schließt Fehlalarme. Für eine robuste Anmeldung sollte der RANSAC Wert höher sein als 90%. Wenn eine ausreichende Anzahl von treuen Kandidaten zwischen zwei Ansichten entsprechend gefunden werden, wird ein Transformationsmodell zwischen jedem Spiel mit der durchschnittlichen Verschiebung in Pixel berechnet. Dann wird die iterative globale Optimierung durchgeführt wird und alle Ansichten werden auf der festen Ansicht registriert. Bei erfolgreicher Registrierung wird ein Transformationsmodell mit seiner Skalierung und die Verschiebung in Pixel berechnet und angezeigt. Der durchschnittliche Fehler sollte optimal unter 1 px und die Skalierung der Transformation der Nähe von 1. Die Registrierung in Sekunden ausgeführt wird (siehe Tabelle 1).
    6. Bestätigen Sie, dass es keine Verschiebung zwischen den verschiedenen Ansichten ist wie an feinen Strukturen innerhalb der Probe beobachtet, zB Zellmembranen. Speichern Sie dann die Transformation für jede Ansicht in die XML-Datei.
      HINWEIS: Nun werden die registrierten Ansichten überlappen einander in der BigDataViewer (2A) und die Perle Bilder sollten auch (2B) werden überlagert.
    7. Entfernen Sie die Transformationen, indem Sie rechts die Zeitpunkte auf sie klicken und wählen Sie Transformationen entfernen> Aktuelle / neueste Transformation.

Re 2 "src =" / files / ftp_upload / 53966 / 53966fig2.jpg "/>

Abbildung 2:. Die Ergebnisse der Multi - View - Rekonstruktion (A) Überlagert registrierte Ansichten, die jeweils in einer anderen Farbe , die Überlappung zwischen ihnen zu demonstrieren. (B) vergrößerte Ansicht, die die Überlappung der PSFs von den verschiedenen Ansichten abgebildet Perlen. (C) Schließen Sie oben von einem Wulst nach der Fusion ist die PSF ein Durchschnitt der verschiedenen Ansichten. (D) PSF des gleichen Wulstes , wie in (C) nach dem Mehrfachanzeige Dekonvolution zeigt , daß das PSF in einen einzigen Punkt kollabiert. (E) xy Schnitt und (F) yz Schnitt einer einzelnen Ansicht einer optic Vesikel, in denen Membranen mit GFP zeigt Verschlechterung des Signals in z tiefer in das Gewebe gekennzeichnet sind. (G) xy Schnitt und (H) yz Schnitt derselben Ansicht nach gewichtete durchschnittliche Fusion von 4 Ansichten etwa 20 Grad auseinander mit etwas mehr degraded xy Auflösung insgesamt aber erhöht z-Auflösung. (I) xy Schnitt und (J) yz Abschnitt der gleichen Daten nach dem Mehrfachanzeige Dekonvolution, eine signifikante Erhöhung der Auflösung und den Kontrast des Signals sowohl in xy und z zeigt. Bilder in (EJ) sind einzelne optische Scheiben. Maßstabsbalken entspricht 50 & mgr; m (A, B, EJ) und 10 & mgr; m (C, D). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

  1. Zeitraffer-Registrierung
    1. Wählen Sie den gesamten Zeitablauf der rechten Maustaste und wählen Sie 'Registrieren Interesse Points verwenden ", um die Zeitraffer im Laufe der Zeit zu stabilisieren.
    2. Im "Basic Registration Fenster Parameter wählen Spiel gegen einen Referenzzeitpunkt (keine globale Optimierung) für Art der Anmeldung '. Ke ep t er andere Einstellungen die gleichen wie bei der Registrierung der einzelnen Zeitpunkten.
    3. Im nächstenFenster, den Zeitpunkt aus, die als Referenz verwendet werden, in der Regel zu einem Zeitpunkt in der Mitte der Zeitraffer. Markieren Sie das Kästchen 'betrachten jedem Zeitpunkt als starre Einheit ", da sich die einzelnen Ansichten innerhalb jedem Zeitpunkt sind bereits aufeinander registriert.
    4. Markieren Sie das Kästchen für "anzeigen Zeitreihe Statistiken". Die anderen Registrierungsparameter bleiben nach wie vor die Regularisierung einschließlich. Drücken Sie OK.
      HINWEIS: Im Log-Fenster wird die gleiche Leistung wie in der individuellen Zeitpunkt Registrierung angezeigt. Wenn die Registrierung für die einzelnen Zeitpunkten war erfolgreich und robust, ist die RANSAC jetzt 99-100% und die durchschnittliche, minimale und maximale Fehler ist in der Regel unter 1 px. Speichern Sie diese Registrierung, bevor Sie fortfahren.

7. Multiview- Fusion

HINWEIS: Die resultierenden Transformationen von den Registrierungsschritte werden verwendet, um einen fusionierten isotropen Stapel aus den mehreren Ansichten zu berechnen. Dieser Stapel has Anzahl z Scheiben erhöhte sich im Vergleich zu der ursprünglichen Daten, da der Abstand z nun gleich dem ursprünglichen Pixelgröße in xy ist. Die Fusion kann entweder durch eine inhaltsbasierte Multi - View - Fusion 21,31 oder Bayes-basierte Multi - View - Entfaltungs 31, durchgeführt werden , die sowohl in der Multi - View - Rekonstruktion Anwendung umgesetzt werden.

  1. Bounding Box
    HINWEIS: Fusion ist ein rechenintensiver Prozess (siehe Tabelle 1), wodurch die Datenmenge zu reduzieren durch Definieren eines Begrenzungskastens wesentlich die Verarbeitungsgeschwindigkeit erhöht.
    1. Wählen Sie alle Zeitpunkte kopieren und einfügen definieren 'Bounding Box'. Verwenden Sie 'definieren mit BigDataViewer' und einen Namen für das Begrenzungsfeld wählen.
    2. Bewegen Sie den Regler für "min" und "max" in jeder Achse die Region von Interesse zu bestimmen und dann die Taste "OK". Die Parameter des Begrenzungsrahmens angezeigt.
      HINWEIS: Die Zeichen-Box enthält alles innerhalbdie grüne Box, die mit einer transparenten Magentaschicht überlagert ist.
  2. Inhaltsbasierte Multiview Fusion
    HINWEIS: Content-basierte Multi - View - Fusion 21 nimmt die Bildqualität Unterschiede über den Stapel (dh Verschlechterung des Signals in z) berücksichtigt und gilt höhere Gewichte für eine bessere Bildqualität anstelle einer einfachen Mitteln zu verwenden.
    1. Wählen Sie die Zeitpunkt (e), die in der 'ViewSetup Explorer' fusioniert werden soll, klicken Sie rechts und wählen Sie "Bild Fusion / Entfaltungs '.
    2. Fusion Fenster im Bild wählen "Gewichtete durchschnittliche Fusion" aus dem Dropdown-Menü, und wählen Sie "Verwenden Sie vordefinierte Bounding Box für Bounding Box '. Für die Ausgabe des fusionierten Bildes wählen Sie 'anhängen zu aktuellen XML-Projekt', die neue hdf5 Dateien zu den bereits vorhandenen hdf5 Dateien schreibt und ermöglicht zusammen die registrierten nicht fusionierten Ansichten und das verschmolzene Bild verwenden. Drücke OK'.
    3. Dann in der "Pre-Definition Bounding Box & #39; Pop-up-Fenster den Namen des zuvor definierten Begrenzungsrahmen aus und drücken Sie "OK".
    4. Beachten Sie die Parameter des Begrenzungsrahmens im nächsten Fenster. Für eine schnelle Fusion, tragen Sie eine Downsampling auf dem fusionierten Daten-Set.
      HINWEIS: Wenn das geschmolzene Stapel ab einer bestimmten Größe ist, wird das Programm wird empfohlen, einen Speicher effizient "ImageLib2 containe'r verwenden. Wechseln Sie von 'ArrayImg' zu den 'PlanarImg (große Bilder, einfach anzuzeigen) oder CellImg (große Bilder)' Container, die Verarbeitung größerer Daten ermöglichen. Ansonsten die vordefinierten Einstellungen verwenden und "blending und inhaltsbasierte Fusion 'gelten. Gehen Sie mit "OK" drücken.
    5. Beachten Sie die hdf5 Einstellungen im nächsten Fenster. Verwenden Sie die vordefinierten Parameter und starten Sie den Fusionsprozess. Stellen Sie sicher, dass Fidschi genügend Speicher zugewiesen hat Bearbeiten> Optionen> Speicher & Themen.
  3. Multiview- Entfaltungs
    HINWEIS: Multiview- Entfaltungs 31 anotihre Art von Multi-View-Fusion. Hier zusätzlich zur Fusion, die PSF des Abbildungssystems berücksichtigt wird genommen , um das Bild und die Ausbeute erhöhte Auflösung und den Kontrast des Signals zu entfalten ( im Vergleich in 2C-J, Figur 5 und Movie 3).
    1. Wählen Sie den Zeitpunkt (n) zur entfalteten rechten Maustaste und klicken Sie auf "Bild Fusion / Entfaltungs '.
    2. Wählen Sie "Multiview Deconvolution" und Verwendung "die vordefinierten Begrenzungsrahmen und hängen Sie an den aktuellen XML-Projekt". Wählen Sie den Begrenzungsrahmen und fortzusetzen.
      HINWEIS: Die vordefinierten Parameter für die Entfaltungs sind ein guter Ausgangspunkt. Zum ersten Versuchsanwendung '20 Iterationen 'und die Auswirkungen der Entfaltungs beurteilen durch die Verwendung von "Debug-Modus". Schließlich setzen die Rechen auf in 512 x 512 x 512 Blöcke.
    3. Im nächsten Fenster, benutzen Sie die vordefinierten Einstellungen. Stellen Sie die "Debug-Modus", um die Ergebnisse anzuzeigen jeder '5 iteVerpflegung'.
      HINWEIS: Der Ausgang des Entfaltungs ist 32-Bit-Daten, aber die BigDataViewer unterstützt derzeit nur 16-Bit-Daten. Um die Ausgabe des Dekonvolution zum bestehenden hdf5 Datensatzes anzuhängen, hat sie zu 16-Bit umgewandelt werden.
    4. Für die Umsetzung laufen 'Use min / max des ersten Bildes (möglicherweise Intensitäten im Laufe der Zeit zu sättigen) ".
      HINWEIS: Die Entfaltungs wird dann beginnen, indem Sie die Bilder laden und sie für die Entfaltungs vorbereitet.
  4. BigDataServer
    1. Verwenden , um die sehr große XML / HDF5 Datensätze zu teilen den HTTP - Server BigDataServer 33. Eine Einführung in die Installation, Konfiguration und eine Verbindung zu solchen Server kann bei http://fiji.sc/BigDataServer finden.
    2. Um eine Verbindung zu einem bestehenden BigDataServer offen Fidschi> Plugins> BigDataViewer> BrowseBigDataServer.
    3. Geben Sie die URL mit dem Port in das Fenster.
      HINWEIS: Die Filme in dieser Veröffentlichung beschrieben über diese Anzeige zugänglich sindKleid: http://opticcup.mpi-cbg.de:8085
    4. Beachten Sie ein Fenster, das die verfügbaren Filme ermöglicht die Auswahl. Doppelklicken Sie auf das BigDataViewer Fenster zu öffnen und die Daten anzeigen, wie zuvor beschrieben.

Zusatz: Checkliste für Material vor dem Start benötigt

  • Genaktivität / Larven fluoreszierende Proteine ​​(durch Zugabe von PTU zu einer Endkonzentration von 0,2 mM Halten Sie die Embryonen im Zebrabärbling E3 Medium ohne Methylenblau. Für Stadien älter als 24 Stunden wirken der Pigmentierung.) exprimieren
  • fluoreszierende Stereoskop
  • Kapillaren (20 & mgr; l Volumen, mit einer schwarzen Markierung) und entsprechende Kolben (Sie die Kapillaren nicht wiederverwendet werden. Die Kolben, auf der anderen Seite, kann für mehrere Experimente verwendet werden.)
  • 1,5 ml Kunststoffröhrchen
  • scharfe Pinzette
  • Glas (Feuer poliert) oder Plastikpipetten (Kunststoff kann für 24 Stunden und ältere Embryonen verwendet werden)
  • Glas oder Plastikschalen Durchmesser 60 mm (Kunststoff kann sein24 h und ältere Embryonen verwendet)
  • zwei 100 ml Bechergläsern
  • 50 ml Luer-Lock-Spritze mit 150 cm Verlängerungsschlauch zur Infusion (Schlauch und Spritze sollte vollständig trocken zwischen den Experimenten gehalten werden Kontamination durch Mikroorganismen zu vermeiden.)
  • Plastilin
  • niedrigen Schmelzpunkt (LMP) Agarose
  • E3 Medium (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2, 0,33 mM MgSO 4)
  • MS-222 (Tricaine)
  • Phenylthioharnstoff (PTU)
  • fluoreszierende Mikrokugeln (hier bezeichnet als Kügelchen)
  • doppelt destilliertem H 2 O (ddH 2 O)

Representative Results

LSFM ist eine ideale Methode zur Abbildung von Entwicklungsprozessen über Skalen. Mehrere Anwendungen sind hier zusammengestellt sowohl kurz- als auch langfristige Darstellung von intrazellulären Strukturen, sowie Zellen und ganze Gewebe zeigt. Diese Beispiele zeigen auch , dass LSFM ist ein nützliches Werkzeug in verschiedenen Stadien der Entwicklung des Auges von Exkavation Bildung Neurogenese in der Netzhaut. Film 1 dient als Illustration der allgemeinen LSFM Ansatz, zuerst eine herausgezoomt , um die Ansicht , die eines intakten Embryo in der Agarose Zylinder in Hellfeld- Einbetten und später eine detaillierte Ansicht der Netzhaut im Fluoreszenzkanal zeigt.

Film 1
Film 1:. LSFM der Zebrabärbling Retina des LSFM Ansatz Zur Veranschaulichung dieser Film zeigt zunächst in der Hell- , dass der Embryo in der ein intaktes abgebildet wirdgarose Zylinder vor dem Fluoreszenz wechseln. Später wird gezeigt, daß das große Sichtfeld Beobachtung der gesamten Netzhaut ermöglicht. Als nächstes zeigt der Film einen vergrößerten kleinen Bereich der Netzhaut, die gute subzellulärer Auflösung zu markieren. Ein Ath5: gap-GFP 37 transgenen Zebrafischembryo wurde für die Bildgebung verwendet. Dieses Transgen-Etiketten verschiedene Neuronen in der Netzhaut (hauptsächlich Ganglionzellen und Photoempfänger Grundstoffe). Die Fluoreszenz-Teil des Films wurde als Single-Ansicht mit doppelseitiger Beleuchtung des 40X / 1.0 W-Objektiv mit 5-Minuten-Intervallen mit der Aufnahme erfasst. Die maximale Intensität Projektion eines 30 & mgr; m dicken Band dargestellt. Bitte hier klicken , um diese Datei herunterzuladen.

Movie 2 zeigt, wie sehr schnelle intrazelluläre Ereignisse mit hoher Auflösung erfasst werden; in diesem Fall wird das Wachstum der Mikrotubuli anihre Plus endet in den retinalen neuronalen Vorläuferzellen. Die Informationen in dem Film enthalten kann für das Tracking und Quantifizierung von Mikrotubuli Plus-Ende Wachstum.

Movie 2
Film 2:. Dynamik der Mikrotubuli in einer einzigen Zelle Dieser Film einfängt wachsenden Plus Spitzen durch das Plus - Spitze Markerprotein EB3-GFP 38 markierte Mikrotubuli. Das Protein wird in einer einzelnen Netzhautvorläuferzelle exprimiert. Die Mikrotubuli wachsen vorwiegend in Richtung von apikal nach basal (von oben nach unten). Die Durchschnittsgeschwindigkeit der EB3 Kometen als 0,28 ± 0,05 & mgr; m / sec gemessen. Der helle Fleck an der apikalen Seite der Zelle hoch Mikrotubuli Nukleation Aktivität zeigt die Zentrosom. EB3-GFP-Plasmid-DNA: Das Wildtyp-Embryo wurde mit Hsp70 injiziert. Der Film wurde 4 h nach Hitzeschock erworben (15 min bei 37 ° C) bei etwa 28 hrpost-Düngeration (HPF) als einer einzigen Ansicht mit einseitiger Beleuchtung Aufzeichnung der Intervalle 63X / 1.0 W objektiv und 1 sec Mal verwenden. Die einzelne Zelle wurde aus einem Sichtfeld für die Mehrheit der Netzhaut abgeschnitten. Die maximale Intensitätsprojektion von zwei Scheiben dargestellt. Bitte hier klicken , um diese Datei herunterzuladen.

Abbildung 3 zeigt, wie die intrazelluläre Strukturen können über viele Stunden folgen. Hier wird das Zentrosom retinalen Ganglionzellen in Translokationseinheiten (RGC) erfasst.

Figur 3
Abbildung 3:. Zentrosom Lokalisation während der retinaler Ganglionzellen Translokation Diese Montage eines Zeitraffer-Experiment zeigt die Position des Zentrosom in der gesamten retinaler Ganglionzellen (RGC) Reifung.In den neuronalen Vorläufern wird der Zentrosomen in der Spitze des apikalen Verfahren (01.00) lokalisiert. Während der Zellteilung dienen die beiden Zentrosomen als Pole für die mitotische Spindel (02.25). Diese Aufteilung führt zu einer Tochterzelle, die in ein RGC und eine zweite Tochterzelle unterscheidet, die eine Sehzellen Vorläufer wird. Nach der Teilung transloziert die Zellkörper der RGC auf die basale Seite der Netzhaut, während die apikale Prozess an der apikalen Seite befestigt bleibt. Sobald die RGC die basale Seite erreicht, löst seine apikal Prozess und das Zentrosom reist mit ihm (6,15). Das Zentrosom kann gefolgt werden, während nach und nach mit dem apikal Prozess (06.50, 07.20, 08.10) Einfahren zusammen. Im letzten Rahmen (8.55) die Ganglionzellen ein Axon von seinem basalen Seite wächst, während der Zentrosomen noch apikal lokalisiert ist. Das Mosaik-Expression wurde durch Plasmid-DNA-Injektion in Wildtyp-Embryo in einem Zell-Stadium erreicht. GFP-CAAX (grün) const: Die Zellen werden durch die Ath5 visualisiertein- em, die RGCs und anderen Neuronen Etiketten. Die Zentrosomen (Pfeilspitzen) sind je nach Centrin-tdTomato 29 Ausdruck (magenta) markiert. Der apikalen Seite der Netzhaut ist an der Oberseite des Bildes und der basalen Seite an der Unterseite. Die maximale Intensität Projektion eines 30 & mgr; m dicken Band gezeigt. Die Bilder wurden aus einem Film zugeschnitten, um die gesamte Netzhaut bedeckt. Der Film beginnt bei rund 34 Stunden nach der Befruchtung (HPF). Ein z Stapel wurde alle 5 min mit dem 40X / 1.0 W Ziel erworben. mm: Die Zeit wird im hh. Maßstabsbalken entspricht 10 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Leicht verfolgt und seine apikalen und basalen Prozess werden kann In 4 es angezeigt wird, wie einzelne Zellverhalten von Daten extrahiert werden kann , das ganze Gewebe wie in Movie 1. Translokation eines RGC Erfassunges folgte.

Abbildung 4
Abbildung 4:. Translokation eines einzelnen retinaler Ganglionzellen Die RGC Translokation von apikal basalen Seite der Retina tritt nach dem Anschluss der Mitose wie in Abbildung 3 beschrieben Die RGC durch die Expression des Ath5 markiert ist. Spalt-GFP 37 Transgen. Die maximale Intensität Projektion eines 30 & mgr; m dicken Band gezeigt. Die Bilder wurden aus einem Film zugeschnitten, um die gesamte Netzhaut bedeckt. Der Film beginnt bei rund 34 HPF. Ein z Stapel wurde alle 5 min mit dem 40X / 1.0 W Ziel erworben. mm: Die Zeit wird im hh. Maßstabsbalken entspricht 5 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5 zeigt die Fähigkeit von Multi - View - LSFM zu erfassen Gewebe scAle morphogenetischen Prozesse mit zellulärer Auflösung am Beispiel der Augenbecher Morphogenese, bei der Augenblase in eine Exkavation verwandelt. Die Bildqualität kann erheblich durch Multi-View-Bildgebung verbessert werden, wenn das endgültige Bild von den Informationen aus 5 verschiedenen Ansichten (in diesem Fall) in einem z-Stack mit isotropen Auflösung kombiniert wird. Diese Abbildung zeigt die Verbesserung der Bildqualität nach dem gewichteten Durchschnitt der Fusion und weitere Verstärkung in den Bildkontrast und die Auflösung nach dem Multi-View-Entfaltungs. Die Abbildung zeigt zwei optische Scheiben in unterschiedlichen Orientierungen durch den Datensatz. Zusätzlich ist eine Montage aus dem entfalteten-Datensatz zeigt die Exkavation Morphogenese im Laufe der Zeit. Alle Zeitpunkte werden dann in Movie 3 gezeigt.

Abbildung 5
Abbildung 5: Vergleich der Bildqualität zwischen den einzelnen Ansicht und zwei Methoden der multiview Fusion. (A) Eine optische Scheibe einzigen Ansicht Daten gezeigt von Seitenansicht und (B) dorsale Ansicht. Streifenartefakten und Verschlechterung des Signals tiefer in der Probe sind offensichtlich. Auch ein Teil des Bildes sichtbar in den verschmolzenen Daten (CF) wurde in diesem besonderen Ansicht nicht erfasst. (C) Das gleiche optische Scheibe, die nun als Multi - View - fusionierten Daten aus Seitenansicht gezeigt und (D) dorsale Ansicht. Beachten Sie, dass Streifen Artefakte unterdrückt und Strukturen tief in der Probe vorhanden sind besser gelöst. (E) die gleiche optische Scheibe nun als Multi - View - entfalteten Daten aus Seitenansicht gezeigt und (F) dorsale Ansicht. Beachten Sie die erhöhten Kontrast und Auflösung, so dass die einzelnen Zellmembranen und Kerne können gut unterschieden werden. Die Auflösung verschlechtert sich nicht deutlich tiefer in die Probe. Der Datensatz wurde mit doppelseitiger Beleuchtung von 5 Ansichten erworben auseinander etwa 20 Grad. Die z-Stapel abaus 100 & mgr; m mit 1,5 & mgr; m Schrittgrße wurden mit dem 20X / 1.0 W Ziel 10 Stunden bei jeder Ansicht in 10 min Intervallen erfasst. Eingabebilder für die Multi-View-Fusion und Entfaltungs wurden um 2 × abgetastet, um die Bildverarbeitung zu beschleunigen. 15 Iterationen des Multi-View-Entfaltungs wurden durchgeführt. (G) Die Montage zeigt einen beschnittenen Bereich der dorsalen Ansicht von den entfalteten Daten die morphogenetischen Ereignisse während der frühen Entwicklung des Auges aus der Augenblase in die Augenbecher Bühne zu markieren. Die beiden Schichten des optischen Vesikel, die zunächst ähnliche säulen Epithelien sind, differenzieren sich in verschiedenen Zellpopulationen. Die distale Schicht nahe der Epidermis wird die retinale neuroepithelium (RN) und der proximalen Schicht nahe dem Neuralrohr wird die retinalen Pigmentepithel (RP). Die Zellen in der RN länglichen und invaginate der Augenbecher (1.40 bis 5.00) zu bilden; zugleich flachen die RP-Zellen. Die Oberfläche Ektoderm induziert eine Linse (01.40) zu bilden, which stülpt später (05.00). Der Film beginnt bei 17 HPF. mm: Die Zeit wird im hh. Alle Zellmembranen werden durch den β-Actin-markiertem: ras-GFP-Transgen und alle Kerne gekennzeichnet sind durch die hsp70: H2B-RFP-Transgen. Maßstabsbalken entspricht 30 & mgr; m. FB Vorderhirns, LE - Objektiv, OP olfaktorischen Plakode, RN retinalen neuroepithelium, RP retinalen Pigmentepithel. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Movie 3
Film 3: Augenbecher Morphogenese mit Einzelansicht und zwei Methoden der Multi - View - Fusion gezeigt Die Zeitraffer-Film zeigt den kompletten Prozess der Augenbecher Morphogenese von der Augenblase in die Augenbecher Bühne.. Es zeigt eine einzige optische Scheibe aus der Seitenansicht (oben) und eine einzige optische Scheibe von der dorsalen Ansicht (unten). Die Zellen des sich entwickelnden Augenblase unterziehen komplexe Umlagerungen schließlich mit der inneren retinalen neuroepithelium und äußeren retinalen Pigmentepithel der hemisphärischen Exkavation bilden. Eine Linse wird von der Oberfläche Ektoderm gebildet. Es stülpt mit dem neuroepithelium entlang und sitzt in der Augenbecher. ras-GFP (grün) Transgen und die Kerne sind beschriftet mit hsp70: H2B-RFP (magenta) alle Zellmembranen werden durch die Expression des β-Actin-markiert. Der Film beginnt bei rund 17 HPF. Der Datensatz wurde mit doppelseitiger Beleuchtung von 5 Ansichten erworben etwa 20 Grad auseinander und az Stapel von etwa 100 & mgr; m alle 10 Minuten mit dem 20X / 1.0 W Ziel erworben wurden. mm: Die Zeit wird im hh. Maßstabsbalken entspricht 50 & mgr; m. Bitte hier klicken , um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

1. Kritische Schritte und Problemlösungen für die Datenerfassung

Die typischen Abbildungseinstellungen für ein GFP und RFP Probe exprimiert , kann das Lichtblatt statisch ist , durch eine zylindrische Linse gebildet in Tabelle 3. In dem beschriebenen Mikroskopaufbau gefunden werden. Die beiden Beleuchtungs Ziele sind Luft Linsen und das Detektionsobjektiv ist ein Wassertauchlinse. Zoom 1.0 mit 20x / 1,0 oder 40X / 1.0 Ziele gibt 230 nm und 115 nm Pixelgröße und ein Sichtfeld von 441 x 441 um oder 221 x 221 & mgr; m beziehungsweise. Es wird empfohlen, die Standard-Lichtbogendicke mit Zentrum zu nutzen Verhältnis zur Grenze 1: 2. Für 20X / 1.0 entspricht diese Dicke auf 4,5 & mgr; m und 40X / 1,0 bis 3,2 um in der Mitte. Wenn Abbildungsgeschwindigkeit nicht die primäre Priorität ist, verwenden separate Spuren im Fall einer Mehrfarbenmuster des Übersprechens der Fluoreszenzemission zwischen den Kanälen zu vermeiden. Die höchste Geschwindigkeit des Erwerbs wird durch die auf 50 ms pro z Schritt begrenztdie Geschwindigkeit der Bewegung des z-Treibers. Wenn das Ziel die maximale Abbildungsgeschwindigkeit bei, beispielsweise zu erreichen , ist, zwei Spuren mit doppelseitigen Beleuchtung muss die Belichtungszeit so eingestellt werden, dass die Summe aller aufgenommenen Bilder pro z Stufe unter 50 msec ist. Auf der anderen Seite, wenn nur ein einziges Bild pro z Schritt erfasst wird, ist es nicht von Vorteil, die Belichtungszeit kürzer als 50 msec eingestellt.

1920 x 1920 Bildgröße
16-bit
Pivot-Scan auf
Doppelseitige Beleuchtung mit Hilfe eines Online-Fusion
10X / 0.2 Beleuchtungsobjektiv
20X / 1.0 W Plan-Apochromat Detektionsobjektiv
Track 1: Anregung 488 nm typischerweise 2% von 100 mW Laser, 550 nm SP Emissionsfilter
Track 2: Anregung 561 nm typischerweise 3% von 75 mW Laser, 585 nm LP Emissionsfilter
Die Belichtungszeit bis zu 100 ms
Z Stapeldicke von 50 bis 100 & mgr; m
1-1,5 um z Schrittweite in der kontinuierlichen z Antriebsmodus
Inkubation bei 28,5 ° C

Tabelle 3: Imaging - Einstellungen.

Inspizieren der Probe nach dem Versuch

Es ist wichtig sicherzustellen, dass die Probe am Ende des Versuchs immer noch gesund ist. Als erste Anzeige, überprüfen Sie unter einem Stereoskop den Herzschlag der Probe. Mit einem Paar scharfe Zange kann die Probe der Agarose herausgenommen werden, und zog in den Inkubator zu entwickeln, um weiter zu prüfen, ob es durch die Abbildungs ​​betroffen war. Alternativ kann es für die Antikörper-Färbung fixiert werden.

Montage und Drift

Es ist wichtig, die Osmolarität der Kammer s zu haltenÖSUNG nahe der Osmolarität des Einbettungs Agarose, sonst Schwellung / Schrumpfen der Agarose und nachfolgende Instabilität der Probe auftreten. Daher verwenden die gleiche Lösung (E3 Medium ohne Methylenblau), um die Kammer zu füllen und die 1% mit niedrigem Schmelzpunkt Agarose-Aliquots herzustellen. Darüber hinaus lassen Sie nicht die Agarose in der 70 ° C Heizblock für mehr als 2 Stunden, wie sie ihre Geliereigenschaften verlieren kann.

Nicht die Fische in zu heiß Agarose eingebettet werden, da dies zu Hitzeschockantwort oder den Tod des Embryos führen kann. Wenn Sie sich unsicher über die Wirkung von warmen Agarose auf den Embryonen zu überprüfen, dass der Schwanz nicht biegt und dass die Herzfrequenz nicht verlangsamt. Wenn dies der Fall ist, verwenden einen anderen Embryo für das Experiment.

Halten Sie die Gesamtlänge der Agarose-Säule mit der Probe kurz (ca. 2 cm) und montieren Sie den Zebrabärbling mit seinem Kopf orientiert sich an der Kolbenspitze. Ebenso extrudiert die Agarose Zylinder von der capillary sollte so kurz wie möglich gehalten werden. Durch diese Maßnahmen wird die Stabilität der Probe während des Films gewährleisten. Zur gleichen Zeit muss die Agarose-Säule lang genug sein, so dass die Glaskapillare selbst nicht in den Lichtweg nicht erreicht, da diese große Brechung und Reflexion verursachen würde.

Die anfängliche Drift der Probe wird durch die Volumenänderungen des Agarose Zylinders selbst verursacht. Gleiten des Kolbens ist nicht der Grund dafür. Daher hilft es nicht, den Kolben mit Plastilin oder Nagellack zu fixieren. Der Embryo könnte seine Position während des Films ändern aufgrund seiner zu natürliches Wachstum. Dementsprechend ist es ratsam, die Region von Interesse in der Mitte des Sichtfeldes zu zentrieren und einen gewissen Spielraum an den Rändern halten, um diese Bewegungen aufzunehmen.

Reduzierte Menge Einbettungsmittel in dem Lichtweg

Die Probe Orientieren hilft richtig , die bestmögliche Bildqualität 15 zu erreichen. GenRallye, Anregungs- und Emissionslicht sollte so wenig Gewebe und Montage Medien wie möglich reisen. Die optimale Lösung ist Agarose freie Montage. Dies wurde beispielsweise in einer Einrichtung für Arabidopsis Seitenwurzelabbildungs ​​14 erreicht , in dem der Hauptwurzel in Phytagel montiert wurde und die Seitenwurzeln wurden anschließend ließ vollständig aus der Gelsäule wachsen. Agarose freie Montage wurde auch für die Abbildung des gesamten Embryonalentwicklung von Tribolium Käfer über zwei Tage 12 entwickelt. Verbesserung der Bildqualität war nicht eine primäre Motivation in diesem Fall. Tribolium Embryonen innerhalb der Agarose einfach nicht überleben lange genug. Ein absolut Einbettmedien freie Montage ist für langfristige Bildgebung in Zebrabärbling nicht erreicht worden. Dennoch können wir einen Vorteil aus der Tatsache, dass, wenn die Agarose erstarrt, werden die meisten Embryonen diagonal mit einem Auge in der Kapillare positioniert in der Agarose und des zweiten Auges sich tief auf die Oberfläche des Einbettungs Spalte die Nähe. Ter Auge näher an der Oberfläche liefert eine hervorragende Bildqualität und sollte daher bevorzugt abgebildet werden.

Agarose-Konzentration und Langzeitabbildungs

Die Konzentration der Agarose für die Montage ist ein Kompromiss zwischen Stabilität der Probe und die Möglichkeit, das Wachstum des Embryos und die Diffusion von Sauerstoff, um es aufzunehmen. Es ist keine zusätzliche Verstärkung in der Stabilität der Probe bei der Verwendung von Agarose-Konzentrationen von mehr als 1%. Als Ausgangspunkt für die Experimente zu optimieren, empfehlen wir 0,6% Agarose, die für Embryonen auch geeignet ist jünger als 24 HPF, die zu empfindlich sind in 1% Agarose montiert werden. Zu anästhesieren älteren Embryonen und Larven, kann die MS-222 - Konzentration ohne Nebenwirkungen 13-200 ug / ml erhöht werden.

Falls sich entwickelnden Embryonen länger als ± 12 hr abgebildet, Agarose Montage wird nicht empfohlen, weil es das Wachstum des Embryos und Caus schränktes Schwanz Verformung. Dieses Problem wurde gelöst , indem Zebrabärbling - Embryonen in FEP - Polymer Rohre mit einem Brechungsindex wie Wasser 13,39 Montage. Mausembryonen, andererseits kann an einer Spritze 41 angebracht in hohlen Agarose - Zylinder 40 oder in Löchern eines Acrylstab immobilisiert werden. FEP Rohrmontage ist allerdings nicht als Standardmethode empfohlen, da die Wand der Röhre bricht das Licht etwas mehr als Agarose.

Lichtbogenausrichtung

Für eine gute Bildqualität ist es wichtig, die automatische Lichtbogenausrichtung vor jedem Versuch durchzuführen. Insbesondere, wenn die Zoom-Einstellungen geändert wurden, wurden die Ziele herausgenommen, oder eine andere Flüssigkeit in der Kammer verwendet wird.

Erleuchtung

Die Pivot-Abtastung des Lichtblattes sollte immer aktiviert werden. Für große Streu Proben ist es erforderlich, das doppelseitige Beleuchtung mit Online f anzuwendenusion zu erreichen gleichmäßige Ausleuchtung über das Sichtfeld. Doppelseitige Beleuchtungs verringert auch ein spezielles Problem des Auges Bildgebung, die durch die Linse des Embryos die Brechung des einfallenden Lichtbogen ist. Kleinere, weniger Streu Proben effizient werden kann unter Verwendung von einseitigen Beleuchtung abgebildet, der die Belichtungszeit um die Hälfte verkürzt und in etwas bessere Bildqualität im Vergleich zu doppelseitige Beleuchtung zur Folge haben kann. Dies ist, weil die Lichtwege für die beiden Beleuchtungsarme immer unterschiedlich sind und je effizienter eine ausgewählt werden kann. Zusätzlich sind die beiden Lichtbögen von jeder Seite kommen nie vollkommen in einer Ebene, die nach dem Fusions Verwischung mild verursacht. Für sehr schnelle intrazelluläre Ereignisse, wie die wachsenden Mikrotubuli (Movie 2), ist die doppelseitige Beleuchtung nicht geeignet, da die Bilder mit Beleuchtung von links und rechts der Reihe nach erfasst werden, die in der Bewegungsunschärfe führen könnte.

Photobleachingund Phototoxizität

Weniger Fluorophor Photobleaching wird oft als ein Hauptvorteil der LSFM erwähnt. Wir würden argumentieren, dass das Ziel überhaupt kein Photobleaching sein sollte. Wenn es in der Live-Imaging-Experiments bemerkbar Photobleaching ist, ist die Probe wahrscheinlich schon aus seiner physiologischen Bereich der tolerierten Laserbelichtung. Bei der Abbildung der Genaktivität in der Drehscheiben-Mikroskop, in unserer Erfahrung können hohe Phototoxizität Embryoentwicklung Stall deutlich, noch bevor die Fluoreszenzsignal bleicht. Daher sollten die Abbildungseinstellungen im LSFM eingestellt werden, so dass wenig oder kein Bleichen beobachtet wird. Obwohl LSFM auf die Probe sanft, ist es ratsam, nur soviel Laserleistung und Belichtungszeit zu verwenden, wie benötigt, um ein Signal-Rausch-Verhältnis ausreichend für die nachfolgende Datenanalyse zu erreichen.

Z-Stapel, Zeitintervalle und Datengröße

Die Dateien, die durch LSFM sind in der Regel sehr groß; manchmal im Terabyte-Bereich. Es ist oft notwendig, einen Kompromiß zwischen Bildqualität und Datengröße zu machen. Dies ist insbesondere der Fall für z Abstand von Stapeln und Intervalle in den Zeitraffer-Akquisitionen. Um die z Abständen die optimale Taste in der Z-Stapel Werkzeugregister definieren sollte idealerweise verwendet werden, insbesondere , wenn die Datenmenge wird später entfaltet werden. Sie berechnet den Abstand 50% Überlappung zwischen benachbarten optischen Scheiben zu erreichen. Dennoch sind etwas größer z Intervalle in der Regel akzeptabel. Sie reduzieren die Zeit benötigt, um die z-Stack sowie die endgültige Dateigröße zu erwerben. Die optimale Zeit Probenahme richtet sich nach dem Prozess von Interesse. Für die Gesamt Auge sind Entwicklung 5-10 min Intervalle in der Regel akzeptabel. Wenn einige Strukturen automatisch verfolgt werden, müssen die nachfolgenden Zeitpunkte ausreichend ähnlich sein.

fluoreszierende Kügelchen

Fluoreszierende Kügelchen dienen in erster Linie als Passermarken für die Registrierung von verschiedenen Ansichteneines Multi-View-Datensatz auf einander. Immer verwirbeln die Perle Lösungen vor Gebrauch gründlich. Erhitzen Sie nicht die Perlen, da dies zu einem Verlust des Fluoreszenzfarbstoffs führen kann. Die optimale Perlenkonzentration für die Multi-View-Registrierung muss experimentell ermittelt werden. Das beschriebene Plugin funktioniert am besten mit rund 1.000 erfassten Perlen während jeder Ansicht. Größere (500 nm oder 1000 nm) Perlen sind robuster als kleiner (weniger als 500 nm) Kügelchen detektiert. Dies liegt daran, größere Perlen sind heller und leichter zu Segment ohne Fehlalarmen von Strukturen in der Probe. Der Nachteil der größeren Kügelchen ist, dass sie in der endgültigen verschmolzenen und entfalteten Bild sehr prominent sind. Für jeden neuen Fluoreszenzmarker, die entsprechende Perlengröße und Fluoreszenzemission müssen optimiert werden. Um ein Beispiel für Probe aus Figur geben 5 und Movie 3, 100 nm grüne Emission Perlen gab zu viele falsche positive Erkennungen in der Membran-GFP - Kanal, aber 1000 nm rote Emission Perlen wurden in der H2B-RFP-Kanal mit sehr wenigen positiven Erkennungen innerhalb der Probe robust nachgewiesen. Wenn der Wulst Erkennung im Kanal mit dem Fluoreszenzmarker ausfällt, nur ein separater Kanal Kügelchen enthalten, können erhalten werden, aber dies ist nicht sehr praktisch. Die Unter Auflösung großen Perlen geben eine direkte Auslesen der Punktverteilungsfunktion (PSF) des Mikroskops, die für die Entfaltungs (2C-D) verwendet werden kann. Wenn die Registrierung und Fusion funktioniert besser mit größeren Perlen (zB 1000 nm), ein unterschiedliches Bild der PSF mit Unter Auflösung, beispielsweise 100 nm Perlen erworben werden. Mit mehrfarbigen Perlen ist hilfreich bei der Registrierung von mehrkanaligen Erfassung und zur Überprüfung, ob die Kanäle Overlay perfekt.

Zugabe von fluoreszierenden Kügelchen ist nicht notwendig, wenn die Abbildung von einer einzigen Ansicht ohne nachfolgende Multiview-Registrierung und Fusion. Aber auch in diesen Fällen Kügelchen können während der Initia hilfreichl Lichtblatt Einstellung für die Qualität des Lichtblattes zu prüfen und im allgemeinen optischen Aberrationen zu offenbaren. Solche optischen Abbildungsfehler aus verschiedenen Quellen wie beschädigt oder verschmutzt Ziele, schmutzige Fenster der Kammer oder Inhomogenität in der Agarose stammen. Perlen kann auch für die Driftkorrektur durch die Multi - View - Registrierung Fidschi - Plugin 20 verwendet werden.

Multiview-

Für die Multi-View-Rekonstruktion Zweck ist es besser eine ungerade Anzahl von Ansichten 3, 5 und so weiter zu erwerben, die einander nicht gegenüberliegen. Dies verbessert Dekonvolution da die PSFs aus verschiedenen Richtungen abgebildet werden. Es ist auch wichtig zu Beginn des Zeitablauferfassung, um zu bestätigen, daß es unter den Ansichten ausreichende Überlappung ist. Dies wird am besten empirisch durchgeführt, das heißt, sofort bestätigt , dass die in dem ersten Zeitpunkt erfolgreich registriert werden. Wenn das Ziel der Multi-View-Akquisition ist die Auflösung zu erhöheneines Bildes eines großen Streu Probe, ist es nicht ratsam, Bild in jeder Ansicht die gesamte Probe, sondern um das Zentrum der Probe, in dem das Signal verschlechtert zu stoppen. Die niedrige Qualität Erwerb aus der zweiten Hälfte der Probe nicht nützliche Informationen für den Multi-View-Rekonstruktion hinzuzufügen.

2. Kritische Schritte und Fehlerbehebung für die Datenverarbeitung

Derzeit gibt es mehrere Möglichkeiten zur Verarbeitung von Multi-View-Daten von einem Lichtblatt-Mikroskop, die gut dokumentiert sind und relativ leicht zu übernehmen. Wir verwenden die Multi - View - Wiederaufbau - Anwendung, die eine Open - Source - Software in Fidschi 32 (Stephan Preibisch nicht veröffentlichten, implementiert ist Link - 1a und Link1b in der Liste der Materialien). Dieses Plugin ist ein wichtiges neues Design der früheren SPIM Registrierung Plugin 20, überprüftvon Schmied et al. 42, die BigDataViewer und seine XML und HDF5 Format 33 mit dem SPIM Registrierung Workflow (Abbildung 1B, die Integration von Link 2 , Link 3 ). Diese Anwendung kann auch für High Performance Computing Cluster angepasst werden, die sich der Verarbeitung 43 erheblich beschleunigt. Diese Multi-View-Registrierungsantrag wird weiter aktiv weiterentwickelt und wird immer besser. Im Falle von Problemen oder Funktionen Anforderungen für die beschriebene Software erfahren Sie Fragen zu den jeweiligen GitHub Seiten (Datei Link - 4 für Multiview- Wiederaufbau und Link - 5 für BigDataViewer).

Die zweite Option ist die kommerzielle Software erhältlich zusammen mit dem Mikroskop zu verwenden. Diese Lösung funktioniert gut und beschäftigt das gleiche Prinzip fluoreszierende Kügelchen der Verwendung der verschiedenen Ansichten zu registrieren. Allerdings fehlt es die Möglichkeit, den gesamten Datensatz schnell wie mit dem BigDataViewer zu visualisieren. Auch kann die Software nicht zum Cluster und darüber hinaus die Verarbeitungsblöcke das Mikroskop für andere Benutzer angepasst werden, es sei denn, zusätzliche Lizenz für die Software erworben wird.

Die dritte Option, die ist auch ein Open - Source - Software, wurde vor kurzem von der Keller - Labor 44 veröffentlicht und bietet einen umfassenden Rahmen für die Verarbeitung und Downstream - Analyse der Lichtblattdaten. Diese Software wird unter Verwendung von Informationen aus dem Inneren der Probe Multiview-Fusion durchzuführen, daher ist es nicht das Vorhandensein von fluoreszierenden Kügelchen erfordern um die Probe herum. Aber zur gleichen Zeit nimmt orthogonalen Ausrichtung der Abbildungsansichten (Ziele), so kann es nicht für Daten aus beliebigen Winkeln 44 erworben werden.

Hardware-Anforderungen

ntent "> Die Hardware für die Verarbeitung verwendet wird, kann in der Tabelle 4 entnommen werden. Es genügend Speicherkapazität und eine klare Pipeline für die Datenverarbeitung zur Verfügung, vor dem eigentlichen Experiment sein muss. Der Erwerb der Bilder ist schneller als die nachfolgende Analyse und es ist leicht , um mit nicht verarbeiteten Daten überflutet. Es ist oft unrealistisch 45 zu speichern alle rAW - Bilder, sondern eine beschnittene Version oder bearbeiteten Bilder wie fusionierten Ansichten, maximale Intensität Projektionen oder sphärische Projektionen.

Prozessor Zwei Intel Xeon Prozessor E5-2630 (Six-Core, 2,30 GHz Turbo, 15 MB, 7,2 GT / s)
Erinnerung 128 GB (16 × 8 GB) 1600 MHz DDR3 ECC-RDIMM
Festplatte 4 × 4 TB 3,5-Zoll-Serial-ATA (7.200 rpm) Festplatte
HDD-Controller PERC H310 SATA / SAS-ConController für Dell Precision
HDD-Konfiguration C1 SATA 3.5 Zoll, 1-4 Festplatten
Grafik Dual 2 GB NVIDIA Quadro 4000 (2 Karten w / 2 DP & 1 DVI-I jeweils) (2 DP-DVI, 2 DVI-VGA-Adapter) (MRGA17H)
Netzwerk Intel X520-T2 Dual-Port-10-GbE-Netzwerkkarte

Tabelle 4: Hardware - Anforderungen.

Datenverarbeitungsgeschwindigkeit

Die Zeit für die Datenverarbeitung benötigt wird, hängt von den Dimensionen der Daten und von der verwendeten Hardware. In Tabelle 1 geben wir einen Überblick über die Zeit für die wichtigsten Schritte , die erforderlich bei der Verarbeitung ein Beispiel 8,6 GB Multi - View - Datenmenge , die mit 4 Ansichten und 2 Kanäle von 1 Zeitpunkt bestand.

Die Verarbeitung sTEP Zeit Protokoll Schritt
Resave als HDF5 6 min 30 sec 6.3
Ermitteln Sie Interesse Points 20 sec 6.4
Registrieren Sie Interesse Punkten 3 Sek 6.5
Inhalt-basierte Multi-View-Fusion 4 Stunden 7.2
Multiview- Entfaltungs (CPU) 8 Stunden 7.3
Multiview- Entfaltungs (GPU) 2 Stunden 7.3

Tabelle 1: Datenverarbeitungszeit.

Eingangsdatenformate für Multi-View-Rekonstruktion

Die Fidschi - Plugin Multiview- Rekonstruktion kann .czi, .tif und ome.tiff Formate unterstützen. Aufgrund der Datenstruktur des .czi Format werden diskontinuierliche Datensätze nichtohne Vorverarbeitung unterstützt. Diskontinuierliche bedeutet , dass die Aufnahme neu gestartet werden musste (zB die Positionen neu zu justieren aufgrund der Probe zu treiben). In diesem Fall müssen die .czi Dateien neu gespeichert als .tif werden. Für TIF-Dateien jede Ansicht und Beleuchtungsrichtung muss als separate Datei gespeichert werden.

Kalibrierung der Pixelgröße

Das Mikroskop-Betriebssoftware berechnet die Kalibrierung für die Größe xy Pixels basierend auf dem ausgewählten Ziel. Jedoch ist die Pixelgröße in z unabhängig durch die Schrittgröße definiert. Wenn ein falsches Ziel in der Software der xy z-Verhältnis angegeben wird, ist falsch und die Registrierung fehl.

Erstzulassung

Die Datenmenge die Anzahl der Anmeldungen Nach der Definition wird 1 und die Anzahl der Punkte von Interesse sein wird , 0 im ViewSetup Explorer sein. Die anfängliche Registrierung stellt die Kalibrierung des Datensatzes. Sowohl die Zahl of Anmeldungen und Interesse Punkte werden während der Verarbeitung zu erhöhen.

Downsampling für bestimmte Punkte detektiert,

Verwendung Abwärtsabtastungs wird empfohlen, da das Laden der Dateien und die Segmentierung wird viel schneller. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass die Erfassungsparameter in Abhängigkeit von der Downsampling wird sich ändern, so dass Erkennungseinstellungen zwischen verschiedenen unten Beispieleinstellungen übertragen ist nicht möglich.

Bestimmte Punkte detektiert,

Es empfiehlt sich, Segment so viele echte Perlen wie möglich in jeder Ansicht, auch um den Preis von ein paar Fehlalarmen zu erhalten, weil sie nicht wesentlich die Registrierung behindern. Unechte Erkennungen, wenn nur wenige in Zahlen werden bei der Registrierung ausgeschlossen (Registrierung von Interesse Punkte Informationen). Allerdings massiven Fehlalarmen stellen ein Problem für den Algorithmus. Es reduziert nicht nur die Leistung für den Nachweis undDie Registrierung, da es viel länger Segment des Bildes sowie vergleichen diese Kügelchen zwischen den Ansichten erfolgt, sondern es verringert auch die Genauigkeit der Registrierung. Dies kann durch Verwendung strengerer Detektionsparameter adressiert werden. Zusätzlich über Segmentierung der Wülste (dh mehrere Erkennungen auf einer 1E bead) ist auf die Registrierung nachteilig und sollte vermieden werden.

Registrierung von Interesse Punkte

Um die Ansichten aufeinander, die Lage jeder Perle in jeder Ansicht registrieren zeichnet sich durch seine Position in Bezug auf die drei am nächsten benachbarten Perlen beschrieben. Diese Konstellationen bilden einen lokalen geometrischen Descriptor und ermöglichen Vergleichen jeder Wulst zwischen den Ansichten. Beads mit passendem Descriptor zwischen zwei Ansichten werden dann als Kandidat Korrespondenzen berücksichtigt. Beachten Sie, dass dies nur für Perlen statistisch verteilt arbeitet, für die die lokalen Deskriptoren für jedes Kügelchen typischerweise einzigartig sind.Man kann andere Strukturen verwenden wie Kerne in der Probe für die Registrierung. Um Kerne jedoch zu erkennen, die nicht zufällig in der Probe verteilt sind, gelten andere Methoden 20,21.

Die Kandidaten Korrespondenzen werden dann gegen RANSAC 36 getestet , um Fehlalarme auszuschließen. Jede Korrespondenz ist darauf hindeutet, ein Transformationsmodell für die Ansichten aufeinander überlagert. Wahre Korrespondenzen würde auf ein Transformationsmodell wahrscheinlich zustimmen, während Ausreißer würde jeder Punkt auf einer anderen. Die wahren Korrespondenzen werden dann eine affine Transformationsmodell zwischen den beiden verglichenen Ansichten zu berechnen verwendet. Eine globale Optimierung mit einem iterativen Optimierungsalgorithmus wird dann durchgeführt, bei dem alle Ansichten mit dem Ziel , eine minimale Verschiebung zwischen den Ansichten 20,21 auf den ersten Blick erfasst werden.

Zeitraffer-Registrierung

Wegen bewegenment der Agarose und unpräzise Motorbewegung des Mikroskoptisches, ändert sich die Position jedes Stapels mäßig über die Zeit. Während die Registrierung der einzelnen Zeitpunkt, um die Differenz zwischen den Ansichten von diesem Zeitpunkt entfernt, muss die Zeitraffer auch als Ganzes registriert sein. Zu diesem Zweck wird jede einzelne Zeitpunkt wird auf den Referenzzeitpunkt registriert.

Referenzzeitpunkt

Wenn eine Zeitreihe mit vielen Zeitpunkten verarbeitet wird, wird eine repräsentative Zeitpunkt als Referenz gewählt Regel von der Mitte der Zeitreihe, da die Sicke Intensitäten über die Zeit aufgrund von Bleich abbauen können. Auf dieser Referenz können die Parameter für Interesse Punkterfassung, Registrierung, Begrenzungsrahmen und Fusion bestimmt werden. Diese Parameter werden dann für die gesamte Zeitablauf aufgetragen, um eine spezifische Transformationsmodell für jeden einzelnen Zeitpunkt zu berechnen. Während Zeitraffer-Registrierung alle anderen Zeitpunkte sind auch per EinschreibenEred räumlich auf diesen Referenzzeitpunkt. Somit ist der Begrenzungsrahmen Parameter für die gesamte Aufnahme auf diesem bestimmten Zeitpunkt abhängig.

Mehrkanal-Registrierung

Wenn mehrere Kanäle Bildgebung, idealerweise die gleichen fluoreszierenden Kügelchen sollten in allen abgebildeten Kanäle sichtbar sein. Die Detektion und Registrierung kann dann für jeden Kanal einzeln durchgeführt werden, die den Einfluss der verschiedenen Lichtwellenlängen auf der Transformation berücksichtigt. Oft ist dies nicht möglich, da die Perlen in allen Kanälen nicht sichtbar sind oder die Kügelchen das Bild zu viel in einem Kanal dominieren und sind zu schwach in den anderen Kanal (n). Die typische Lösung ist sichtbar in einem Kanal nur für den Nachweis und die Registrierung und das erworbene Transformationsmodell Perlen zu verwenden (dh nach der Erfassung, Registrierung und Zeitraffer-Anmeldung) wird dann zu den anderen Kanälen von Fidschi angewendet> Plugins> Multiview- Reconstruction> Batch - Verarbeitung> Tools> Doppelte Transformationen. In dem Dropdown - Menü für die Transformation von Wählen Sie einen Kanal auf andere Kanäle übernehmen. Im folgenden Fenster wählen Sie die XML und klicken Sie auf OK. Wählen Sie dann den Kanal, der die Perlen als Quellkanal enthält und als Zielkanal wählen Sie den Kanal (n) ohne Perlen. Für doppelte denen verwenden Transformationen alle Transformationen und drücken Sie OK ersetzen. Die Transformationen werden dann auf alle anderen Kanäle kopiert und im XML - Format gespeichert. Um die neuen Transformationen im ViewSetup Explorer, starten Sie den Multiview Wiederaufbau Anwendung finden.

Markierungsrahmen

Die Fusion von mehreren Ansichten ist sehr rechenintensiv. Allerdings sind große Bilder typischerweise zur Aufnahme erworben, nicht nur die Probe, sondern auch die Perlen um ihn herum. Sobald die Registrierungsparameters aus den Perlen extrahiert werden, sind sie nicht mehr nützlich als Teil des Bildes. Daher ist die Effizienz der Fusion zu erhöhen, nur die Teile der Bildstapel der Probe enthalten, sollten miteinander verschmolzen werden. Ein Bereich von Interesse (Bounding Box) sollte die Probe zu enthalten und so wenig von der umgebenden Agarose wie möglich definiert werden. Für das Beispiel in Figur 2 eine gewichtete durchschnittliche Schmelz auf das gesamte Volumen mit 2229 × 2136 × 2106 Pixel würde 38.196 MB RAM erfordern, während mit einem Begrenzungskasten wird das Volumen auf 1634 × 1746 × 1632 Pixel , und die Speicheranforderungen reduziert werden reduziert zu 17.729 MB.

Inhalt-basierte Multi-View-Fusion

Die Herausforderung Multi-View-Daten in Fusion ist, dass die Ansichten in der Regel abrupt enden und enthalten nicht die gleiche Bildqualität für die gleichen Voxel. Einfache Mitteln der Ansichten daher Mischen Artefakte und unnötige Bildverschlechterung führen würde. Inhalt-basierte Multi-View-fu sion berücksichtigt diese beiden Probleme. Zunächst fügt es sich, die verschiedenen Ansichten, wo ein Bild endet und das andere beginnt und zweitens, beurteilt er die lokale Bildqualität und wendet höhere Gewichte auf eine höhere Bildqualität bei der Fusion 21. Im Vergleich zu einer einzigen Ansicht gibt es eine Verbesserung der Auflösung in z mit einer leichten Verschlechterung des Signals in xy (Abbildung 2E-H, 5A-D).

Multiview- Entfaltungs

Multiview- Entfaltungs ist ein weiterer Ansatz, um die Fusion der Ansichten zu erreichen. Mit dieser Methode auch die PSF der verschiedenen Ansichten berücksichtigt genommen, um das Bild zu gewinnen, die durch die Optik des Mikroskops convolved wurde. Dieses Verfahren verbessert drastisch die Bildqualität durch die Bildunschärfe zu entfernen und zunehmender Auflösung und den Kontrast des Signals 31 (2C-D, 2I-J, 5E-G, Movie 3).

ve_content "> Entfaltungs sehr rechenintensiv ist (siehe Tabelle 1), so dass eine GPU für die Verarbeitung unter Verwendung erhöht die Geschwindigkeit dieses Prozesses. Es ist auch notwendig sein, die Entfaltungs abwärts abgetasteten Daten durchzuführen. Um nach unten Beispiel verwenden Fidschi> Multiview- Wiederaufbau > Stapelverarbeitung> tools> anwenden Transformationen. wird dies eine neue Transformationsmodell auf Basis der Ansichten anwenden, die in der XML - Datei gespeichert werden.

HDF5 Dateiformat für BigDataViewer und BigDataServer

Die BigDataViewer 33 ermöglicht eine einfache Visualisierung von Terabyte-Daten. Wie die BigDataViewer zu steuern , ist in Tabelle 2 zusammengefasst. Ein Screencast von der grundlegenden Bedienung des Programms ist auch als Ergänzung in seiner ursprünglichen Veröffentlichung 33. Die BigDataViewer ist zentriert auf eine XML-Datei, die die Metadaten enthält, und eine hdf5 Datei, die die Bilddaten enthält. Die Bilddaten werden present im hdf5 in mehreren Auflösungsniveaus in 3D-Blöcke. Die mehreren Auflösungsstufen erlauben die Daten schneller und mit geringerer Auflösung zu visualisieren, bevor die volle Auflösung geladen ist. Einzelne Blöcke werden nur in den Speicher geladen. Somit ermöglicht das hdf5 Bildformat direkte und schnelle Visualisierung der Daten über die BigDataViewer 33. Es beschleunigt auch Verarbeitung, da das Laden der Dateien mehr aus effizient durchgeführt wird. Deshalb empfehlen wir, die Datenmenge in diesem Format resaving, obwohl es nicht unbedingt für die Verarbeitung erforderlich ist. Zur weiteren Erläuterung des Datenformats finden Sie auf Link 3 . Zusätzlich können die Datensätze mit Mitarbeitern oder der Öffentlichkeit geteilt werden , um die BigDataServer 33 (mit Link - 6 ).

Wirkung
Schlüssel
F1 zeigt die Hilfe mit einer kurzen Beschreibung des BigDataViewer und deren Bedienung
<> Oder Mausrad Bewegung in z
Auf- und Abwärtspfeil vergrößern und verkleinern
rechts klicken und ziehen bewegt Probe im Viewer
links klicken und ziehen dreht Probe um den Cursor
Regler am unteren Rand des Betrachters oder Tab und links oder rechts Pfeil bewegt sich auf der Zeitachse
zusätzlich shift schneller Bewegung oder Drehung entlang einer Achse
x und dann links und rechts Pfeil dreht sich um die x-Achse
y und dann links und rechts Pfeil dreht sich um die y-Achse
z und dann links und rechts Pfeil dreht sich um die z-Achse
Verschiebung und x richtet die Ansicht entlang der x-Achse
Verschiebung und y richtet die Ansicht entlang der y-Achse
Verschiebung und z richtet die Ansicht entlang der z-Achse
ich Umschaltung zwischen den verschiedenen Interpolationsmodi (dh nächste Nachbar und trilinear)
s oder Einstellungen> Helligkeit und Kontrast ändert die Farbe der Kanäle, Helligkeit und Kontrast
F6 oder Einstellungen> Sichtbarkeit und Gruppierung ändert die angezeigten Gruppen ermöglicht Gruppierung zu verschiedenen Gruppen überlagern und die Gruppen über die Zifferntasten aufrufen
F10 oder Werkzeuge> Film aufnehmen erwirbt eine Zeitreihe des aktuell angezeigten Scheibe

Tabelle 2: Big Data Viewer.

3. Einschränkungen der beschriebenen Umsetzung von LSFM

Low-Durchsatz

In einem typischen LSFM Experiment nur eine Probe pro Experiment abgebildet wird. Dennoch gibt es in unserer Erfahrung können viele nützliche Informationen aus diesem einzigen Probe extrahiert werden. Hochdurchsatz - Abbildungs ​​mehrerer Embryonen wurde in Haus gebaut LSFM Aufbauten 46-48, obwohl in der Regel auf Kosten der Freiheit der Probenpositionierung und Rotation kürzlich erreicht.

Unzureichende Penetration tief in das Gewebe

Obwohl Zebrabärbling Embryonen durchscheinend sind, ist die erhaltene Bildqualität schnell verschlechtert wird, wenn in dem Gewebe tiefer Abbilden aufgrund von Streuung und Absorption. Teilweise ist dies ein Effekt der Streuung und Absorption der emittierten Fluoreszenz von der Probe und nicht in der aktuellen Einstellungen korrigiert werden kann. Eine weitere Quelle für die ungleichmäßige Bildqualität ist die unregelmäßige Beleuchtung. Ter Lichtbogen fällt von der linken oder rechten Seite und alle Objekte auf seinem Weg brechen es, die in Streifen Artefakte und Unschärfe führt. Die doppelseitige Beleuchtung und Multi-View-Fusion, die Artefakte im endgültigen Bild verringern kann. Schließlich neigt die Bildqualität etwas schlechter gegenüber dem Rand des Sichtfeldes auf die natürliche Geometrie des Lichtbogen aufgrund sein, die dicker zu den Rändern gewinnt.

Begrenzte chemische Manipulation

Der Gebrauch von Drogen oder Inhibitoren ist weit verbreitet in Zebrabärbling Forschung. In diesem Mikroskop Gebrauch von Drogen gezwungen ist, aufgrund des großen Volumens der Probenkammer und Erwägungen anderer Nutzer des Instruments, die die gleiche Kammer teilen. eine zusätzliche Kammer Droge Experimente gewidmet Verwendung kann dieses Problem lösen. die Kammer teilweise mit Glasperlen Füllung verringert das Flüssigkeitsvolumen, das erforderlich ist.

Kein Photomanipulation

Currently gibt es keine Möglichkeit, lokalisierte optische Manipulation wie Photo oder Laserablation in diesem Mikroskop. Trotzdem kann Haus gebaut Setups für solche speziellen Anwendungen verwendet werden.

4. Bedeutung und zukünftige Anwendungen

LSFM ist die beste Methode zur schnellen Abbildung von großen Mengen an lebenden Embryonen auf dem Laufenden. Die meisten Versuche denkbar auf einem konfokalen Mikroskop kann auch auf einem Lichtbogen-Mikroskop mit oben genannten Vorteilen durchgeführt werden. Im Fall der Abbildung von der Entwicklung des Auges, ist die Geschwindigkeit der LSFM nicht der entscheidende Parameter. Stattdessen sind die geringe Phototoxizität und Flexibilität bei der Positionierung der Probe die entscheidenden Vorteile.

Die LSFM Daten haben einen hohen SNR, die eine gute Entfaltungs Ergebnisse zu erzielen hilft und ist auch für die automatisierte Bildanalyse und Objektverfolgung von Vorteil. Abschließend ist LSFM ein großes Werkzeug zur Erzeugung von quantifizierbare Daten auf die embryonale Entwicklung und Marktpreisefürll Zell- und Gewebeeigenschaften für nachfolgende Modellierung und physikalische Beschreibungen der Prozesse in Frage.

Disclosures

Die Veröffentlichung dieses Video-Artikel wird von Zeiss unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lightsheet Z.1 microscope Carl Zeiss Microscopy
Low melting point agarose Roth 6351.1
Low melting point agarose Sigma A4018 or A9414
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB/MS-222/Tricaine) Sigma E10521
N-Phenylthiourea (PTU) Sigma P7629
500 nm red fluorescent beads F-Y 050 Millipore (Estapor) 80380495
20 μl (1 mm inner diameter, marked black) capilllaries Brand 701904 sold as spare part for transferpettor
Teflon tip plungers for 20 μl capillaries Brand 701932 sold as spare part for transferpettor
Circular glass coverslips diameter 18 mm, selected thickness 0.17 mm Thermo scientific (Menzel-Glaser)
O-rings for chamber windows 17×1.5 mm Carl Zeiss Microscopy
Tweezers, style 55 Dumont 0209-55-PO
50 ml Luer-Lock syringes Becton Dickinson 300865
150 cm extension cable for infusion compatible with Luer-Lock syringes Becton Dickinson 397400
Links
Link 1 Multiview reconstruction application https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration
http://fiji.sc/Multiview-Reconstruction
Link 2 BigDataViewer https://github.com/bigdataviewer
Link 3 BigDataViewer http://fiji.sc/BigDataViewer
Link 4 Multiview reconstruction application-issues https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration/issues
Link 5 BigDataViewer-issues https://github.com/bigdataviewer/bigdataviewer_fiji/issues
Link 6 BigDataServer http://fiji.sc/BigDataServer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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