Introduction
형태 형성은 배아 모양과 함께 성장 및 분화와 성숙 다세포 유기체로 수정란에서 개체 발생을 구동하는 과정입니다. 동물 개발하는 동안 형태 발생 과정은 그대로 살아있는 표본 1-3의 이미지로 최고의 분석 할 수 있습니다. 이러한 전 배아 촬상 이용시 시그널링 분자의 기울기, 세포 외 기질, 혈관, 신경 분포뿐만 아니라 주변 조직의 기계적 특성을 포함한 현상을 조절하는 모든 부품을 유지하기 때문이다. 형태 형성이 발생하는 비늘, 다리, 빠른 세포 내 사건은 시간 또는 며칠에 걸쳐 전체 조직의 발달의 맥락에서 미소 시간 스케일에 캡처되어야한다. 이러한 모든 요구 사항을 충족하기 위해 직교 평면 조명 현미경 (5)의 현대적인 구현 (4)는 개발되었다. 원래, 그것은 선택적 평면 조명 현미경 (SPI 지명되었다M) 4; 이제 모든 것을 포함하는 용어 가벼운 시트 형광 현미경 (LSFM)이 일반적으로 사용된다. 레이저 스캐닝 또는 회전하는 디스크 공 초점 현미경 6,7보다 광독성을 유도하면서 LSFM 높은 시간 해상도로 촬영을 할 수 있습니다. 요즘이 이미 기본적인 광 시트 조명의 원리의 많은 구현하고 그 이미지에 이전 연구자 8-11 액세스 시험편 및 프로세스의 많은 다양한 사용되었다.
우리는 먼저 기존의 공 초점 현미경 접근 방식을 통해 LSFM의 몇 가지 주요 장점을 강조하고 싶습니다 :
라이브 영상 현미경 실험에서 의미있는 결과를 얻기 위해서는, 관찰 만 최소 시료에 영향을 미치는 것이 중요하다. 그러나, 제브라 피쉬를 포함한 많은 생물은 광독성의 EF없이 높은 시간 해상도의 공 초점 현미경 이미지 그들에게이 도전하고, 레이저 광선에 매우 민감하다정체 또는 지연 개발 6,7 등 fects. LSFM 현재 샘플 7의 최소 분열 효과 형광 영상 법이다. 얇은 레이저 광 시트는 특정 시점에서 촬상 된 시험편의 일부만을 조명하므로, 광 시트 현미경은 매우 효율적으로 광자를 사용하고있다. 따라서, 낮은 조명 노출은 건강 시편의 이상 경과 관찰, 예를 들어 12 ~ 17 수 있습니다. 또한 LSFM의 최소 침습 덕분에, 획득 된 영상의 개수가 더이상 아니라 처리되고 저장 될 수있는 데이터의 양에 의해 시료가 견딜 수있는 빛의 양에 의해 결정되지 않는다.
근처 생리 학적 조건에서 시편을 유지하는 동일한 선에 따라서, LSFM 라이브 배아에 적합 다른 샘플 설치 전략이 함께 제공됩니다. LSFM 기술에서, 배아는 일반적으로 낮은 비율 아가로 오스의 얇은 칼럼에 포함된다. mountin동시에 여러 도면에서 (LSFM보기라고에서) 아가로 g 실린더는 회전 자유롭게 허용하므로 시료 완벽한 각도에서 관찰 될 수있다. 멀티 뷰 영상 및 후속 안식 융합 큰, 산란 표본에 특히 유용 높은 등방성 해상도로 캡처 할 수 있습니다. 다른 가능한 LSFM 설치 전략의 요약 E. 레이노의 실험실에 의해 작성된 샘플 준비의 장에서, 공식 현미경 운영 매뉴얼에서 찾을 수 있습니다. 그것은 여기에 설명 된 것보다 목표는 이미지를 다른 샘플에 특히 경우, 권장 읽기입니다.
LSFM의 화상 취득은 레이저 스캐닝 공 초점 레이저 주사 현미경 반대로, 넓은 시야, 카메라 계이다. 이것은 더 높은 신호 - 취득 이미지 잡음비 (SNR)를 초래하고 (초당 프레임 수십에서 수백)을 매우 빠르게 할 수있다. LSFM의 높은 민감도는 더 약하게 형광 SAMP의 영상을 가능하게레, 가까운 미래에 내인성 레벨 18에서 표현 된 전사 인자와 같은 내인성 단백질 / Cas9를 CRISPR를 사용하여 태그. 높은 SNR은 성공적인 하류 이미지 분석에 중요하다. 높은 속도가 빠른만큼 여러보기에서 전체 배아를뿐만 아니라 빠른 세포 내 프로세스를 캡처하는 데 필요한뿐만 아니라 이미지입니다. 관찰 된 현상은 별도의 뷰에서 오는 이러한 여러 Z 스택 획득 동안 변경하지 않는 경우 여러 뷰의 원활한 융합 만 달성 될 수있다.
LSFM의 이점은 일반적으로 화질을 희생 오지 않는다. LSFM의 측면 해상도는 공 초점 현미경의 해상도보다 약간 더 나쁘다. LSFM에 사용되는 검출 목적이 하부 개구 표준 촛점 설정 물 또는 실리콘 침지 목표 1.2~1.3 비교 (보통 1.0 이하)을 가지고 있기 때문이다. 또한, 때문에 LSFM의 넓은 필드 검출 (에 absen핀홀 CE)은 공 초점 현미경에 비해 포커스 아웃 광있다. 포커스 아웃 광량은 광 시트의 두께에 의해 결정된다. 그럼에도 불구하고, 이러한 단점은 LSFM에서 높은 SNR에 의해 보상된다. 실제로, 이것은 예컨대 디스크 촛점 취득 15 회전에 비해 유사한 이미지 품질을 초래한다. 따라서,이 세포 혈통이 15,19 추적을 위해, 세포막이나 핵, 예를 들어, 같은 기능의 신뢰성 추출 할 수 있습니다.
LSFM의 축 해상도 광 판 두께에 의해, 검출 목적에 부가하여, 결정된다. 어떤 경우 LSFM 캔의 축 방향 해상도는 공 초점 현미경의 해상도를 넘어. 광 시트는 일반적으로 저배율 대물 이미지화 큰 시험편 발생하는 검출 목적의 축 해상도보다 얇은 경우에는 우선, 해상도의 향상이 온다. LSFM은 ACH 수있는 방법 두 번째 방법,더 축 해상도 ieve, 다른 관점에서 높은 XY 해상도 정보가 하나의 이미지 스택에 결합되는 안식 융합이다. 생성 된 병합 스택은 횡 방향 (20, 21)의 해상도 값에 접근 등방성 해상도를 갖는다. 이 문서에서 설명하는 서로 상에 여러 뷰를 등록하기위한 전략은 샘플 (20, 21)의 주위에 아가로 오스에 포함 된 신탁 마커로 형광 폴리스티렌 비즈를 사용하여 기반으로합니다.
LSFM 상용화로 인해,이 기술은 과학 (22)의 넓은 지역에 사용할 수있다. 따라서,이 프로토콜을 작성하기위한 동기 부여는 LSFM에서 실무 경험이 부족한 발달 생물 학자들에이 기술이 액세스 할 수 있도록 이들 과학자들은 샘플이 기술을 사용하기 시작 얻는 것입니다. 우리의 프로토콜은 개념적으로 간단한 현미경 t를 구성하는 상업 빛 시트 현미경을 사용모자가 작동하기 쉽습니다. 우리는 또한 특정 질문에 23-25 답변을 적합 할 수 있습니다 홈 내장 LSFM의 설정과 제브라 피쉬 이미징에 대한 최근의 다른 프로토콜을 언급하고 싶습니다. LSFM 또 다른 항목 옵션은 넓은 지역 사회에 빛 시트 현미경을 가지고 오픈 액세스 원리를 사용하는 오픈 플랫폼 (26, 27)이다. 하드웨어와 소프트웨어 측면 모두의 문서는 http://openspim.org 및 https://sites.google.com/site/openspinmicroscopy/에서 찾을 수 있습니다.
이 프로토콜에서는, 우리는 LSFM과 발달 과정을 연구하는 모델 시스템으로 경골 제브라 피쉬를 사용합니다. 제브라 피쉬 눈의 형태 형성은 LSFM의 혜택을 많이 강조 예입니다. LSFM 이미 28 메다카 및 지브라 피쉬 29,30 안구 발달을 조사하기 위해 과거에 사용되었다. 시력 발달의 초기 단계는 종래의 현미경 정확하게 태아의 방향을 복잡부피가 큰 노른자로 배아가 눈 목표를 향하도록 측면에 거짓말을 할 수 없습니다. 그러나 LSFM는 아가 로스 칼럼에 장착하여, 샘플 재현성 위치 될 수있다. 또한, 광학 컵 무대에 광학 소포에서 전환하는 동안, 눈은 큰 Z 스택과보기의 큰 필드를 캡처 필요 성장과 함께 주요 형태 형성 재 배열을 겪는다. 또한 이러한 문제에 대한 LSFM은 기존의 공 초점 이미징 우수하다. 광섬유 컵 형성 과정은 따라서 이해할 한 시야에서 촬상 의해서만 시각화하기 어려운 입체이다. 이 등방성 해상도를 가진 멀티 뷰 영상이 유용합니다. 광학 컵 형성 한 후, 망막 레이저 노출에 더욱 민감하게된다. 따라서 LSFM와 연관된 낮은 광독성 장기 이미징 큰 장점이다.
여기에서 우리는 이전 제브라 피쉬는 배아 1 ~ 3 일의 촬영을 위해 최적화 된 프로토콜을 제시눈 개발에 초점을 맞춘 차 애벌레. 우리의 방법은 높은 공간 및 시간 해상도로 12 ~ 14 시간까지 취재 시간 경과 동영상 촬영을 할 수 있습니다. 이 기술은 변함없이 자주 테라 바이트 범위에서, 큰 데이터 세트를 생성으로 중요한 것은, 우리는 또한, LSFM에 필수적인 단계이다 데이터 처리를위한 파이프 라인을 보여줍니다.
Protocol
참고 : 모든 동물의 작업이 유럽 연합 (EU) 지침 63분의 2,011 / EU 및 독일의 동물 복지법에 따라 수행 하였다. 프로토콜은 샘플을 이미징하는 설치에서, 중단없이 따라야하는 것을 의미한다. 실제적인 경험에 따라, 시간 경과 실험을 시작하기 2 ~ 3 시간이 소요됩니다. 데이터 처리 시간이 계산에 포함되지 않는다. 실험에 필요한 모든 재료는 보충 자료로서 제공되는 것을 시작하기 전에 필요한 재료의 체크리스트에서 찾을 수있다. 단계 1, 2, 3, 4 단계를 2, 3, 4 및 프로토콜은 또한 공식 현미경 작동 설명서를 참조하십시오 5시 분말 무료 장갑을 착용 할 것.
이미징 실험 전에 1. 준비 작업
- 형광 구슬 원액
- 이 프로토콜의 경우, (적색 발광 형광 염료로 표지) 500 또는 1,000 nm의 직경 폴리스티렌 비즈를 사용합니다. 구슬의 작업 희석은 1 : 4,000 첫째, 소용돌이 1 분 비드 원액. DDH 2 O. 990 μL에 구슬의 10 μl를 희석 4 ° C에서 어둠 속에서 솔루션을 저장 1이 사용 1시 40분에 더 희석에 대한 재고 솔루션으로 100 희석.
- 샘플 실에 대한 준비 솔루션
- 100㎖의 비이커에서 혼합 메틸렌 블루없이 E3 매체 38.2 ㎖, 10 mM의 N의 -phenylthiourea 0.8 mL 및 1 ml의 0.4 % MS-222. 나중에 샘플 챔버에 떠있는 작은 먼지 입자 또는 불용 결정을 피하기 위해 필터링 E3 매체를 사용하는 것이 유리하다.
- 형광 물고기 배아 선택
- 이전 실험에 일에 형광 단백질을 발현하는 배아를 준비합니다. 마우스 오른쪽 실험하기 전에, 형광 신호의 바람직한 강도 형광 입체경에서 배아를 정렬합니다. 5-10 건강한 배아를 가지고 핀셋을 사용하여 dechorionate.
참고 :이 프로토콜은 16-72 시간 이전에 최적화되어 있습니다배아.
- 이전 실험에 일에 형광 단백질을 발현하는 배아를 준비합니다. 마우스 오른쪽 실험하기 전에, 형광 신호의 바람직한 강도 형광 입체경에서 배아를 정렬합니다. 5-10 건강한 배아를 가지고 핀셋을 사용하여 dechorionate.
2. 샘플 상공 회의소 설정
- 세 회의소 윈도우 조립
- (두께 0.17 mm 선택된 18mm 직경) 샘플 챔버 4 윈도우 대물 용과 세 된 커버로 밀봉 할 수 있습니다. 70 %의 에탄올이 된 커버를 저장합니다. 에테르로 사용하기 전에 깨끗이 닦아 : 에탄올 (1 : 4).
- 미세 집게를 사용하여 창에 커버 슬립을 삽입하고 가장 작은 홈에 적합해야합니다. 17mm 직경의 고무 O 링으로 커버 챔버 창 도구를 사용하여 조명 어댑터 링 스크류. 다른 두 개의 창을위한 과정을 반복합니다.
- 남은 챔버 부품을 부착
- 상기 챔버의 제 잔류 측에 적절한 대물 용 어댑터 스크류. 어댑터의 중심으로 15 mm 직경의 O 링을 삽입합니다.
- 차의 오른쪽 구멍에 흰색 루어 잠금 어댑터 나사mber와 왼쪽 구멍에 회색 드레인 연결합니다. 검은 블라인드 플러그와 모든 나머지 세 구멍을 차단합니다.
- 펠티에 블록과 육각 렌치를 이용하여 챔버의 금속 더브 테일 슬라이드 하단을 연결합니다. 루어 잠금 어댑터에 50 ML의 주사기와 호스를 연결합니다. 챔버에 온도 프로브를 삽입합니다.
- 마이크로 스코프로 목표 및 상공 회의소 삽입
- 모든 목적이 깨끗한있는 입체경에서 확인하십시오. 10 배 / 0.2 조명 목적과 계획 - 고차 색지움 20X / 1.0 W 감지 목표를 사용하여 굴절률 보정 칼라가 물 1.33로 설정되어 있는지 확인하십시오. 덮여 조명 목표를 유지하면서, 현미경으로 검출 대물 스크류.
- 조명 목표를 덮고있는 플라스틱 보호 캡을 제거합니다. 조심스럽게 현미경으로 챔버를 밀어 고정 나사를 조입니다.
- 온도 프로에 연결하고 현미경으로 펠티에 블록.
참고 : 펠티에 블록의 냉각액을 순환 두 개의 튜브가 두 커넥터와 호환됩니다. 이들은 관계없이 연결 방향의 작동 회로를 형성한다. - 챔버 창문의 상단까지의 단계 1.2에서 제조 한 용액을 주사기를 통해 챔버를 입력합니다. 챔버가 누출되지 않았는지 확인합니다.
- 현미경, 배양 및 제어 및 스토리지 컴퓨터를 시작합니다. 현미경-운영 소프트웨어를 시작하고 28.5 ° C로 배양 온도를 설정합니다.
참고 :이 완전히 평형을 1 시간이 소요됩니다. 그 동안 샘플을 준비합니다.
3. 샘플 준비
- 아가로 오스 믹스 준비
- 아가로 혼합하기 전에 15 분, 70 ° C로 설정된 가열 블록 (E3 매체에 용해) 한 1 ml의 분취 량을 1 % 저 융점 아가로 오스를 용융. 아가로 오스는 완전히 몰되면열, 신선한 1.5 ML 튜브에 600 μl를 전송 E3 매체의 250 μL, 0.4 % MS-222의 50 μL와 텍싱 비드 원액 25 μl를 추가합니다.
참고 : 추가 75 μL가 배아 나중에 함께 추가 된 액체에 대해 계산되는 동안이 믹스 925 μl를합니다. - 38 ~ 40 ° C에서 제 2 가열 블록에 튜브를 유지하거나 아가로 오스는 그것으로 샘플 배아를 놓기 전에 그 겔화 점에 매우 가까이 있는지 확인합니다.
- 아가로 혼합하기 전에 15 분, 70 ° C로 설정된 가열 블록 (E3 매체에 용해) 한 1 ml의 분취 량을 1 % 저 융점 아가로 오스를 용융. 아가로 오스는 완전히 몰되면열, 신선한 1.5 ML 튜브에 600 μl를 전송 E3 매체의 250 μL, 0.4 % MS-222의 50 μL와 텍싱 비드 원액 25 μl를 추가합니다.
- 배아를 장착
- (~ 1mm 내경, 블랙 마크) 20 μL 볼륨의 오 유리 모세관을 가지고 그들에 일치하는 테플론 팁 플런저를 삽입합니다. 테프론 팁 모세관의 바닥에 위치하도록 모세관을 통해 상기 플런저를 밀어.
- 텍싱 37 ° C 따뜻한 아가 믹스 튜브에 유리 또는 플라스틱 피펫 전송 다섯 배아 (한 번에 장착 될 수있는 수).
참고 : 액체 함께 재치 최소 볼륨을 이월하는 것을 시도하십시오시간 배아. - 믹스에 모세관을 삽입하고 플런저를 위로 당겨 내부에 하나의 배아를 빨아. 태아의 머리가 꼬리 전에 모세관을 입력했는지 확인하십시오. 플런저 및 샘플 사이에 공기 방울을 피하십시오. 배아 위의 아가로 오스의 ± 2 cm이고, 그 아래 ± 1cm가 있어야합니다. 잔여 배아에 대해 반복합니다.
- 아가로 오스가 완전히 굳은 때까지 몇 분 이내에 발생하는 기다린 후 플라 스티 나 테이프와 비커의 벽을 고집하여, E3 매체에 샘플을 저장합니다. 모세관의 바닥 개구는 샘플 가스 교환을 허용하는 용액에서 자유 장착되어야한다.
참고 : 섹션 3.1 및 3.2에 유사한 프로토콜은 또한 OpenSPIM 위키 페이지 http://openspim.org/Zebrafish_embryo_sample_preparation에서 찾을 수 있습니다.
4. 샘플 위치
- 샘플 홀더 어셈블리
- 적당한 크기의이 플라스틱 슬리브 (검은 색)을 삽입샘플 홀더 줄기에 서로에 대해. 이들의 슬릿면이 바깥쪽으로 향하도록해야합니다. 그것을 2 ~ 3 라운드를 돌려 느슨하게 고정 나사를 연결합니다. 클램프 나사를 통해 모세 혈관을 삽입하고 검은 색 밴드는 다른 측면에서 볼 때까지 홀더를 밀어 넣습니다. 플런저를 만지지 마십시오.
- 클램프 나사를 조입니다. 모세관에서 배아 아래 아가로 오스의 초과 1cm를 누르고 잘라. 샘플 홀더 디스크에 줄기를 삽입합니다.
- 현미경 스테이지 하중 위치에있는 소프트웨어에 확인. 현미경으로 수직으로 아래로 샘플 전체 홀더를 활주하는 가이드 레일을 사용합니다. 그래서 자기 홀더 디스크 잠금 위치로 그것을 돌립니다.
- 모세관 찾기
- 지금부터, 소프트웨어하여 샘플의 위치를 제어 할 수 있습니다. 찾기] 탭에서 모세관 옵션을 찾아 바로 검출 물체 위에 초점에 X, Y의 모세관 및 z 위치를 선택필자 렌즈. 지침에 대한 표본 탐색기에서 그래픽 표현을 사용합니다.
- 이 검출 목적의 학생 앞에 때까지 모세관에서 부드럽게 배아를 밀어 넣습니다.
주 : '의 위치는 캐 필러'현미경의 상부 덮개가 개방되어야하며 샘플이 압출되는 동안 나머지 프로토콜의 유일한 단계이다.
- 샘플 찾기
- '샘플을 찾습니다'옵션으로 전환 0.5 줌에서 시야의 중심에 제브라 피쉬 눈을 가지고. 그것이 눈에 도달하기 전에 광 시트 시험편 중 높은 굴절 또는 흡수하는 부분을 통과하지 않도록, 배아를 돌린다. 마찬가지로, 방출 된 형광은 시편에서 명확한 경로를 필요로한다. '설정 홈 위치'를 클릭합니다.
- 현미경의 전면 도어를 열고 증발을 방지하기 위해 챔버의 상단에 3mm 구멍에 플라스틱 커버를 넣어.
참고 : 액체 레벨 아래로 떨어지면촬상 레벨이 실험은 손상 될 것이다. - 전반적인 건강에 대한 프록시로 태아의 심장 박동을 확인합니다. 너무 느린 경우, 다른 샘플을 사용 (비 장착 된 컨트롤에 비교, 특정 값이 발달 단계에 따라 달라집니다). 최종 줌 설정으로 전환 배아의 위치를 재조정.
5. 다차원 취득 설정
- 취득 매개 변수
- '취득'탭으로 전환합니다. 레이저 라인, 검출 목적, 레이저 차단 필터, 빔 스플리터와 카메라를 포함하여 빛의 경로를 정의합니다.
- 피벗 스캔 확인란을 활성화합니다. 비트 심도, 이미지 형식, 빛 시트 두께 등 다른 인수 설정을 정의하고 단일 양면 조명을 선택합니다.
- 를 눌러 '연속'얻어진 이미지의 강도에 따라 레이저 파워 및 카메라 노출 시간을 변경합니다.
참고 : 조정을 위해 모든 영상 설정을 사용하여 레의 레이저 출력 (100 mW의 레이저, 30 msec의 노출 시간의 0.5 %)이 실제 실험보다 시험편에 불필요한 포토 손상을 방지한다.
- 라이트 시트 조정
- '이중 양면 조명'과로 전환 '온라인 듀얼 사이드 Fusio'n 확인란을 활성화합니다. 'Lightsheet 마법사를 자동 조정'시작합니다. 단계별로 지침의 단계를 따릅니다.
주 : 마법사 검출 목적의 초점면에 광 시트를 이동하고 기울어되지 않도록 그 몸통은 시야의 중심에있다. 자동 조정을 마친 후, 좌우의 광 시트의 위치가 자동으로 소프트웨어가 갱신된다. 화질 개선 이제 명백하다. 'Z-스택'확인란을 활성화합니다. - XZ 및 YZ 오르토 뷰 형광 비드에 의해 지정된 점 확산 함수 (PSF)의 대칭을 검사하여 광 시트 조정을 확인한다. 이 경우 없음t 대칭 수동으로 상하 대칭 모래 시계 모양의 PSF (그림 1A)를 달성 할 때까지 광 시트 매개 변수의 위치를 조정합니다.
- '이중 양면 조명'과로 전환 '온라인 듀얼 사이드 Fusio'n 확인란을 활성화합니다. 'Lightsheet 마법사를 자동 조정'시작합니다. 단계별로 지침의 단계를 따릅니다.
- 다차원 취득 설정
- '첫 번째 조각'과 '마지막 조각'옵션은 z-스택을 정의하고 1 ㎛의 Z 단계를 설정합니다.
주 :이 현미경의 광 시트는 고정되고 Z 방향 단면을 통해 샘플을 이동시킴으로써 달성된다. 항상 Z-스택의 빠른 획득을위한 '연속 드라이브'옵션을 사용합니다. - '시계열'확인란을 활성화합니다. 시점의 수와 그 사이의 간격을 정의한다.
- '멀티 뷰'확인란을 활성화합니다. 는 X, Y, Z와 각도 정보가 저장되는 멀티 뷰 목록에 현재보기를 추가합니다. 다른 원하는보기를 모세관을 회전 정의 단계 컨트롤러를 사용합니다. 각 뷰에서 Z - 스택을 설정하고 멀티 뷰 목록에 추가합니다.
참고 :이미지가 취득하는 동안 모세는 단방향으로 설정되도록 소프트웨어는 직렬 방식으로보기를 정렬합니다.
- '첫 번째 조각'과 '마지막 조각'옵션은 z-스택을 정의하고 1 ㎛의 Z 단계를 설정합니다.
- 드리프트 보정과 실험 시작
- 설정 인수가 완료되면, 실제 실험을 시작하기 전에 15 ~ 30 분을 기다립니다.
참고 :이 샘플은 처음에 X, Y 및 Z에 몇 마이크로 미터 품으로하지만, 30 분 이내에 중지해야합니다. 샘플이 이상 표류 유지하는 경우, 다른 샘플 또는 다시 마운트를 사용합니다. - 데이터가 저장되는 방법을 정의하는 '스트리밍'옵션 '유지'탭과에 전환 예를 들어, 각 뷰 및 채널에 대한 시점 또는 별도의 파일 당 하나의 파일입니다. 다시 '수집'탭으로 이동을 눌러 '실험 시작'과 파일 이름이 저장 될 위치와 파일 형식 (사용 .czi)을 정의합니다.
- 모든 것이 완벽하게 실행되고 있는지 확인하기 위해 처음으로 지점의 인수를 관찰한다. 즉시 등록 진행상기 제 시점의 융합은 전체 데이터 세트를 처리 할 수있을 것이라는 점을 확인하기 위하여 단계 6 및 7에 기재된 바와 같이.
- 설정 인수가 완료되면, 실제 실험을 시작하기 전에 15 ~ 30 분을 기다립니다.
6. 멀티 뷰 등록
- 멀티 뷰 재건 응용 프로그램
- 촬상 세션의 끝에서, 데이터 처리 시스템으로 현미경에 데이터 저장 시스템에서 데이터를 전송. '멀티 뷰를 사용하여 ReconstructionApplication '20,21,31 데이터 처리 피지 (32) (도 1B)으로 구현.
- 데이터 집합을 정의
- > 업데이트 피지> 피지> 도움말 업데이트 ImageJ에 피지> 도움말 : 피지를 업데이트합니다. 주 ImageJ에 피지 업데이트 사이트를 사용합니다.
- 하나의 폴더에 전체 데이터 집합을 전송합니다. 결과 및 처리의 중간 파일은이 폴더에 저장됩니다. 멀티 뷰 재건 응용 프로그램을 시작합니다 : 피지> 플러그인> 멀티 뷰 재건> Multivi을EW 재건 응용 프로그램.
- '새 데이터 집합을 정의'를 선택합니다. 데이터 세트의 유형으로 MEU 옵션 "자이스 Lightsheet Z.1 데이터 집합 (궤적 Bioformats)"을 선택하고 .xml 파일의 이름을 만듭니다. 그런 다음 데이터 세트 (인덱스가없는 즉, 파일)의 첫 번째 .czi 파일을 선택합니다. 또한, 화상 데이터뿐만 아니라, 기록의 메타 데이터를 포함한다.
참고 : 프로그램이 처음 .czi 파일을 엽니 다되면, 메타 데이터가 프로그램에로드됩니다. - 각도, 채널, 조명의 수 있음을 확인하고 메타 데이터에서 복셀의 크기를 관찰합니다. 피지의 오류 메시지를 표시, 처리 및 그 결과의 'ViewSetup 탐색기'와 콘솔의 진행 상황을 보여주는 로그 창 : OK 키를 누른 후, 열려있는 세 개의 창 (그림 1C)을 관찰한다.
참고 : 'ViewSetup 탐색기'각 뷰, 채널 및 조명을 보여주고의 선택을 할 수있는 사용자 친화적 인 인터페이스 관심있는 파일입니다. 또한, 'ViewSetup 탐색기'는 모든 처리 단계의 조정을 허용한다. - 처리해야하고 탐색기에 마우스 오른쪽 버튼을 눌러 파일을 선택합니다. 다른 처리 단계 (그림 1C) 열린 창을 준수하십시오.
- 데이터 집합을 정의하면, 데이터가있는 폴더에 .XML 파일이 생성되는 것을 관찰합니다.
참고 :이 파일은 이전에 확인 된 메타 데이터가 포함되어 있습니다. - 오른쪽 상단에 두 개의 버튼 '정보'를 관찰하고 '저장'. '정보'를 누르면 .xml 파일의 내용의 요약을 표시합니다. 누르면 처리 결과를 저장합니다 '저장'.
참고 : 다른 처리 단계가 필요로하는 '멀티 뷰 재건 응용 프로그램'의 처리가 피지를 닫기 전에 .XML에 저장되는 동안.
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그림 1 : 멀티 뷰 재건 워크 플로우 및 관심 지점 검출 (A) 형광 구슬 영상을 기반으로 라이트 시트 정렬.. 비드 화상 XZ 및 YZ 돌기에 대칭 모래 시계 형상을 갖는 때,이 시스템은 (중앙) 정렬된다. 어느 한 방향으로 잘못 정렬 된 빛 시트의 예는 왼쪽과 오른쪽에 표시됩니다. XZ에서 500 나노 구슬의 최대 강도 예측, YZ 및 XY 축이 표시됩니다. lightsheet 올바르게 오정렬 상황에 비해 정렬 될 때 사이드 로브로 (XY)에 에어리 디스크의 중심 피크의 강도의 비율이 더 큰 참고. 이미지는 0.7 줌에 20X / 1.0 W 목표로 촬영되었다. 스케일 바 5 μm의를 나타냅니다. (B) 데이터 집합을 정의하고 HDF5 형식으로 다시 저장된다. 구슬은 분할 후 등록됩니다. 시계열의 각 시점은 기준 시점에 등록된다. 데이터는 마지막으로 융합단일 등방성 볼륨. (C, 상단)에 ViewSetup 탐색기 시점, 각도, 채널 및 데이터 세트의 조명면 다른 보여줍니다. BigDataViewer 창은 ViewSetup 탐색기에서 선택한보기를 보여줍니다 (C는 낮은 코너를 왼쪽). (C는 중간 오른쪽) 오른쪽 ViewSetup 탐색기에 클릭은 처리 옵션을 엽니 다. (C는 하부 우측 모서리)을 진행하고, 처리의 결과를 로그 파일에 표시된다. (D 및 E) 검출의 목적은 여기에 대화 형 비드 분할에서 스크린 샷으로 표시 가능한 샘플에서와 같이 작은 탐지와 세그먼트에 많은 관심 포인트 (구슬)이다. (D 및 E, 왼쪽 상단)을 분할은 두 개의 매개 변수, 시그마 1 임계 값의 차이 - 중 - 가우스 값에 의해 정의된다. (D) 정확하게 검출 비드의 확대 볼 수있는 성공적인 검출의 예. 너무 많은 오탐 (false positive)과 하나의 구슬의 여러 탐지와 (E) 분할. (C)의 스케일 바는 50 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- HDF5 형식으로 데이터 집합을 다시 저장
- 전체 데이터 집합을 다시 저장하려면 Ctrl 키 / 애플 + a와 마우스 오른쪽 클릭으로 모든 파일을 선택합니다. 그런 다음 다시 저장 데이터 세트를 선택하고 HDF5있다.
- 창이 현재 데이터 세트의 모든 뷰가 다시 저장됩니다 경고 표시가 나타납니다. 를 눌러 예.
참고 :이 프로그램은 모든 파일을 열고 HDF5 포맷의 다른 해상도 수준을 다시 저장하여 HDF5에 .czi 파일을 다시 저장하는 것입니다. 완료되면 '완료'로 확인됩니다. usuall 다시 저장Y는 평가시기 당 몇 분 소요 (표 1 참조).
참고 : HDF5 형식의 파일을 매우 빠르게로드 할 수 있기 때문에,이 '(온 / 오프) BigDataViewer의 표시'탐색기에 '마우스 오른쪽 버튼으로 클릭'및 전환에 의해 등록되지 않은 데이터 집합을 볼 수있게되었습니다. BigDataViewer 창은 선택한보기 (그림 1C)로 표시됩니다. BigDataViewer (33)의 핵심 기능은 표 2와 http://fiji.sc/BigDataViewer 설명한다.
- 관심 포인트를 감지
- 관심 지점을 검색 선택 Ctrl 키 / 애플 + A의 모든 시점을 선택하고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭.
- 선택의 차이-의 가우시안 (34) 관심 포인트 검출의 유형. 비드 기반의 등록 상표 관심 지점에 대한 필드에 여기 입력 "구슬"을 사용하기 때문에. '분할하기 전에 이미지를 다운 샘플링'활성화합니다.
- 다음 창에서, DET을 관찰ection 설정. '서브 픽셀 현지화'사용 '3 차원 차에 맞는'(34)와 비드 분할 사용 '을 i'nterest 포인트 사양의'대화 '의 차이 - 중 - 가우스 값과 반경을 확인하는.
- '다운 샘플링 XY'사용 '대전 Z 해상도 (이하 다운 샘플링)'과 '다운 샘플링 Z'사용 1 ×합니다. Z 방향 스텝 사이즈는 따라서 단순히 다운 Z 해상도가 충분한 일치하도록 XY 샘플링은 XY 픽셀 크기보다 크다. 'CPU (JAVA)의 계산'을 선택합니다. 를 눌러 'OK'.
- 팝업 창에서 드롭 다운 메뉴에서 매개 변수를 테스트하기위한 하나의보기를 선택합니다. 뷰가로드되면, 밝기 및 피지와 윈도우의 대비> 이미지를 조정> 조정> 밝기 / 대비 또는 비드 검출 Ctrl 키 + + C. 진드기에게 상자를 시프트 '최대 (녹색)에 대한 모습'.
- aroun를 'viewSetup'로 녹색 반지의 분할을 준수D를 탐지는 최소값에 대한 최대 값과 빨간색을 찾을 때. 분할은 두 개의 매개 변수, 시그마 1의 차이 - 중 - 가우스 값과 임계 값 (그림 1D)에 의해 정의된다. 세그먼트 샘플 주위에 많은 구슬과 수 (그림 1D)와 같은 샘플 내에서 적은 수의 오 탐지로 조정합니다. 한 번이 아니라 여러 번 (그림 1E)를 각각의 구슬을 감지합니다. 최적의 매개 변수를 결정한 후, 언론은 '완료'.
주 : 검출 시점의 각 뷰 로딩 비드를 분할함으로써 시작된다. 로그 파일에, 프로그램은 뷰당 검출 비드의 수를 출력한다. 검출은 수 초에 완료되어야한다 (표 1 참조). - 탐지의 양이 적절한있을 때이 버튼을 누르면 (보기 당 수천 600)를 저장합니다.
주 : 폴더가 데이터 디렉토리에 생성됩니다의 informatio를을 포함하는검출 된 비드의 좌표에 대한 N.
- 관심 포인트를 사용하여 등록
- Ctrl 키 / 애플 모든 시점을 선택 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 '관심 포인트를 사용하여 등록'을 선택하고를 +.
- '등록 알고리즘'으로 비드 검출을 위해 '빠른 3 차원 기하학적 해싱 (회전 불변)를'사용합니다.
참고 :이 알고리즘은 서로에 대해 서로 다른 견해의 방향 및 위치에 대한 사전 지식을지지 않습니다. - 서로 상보기의 등록은 '등록 형'으로 '개별적 시점들 등록'을 선택합니다. 선택한 채널에 '관심 지점'의 경우, 관심 지점에 대해 이전에 지정된 레이블은 지금 (즉, "구슬") 볼 수 있어야합니다.
- 다음 창에서 등록을위한 사전 설정 값을 사용합니다. '수정 타일 : 첫 번째 타일 다시 매핑하지 마십시오 사용 수정'을 선택하여 첫 번째보기를 수정 참깨 경우 (이것을 사용ES는 '타일을 다시지도'섹션에) 고정되지 않습니다.
- '정규화'와 함께 '아핀 변환 모델'을 사용합니다.
참고 : RANSAC에 대한 허용 오차는 5px 될 것이며, '기술자 경기에 대한 중요성은' '정규화'변환이 10 % 강성 및 90 있음을 의미 0.10의 람다,와 '강성 모델'을 사용 10. 될 것입니다 % 아핀 35. 확인을 눌러 등록을 시작합니다.
참고 : 로그 창에 표시되는 바와 같이, 먼저 각 뷰가 다른 모든 뷰와 일치합니다. 그런 다음 무작위 표본 컨센서스 (RANSAC) (36)는 대응을 테스트하고 오탐 (false positive)을 제외합니다. 강력한 등록 상기 RANSAC 값은 90 % 이상이어야한다. 두 뷰 사이 대응 진정한 후보 충분한 개수가 발견되면, 변환 모델의 화소의 평균 변위 각 일치간에 계산된다. 그런 다음 반복 글로벌 최적화를 수행하고 모든 전망된다 고정 뷰에 등록됩니다. 성공적인 등록으로 변환 모델은 계산 및 스케일링 및 픽셀의 변위로 표시. 평균 오차 최적 아래 1 (PX)과 등록 초 (표 1 참조)에서 실행되는 1에 가까운 변환의 스케일링되어야한다. - 샘플 내에서 미세 구조를 관찰 다른보기 사이에 변화, 예를 들어 세포막이 없음을 확인합니다. 그런 다음 .xml 파일로 각 뷰의 변환을 저장합니다.
주 : 지금 등록 인원이 BigDataViewer (도 2A)에서 서로 중첩되고, 비드 이미지뿐만 아니라 중첩한다 (도 2B). - > 최신 / 최신 변환을 변환 제거를 선택 후 시점이 바로 그들 클릭 선택하여 변환을 제거하고.
2 다시 "SRC ="/ 파일 / ftp_upload / 53966 / 53966fig2.jpg "/>
그림 2. 안식 재구성의 결과 (A)는 그 사이의 오버랩을 설명하는 다른 색에 등록보기 각 입혔다. (B)은 다른 관점에서 묘화 비드 PSFS의 중첩을 도시 한 도면을 확대. (C) 닫기 융합 후 비드의 폐쇄, PSF는 다른보기의 평균이다. 안식 디콘 볼 루션은 PSF 단일 포인트로 축소 보여주는 후 (C)에서와 같은 비드 (D) PSF. (E) XY 부와 멤브레인가 깊은 조직에 Z에서 신호의 GFP 보여주는 저하로 표지 된에 광학 소포의 단일 뷰 (F) YZ 섹션. (G) XY 부와 약간 더 degra으로 약 20도 떨어져 조회 수의 가중 평균 융합 후 동일한 뷰 (H) YZ 부전체 DED XY 해상도 만 증가 Z-해상도입니다. (I) XY 부 해상도와 XY 및 Z 모두 신호의 콘트라스트의 상당한 증가를 나타내는 안식 컨벌루션 후 동일한 데이터 (J) YZ 부. (EJ)의 이미지는 하나의 광 조각입니다. 스케일 바는 대표 50 μm의 (A, B, EJ) 및 10 μm의 (C, D). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 시간 경과 등록
- 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 시간이 지남에 따라 시간 경과 안정 '관심 포인트 사용 등록'을 전체의 시간 경과를 선택합니다.
- 에 '기본 등록 매개 변수 창 등록의 종류에 대한 하나의 기준 시점에 대한 일치 (전역 최적화)를 선택합니다'. 애의 EP t 그가 다른 설정 각 시점의 등록과 동일.
- 다음에창 시점을 선택하는 기준은 시간 경과의 중간에서 통상의 시점으로 사용한다. 각 시점에서 개별 뷰가 이미 서로에 등록 된 이후 확인란을 선택, '강성 단위로 각 평가시기를 고려'.
- '쇼 시계열 통계'에 대한 확인란을 선택합니다. 다른 등록 파라미터는 정규화를 포함하여 이전과 같이 남아있다. OK를 누릅니다.
참고 : 로그 창에서 동일한 출력이 각각의 시점 등록에서와 같이 표시됩니다. 각 시점에 대한 등록이 성공적이고 강력한 되었다면, RANSAC 해주기 99-100% 평균, 최소 및 최대 인 오류는 한 픽셀 이하이다. 진행하기 전에이 등록을 저장합니다.
7. 멀티 뷰 퓨전
참고 : 등록 단계에서 생성 된 변환은 여러보기에서 융합 등방성 스택을 계산하는 데 사용됩니다. 이 스택 하Z 방향의 간격이 XY 이제 원래 화소 사이즈와 동일하기 때문에, 원래의 데이터와 비교하여 Z 슬라이스의 수를 증가 s는. 융합은 콘텐트 기반 융합 안식 (21), (31) 또는 둘 다 안식 재구성 애플리케이션에서 구현 베이지안 기반 안식 컨벌루션 (31) 중 하나에 의해 수행 될 수있다.
- 경계 상자
참고 융합 따라서 바운딩 박스 크게 처리의 속도를 증가 정의함으로써 데이터 량을 줄이고, 계산적으로 고가의 공정 (표 1 참조).- 모든 시점은 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 '경계 상자를'정의 선택을 선택합니다. 'BigDataViewer과 정의'를 사용하고 경계 상자의 이름을 선택합니다.
- '분'모든의 '최대'의 슬라이더를 이동하여 관심의 영역을 결정하는 축하고 'OK'를 누릅니다. 경계 상자의 매개 변수가 표시됩니다.
참고 : 경계 상자는 내 모든 것을 포함투명 마젠타 층으로 중첩 된 녹색 상자.
- 콘텐츠 기반의 멀티 뷰 퓨전
주 : 콘텐츠 기반 안식 융합 (21) 대신에 단순 평균을 이용하여 더 나은 이미지 품질을 위해 더 높은 가중치를 고려 스택 위에 화질 차이 (Z에서의 신호, 즉 열화)을 취하고 적용된다.- 'ViewSetup 탐색기'에서 융합해야하는 시점 (들)을 선택하고 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 '이미지 퓨전 / 역대 합'를 선택합니다.
- 이미지 퓨전 창에서 드롭 다운 메뉴에서 '가중 평균 융합'을 선택하고 선택 '경계 상자에 대해 미리 정의 된 경계 상자를 사용하여'. 선택 융합 된 이미지의 출력을 위해 이미 HDF5 기존 파일에 새로운 HDF5 파일을 기록하고 함께 등록 융합 전망과 융합 된 이미지를 사용 할 수 있습니다, '현재 XML 프로젝트에 추가'. 를 눌러 'OK'.
- 그런 다음에 '경계 상자 & # 사전 정의39; 이전에 정의 된 경계 상자의 이름을 선택 창을 팝업하고 'OK'를 누릅니다.
- 다음 창에서 바운딩 박스의 매개 변수를 관찰한다. 빠른 융합 들어, 융합 데이터 세트에 다운 샘플링을 적용합니다.
참고 융합 스택이 일정 크기 이상이면, 프로그램은 메모리 효율적인 'ImageLib2 containe'r의 사용을 권장한다. 큰 데이터의 처리를 허용하는 'PlanarImg (큰 이미지 표시하기 쉬운) 또는 CellImg (큰 이미지)'컨테이너에 대한 'ArrayImg'에서 전환합니다. 그렇지 않으면 미리 정의 된 설정을 사용하고 '혼합 및 콘텐츠 기반의 융합'을 적용한다. 'OK'를 눌러 진행합니다. - 다음 창에서 HDF5 설정을 확인하십시오. 미리 정의 된 매개 변수를 사용하여 융합 과정을 시작합니다. 피지에 충분한 메모리를 할당 한 것을 확인 편집> 옵션> 메모리 및 스레드.
- 멀티 뷰 역대 합
참고 : 멀티 뷰 역대 합 (31)는 anot이다멀티 뷰 융합의 그녀의 유형입니다. 여기에 부가 적으로 융합하기 위해 이미징 시스템의 PSF는 신호의 화상 및 수율 증가 해상도와 콘트라스트 deconvolve하기 위해 고려된다 (도 2C-J,도 5와 Movie 3 비교).- 시점 (들) deconvolved 할을 선택하고 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고를 눌러 '이미지 퓨전 / 역대 합'.
- '멀티 뷰 역대 합'사용 '미리 정의 된 경계 상자를 현재 XML 프로젝트에 추가'를 선택합니다. 경계 상자를 선택하고 계속합니다.
주 : 디콘 볼 루션에 대한 사전 정의 된 파라미터 좋은 출발점이다. 첫 번째 시험 사용 '20 반복 디버그 모드 '및를 이용하여 상기 컨벌루션의 영향을 평가'. 마지막에 512 X 512 X 512 블록에 계산을 설정합니다. - 다음 창에서 미리 정의 된 설정을 사용합니다. 모든 '5 ITE 결과를 표시하기 위해'디버그 모드 '를 설정식료품'.
주 : 컨벌루션의 출력 그러나 BigDataViewer는 현재 16 비트 데이터를 지원하는 32 비트 데이터이다. 기존 HDF5 데이터 세트에 디컨 볼 루션의 출력을 추가하기 위해, 16 비트로 변환한다. - 변환의 경우, 실행 '(시간이 지남에 따라 강도를 포화 수) 첫 번째 이미지의 최소 / 최대 사용'.
주 : 디컨 볼 루션 다음 이미지를로드하고 디컨 볼 루션을 위해 그들을 준비하여 시작합니다.
- BigDataServer
- 매우 큰 XML을 공유하기 위해 / HDF5 데이터 세트는 HTTP 서버 BigDataServer (33)를 사용합니다. 같은 서버에 연결 설정하는 방법과에 대한 소개는 http://fiji.sc/BigDataServer에서 찾을 수 있습니다.
- 기존 BigDataServer 열려 피지> 플러그인> BigDataViewer> BrowseBigDataServer에 연결합니다.
- 창에 포트를 포함하는 URL을 입력합니다.
주 :이 책에서 설명하는 동영상이 광고를 통해 액세스 할 수 있습니다드레스 : http://opticcup.mpi-cbg.de:8085 - 사용 가능한 영화를 선택하는 허용하는 창을 준수하십시오. 더블 BigDataViewer 창을 열고 전술 한 바와 같이 데이터를 보려면 클릭하십시오.
보충 : 시작하기 전에 필요한 소재의 체크리스트
- 제브라 피쉬 배아 / 형광 단백질을 발현 유충 (메틸렌 블루없이 제브라 피쉬 E3 매체에 배아를 보관하십시오. 단계의 경우 24 시간 이상 된 0.2 mm의 최종 농도 PTU를 추가하여 색소 침착을 방해.)
- 형광 입체경
- (블랙 마크 20 μL 볼륨) 모세 혈관 적절한 플런저 (모세 혈관을 재사용하지 마십시오. 플런저는, 다른 한편으로는, 여러 실험을 위해 재사용 될 수있다.)
- 1.5 ml의 플라스틱 튜브
- 날카로운 핀셋
- 유리 (화재 광택) 또는 플라스틱 피펫 (플라스틱은 24 시간 이상 배아 사용할 수 있습니다)
- 유리 또는 플라스틱 접시 지름 60mm (플라스틱이 될 수 있습니다24 시간 이상 배아 사용)
- 이 100 ㎖ 비커
- 주입을위한 150cm 연장 호스 50 ㎖ 루어 잠금 주사기 (호스와 주사기는 미생물에 의한 오염을 방지하기 위해 실험 사이에 완전히 건조 보관해야합니다.)
- 플라 스티
- 저 융점 (LMP) 아가로 오스
- E3 매체 (5 mM의 염화나트륨, 0.17 밀리미터의 KCl, 0.33 mM의 염화칼슘 2, 4, 0.33 mM의 황산)
- MS-222 (Tricaine)
- 페닐 티오 요소 (Phenylthiourea) (PTU)
- (여기서 비드라고도 함), 형광 마이크로 스피어
- 두 번 증류 H 2 O (DDH 2 O)
Representative Results
LSFM 비늘에 걸쳐 개발 프로세스를 이미징을위한 이상적인 방법입니다. 몇몇 애플리케이션은 세포 구조뿐만 아니라, 세포 및 조직 전체의 짧은 두 장기 영상을 도시 여기 컴파일된다. 이러한 예는 LSFM은 망막 신경에 광학 컵 형성에서 눈 개발의 여러 단계에서 유용한 도구가 있음을 보여줍니다. 영화 1은 처음에 그대로 배아의 축소보기를 보여주는, 일반 LSFM 방법의 예시로 제공 시야에서 아가로 오스 실린더를 삽입하고 나중에 형광 채널에서 망막의 상세도를 나타내는.
영화 1 :. 제브라 피쉬 망막의 LSFM LSFM 접근 방식을 설명하기 위해,이 영화는 배아이 (가) 내부에 그대로 영상화 된 시야에서 처음으로 보여줍니다형광로 전환하기 전에 실린더를 garose. 나중에는보기의 큰 필드가 전체 망막의 관찰을 가능하게 것을 알 수있다. 다음으로, 영화는 좋은 세포 내 해상도를 강조하기 위해 망막의 확대 작은 영역을 보여줍니다. Ath5 : 갭 37 GFP 형질 전환 지브라 피쉬 배아 촬상을 위해 사용되었다. 이 유전자는 망막 (주로 신경절 세포 감광체 전구체)에서 다른 뉴런 라벨. 영화의 형광 부분은 5 분 간격으로 40 배 / 1.0 W 목표를 사용하여 이중 양면 조명으로 촬영 단일보기로 체포됐다. 30 μm의 두께 볼륨의 최대 강도 투사가 표시됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
동영상이 매우 빠른 세포 내 이벤트를 높은 해상도로 캡처 할 수있는 방법을 보여줍니다; 미세 소관의 성장에서이 때그들의 플러스는 망막 신경 전구 세포에 끝납니다. 영화에 포함 된 정보는 미세 소관 플러스 엔드 성장의 추적 및 정량이 가능합니다.
영화 2 :. 단일 셀의 미세 소관 역학이 영화는 플러스 팁 마커 단백질 EB3-GFP (38)에 의해 표시된 미세 소관의 플러스 팁을 성장 캡처. 단백질은 단일 망막 전구 세포에서 발현된다. 미세 소관이 기저에 혀끝에서 방향으로 주로 성장하고있다 (위에서 아래로). EB3 혜성의 평균 속도는 0.28 ± 0.05 μm의 / 초로 측정 하였다. 높은 미세 소관 핵 활성을 갖는 세포의 근단 측의 밝은 점은 중심체이다. 야생 형 배아는 HSP70로 주입 : EB3-GFP 플라스미드 DNA. 영화는 약 28 hrpost의 fertiliz에서 열 충격 (37 ° C에서 15 분) 후 4 시간을 인수 한ATION 63X / 1.0 W 객관적이고 1 초 시간 간격을 사용하여 단면 조명으로 촬영 단일보기로 (HPF). 단일 셀은 망막의 대부분을 덮는 시야에서 자른 하였다. 두 조각의 돌기가 표시되는 최대 강도. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3은 어떻게 세포 내 구조물은 많은 시간에 걸쳐 올 수 있습니다. 여기에, 망막 신경절 세포 (망막 신경절 세포)를 전좌 내 중심체가 캡처됩니다.
그림 3 :. 망막 신경절 세포의 전위 동안 중심체 현지화는 시간 경과 실험이 몽타주는 망막 신경절 세포 (RGC) 성숙에 걸쳐 중심체의 위치를 보여줍니다.신경 전구 세포의 중심체는 혀끝의 과정 (1시)의 매우 팁에서 지역화됩니다. 세포 분열 동안, 두 중심체는 유사 분열 스핀들 (2시 25분)에 대한 극 역할을합니다. 이 부서는 RGC와 시각 세포 전구체가되는 둘째 딸 세포로 분화 한 딸 셀에 발생합니다. 꼭대기 처리가 근단 측에 부착 한 채로 분할 후, RGC의 세포체는 망막의 기부 측으로으로 전위. RGC는 기저 측에 도달하면, 그 정점 처리는 분리와 중심체는 (6시 15분)로 이동한다. 서서히 혀끝의 과정 (6시 50분 7:20 8:10)과 함께 후퇴하는 동안 중심체가 올 수 있습니다. 중심체가 여전히 치근단 지역화 된 상태에서 마지막 프레임에서 (8:55) 신경절 세포는, 그 기저 측면에서 축삭을 성장하고있다. 모자이크 발현 한 세포 단계에서 야생형 수정란에 플라스미드 DNA 주입에 의해 달성 하였다. 세포는 Ath5 시각화되어 GFP-caax (녹색) CONST망막 신경절 세포와 다른 신경 세포 레이블 ruct. 중심체 (화살촉)는 Centrin-tdTomato 29 식 (마젠타)로 표시되어 있습니다. 망막의 정점면은 아래쪽의 화상의 상부 및 기부 쪽이다. 30 μm의 두께 볼륨의 최대 강도 투영 도시된다. 이미지는 전체 망막을 다루는 영화에서 잘립니다했다. 영화는 약 34 시간 게시물 수정 (HPF)에서 시작한다. A에서 Z 스택은 40X / 1.0 W의 목적으로 매 5 분을 인수했다. 시간은 HH에 표시됩니다 : mm입니다. 스케일 바는 10 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4에 표시하고, 이러한 영화 1과 전체 조직을 촬상 데이터로부터 추출 할 수있는 방법을 단일 셀 동작. RGC의 전좌 쉽게 추적 및 정점과 기저 처리 될 수있다ES는 다음에.
도 4.도 3에 기술 된 바와 같이 하나의 망막 신경절 세포의 전좌 망막의 기저 측으로 혀끝에서 RGC 전위 터미널 분열 후에 발생하는 RGC는 Ath5의 식으로 분류된다. 갭-GFP 37 유전자. 30 μm의 두께 볼륨의 최대 강도 투영 도시된다. 이미지는 전체 망막을 다루는 영화에서 잘립니다했다. 영화는 약 34 HPF에서 시작한다. A에서 Z 스택은 40X / 1.0 W의 목적으로 매 5 분을 인수했다. 시간은 HH에 표시됩니다 : mm입니다. 스케일 바 5 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5는 조직 SC를 캡처 안식 LSFM의 능력을 입증광 소포는 눈 컵으로 변환하는 동안 광학 컵 형태 형성의 예에 휴대 해상도와 에일 형태 형성 과정. 화질이 크게 최종 화상 해상도 등방성 한 Z 스택에 (이 경우) (5) 다른 관점에서의 정보를 결합한다 다안 촬상에 의해 개선 될 수있다. 이 도면은 멀티 뷰 컨벌루션 후 가중 평균 융합 및 이미지 콘트라스트의 추가 이득 및 해상도 후의 화상 품질의 향상을 나타낸다. 그림은 데이터 세트를 통해 서로 다른 방향에서 두 개의 광학 조각을 보여줍니다. 또한, deconvolved 데이터 세트에서 몽타주는 시간이 지남에 따라 광 컵 형태 형성을 보여줍니다. 모든 시점이어서 영화 3에 나타낸다.
그림 5 : 단일보기와 multiv의 두 가지 방법 사이의 화질 비교서평 융합. (A) 측면도 및 (B) 등의보기에서 표시 단일 뷰의 데이터를 하나의 광 조각. 스트라이프 유물과 샘플 내부의 깊은 신호의 저하는 분명하다. 또한, 데이터 융합 (CF)에서 보이는 이미지의 일부는 특정 뷰에서 포착되지 않았다. (C) 같은 광학 슬라이스, 다안 융합 데이터 측면도 및 (D) 등의보기에서 표시 해주기있다. 스트라이프 유물을 억제하고 샘플에 깊은 구조를 더 잘 해결되어 있습니다. (E) 같은 광학 슬라이스 이제 안식는 측면도 및 (F) 등의보기에서 표시된 데이터를 deconvolved있다. 개별 세포막과 핵 잘 구별 할 수 있도록 증가 대비 및 해상도를합니다. 해상도는 샘플 내부에 특히 깊은 저하되지 않습니다. 데이터 집합은 약 20도 떨어져 5보기에서 이중 양면 조명에 인수되었다. AB의 z 스택1.5 μm의 스텝 크기 100 ㎛의은 20X / 1.0 W 목적으로 10 시간 동안 10 분 간격으로 각 뷰에서 취득한 아웃. 안식 융합 디콘 볼 루션에 대한 입력 이미지는 아래의 화상 처리 속도를 2 × 샘플링 하였다. 안식 디컨 볼 루션의 15 반복 실행 하였다. (G) 몽타주는 광학 컵 무대에 광학 소포에서 일찍 눈 개발하는 동안 형태 발생 이벤트를 강조하는 deconvolved 데이터로부터 지느러미보기의 자른 영역을 보여줍니다. 초기 비슷한 원주 상피있는 광섬유 소포의 두 층은 별개의 세포 집단으로 분화. 표피에 가까운 말단 층은 망막 neuroepithelium (RN) 및 신경 튜브에 가까운 근위부 층은 망막 색소 상피 (RP)하게된다. 감소 임시 신장 및 invaginate의 셀은 광 컵 (5시에서 1시 40분까지)을 형성하는 단계; 동시에 RP 세포 평평. 표면 외배엽은 WH, 렌즈 (1:40)을 형성하도록 유도무형 문화 유산 invaginates 이상 (5시). 영화는 17 HPF에서 시작한다. 시간은 HH에 표시됩니다 : mm입니다. 모든 세포막은 β - 굴지으로 표시되어 있습니다 : RAS-GFP의 유전자와 모든 핵은 HSP70에 의해 표시되어 있습니다 : H2B-RFP 형질 전환 유전자. 스케일 바는 30 μm의를 나타냅니다. FB의 전뇌, LE 렌즈, 영업 이익 후각 placode, RN 망막 neuroepithelium, RP 망막 색소 상피. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
영화 3 : 광학 컵 형태 형성은 단일보기와 안식 융합의 두 가지 방법으로 표시된 시간 경과 영화는 광학 컵 무대에 광학 소포에서 광학 컵 형태 형성의 전체 프로세스를 보여줍니다.. 그것은 측면도 (위)와 지느러미보기에서 하나의 광학 슬라이스 (아래)에서 단일 광학 슬라이스를 보여줍니다. 현상 광섬유 소포 세포를 최종적으로 내부 및 외부 망막 neuroepithelium 망막 색소 상피 반구형 광섬유 컵을 형성하기 위해 복잡한 재 배열을 겪는다. 렌즈는 표면 외배엽 형성된다. 그것은 neuroepithelium와 함께 invaginates 및 광학 컵에 앉아있다. 모든 세포막은 β - 굴지의 식으로 표시됩니다 RAS-GFP (녹색) 유전자와 핵는 HSP70으로 표시됩니다 H2B-RFP (마젠타). 영화는 약 17 HPF에서 시작한다. 데이터 집합은 20X / 1.0 W의 목적으로 매 10 분을 취득한 약 20도 떨어져 5보기에서 이중 양면 조명으로 약 100 μm의 스택 AZ 인수되었다. 시간은 HH에 표시됩니다 : mm입니다. 스케일 바는 50 μm의를 나타냅니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
데이터 수집 1. 중요한 단계 및 문제 해결
GFP의 발현 및 샘플 RFP의 일반적인 촬상 설정 원통형 렌즈에 의해 형성된 광 시트는 정적 설명한 현미경 설정, 표 3에서 볼 수있다. 두 조명 목적은 공기 렌즈이며, 검출의 목적은 물에 침지 렌즈이다. 20X / 1.0 또는 40X / 1.0 목표에 1.0을 확대하는 것은 230 내지 115 나노 미터 픽셀 크기는 각각 441 X 441 μm의 또는 221 X 221 μm의의 시야를 제공합니다. 2 : 비율 1 국경 센터 기본 광 시트 두께를 사용하는 것이 좋습니다. 20X / 1.0이 두께는 4.5 μm의 및 40X / 1.0 중앙 μm의 3.2에 대한 대응한다. 이미징 속도 차 우선 순위가 아닌 경우, 채널들 사이의 형광 발광의 크로스 토크를 방지하는 다색 샘플의 경우에는 별도의 트랙을 사용한다. 취득 최고 속도가 Z에 의해 단계 50 밀리 초에 한정Z 축 드라이버의 이동 속도. 목표 등의 경우에 최대 촬상 속도를 달성하는 경우, Z 스텝 당 찍은 모든 이미지의 합이 50 밀리 초 이하가되도록, 이중면 조명 두 트랙은, 노광 시간이 설정되어야한다. 단일 이미지 Z 스텝마다 취득하는 경우 한편, 이는 50 밀리 초보다 짧은 노출 시간을 설정하는 것이 유익하지 않다.
| 1920 X 1920 이미지 크기 |
| 16 비트 |
| 피벗에 스캔 |
| 온라인 융합 이중 양면 조명 |
| 10X / 0.2 조명 목적 |
| 20X / 1.0 W-플랜 고차 색지움 검출 대물 |
| 트랙 1 : 여진 488 nm의 통상적 100 mW의 레이저의 2 %, 550 nm의 발광 SP 필터 |
| 트랙 2 : 여진 561 nm의 일반적으로 3 %의 75 mW의 레이저 (58)5 nm의 발광 LP 필터 |
| 100 밀리 초 노출 시간까지 |
| Z 스택 두께 50 ~ 100 μm의 |
| 연속 Z 구동 모드에서 1.5 μm의 Z 스텝 사이즈 |
| 28.5 ° C에서 배양 |
표 3 : 설정 이미징.
실험 후 샘플을 검사
이 시험편은 아직 실험 끝에 정상인지 확인하는 것이 중요하다. 첫 번째 판독으로, 입체경에서 시편의 심장 박동을 확인합니다. 날카로운 집게 한 쌍의 시료 아가 취출 할 수 있고,이 촬상에 의해 영향을받는 경우를 확인하기 위해 추가 개발 인큐베이터로 옮겼다. 대안 적으로, 항체 염색을 위해 고정 될 수있다.
설치 및 드리프트
실 (S)의 삼투압을 유지하는 것이 필수적이다그렇지 않으면 / 부종 아가로 오스와 발생 샘플의 후속 불안의 감소, 가까운 매립 아가로 오스의 삼투압에 olution. 따라서, 챔버를 채우기 위해 동일한 용액 (메틸렌 블루없이 E3 매체)를 사용하고, 1 % 저 융점 아가로 분액을 제조 하였다. 그것의 겔화 특성을 잃을 수있는 또한, 2 개 이상의 시간 동안 70 ° C 가열 블록의 아가로 오스를 두지 마십시오.
이 배아의 열 충격 반응 또는 사망으로 이어질 수있는, 너무 뜨거운 아가로 오스로 물고기를 포함하지 마십시오. 배아에 따뜻한 아가로 오스의 효과에 대해 확신하는 경우, 꼬리가 구부러지지 않는과 심장 박동이 진정되지 않는 것을 확인합니다. 이 경우, 실험에 다른 배아를 사용한다.
샘플 짧은 (약 2 cm)와 아가로 오스 컬럼의 전체 길이를 유지하고 플런저 팁을 지향 머리로 제브라 피쉬를 탑재합니다. 마찬가지로, 아가 실린더는 capill로부터 압출진은 가능한 짧게 유지되어야한다. 이러한 조치는 영화에 걸쳐 샘플의 안정성을 보장한다. 이 큰 굴절과 반사를 야기 같이 유리 모세관 자체가 광 경로로 도달하지 않도록 동시에, 아가 로스 컬럼 충분히 길어야한다.
샘플의 초기 드리프트 아가 실린더 자체의 체적 변화에 의해 야기된다. 플런저의 슬라이딩하는 것은 이유가 아닙니다. 따라서, 플라 스티 나 매니큐어와 플런저를 해결하는 데 도움이되지 않습니다. 배아가 너무 인해 자연 성장 영화 동안 위치를 변경 될 수 있습니다. 따라서, 시야의 중앙에 관심 영역의 중심 및 이들의 움직임을 수용하기 위하여 가장자리에 약간의 공간을 유지하는 것이 바람직하다.
광로의 매립 매체의 감소량
제대로 샘플을 배향하는 최상의 이미지 품질 15을 달성하는 데 도움이됩니다. 유전자집회는 여기 및 방출 빛이 가능한 한 적은 조직 및 장착 미디어를 통해 이동해야합니다. 최적의 솔루션은 아가없이 장착된다. 이것은 메인 루트가 phytagel에 장착하고 좌우 뿌리이어서 완전히 겔 컬럼에서 성장할 수 있도록하고있는 애기 횡 루트 촬상 14에 대한 설치 예를 달성 하였다. 아가로 오스 프리 실장은 이일 (12)를 통해 Tribolium 비틀의 전체 배아의 영상을 위해 개발되었다. 이미지 품질을 개선하는 경우의 기본 동기 아니었다. Tribolium 배아는 단순히 충분히 아가로 오스 내부에 생존하지 않습니다. 절대적으로 삽입 미디어 무료 장착은 제브라 피쉬의 장기 이미징 달성되지 않았습니다. 그럼에도 불구하고, 우리는 사실을 이용할 수있는 아가 응고가 가장 배아 하나 아가 깊은 위치 눈 매립 컬럼의 표면 부근에 상기 제 2 눈으로 모세관에 비스듬히 배치되는 경우. 티표면에 가까운 그 눈이 우수한 이미지 품질을 제공하며, 따라서 우선적으로 묘화한다.
아가 로스 농도 장기 이미징
장착 아가 로스의 농도는 시료의 안정성과 산소의 태아 성장과 확산을 수용 할 가능성 사이의 타협이다. 1 % 아가 로스 농도 이상을 사용하여 샘플의 안정성에 추가 이득이 없다. 실험을 최적화하기위한 출발점으로 우리는 1 % 아가 로스에 장착하기에 너무 섬세 미만 24 HPF의 배아에 적합한 0.6 % 아가로 오스를 권장합니다. 이전 배아와 유충 마취시키다 위해, MS-222 농도는 부작용없이 13 μg의 200 / ㎖로 상승 될 수있다.
이 배아 및 CAUS의 성장을 제한하기 때문에 경우 개발 배아는, 장착 아가로 오스는 권장하지 않습니다, 이상 ± 12 시간 동안 몇 군데 있습니다꼬리 변형을 말이지. 이 문제는 13,39 물을 유사한 굴절률 FEP 폴리머 튜브에 배아를 장착하여 제브라 피쉬에 대한 해결되었다. 마우스 배아 한편, 아가 중공 실린더 (40) 나 주사기 (41)에 부착 된 아크릴로드의 구멍에 고정 될 수있다. FEP 튜브 장착 튜브의 벽은 아가로 오스보다 빛이 약간 더 굴절 때문에,하지만 기본 방법으로 사용하지 않는 것이 좋습니다.
라이트 시트 정렬
좋은 이미지 품질을하여도 모든 실험 전에 자동 광 시트 정렬을 수행하는 것이 중요합니다. 줌 설정이 변경된 경우 특히 목적은 취출하고, 또는 다른 액체 챔버에 사용 하였다.
조명
빛 시트의 피벗 스캔이 항상 활성화되어야한다. 큰 산란 시험편 들어, 온라인 F와 이중면 조명을 적용 할 필요가있다usion보기의 들판을 가로 질러에도 조명을 달성했다. 이중면 조도는 배아의 렌즈에 의해 입사광 시트의 굴절률이며 눈 영상의 특정 문제를 감소시킨다. 더 작고 산란 시험편 효율적 절반 촬상 시간을 단축하고 양면 이중 조명에 비해 약간 더 나은 이미지 품질을 초래할 수있는 하나의면 조명을 이용하여 이미징 될 수있다. 두 아암 용 조명 광로 항상 상이하고보다 효율적인 하나가 선택 될 수 있기 때문이다. 또한, 각각의 측면에서 오는 두 개의 빛 시트를 융합 한 후 흐림 약한 원인이 하나의 평면에 완벽 적이 없습니다. 성장하는 미세 소관 (동영상 2)와 같은 매우 빠른 세포 내 이벤트의 경우, 이중 양면 조명 모션 블러가 발생할 수 있습니다 순차적으로, 취득 왼쪽과 오른쪽에서 조명 이미지 때문에, 적합하지 않습니다.
광표백및 광독성
이하의 형광 광표백 종종 LSFM의 큰 장점으로 언급된다. 우리는 목표는 전혀 광표백 없어야한다고 주장한다. 실시간 이미징 실험 띄는 광표백이있는 경우, 시료는 허용 레이저 노광의 생리 학적 범위에서 이미 아마. 회전 디스크 현미경의 제브라 피쉬 배아를 이미징 할 때, 우리의 경험, 높은 광독성도 크게 형광 신호 표백제 전에 배아 발달을 멈출 수 있습니다. 광표백 거의 또는 전혀 관찰되도록 따라서 LSFM에서 촬상 설정을 조정한다. LSFM 샘플 완만해도, 그 이후의 데이터 분석을위한 충분한 잡음 비율로 신호를 달성하는데 필요한만큼의 레이저 파워 및 노출 시간을 사용하는 것이 현명하다.
Z 스택, 시간 간격 및 데이터 사이즈
LSFM 의해 생성 된 파일은 일반적으로 매우 크다; 때로는 테라 바이트 범위이다. 이미지 품질 및 데이터 크기 사이의 타협을 만드는 것이 필요하다. 특히 시간 경과 인수에 스택 및 간격의 Z 간격에 해당합니다. 는 z 간격을 정의하려면 Z-스택 도구 탭에서 최적의 버튼을 이상적으로 데이터 세트 나중에 deconvolved됩니다 특히, 사용되어야한다. 이것은 주변 광 조각 사이의 50 % 오버랩을 달성하기 위해 간격을 산출한다. 그럼에도 불구하고, 다소 큰 Z 간격은 일반적으로 허용됩니다. 이들은 Z 스택뿐만 아니라 최종 파일 크기를 획득하는데 필요한 시간을 감소시킨다. 최적의 시간 샘플링 관심의 과정에 따라 달라집니다. 전체 눈을 위해 개발 5 ~ 10 분 간격으로 일반적으로 허용됩니다. 일부 구조를 자동으로 추적 할 수있는 경우, 이후의 시점 충분히 유사해야한다.
형광 구슬
형광 구슬은 주로 다른 뷰를 등록하는 등의 기준 마커를 제공서로 상에 다 관찰 데이터 세트의. 항상 철저하게 사용하기 전에 비드 솔루션을 소용돌이. 이 형광 염료의 손실을 초래할 수있는 구슬을 가열하지 마십시오. 안식 등록 최적 비드 농도를 실험적으로 결정되어야한다. 설명 된 플러그인은 각 뷰에 걸쳐 약 1,000 검출 구슬 가장 잘 작동합니다. 큰 (500 내지 1,000 ㎚) 구슬은 작은 (500nm 이하) 구슬보다 더 견고하게 검출된다. 큰 구슬 밝게하며 샘플 구조 오 탐지없이 세그먼트 쉽기 때문이다. 큰 비드의 단점은 최종 융착 deconvolved 이미지에서 매우 눈에 띄는 것으로된다. 각각의 새로운 형광 마커를 들어, 적절한 비드 크기 및 형광 방출을 최적화한다. 그림 5와 영화 (3)로부터 샘플의 예를 제공하기 위해, 100 nm의 녹색 발광 구슬 막-GFP 채널에 너무 많은 오 탐지를 만들었지 만 1,000 Nm 적색 발광 비즈는 견고 샘플 내부의 매우 적은 양의 탐지와 H2B-RFP 채널에서 검출되었다. 비드 검출 형광 마커 채널에 실패한 경우에만 비드를 함유하는 별개의 채널이 획득 될 수 있지만, 이것은 매우 실용적이지 않다. 서브 해상도 크기 비드는 컨벌루션 (도 2C-D)에 사용할 수있는 현미경의 점 확산 함수 (PSF)를 직접 판독을 제공한다. 정렬 및 합성이 더 큰 비드 (예 : 1000 ㎚)로 작동하는 경우, PSF의 별도의 이미지 서브 해상도, 예를 들어, 100 nm의 비드를 얻을 수있다. 여러 가지 빛깔의 구슬을 사용하여 멀티 채널 획득의 등록 과정 및 채널 오버레이 완벽하게되는지 확인을 위해 도움이됩니다.
이후 멀티 뷰 등록 및 융합없이 하나의보기에서 이미징 때 형광 구슬의 추가가 필요하지 않습니다. 그러나, 이러한 경우에 구슬 있으면 초기시 도움이 될 수 있습니다리터 빛 시트 조정은 빛 시트의 품질을 확인하고 일반적으로 광학 수차를 공개 할 수 있습니다. 이러한 광학 수차가 손상되었거나 오염 목적, 아가로 오스의 챔버 또는 불균일의 더러운 창 같은 다양한 소스에서 발생 할 수 있습니다. 비즈는 안식 등록 피지 플러그 (20)에 의해 드리프트 보정에 이용 될 수있다.
멀티 뷰
안식 재구성 위해서는, 서로 대향하지 뷰 3 등 (5)의 홀수 번호를 취득하는 것이 좋다. PSFS가 서로 다른 방향에서 몇 군데 있기 때문에이 디컨 볼 루션을 향상시킨다. 플레이 중 충분한 오버랩이되는 시간 경과 수집의 시작을 확인하는 것이 중요하다. 이것은 가장 바로 첫 시점의 뷰가 성공적으로 등록 할 수있는 것을 확인, 즉, 경험적으로 이루어진다. 안식 수집의 목적은 해상도를 증가시킬 때큰 산란 표본의 이미지는, 각 뷰의 시료 전체 이미지에 바람직하지 않지만, 신호 열화가 샘플의 중심을 중지. 시험편의 후반부에서 저화질 취득 안식 재건술에 유용한 정보를 추가 할 것이다.
데이터 처리를위한 중요한 단계 2와 문제
현재 잘 문서화 채택하기가 비교적 쉬운 밝은 장 현미경 안식 데이터를 처리하기위한 여러 가지 가능성이 존재한다. 우리는 피지 (32) (스테판 Preibisch 게시되지 않은, 구현 된 오픈 소스 소프트웨어 인 다안 재구성 응용 프로그램 사용 링크 (1A) 및 Link1b 재료의 목록을). 이 플러그인은 이전 SPIM 등록 플러그인 (20)의 주요 재 설계하고, 검토BigDataViewer와 XML 및 SPIM 등록 워크 플로우와 HDF5 형식 (33) (그림 1B, 통합 Schmied 등. (42)에 의해 링크 2 , 링크 3 ). 본 출원은 또한 상당한 처리 속도 43 고성능 컴퓨팅 클러스터에 대해 적응 될 수있다. 이 다 안식 등록 신청 적극적 더욱 개발되고 향상 유지. 설명 된 소프트웨어에 대한 문제 또는 기능 요청의 경우, 각각의 GitHub의 페이지 (에 문제를 제기하십시오 링크 4 멀티 뷰 재건 및 링크 5 BigDataViewer를 들어).
두 번째 옵션은 현미경과 함께 사용할 수있는 상용 소프트웨어를 사용하는 것이다. 이 솔루션은 잘 작동 및 사용 다른보기를 등록 형광 비드를 사용하는 동일한 원리. 그러나, 빠른 BigDataViewer와 같은 전체 데이터 세트를 가시화하기위한 옵션이 부족하다. 또한, 소프트웨어는 클러스터에 적합한 소프트웨어에 대한 추가 라이센스를 구입하지 않는 다른 사용자에 대한 또 처리 블럭 현미경 수 없다.
또한 오픈 소스 소프트웨어입니다 세 번째 옵션은, 최근 켈러 실 (44)에 의해 출판 처리 및 광 시트 데이터의 다운 스트림 분석을위한 포괄적 인 프레임 워크를 제공했다. 이 소프트웨어는 따라서 샘플 주위 형광 비드의 존재를 필요로하지 않으며, 다안 융합을 수행하는 샘플 내의 정보를 사용한다. 그러나, 동시에 촬상 뷰 (목표)에 직교하는 방향을지지하므로는 임의의 각도 (44)로부터 취득한 데이터에 대해 사용될 수 없다.
하드웨어 요구 사항
ntent "> 처리를 위해 사용되는 하드웨어는 이미지의 취득 이후의 분석보다 빠르다. 앞서 실제 실험의 충분한 저장 용량을 사용할 수있는 데이터 처리에 대한 명확한 파이프 라인을이 있어야한다. 표 4에서 찾아 볼 수 있으며 쉽게 처리되지 않은 데이터 홍수하세요. 융합보기, 최대 강도 예측 또는 구형 돌기 (45)와 같은 모든 원시 이미지가 아니라 자른 버전 또는 처리 된 이미지를 저장할 종종 비현실적이다.| 프로세서 | 두 개의 인텔 제온 프로세서 E5-2630 (식스 코어, 2.30 GHz의 터보 15 MB, 7.2 GT / 초) |
| 기억 | 1백28기가바이트 (16 × 8 GB) 1600 MHz의 DDR3 ECC RDIMM |
| 혹사하다 | 4 × 4 TB 3.5 인치 시리얼 ATA (7.200 RPM) 하드 드라이브 |
| HDD 컨트롤러 | PERC H310 SATA / SAS 콘델 정밀에 대한 콘트롤러 |
| HDD 구성 | C1 SATA 3.5 인치, 1-4 하드 드라이브 |
| 제도법 | 듀얼 2기가바이트 엔비디아 쿼드로 4000 (/ 2 DP & 1w이 카드는 DVI-I 각) (2 DP-DVI & 2 DVI-VGA 어댑터) (MRGA17H) |
| 네트워크 | 인텔 X520-T2 듀얼 포트 10 기가비트 이더넷 네트워크 인터페이스 카드 |
표 4 : 하드웨어 요구 사항.
데이터 처리 속도
데이터 처리에 필요한 시간은 데이터의 크기와 사용 된 하드웨어에 좌우된다. 표 1에서는 4보기 2 채널과 1 시점 구성 예 8.6 GB의 다 관찰 데이터 세트 처리에서의 주요 단계에 필요한 시간의 개요를 제공한다.
| 가공의TEP | 시각 | 프로토콜 단계 |
| HDF5로 다시 저장 | 6 분 30 초 | 6.3 |
| 관심 포인트를 감지 | 20 초 | 6.4 |
| 관심 지점을 사용하여 등록 | 3 초 | 6.5 |
| 콘텐츠 기반의 멀티 뷰 융합 | 4 시간 | 7.2 |
| 멀티 뷰 디컨 볼 루션 (CPU) | 8 시간 | 7.3 |
| 멀티 뷰 디컨 볼 루션 (GPU) | 2 시간 | 7.3 |
표 1 : 데이터 처리 시간.
멀티 뷰 재건을위한 입력 데이터 형식
피지 플러그인 멀티 뷰 재건 .czi,이 .tif 및 ome.tiff 형식을 지원할 수 있습니다. .czi 형식의 데이터 구조로 인해, 불연속 데이터 세트는 아니다전처리없이 지원. 불연속는 기록 (예 : 샘플의 드리프트에 의한 위치를 재조정하기 위해) 다시 시작했다는 것을 의미한다. 이 경우 .czi 파일이 .tif로 다시 저장해야합니다. 이 .tif 각보기를 파일과 조명의 방향은 별도의 파일로 저장해야합니다.
화소 크기의 교정
현미경 - 운영 소프트웨어는 선택된 목표에 기초하여 XY 화소 크기에 대한 보정을 계산한다. 그러나, Z의 화소 크기는 스텝 크기에 의해 독립적으로 정의된다. 잘못된 목적은 소프트웨어에 지정되면 Z 비율로 XY 잘못되었습니다 및 등록에 실패합니다.
초기 등록
데이터 집합을 정의한 후 등록수는 한 것 및 관심 지점의 수는 ViewSetup 탐색기에서 0이된다. 초기 등록은 데이터 세트의 교정을 나타냅니다. 숫자 O를 모두F 등록 및 관심 지점을 처리하는 동안 증가 할 것이다.
관심 지점의 검출을위한 다운 샘플링
샘플링을 사용하여 파일의 로딩 이후, 추천 및 분할 훨씬 빠를 것이다. 검출 매개 변수 따라서 다른 아래 샘플 설정 사이에 감지 설정을 전송, 다운 샘플링에 따라 변경 될 수없는 점에 유의하기 그러나 중요하다.
관심 지점의 검출
이들이 상당히 등록을 방해하지 않기 때문에, 그것은 심지어 오 탐지를 획득하는 가격 각 도면에서 가능한 많은 사실 비드 세그먼트하는 것이 바람직하다. 숫자 몇 가지 경우 허위 탐지는, (관심 지점의 등록 참조) 등록시 제외됩니다. 그러나, 대규모 오 탐지 알고리즘에 문제가 포즈. 그것은뿐만 아니라 검출 성능을 감소시키고,등록,이 세그먼트에 더 이상 화상을 얻어뿐만 아니라보기 사이 이러한 비드를 비교하지만, 또한 등록의 정확성을 감소입니다. 이는 엄격한 검출 파라미터를 이용하여 해결 될 수있다. 또한, 비드 (하나의 구슬 그림 1E에 즉 다중 탐지)의 분할을 통해 등록에 해로운 피해야한다.
관심 지점 등록
서로 상에 뷰를 등록하려면, 각보기의 각 구슬의 위치는 세 개의 가장 가까운 이웃 구슬에 대한 그것의 위치에 의해 설명된다. 이 별자리는 로컬 기하학적 설명을 형성하고 뷰 사이의 각각의 구슬을 비교 할 수 있습니다. 두보기 사이를 설명 일치하는 비즈는 다음 후보의 대응으로 간주됩니다. 이 로컬 기술자는 일반적으로 각각의 구슬에 대한 고유있는 랜덤하게 분포 구슬, 작동합니다.하나는 등록을위한 샘플 핵으로 다른 구조를 사용할 수있다. 그러나, 샘플이 아닌 무작위로 분포되어 핵을 검출하기 위해 다른 방법들 (20, 21)이 적용된다.
후보의 대응은 오탐 (false positive)을 제외하기 위해 RANSAC (36)에 대해 시험한다. 각각의 대응은 서로 상보기를 오버레이에 대한 변환 모델을 제안한다. 아웃 라이어가 다른 하나에 각 지점을 것 반면에 진정한 대응 가능성, 하나의 변환 모델에 동의 할 것이다. 진정한 대응은 두 비교보기 사이 아핀 변환 모델을 산출하기 위해 사용된다. 반복적 최적화 알고리즘있는 글로벌 최적화는 모든 뷰는 뷰 (20, 21) 사이의 최소 변위 목적으로 제 뷰에 등록되어있는 동안 수행된다.
시간 경과 등록
이동하기 때문에현미경 스테이지의 아가 부정확 모터 운동, 표준은 각 스택의 위치가 시간이 지남에 따라 적당히 변한다. 각 시점의 등록이 시점의 의견 차이를 제거하는 반면, 시간 경과 또한 전체로서 등록 할 필요가있다. 이를 위해, 각 시점은 기준 시점에 등록된다.
기준 시간 점
다양한 시점과 시계열 처리되면 비드 강도 인해 표백 시간 동안 저하 될 수 있기 때문에, 대표 시점은 시계열의 중간 통상 기준으로서 선택된다. 이러한 기준에서 관심 지점 감지, 등록 경계 박스 및 융합을위한 파라미터가 결정될 수있다. 이들 파라미터는 각각의 시점에 대한 특정 변형 모델을 계산하는 전체 시간 경과에 적용된다. 시간 경과 등록하는 동안 다른 모든 시점은 REGIST 있습니다이 기준 시점에 공간적으로 겹. 따라서, 전체 기록 용 바운딩 박스 파라미터는 이러한 특정 시점에 의존한다.
멀티 채널 등록
여러 채널을 이미징 할 때 이상적으로 같은 형광 구슬은 모두 몇 군데 채널에서 볼 수 있어야합니다. 검색 및 등록 후 고려 변환에 다른 파장의 빛의 영향을 얻어 개별적 채널에서 수행 될 수있다. 구슬이 모든 채널에 표시되지 않습니다 또는 구슬이 하나의 채널에 너무 많은 이미지를 지배하고 다른 채널 (들)이 너무 어둡 때문에 종종이는 할 수 없습니다. 일반적인 솔루션은 검색 및 등록 취득한 변환 모델의 하나의 채널에 표시 비드를 사용하는 것이다 (즉, 감지, 등록 및 저속 등록 후) 다음 피지> 플러그인> 멀티 뷰 Reconstr하여 다른 채널에 적용uction는> 일괄 처리> 도구> 중복 변환. 드롭 다운 메뉴에서 다른 채널을 선택 한 채널의 변환을 적용합니다. 다음 창에서 XML을 선택하고 확인을 클릭합니다. 그런 다음 소스 채널로 구슬을 포함하고 대상 채널로 구슬없이 채널을 선택하고 채널을 선택합니다. 이는 중복의 경우 변환은 모든 변환하고 OK를 교체 사용합니다. 변환은 모든 다른 채널로 복사 및 XML에 저장됩니다. 멀티 뷰 재건 응용 프로그램을 다시 시작 ViewSetup 탐색기에서 새로운 변환을 참조하십시오.
경계 상자
여러 뷰의 융합은 계산이 매우 많이 있습니다. 그러나, 큰 이미지는 일반적으로 샘플뿐만 아니라, 그 주위의 비드뿐만 아니라 수용 취득한다. 등록 파라미터 일단(S)가 비드로부터 추출되고, 그들 화상의 일부로서 더 이상 유용하지 않는다. 따라서, 융합의 효율을 높이기 위해, 샘플을 포함하는 이미지 스택의 부분은 융합한다. 이자 (바운딩 박스)의 영역 샘플을 포함하도록 정의 가능한 주변의 아가 적게한다. 경계 박스와 부피가 1634 × 1746 × 1632 픽셀로 축소되며, 상기 메모리 요구가 감소되는 반면,도 2에서 예를 들어 2229 × 2136 × 2106 픽셀로 전체 볼륨의 가중 평균 융합, RAM의 3만8천1백96메가바이트을 필요 1만7천7백29메가바이트합니다.
콘텐츠 기반의 멀티 뷰 융합
다 관찰 데이터를 융합에 도전보기는 보통 갑자기 종료하고 동일한 복셀에 대한 동일한 화상 품질을 포함하지 않는다는 것이다. 뷰의 단순 평균 따라서 혼합 유물과 불필요한 이미지 저하로 이어질 것입니다. 콘텐츠 기반의 안식 쿵푸 시온 계정으로 이러한 문제를 모두합니다. 하나의 영상이 종료하고, 다른 하나가 시작되고 둘째, 로컬 이미지 품질을 평가하고, 융합 21 고화질화에 높은 가중치를 적용 여기서 첫째는 상이한 도면을 혼합. 하나의 뷰에 비해 XY의 신호 약간 저하 (도 2E-H,도 5A-D)와 (Z)의 해상도의 향상이있다.
멀티 뷰 디컨 볼 루션
멀티 뷰 디컨 볼 루션의 의견의 융합을 달성하는 또 다른 방법입니다. 이 방법의 다른보기도 PSFS 현미경의 광학계에 의해 콘볼 루션 된 이미지를 복구하기 위해 고려된다. 이 방법은 크게 영상 흐림을 제거하고 신호 (31) (도 2C-D도 2I-J,도 5E-G, 영화 3)의 해상도 및 콘트라스트를 증가시켜 이미지의 품질을 향상시킨다.
ve_content "> 역대 합이 계산 상 매우 집약적 따라서 처리하는 GPU는이 프로세스의 속도를 증가하여 (표 1 참조). 또한 다운 샘플링 된 데이터에 디컨 볼 루션을 수행하기 위해 필요하다. 다운 샘플 피지> 멀티 뷰 재구성을 사용 > 일괄 처리> 도구> 적용을 변환.이 .xml 파일에 저장됩니다 뷰에 새로운 변형 모델을 적용합니다.BigDataViewer 및 BigDataServer에 대한 HDF5 파일 형식
BigDataViewer 33 테라 바이트 규모의 데이터를 쉽게 시각화 할 수 있습니다. 어떻게 BigDataViewer을 제어하는 방법은 표 2에 요약되어있다. 프로그램의 기본 동작의 스크린 캐스트는 원래 출판 (33)의 보충 교재로도 사용할 수 있습니다. BigDataViewer은 이미지 데이터를 포함하는 메타 데이터를 포함 .xml 파일, 및 HDF5 파일에 집중되어있다. 화상 데이터는 대가이다3D 블록에서 여러 해상도 수준의 HDF5에 천만에. 전체 해상도가로드되기 전에 여러 해상도 수준, 낮은 해상도로 더 빠르게 데이터를 시각화 할 수 있습니다. 필요한 경우 각각의 블록은 메모리로로드된다. 따라서, HDF5 이미지 포맷은 BigDataViewer (33)를 통해 데이터를 직접 고속 시각화 할 수있다. 파일의로드가 더 효율적으로 수행하기 때문에이 또한 처리 속도. 이 엄격하게 처리를 위해 필요하지 않지만 따라서, 우리는이 형식으로 데이터 집합을 다시 저장하는 것이 좋습니다. 데이터 형식의 자세한 설명은 참조하시기 바랍니다 링크 (3) . 또한, 데이터 세트 공동 작업자 또는 BigDataServer 33 (사용하여 대중과 공유 할 수있는 링크 6 ).
| 키 | |
| F1 | 상기 BigDataViewer의 간단한 설명과 기본적인 조작으로 도움말을 보여줍니다 |
| <> 또는 마우스 휠 | Z에서 운동 |
| 위쪽 및 아래쪽 화살표 | 확대 및 축소 |
| 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 드래그 | 뷰어에 샘플을 이동 |
| 왼쪽 클릭 및 드래그 | 커서 주위에 샘플을 회전 |
| 뷰어 또는 탭 왼쪽 또는 오른쪽 화살표 하단의 슬라이더 | 시간 축에서 이동 |
| 추가로 이동을 눌러 | 어떤 축을 따라 빠르게 이동 또는 회전 |
| x와 다음 왼쪽 및 오른쪽 화살표 | X 축을 중심으로 회전 |
| Y 다음 왼쪽과 오른쪽 화살표 | y 축을 중심으로 회전 |
| Z 다음 왼쪽과 오른쪽 화살표 | Z 축을 중심으로 회전 |
| 이동과 X | x 축의보기 배향 |
| 변화와 y | y 축 방향의보기 배향 |
| 이동 및 z | Z 축을 따라 배향보기 |
| 나는 | 다른 보간 모드 간 전환 (즉, 가장 가까운 이웃과 삼선) |
| s 또는 설정> 밝기 및 대비 | 채널, 휘도와 콘트라스트의 색상을 변경 |
| F6 또는 설정> 가시성 및 그룹화 | 표시된 그룹을 변경하는 숫자 키를 통해 그룹을 다른 그룹을 중첩시키고 호출하는 그룹핑있게 |
| F10 또는 도구> 기록 영화 | 현재 표시된 슬라이스의 시계열을 취득 |
표 2 : 빅 데이터 뷰어.
LSFM의 기술 된 구현 3. 제한
낮은 처리량
일반적인 LSFM 실험에서 단지 실험 당 하나의 샘플이 몇 군데있다. 또, 우리의 경험에서 많은 유용한 정보는 하나의 샘플로부터 추출 할 수있다. 여러 배아 고 스루풋 촬상 최근 샘플 위치와 회전 자유도를 희생하더라도 일반적으로 홈 내장 LSFM 셋업 46-48에서 달성되었다.
조직에 부족 침투 깊이
제브라 피쉬 배아 반투명하더라도, 산란 및 흡수 등에 의한 조직에 깊은 촬상하면, 얻어지는 화질 빨리 악화된다. 부분이 샘플에 의해 방출 된 형광의 산란 및 흡수의 효과가 현재 설정 수정 될 수 없다. 불균일 한 화상 품질의 또 다른 원인은 불규칙한 조명이다. 티그는 빛 시트는 왼쪽이나 오른쪽 측면에서 입사 스트라이프 유물과 흐림 결과 해당 경로를 굴절, 어떤 개체입니다. 이중 양면 조명 및 멀티 뷰 융합는 최종 이미지에서 아티팩트를 감소 할 수 있습니다. 마지막으로 화질 인해 에지 방향으로 두꺼워지고 광 시트의 자연스런 형상에 시야의 가장자리쪽으로 약간 악화되는 경향이있다.
유한 화학 조작
약물이나 억제제의 사용은 제브라 피쉬의 연구에 널리 퍼져있다. 약물이 현미경 사용에 의한 시료 챔버와 동일한 챔버를 공유 악기의 다른 사용자의 고려 큰 부피로 제한된다. 약물 실험에 전념 여분의 실을 사용하면이 문제를 해결할 수 있습니다. 유리 구슬 부분적으로 챔버를 작성하는 것은 필요한 액체의 양을 줄일 수 있습니다.
어떤 photomanipulation이 없습니다
CURRENTLY이 광 현미경이나 레이저 어블 레이션 등 지역화 광학 조작의 가능성이 없다. 그럼에도 불구하고, 내장 된 홈 설정은 이러한 특정 애플리케이션에 사용될 수있다.
4. 의의 및 향후 응용 프로그램
LSFM 라이브 배아의 큰 볼륨의 빠른 이미징을위한 날짜에 사용할 수있는 가장 좋은 방법입니다. 공 초점 현미경을 생각할 실험의 대부분은 상술 한 장점을 가진 광 시트 현미경상에서 수행 될 수있다. 시력 발달의 촬상의 경우, LSFM 속도가 중요한 파라미터가 아니다. 대신, 샘플 위치에서 낮은 광독성과 유연성은 결정적인 이점이 있습니다.
LSFM 데이터는 컨벌루션 좋은 결과를 달성하는 데 도움 자동화 된 이미지 분석, 물체 추적에 도움이되는 높은 SNR을 갖는다. 결론적으로, LSFM는 배아 발달과 overa에 정량적 데이터를 생성하는 훌륭한 도구입니다LL 셀과 이후의 모델링 및 해당 프로세스의 물리적 설명은 조직 특성.
Disclosures
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lightsheet Z.1 microscope | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Low melting point agarose | Roth | 6351.1 | |
| Low melting point agarose | Sigma | A4018 or A9414 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB/MS-222/Tricaine) | Sigma | E10521 | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma | P7629 | |
| 500 nm red fluorescent beads F-Y 050 | Millipore (Estapor) | 80380495 | |
| 20 μl (1 mm inner diameter, marked black) capilllaries | Brand | 701904 | sold as spare part for transferpettor |
| Teflon tip plungers for 20 μl capillaries | Brand | 701932 | sold as spare part for transferpettor |
| Circular glass coverslips diameter 18 mm, selected thickness 0.17 mm | Thermo scientific (Menzel-Glaser) | ||
| O-rings for chamber windows 17×1.5 mm | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Tweezers, style 55 | Dumont | 0209-55-PO | |
| 50 ml Luer-Lock syringes | Becton Dickinson | 300865 | |
| 150 cm extension cable for infusion compatible with Luer-Lock syringes | Becton Dickinson | 397400 | |
| Links | |||
| Link 1 Multiview reconstruction application | https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration http://fiji.sc/Multiview-Reconstruction |
||
| Link 2 BigDataViewer | https://github.com/bigdataviewer | ||
| Link 3 BigDataViewer | http://fiji.sc/BigDataViewer | ||
| Link 4 Multiview reconstruction application-issues | https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration/issues | ||
| Link 5 BigDataViewer-issues | https://github.com/bigdataviewer/bigdataviewer_fiji/issues | ||
| Link 6 BigDataServer | http://fiji.sc/BigDataServer |
References
- Pantazis, P., Supatto, W. Advances in whole-embryo imaging: a quantitative transition is underway. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (5), 327-339 (2014).
- Truong, T. V., Supatto, W. Toward high-content/high-throughput imaging and analysis of embryonic morphogenesis. Genesis. 49 (7), 555-569 (2011).
- Keller, P. J. Imaging Morphogenesis: Technological Advances and Biological Insights. Science. 340 (6137), 1234168-1234168 (2013).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens. J Microsc. 170 (Pt 3), 229-236 (1993).
- Jemielita, M., Taormina, M. J., DeLaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques. J Biophoton. 6 (11-12), 920-928 (2012).
- Stelzer, E. H. K. Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology. Nat Meth. 12 (1), 23-26 (2015).
- Chen, B. C., Legant, W. R., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998-1257998 (2014).
- Keller, P. J., Ahrens, M. B. Visualizing Whole-Brain Activity and Development at the Single-Cell Level Using Light-Sheet Microscopy. Neuron. 85 (3), 462-483 (2015).
- Pampaloni, F., Chang, B. -J., Stelzer, E. H. K. Light sheet-based fluorescence microscopy (LSFM) for the quantitative imaging of cells and tissues. Cell Tissue Res. 360 (1), 129-141 (2015).
- Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. Light sheet microscopy. Quantitative Imaging in Cell Biology. , Elsevier Inc. 193-215 (2014).
- Strobl, F., Stelzer, E. H. K. Non-invasive long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos. Development. 141 (11), 2361-2361 (2014).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
- Maizel, A., von Wangenheim, D., Federici, F., Haseloff, J., Stelzer, E. H. K. High-resolution live imaging of plant growth in near physiological bright conditions using light sheet fluorescence microscopy. Plant J. 68 (2), 377-385 (2011).
- Swoger, J., Muzzopappa, M., Lòpez-Schier, H., Sharpe, J. 4D retrospective lineage tracing using SPIM for zebrafish organogenesis studies. J Biophoton. 4 (1-2), 122-134 (2010).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).
- Wu, Y., Ghitani, A., et al. Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (43), 17708-17713 (2011).
- Sarov, M., Barz, C., et al. A genome-wide resource for the analysis of protein localisation in Drosophila. bioRxiv. , 028308 (2015).
- Amat, F., Lemon, W., et al. Fast, accurate reconstruction of cell lineages from large-scale fluorescence microscopy data. Nat Meth. 11 (9), 951-958 (2014).
- Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J., Tomancak, P. Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data. Nat Meth. 7 (6), 418-419 (2010).
- Preibisch, S., Rohlfing, T., Hasak, M. P., Tomancak, P. Mosaicing of single plane illumination microscopy images using groupwise registration and fast content-based image fusion. SPIEMed Imaging. 6914, 69140E (2008).
- Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nat Meth. 12 (1), 30-34 (2015).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Digital Scanned Laser Light-Sheet Fluorescence Microscopy (DSLM) of Zebrafish and Drosophila Embryonic Development. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (10), (2011).
- Pinto-Teixeira, F., Muzzopappa, M., Swoger, J., Mineo, A., Sharpe, J., Lòpez-Schier, H. Intravital imaging of hair-cell development and regeneration in the zebrafish. Front Neuroanat. , (2013).
- Keller, P. J. In vivo imaging of zebrafish embryogenesis. METHODS. , 1-11 (2013).
- Pitrone, P. G., Schindelin, J., et al. OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nat Meth. 10 (7), 598-599 (2013).
- Gualda, E. J., Vale, T., Almada, P., Feijò, J. A., Martins, G. G., Moreno, N. OpenSpinMicroscopy: an open-source integrated microscopy platform. Nat Meth. 10 (7), 599-600 (2013).
- Martinez-Morales, J. R., Rembold, M., et al. ojoplano-mediated basal constriction is essential for optic cup morphogenesis. Development. 136 (13), 2165-2175 (2009).
- Strzyz, P. J., Lee, H. O., Sidhaye, J., Weber, I. P., Leung, L. C., Norden, C. Interkinetic Nuclear Migration Is Centrosome Independent and Ensures Apical Cell Division to Maintain Tissue Integrity. Dev Cell. 32 (2), 203-219 (2015).
- Young, L. K., Jarrin, M., Saunter, C. D., Quinlan, R., Girkin, J. M. Using SPIM to track the development of the focal power of the zebrafish lens. SPIE BiOS. 9334, 933408 (2015).
- Preibisch, S., Amat, F., et al. Efficient Bayesian-based multiview deconvolution. Nat Meth. 11 (6), 645-648 (2014).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).
- Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets. Nat Meth. 12 (6), 481-483 (2015).
- Brown, M., Lowe, D. G. Invariant Features from Interest Point Groups. Proceedings of the British Machine Vision Conference. , BMVA Press. 23.1-23.10 (2002).
- Saalfeld, S., Fetter, R., Cardona, A., Tomancak, P. Elastic volume reconstruction from series of ultra-thin microscopy sections. Nat Meth. 9 (7), 717-720 (2012).
- Fischler, M. A., Bolles, R. C. Random sample consensus: a paradigm for model fitting with applications to image analysis and automated cartography. Commun ACM. 24 (6), 381-395 (1981).
- Zolessi, F. R., Poggi, L., Wilkinson, C. J., Chien, C. -B., Harris, W. A. Polarization and orientation of retinal ganglion cells in vivo. Neural Dev. 1 (1), 2 (2006).
- Stepanova, T., Slemmer, J., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). J Neurosci. 23 (7), 2655-2664 (2003).
- Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish. J Vis Exp. (84), e51119 (2014).
- Udan, R. S., Piazza, V. G., Hsu, C. W., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Quantitative imaging of cell dynamics in mouse embryos using light-sheet microscopy. Development. 141 (22), 4406-4414 (2014).
- Ichikawa, T., Nakazato, K., et al. Live imaging and quantitative analysis of gastrulation in mouse embryos using light-sheet microscopy and 3D tracking tools. Nat Protoc. 9 (3), 575-585 (2014).
- Schmied, C., Stamataki, E., Tomancak, P. Open-source solutions for SPIMage processing. Methods Cell Biol. 123, 505-529 (2014).
- Schmied, C., Steinbach, P., Pietzsch, T., Preibisch, S., Tomancak, P. An automated workflow for parallel processing of large multiview SPIM recordings. , Available from: http://arxiv.org/abs/1507.08575 (2015).
- Amat, F., Höckendorf, B., Wan, Y., Lemon, W. C., McDole, K., Keller, P. J. Efficient processing and analysis of large-scale light-sheet microscopy data. Nat Protoc. 10 (11), 1679-1696 (2015).
- Schmid, B., Shah, G., et al. High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics. Nat Commun. 4, 1-10 (2013).
- Gualda, E. J., Pereira, H., Vale, T., Estrada, M. F., Brito, C., Moreno, N. SPIM-fluid: open source light-sheet based platform for high-throughput imaging. Biomed Opt Express. 6 (11), 4447-4456 (2015).
- McGorty, R., Liu, H., Kamiyama, D., Dong, Z., Guo, S., Huang, B. Open-top selective plane illumination microscope for conventionally mounted specimens. Opt Express. 23 (12), 16142-16153 (2015).
- Jemielita, M., Taormina, M. J., et al. Spatial and Temporal Features of the Growth of a Bacterial Species Colonizing the Zebrafish Gut. mBio. 5 (6), e01751-14-8 (2014).
