Abstract
Hele mount in situ hybridisering (WMISH) er en teknik, der giver mulighed for den rumlige opløsning af nukleinsyremolekyler (ofte mRNA'er) inden for en "hele mount 'væv forberedelse, eller udviklingsstadiet (såsom et embryo eller larve) af interesse. WMISH er ekstremt kraftfuld, fordi det væsentligt kan bidrage til funktionel karakterisering af komplekse metazoan genomer, en udfordring, der bliver mere af en flaskehals med syndflod af næste generation af sekvens data. Trods den konceptuelle enkelthed af teknikken ofte behov for meget tid til at optimere de forskellige parametre, der er forbundet til WMISH forsøg til hidtil ukendte modelsystemer; subtile forskelle i de cellulære og biokemiske egenskaber mellem vævstyper og udviklingsstadier betyde, at en enkelt WMISH metode ikke kan være passende for alle situationer. Vi har udviklet et sæt af WMISH metoder til genopståede havsnegle model stor mosesnegl der genererer konsekvent ogklare WMISH signaler for en række gener, og på tværs af alle udviklingsstadier. Disse fremgangsmåder indbefatter tildeling af larver af ukendt kronologiske alder til en ontogenetisk vindue, effektiv fjernelse af embryoner og larver fra deres æg kapsler, anvendelsen af en passende proteinase K-behandling for hver ontogenetisk vindue, og hybridisering, post-hybridisering og immunodetektion trin. Disse metoder giver et fundament, hvorfra det resulterende signal for en given RNA udskrift kan yderligere forfinet med sonde specifikke justeringer (primært sonde koncentration og hybridisering temperatur).
Introduction
Bløddyr er en gruppe af dyr, der holder af hensyn til en bred mangfoldighed af videnskabelige discipliner. På trods af deres morfologiske diversitet 1, artsrigdom (kun overgået de Leddyr i form af arter nummer 2) og relevans for en bred vifte af kommercielle 3, medicinske 4 og videnskabelige spørgsmål 5-8, er der relativt få bloeddyr arter, der kan gøre krav på være både veludstyrede videnskabelige modeller og let at vedligeholde i et laboratoriemiljø. Et bløddyr, der er meget anvendt af discipliner som neurobiologi 9, økotoksikologi 10 og senest evolutionær biologi 11,12, er stor mosesnegl, primært på grund af sin store udbredelse og ekstrem nem vedligeholdelse. Trods sin popularitet som en "model" organisme og dens lange historie med brug af udviklingsmæssige biologer 13-19, området og magt molekylære værktøjer til rådighed til L. stagnalis videnskabelige samfund ligger langt bagefter, at mere traditionelle dyremodeller (Drosophila, mus, søpindsvin, nematoder).
Vores ønske om at udvikle Lymnaea som en molekylær model stammer fra en interesse i de molekylære mekanismer, der styrer shell formation. Denne motiveret os til at forfine et sæt teknikker, der vil gøre det muligt for en effektiv, sammenhængende og følsom visualisering af genekspression under Lymnaea udvikling. Hele mount in situ hybridisering (WMISH) er almindeligt anvendt til en række forskellige modelorganismer og har været i brug i mere end 40 år 20. I sine forskellige forklædninger, kan ISH anvendes til rumligt lokalisere specifikke loci på kromosomer, rRNA, mRNA og mikro-RNA.
En af de udfordringer, vi havde brug for at tage fat, før raffinering en WMISH metode til L. stagnalis var spørgsmålet om blidt og effektivt udtrække embryoner og larver af varierende stadier fra than egg kapsler, hvori de er deponeret. Denne ekstraktion, eller 'decapsulation', skal opnås effektivt for at indsamle tilstrækkelig materiale til en given in situ eksperiment, mens de på samme tid opretholder morfologisk og cellulær integritet. Mens andre modelorganismer også gennemgå indkapslet udvikling, i vores hænder ingen af de metoder der er indberettet for disse arter med held kan anvendes i L. stagnalis.
De overordnede mål for denne metode er derfor: at udtrække L. stagnalis embryoner og larver fra deres kapsler i en high-throughput fashion, at anvende præ-hybridisering behandlinger, der optimerer WMISH signal, at forberede embryoner og larver med tilfredsstillende WMISHsignals til billeddannelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Følgende trin skitsere vores metode til udførelse af en in situ forsøg på embryonale og larvestadier af L. bør vedtages stagnalis. Hvis et trin indebærer anvendelse af et farligt kemikalie dette angives med ordet "ADVARSEL" og alle relevante sikkerhedsprocedurer. Links til repræsentative MSDS ark for farlige kemikalier findes i supplerende fil 1. Opskrifter til alle reagenser findes i supplerende Fil 2.
1. Montering af Decapsulation Apparatur
- For at gøre dette, tilslutte en 20 ml engangssprøjte og silicium slange (med en indre diameter på 1 mm og en ydre diameter på 3 mm) ved anvendelse af en P1,000 spids skåret til en passende længde, som vist i figur 2A.
- Tape en standard objektglas til en omvendt stor petriskål. Tape silikoneslangen umiddelbart op til mikroskopobjektglasset som vist i figur60; 2C og 2D.
- Hvile et trukket glas nål på mikroskopobjektglasset og forsigtigt indsætte det i silikoneslangen indtil spidsen af nålen rager ca. 20% af vejen over den indre diameter af slangen (se Figur 2C og 2D). Når nålen er i position tape det ned til petriskålen.
- Tillade fri ende af silicium slangen til hvile i en anden petriskål, der vil opsamle Decapsulated materiale.
2. Prøvetagning, Fiksering og Decapsulation
BEMÆRK: Alle trin udføres ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet.
- Omhyggeligt indsamle æg strenge fra væggene i et akvarium. For at gøre dette, skal du bruge et fladt stykke fleksibel plast som en spatel til at skrabe ægget strengen fra underlaget, og bruge en plastik tesi til at fiske den flydende æg strengen ud af vandet. Stage og sortere materiale under et mikroskop ved hjælp af den vejledning tilvejebragt i figur1.
- Placer ægget strengen på et stykke køkkenrulle og gøre en langsgående snit langs æggemassen ved hjælp af fjervægtsklassen pincet. Rul ægget kapslerne ud af ægget strengen og fjerne så meget af jelly materiale som muligt fra hver kapsel ved at skubbe dem omkring papirhåndklæde hjælp af fjervægtsklassen pincet.
- Brug af fjervægtsklassen pincet, overføre ægget kapsler i en petriskål indeholdende 5 ml ledningsvand. Fortsæt med at indsamle de-gelé æg kapsler af de ønskede udviklingsstadier i denne skål. Saml nok kapsler fra alle udviklingsstadier til den planlagte WMISH eksperimentet derefter gå videre til næste trin.
- Når man arbejder med mere udviklede larver (5 dage efter første spaltning (dpfc) og ældre) bedøve dem før fiksering.
BEMÆRK: Dette vil forhindre muskler fra ordregivende der gør fortolkningen af in situ farvede mønstre meget vanskelige.- Slap larver (mens de stadig er i deres capsules) i en 2% vægt / volumen opløsning af MgCl2 • 6H 2 O i 30 min før fiksering.
- Vurdere graden af afslapning efter 30 minutter ved at nedsænke flere larver, mens du stadig i deres æg kapsler i fikseringsopløsning og overvåge deres svar under et mikroskop. Ufuldstændigt afslappet larver vil trække ind i deres skaller, mens helt afslappet larver ikke vil reagere. Når disse larver er blevet lempet gå videre til næste trin.
- Overfør ægget kapsler under anvendelse af en bred boring plast pipette til et forsegleligt rør, der giver 10 gange volumenet af æg kapsler (f.eks., 1 ml af afviklede kapsler ville kræve en 10 + ml rør).
- Aspirer så meget væske som muligt fra røret og erstatte med et volumen på fiksativ løsning, der er 10x mængden af de bosatte æg kapsler. Drej forsigtigt ægget kapsler i fiksativ ved stuetemperatur i et passende tidspunkt for hvert udviklingstrin (se figur 1).
- Discontinue rotation og tillade kapslerne at synke og udsuge fiksativ opløsning i en passende affaldsbeholder.
- Vask ægget kapsler ved at erstatte fikseringsopløsning med phosphatpufret saltvand med 0,1% Tween-20 (PBTw) og roterer ved stuetemperatur i 5 min. Aspirer PBTw og gentag to gange.
- Fjern embryoner og larver fra deres kapsler ved hjælp af apparatet (se punkt 1 for detaljer) vist i figur 2. Tegn kapslerne op i 20 ml sprøjte, vedhæfte slangen og derefter fjerne kapslerne gennem slangen og forbi glasset nål ud i indsamling skålen.
BEMÆRK: Normalt skal de fleste (> 90%) af alle kapsler behøver kun en aflevering gennem enheden. I mange tilfælde kapslen membran er beskadiget, men embryoner og larver forblive inde den opbrudte kapsel. Ombearbejd dette materiale ved simpelthen at trække den op i sprøjten og bortvejre den igen. - Saml de Decapsulated embryoner og larver i et 1,5 ml rør ved hjælp af en mikrofonropipette (a P20 for 0 - 3 dag gamle larver, og en P200 for ældre larver med enden af spidsen skåret af).
BEMÆRK: En pause (i op til flere måneder) i protokollen kan foretages på dette tidspunkt. Hvis dette er påkrævet, bør det decapsuled materiale samles i en 1,5 ml rør til opbevaring (fortsæt til næste trin). Ellers fortsætter straks til protokol 3. - Tillad embryoner og larver at synke til bunden af røret og udsuge supernatanten. Udskift med 33% Ethanol (EtOH) i PBTw og lad sidde i 5 - 10 min. Gentag med 66% EtOH i PBTw og 100% EtOH. Vask larver to gange i 100% EtOH ved stuetemperatur. Opbevar materialet ved -20 ° C i 100% EtOH.
- Når du er klar til at fortsætte, re-hydrat prøverne ved at fjerne 100% EtOH og erstatte med 66% EtOH i PBTw, lad sidde i 5 - 10 min. Gentag med 33% EtOH i PBTw, lad sidde i 5 - 10 min. Endelig vaskes med 3x 5 minutters vaske af PBTw at sikre alle EtOH fjernes.
3. proteinase-K, TEA og Post-fixation
BEMÆRK: Vi finder at udføre følgende trin i små kurve med en maskestørrelse gulv den mest effektive og blid metode til hurtigt at udveksle tidskritiske løsninger. Mens disse kan hjemmelavet, bruger vi kurve (medium størrelse), der er kompatible med Intavis InSituPro -Vsi væske håndtering robot (www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc). Sådanne kurve kan hurtigt og nemt flyttes mellem brøndene i en 12 brønd vævskulturskål (TCD) for at udveksle løsninger, eller opløsningen kan aspireres fra brønden ved hjælp af en pipette. Alternativt kan alle løsning udvekslinger udføres uden disse kurve ved blot opsugning af supernatanten fra larverne. I dette tilfælde vil en forsigtig svingning koncentrere alle embryoner og larver til midten af skålen tillader supernatanten fjernes fra kanten af brønden. Følgende forudsætter brugeren ansætte kurve til udvekslinger løsning.
- Ved hjælp af en pipette, Overføre embryoner og larver i en kurv sidder i en 12 brønd TCD med 2 ml PBTw.
BEMÆRK:. Antallet af fostre og / eller larver, der kan føjes afhænger af udviklingsstadiet bliver undersøgt, men en generel tommelfingerregel er at opretholde mindst 25% af gulvarealet fri af embryoner / larver (dvs. ikke overcrowd kurven). - Forbered en tilstødende brønd med 2 ml af den passende proteinase-K-opløsning (se figur 1), og yderligere 2 brønde med 2 ml 0,2% Glycine hver. Flytte hver kurv i brønden indeholdende den passende koncentration af proteinase-K og straks begynde timing.
- Efter 10 min flytte hver kurv i en brønd indeholdende 0,2% glycin og inkuberes i 5 min. Derefter bevæger hver kurv i den anden brønd med 0,2% glycin og inkuberes i 5 min. Skyl den Glycine med 3x 5 min udveksling af tre ml PBTw.
- Fjern PBTw løsning og behandle prøverne gang med frisklavet triethanolamin (TEA) solution i 5 min ADVARSEL! Må ikke agitere. Erstat med 3 ml frisk fremstillet TEA-opløsning i 5 minutter. Må ikke agitere. Aspirere størstedelen af TEA-opløsning fra prøverne. Tilsæt frisklavet Triethanolamin med eddikesyreanhydrid (TEAAA) løsning, og der inkuberes i 5 min. ADVARSEL! Må ikke agitere.
- EKSTRA - Mens ovenstående trin er inkubation, forberede en anden frisk batch af TEAAA løsning, og gentag ovenstående trin.
BEMÆRK: Denne anden behandling med TEAAA er valgfrit, men kan bidrage til at helt at eliminere alle baggrund med sonder tilbøjelige til at generere baggrund. - Fjern TEAAA opløsning ved sugning det fra brønden og erstatte med 3 ml PBTw. Må ikke agitere. Fjern PBTw og anvendelse 3 ml 3,7% formaldehyd i PBTw. Forsigtigt hvirvle lejlighedsvis i løbet af en 30 min inkubation.
- Fjern fiksativ ved sugning det fra brønden og erstatte med 3 ml PBTw. Flytte materialet i et 1,5 ml rør. RELæg PBTw med hybridiseringsbuffer og inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur - forsigtighed.
- Anbring glassene i en varm blok ved stuetemperatur, og indstille temperaturen til den ønskede hybridiseringstemperatur.
BEMÆRK: hybridiseringstemperaturen er probe specifik og vil skulle empirisk optimeret, men vi finder 55 ° C for at være en god temperatur til at begynde forsøget. Tillad blokken til at komme til hybridiseringstemperaturen, og tillade prøverne at pre-hybridisere i ca. 15 min (dvs. den tid det tager at forberede riboprober, længere er ikke nødvendigt). Forbered tilstrækkelige mængder (normalt 100 ul) af de fortyndede riboprober. Vi typisk forsøg probekoncentrationer på 100 og 500 ng / ml som en første række. Vi forbereder riboprober ifølge 12. - Fjern hybridiseringsbufferen fra prøverne og tilføj sonden i hybridiseringspuffer til prøverne. Overlay med 100 pi (eller en passende volumen til dannelse af en fase over hybridisering buffer) af mineralsk olie.
BEMÆRK: mineralolie forhindrer omfattende kondens, der vil dannes under lange hybridisering trin. Omfattende kondensering vil i væsentlig grad ændre både kemien i hybridiseringsopløsningen og koncentrationen af proben. - Denaturering af probe og mål-RNA ved opvarmning af prøverne til 75 ° C i 10 minutter, derefter ned for varmen til den ønskede hybridiseringstemperatur. Tillad hybridisering at forløbe i mindst 12 timer (O / N) eller længere (24 - 48 timer).
- Under hybridisering fjerne et enkelt rør fra varmen blok, rotere det hurtigt mellem tommel- og pegefinger til at suspendere larverne uden at forstyrre oliefasen, og erstatte det i varmen blokken. Gentag denne gang hver 6-12 timer eller deromkring.
4. Hot vasker og Immundetektion
BEMÆRK: Mens vi bruger en flydende håndtering robot til de følgende trin, disse kan også nemt gøres manuelt. I dette tilfælde, embryoner og larver should opbevares i 1,5 ml rør de blev hybridiseret i. Alle efterfølgende løsning udvekslinger opsuges og tilsættes med en P1,000 pipette. Når udført manuelt hver af de følgende trin bør ansætte 1 ml af hver opløsning.
- Heat passende volumener (3 ml hver for hver prøve), i 4x, 2x og 1x vaskeopløsninger til hybridiseringstemperaturen.
- Vask alle prøverne tre gange i 4x vaskebuffer i 15 minutter hver ved hybridiseringstemperaturen. Vask alle prøverne tre gange i 2x vaskebuffer i 15 minutter hver ved hybridiseringstemperaturen. Vask alle prøverne tre gange i 1X vaskebuffer i 15 minutter hver ved hybridiseringstemperaturen.
- Vask alle prøver en gang med 1x natriumchlorid natriumcitratbuffer + 0,1% Tween (SSC + 0,1% Tween) ved hybridiseringstemperaturen. Tillad prøver at afkøle til stuetemperatur.
- Vask alle prøver to gange i 1x SSC + 0,1% Tween i 15 minutter Erstat denne 1x SSC-opløsning med maleinsyre Buffer (MAB) og lad det sidde i 10 minutter Gentag MAB waske. Erstat MAB med blok-opløsning og inkuberes i 1,5 timer.
- Bytter blok opløsning antistofopløsning (1: 10.000 fortynding af antistof i blok opløsning) og inkuberes i 12 timer (O / N) ved stuetemperatur under forsigtig omrøring.
5. Color Udvikling og Montage
- Aspirer antistofopløsningen og vask 15 gange med PBTw i 10 min hver. Erstat PBTw med 1x alkalisk phosphatase buffer (AP) og inkuberes i 10 min.
- Mens de ovennævnte inkubation trin udbytte, forberede AP farveopløsning (se supplerende fil 2) - ADVARSEL. Flytte materialet ind i en TCD godt og erstatte 1x AP-opløsning med AP farveopløsning. Bemærk tiden nu, således at længden af tid farvereaktionen finder sted for kan optages. Overvåge udviklingen af farvningen mønster, indtil signalet til baggrunden forholdet er optimal.
- For at stoppe farve udvikling, fjerne 1x AP farveopløsning (disponere i det relevante spildere container), og anvende 2 ml PBTw og bemærk tid nu. Skyl to gange mere med PBTw i 5 min hver. Brug en af disse skylninger at flytte materialet ind i et 1,5 ml rør.
- Fjern PBTw og anvende 1 ml 3,7% formaldehyd i PBTw og agitere eller rotere i mindst 30 minutter ved stuetemperatur (dette kan også gøres O / N).
- Skyl fiksativ med 3 vaske af PBT (bortskaffe affaldet fiksativ i en passende affaldsbeholder). Vask prøverne 3 gange ved 50 ° C i deioniseret vand.
BEMÆRK: Disse vasker eliminere udfældning af salte, der kan blive synlige under clearing og visualisering trin. - Beslut, om prøverne skal monteres i Benzyl Benzoate: Benzylalkohol (BB: BA, også kendt som Murray klare) eller glycerol.
BEMÆRK: Vi foretrækker de mere magtfulde clearing agent BB: BA som L. stagnalis embryoner er noget uigennemsigtig. Prøver, der skal monteres i BB: BA skal først blive dehydreret gennem en ethanol-serien. Prøver, der skal monteres i 60%glycerol kan umiddelbart monteres. - Overfør prøverne ind i monteringsrammen opløsning (BB: BA eller 60% glycerol) ved anvendelse af en pipette.
BEMÆRK: Ved montering i BB: BA dette skal ske i et glas godt (BB: BA vil smelte polycarbonat plastik). - Lad prøverne at rydde i 5 - 10 min, og derefter montere dem på et dias ved hjælp af et passende antal stablede dækglas som afstandsstykker (1 dækglas for prøver <1 dpfc, 2 dækglas for prøver> 1 dpfc).
BEMÆRK: hele underlag kan nu afbildes under anvendelse af en sammensat mikroskop med DIC optik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De repræsentative WMISH farvningsmønstre vist i figur 3 blev frembragt ved anvendelse af teknikken beskrevet ovenfor, og afspejler en række rumlig ekspressionsmønstre for gener involveret i en række molekylære processer lige fra skalformation (Novel gen 1, 2, 3 og 4), til celle-celle signalering (DPP) til transskription regulering (Brachyury) på tværs af en række udviklingsstadier. Mens vi ikke har kvantificeret ekspressionsniveauerne af disse gener, vi forventer, at de ville også variere betydeligt, hvilket indikerer, at vores metode kan anvendes mod en bred vifte af genprodukter udtrykt i alle faser af udvikling på forskellige niveauer. Kun et af generne, der præsenteres her (DPP) er tidligere blevet beskrevet i L. stagnalis 21,22. De resultater, vi præsenterer her er stort set i overensstemmelse med disse tidligere rapporter, men med betydeligt højere rumlig reso lution. Den rumlige ekspressionsmønster af Brachyury er blevet beskrevet i abalone 23 og limpet 24 og i begge tilfælde blev også påvist i mantle celler som vi finder for L. stagnalis (figur 3F). Vi isoleret hidtil ukendte gener 1 - 4 (fra en proteomisk skærm designet til at identificere genprodukter direkte involveret i skal-dannelse og så deres rumlige ekspressionsmønstre forbundet med skallen kirtel (figur 3A og B) eller shell felt (figur 3C og D) er helt kongruent med shell-dannende funktioner. Disse resultater indikerer, at high throughput teknik, vi har udviklet til fjernelse af embryoner og larver fra ægget kapsel, og de efterfølgende trin-specifik permeabilisering behandlinger, generere hele mount prøver, der vil give høj kvalitet in situ-farvning mønstre for en bred vifte af gener for alle stadier af embryo- og larvernes udvikling.
ove_content "fo: holde-together.within-side =" 1 ">
Figur 1. En opsummeret ontogeni af stor mosesnegl og tilsvarende Fiksering og proteinase-K behandlinger. Repræsentative billeder af embryoner og larver fra de første 7 dage af udvikling illustrerer en betydelig stigning i størrelse (række 1) og morfologisk kompleksitet (rækker 2 og 3) . Disse udviklingsmæssige ændringer udslag i store forskelle i passende fiksering tid og proteinase-K-koncentrationer, der genererer optimale WMISH signaler. For WMISH alle faser bør fastsættes i 3,7% formaldehyd i PBS ved RT under forsigtig omrøring i deres æg kapsler. Alle faser skal derefter behandles med et passende Proteinase-K-koncentration i 10 minutter. Bemærk, at vi iagttager betydelig inter-batch variation i aktiviteten af proteinase-K fra vores leverandør. skal regnskabsmæssigt Denne variation for ved performing en runde af »Kalibrering" WMISH eksperimenter, hvor aktiviteten af den nye Proteinase-K er empirisk bestemt. De proteinase-K-koncentrationer er angivet i figuren, bør derfor behandles som en indledende vejledning, men de relative koncentrationer mellem udviklingsstadier (fx 2 dage gamle embryoner kræver en proteinase-K-koncentration 3 gange højere end dagen 1 embryoner) er indstillet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Apparater, der anvendes til Decapsule L. stagnalis embryoner. (A) En oversigt over apparatet, der effektivt kan fjerne L. stagnalis embryoner og larver fra deres kapsler. (B) En forstørret billede afden gule indrammede areal i (A). En skarp glas nål anbringes på objektglasset og indsættes i silicium-rør (indvendig diameter 1 mm, ydre diameter 3 mm), således at spidsen rager ca. 20% af vejen ind i hulrummet af røret. Glasset Nålen er derefter også tapede til mikroskopobjektglasset og petriskålen. (C) En skematisk "plan" visning af gule boxed sektion i A. Egg kapsler indeholdende faste embryoner og larver først indsamlet ved brug af 20 ml sprøjte. Sprøjten fastgøres derefter til silikoneslangen, og kapslerne udstødes gennem røret og forbi nålen. Egg kapsel membraner er revet af nålen og den frigjorte embryonale og larver materiale kan opsamles fra samlingen parabol ved hjælp af en mikropipette. (D) En skematisk 'tværsnit' billede af den gule indrammede afsnit i A. mikroskopobjektglas sikrer, at nålen går ind i silicium slangen i den korrekte højde.
Figur 3. Repræsentative Billeder af WMISH Expression Patterns mod en række gener fra en række L. . stagnalis udviklingsstadier Dannet med den her beskrevne fremgangsmåde Alle udviklingsstadier blev forarbejdet som beskrevet i ovennævnte fremgangsmåde og er blevet monteret og afbildet i BB: BA (Murray klare). Omtrentlige aldre er angivet i tilp højre for hvert panel og orienteringen er angivet i nederste højre. Gene orthology (når kendes) vises i nederste venstre for hvert panel. Forkortelser: shell kirtel (sg); shell felt (SF); kappe (mt); fod (ft); Decapentaplegic (DPP); dpfc (dage efter første spaltning). Alle skala barer er 20 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den her beskrevne metode giver mulighed for effektiv visualisering af RNA-transkripter med formentlig varierende ekspressionsniveauerne inden for alle udviklingsstadier af stor mosesnegl. For at fjerne embryoner og larver fra deres kapsler vi afprøvet en række kemiske, osmotisk chok og fysiske behandlinger rapporteret for andre encapsulated- udvikle modelorganismer. Men i vore hænder fremgangsmåden vi beskriver her er den eneste high-throughput teknik, der fjerner den hårde kapsel membranen uden at beskadige embryoner og larver. Efter decapsulation kan materialet enten opbevares eller behandles med en fase specifik regime af proteinase-K og derefter hybridiseret til en riboprobe. kan være behov for yderligere empiriske optimering indsats (typisk fokuseret på sonde koncentration og hybridisering temperatur) for hver probe / target. Disse parametre (foruden fiksering regimen og proteinase-K-behandlinger) typisk de mest indflydelsesrige parametrenogen in situ forsøg (forudsat, at kvaliteten af den faste materiale og det RNA-probe er af høj standard).
Betydningen af en passende proteinase K-behandling til det endelige resultat af en in situ eksperiment er altafgørende for L. stagnalis. Dette afspejles i den brede vifte af proteinase-K-koncentrationer, der kræves af forskellige udviklingsstadier (varierende fra 0 ug / ml til 500 ug / ml). Det er derfor vigtigt at være i stand til at tildele et givet æg streng til et ontogenetisk vindue. Til dette formål retningslinjen, som vi leverer i figur 1 giver mulighed for iscenesættelsen af udviklingsmæssige materiale af ukendte aldre (en printvenlig version af dette tal er tilgængelig i supplerende Fil 3, at brugerne kan finde nyttigt at have på mikroskopet, når iscenesættelse materiale) . Vi bemærker, at for andre arter af havsnegle Proteinase-K-behandlinger for WMISH kan enten holdes konstant for en bred vifte af udvikpmental iscenesætter 8,25,26, eller kan udelades helt 27. Dette står i skarp modsætning til situationen i L. stagnalis. Desuden mens andre forskergrupper tidligere har rapporteret WMISH ekspressionsmønstre flere gener i L. stagnalis larver (se 22,28,29) den metode, som vi beskriver her giver mønstre af væsentligt højere rumlig opløsning. Endelig har vi observeret signifikant inter-batch variation i aktiviteten af proteinase K fra vores leverandør. skal der redegøres denne variation for ved at udføre en runde af »Kalibrering" WMISH eksperimenter, hvor aktiviteten af den nye Proteinase-K bestemmes empirisk. Alle efterfølgende forsøg med portioner af proteinase-K fra holdet kan derefter frit udføres.
Vi har tidligere beskrevet en alternativ WMISH fremgangsmåde til L. stagnalis embryoner og larver andetsteds 12. Denne metode detaljeret brugen af mucolytic agent N-acetyl-L-cystein (NAC), et reduktionsmiddel, såsom dithiothreitol (DTT) og en præ-hybridisering behandling med natriumdodecylsulfat (SDS). Vi fandt disse behandlinger forbedrede farvningsmønstrene af nogle gener for nogle udviklingsstadier. Det fiksering strategi, som vi for nylig udviklet og beskrive her (fastsættelse larver i deres kapsler) forenkler og fremskynder de nødvendige skridt til at forberede materiale til en in situ eksperiment, og tilsyneladende ophæver behovet for empirisk at bestemme yderligere optimale pre-hybridisering behandlinger med NAC, DTT eller SDS. Fremtidige forbedringer til den teknik rapporteret her kunne omfatte visualisering af microRNA (efter ændringer i standard WMISH protokoller tidligere rapporterede 30), dobbelt eller tredobbelt mærkning af mRNA henvender 31, og fluorescerende visualisering af WMISH signaler 32. Formentlig den største begrænsning af teknikken er den tid samlet det tager at gå fra kollekting materialet, til et digitalt billede, der repræsenterer et givet gen ekspressionsmønster. Grundet arten af de biokemiske og biofysiske begivenheder, som skal finde sted under en sådan proces er en iboende egenskab ved de fleste in situ hybridisering protokoller.
Lymnaea indtager en position i Metazoa der er ekstremt underrepræsenteret i form af modelorganismer. Som repræsentant Spiralian kan Lymnaea bringe indsigt i udviklingen af distinkte morfologiske funktioner såsom shell dannelse 12 og krop håndethed 33-35 og er også en værdifuld neuroetologi 36 og neurofysiologi model 9,37. Kraftfulde teknikker såsom evnen til effektivt at visualisere genekspressionsmønstre in situ øger funktionaliteten af Lymnaea som en model organisme, og udvider forskellige spørgsmål, som det kan anvendes til at behandle. På et tidspunkt, hvor generation af store sekvens datasets (komplet transcriptomes og endda genomer) er relativt rutinemæssige, sådanne metoder vil blive mere relevante for forskere, der ønsker at fortolke strøm af sekvens data fra sådanne modeller. Mens Lymnaea er en relativt afledt gastropod 38, og besidder hvad der ville blive betragtet som en stor genom i sammenligning med andre modelorganismer (1,22 Gb 39), findes der mange praktiske og interessante funktioner, der gør det til et attraktivt modelsystem. De metoder, som vi beskriver her udvide værktøjskassen til rådighed for Lymnaea og kan være til nytte for andre arter, der gennemgår indkapslede udvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af midler til DJJ gennem DFG projekt # JA2108 / 2-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Featherweight forceps | Ehlert & Partner | #4181119 | |
| Silicon tubing | Glasgerätebau OCHS GmbH | 760070 | |
| Glass capillaries | Hilgenberg | 1403547 | |
| 12 well tissue culture dishes | Carl Roth | CE55.1 | |
| 37% Formaldehyde | Carl Roth | P733.1 | CAUTION - May cause cancer. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Toxic: danger of very serious irreversible effects through inhalation, in contact with skin and if swallowed. |
| Ethylenediamine tetraacetic acid | Carl Roth | CN06.3 | CAUTION - CAUSES EYE IRRITATION. MAY CAUSE RESPIRATORY TRACT AND SKIN IRRITATION. Avoid breathing dust. Avoid contact with eyes, skin and clothing. Use only with adequate ventilation |
| Magnesium Chloride | Carl Roth | 2189.1 | |
| Tween-20 | Carl Roth | 9127.1 | CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed. |
| Sodium Chloride | Carl Roth | 3957.1 | |
| Ficoll type 400 | Carl Roth | CN90.1 | |
| polyvinylpyrrolidone K30 (MW 40) | Carl Roth | 4607.1 | CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed. |
| Nuclease freeBovine Serum Albumin | Carl Roth | 8895.1 | |
| Salmon sperm | Carl Roth | 5434.2 | |
| Heparin | Carl Roth | 7692.1 | CAUTION - ADVERSE EFFECTS INCLUDE HEMORRHAGE, LOCAL IRRITATION. POSSIBLE ALLERGIC REACTION IF INHALED, INGESTED/CONTACTED. EYES/SKIN/RESPIRATORY TRACT IRRITANT. POSSIBLE HYPERSENSITIZATION. DURING PREGNANCY HAS BEEN REPORTED TO INCREASE RISK OF STILLBIRTH |
| Proteinase-K | Carl Roth | 7528.1 | |
| Glycine | Carl Roth | 3790.2 | |
| Deionised formamide | Carl Roth | P040.1 | CAUTION - Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic. |
| Standard formamide | Carl Roth | 6749.3 | CAUTION - Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic. |
| Triethanolamine | Carl Roth | 6300.1 | CAUTION - Avoid breathing vapor or mist. Avoid contact with eyes. Avoid prolonged or repeated contact with skin. Wash thoroughly after handling. |
| Acetic anhydride | Carl Roth | 4483.1 | CAUTION - CAUSES SEVERE SKIN AND EYE BURNS. REACTS VIOLENTLY WITH WATER. HARMFUL IF SWALLOWED. VAPOR IRRITATING TO THE EYES AND RESPIRATORY TRACT |
| Maleic acid | Carl Roth | K304.2 | CAUTION - Very hazardous in case of eye contact (irritant), of ingestion, . Hazardous in case of skin contact (irritant), of inhalation (lung irritant). Slightly hazardous in case of skin contact (permeator). Corrosive to eyes and skin. |
| Benzyl benzoate | Sigma | B6630-250ML | CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. Harmful if swallowed. |
| Benzyl alcohol | Sigma | 10,800-6 | CAUTION - Harmful if swallowed. Harmful if inhaled. Causes serious eye irritation. |
| Glycerol | Carl Roth | 3783.1 | |
| Blocking powder | Roche | 11096176001 | |
| Anti DIG Fab fragments AP conjugated | Roche | 11093274910 | |
| Tris-HCl | Carl Roth | 9090.3 | |
| 4-Nitro blue tetrazolium chloride in dimethylformamide | Carl Roth | 4421.3 | CAUTION - May cause harm to the unborn child. Harmful by inhalation and in contact with skin. Irritating to eyes. |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate | Carl Roth | A155.3 | CAUTION - Potentially harmful if ingested. Do not get on skin, in eyes, or on clothing. Potential skin and eye irritant. |
| N-acetyl cysteine | Carl Roth | 4126.1 | |
| Dithiothreitol | Carl Roth | 6908.1 | CAUTION - May cause eye and skin irritation. May cause respiratory and digestive tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated. |
| Tergitol | Sigma | NP40S | CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed. |
| Sodium dodecyl sulphate | Carl Roth | CN30.3 | CAUTION - Harmful if swallowed. Toxic in contact with skin. Causes skin irritation. Causes serious eye damage. May cause respiratory irritation. |
| Potassium Chloride | Carl Roth | 6781.1 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4•2H2O) | Carl Roth | 4984.1 | |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth | 3904.1 | |
| Tri sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7•2H2O) | Carl Roth | 3580.1 | CAUTION - May cause eye, skin, and respiratory tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated. |
| Mineral oil | Carl Roth | HP50.2 | |
| InSituPro-Vsi | Intavis | www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc |
References
- Smith, S. A., Wilson, N. G., Goetz, F. E., Feehery, C., Andrade, S. C. S., et al. Resolving the evolutionary relationships of molluscs with phylogenomic tools. Nature. 480 (7377), 364-367 (2011).
- Brusca, R. C., Brusca, G. J. Invertebrates. , Sinauer. Sunderland. (2002).
- Food and Agriculture Organisation of the United Nations. Global Aquaculture Production 1950-2013. , Available from: http://www.fao.org/fishery/statistics/global-aquaculture-production/query/en (2013).
- World Health Organization. Schistosomiasis: number of people treated in 2011. Week. Epi. Rec. 88, 81-88 (2013).
- Henry, J. Q., Collin, R., Perry, K. J. The slipper snail, Crepidula.: an emerging lophotrochozoan model system. Biol. Bull. 218 (3), 211-229 (2010).
- Perry, K. J., Henry, J. Q. CRISPR/Cas9-mediated genome modification in the mollusc, Crepidula fornicata. Genesis. 53 (2), 237-244 (2015).
- Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialog between genes and synapses. Bio. Rep. 24, 475-522 (2004).
- Jackson, D. J., Ellemor, N., Degnan, B. M. Correlating gene expression with larval competence, and the effect of age and parentage on metamorphosis in the tropical abalone Haliotis asinina. Mar. Biol. 147, 681-697 (2005).
- Carter, C. J., Farrar, N., Carlone, R. L., Spencer, G. E. Developmental expression of a molluscan RXR and evidence for its novel, nongenomic role in growth cone guidance. Dev. Biol. 343 (1-2), 124-137 (2010).
- Rittschof, D., McClellan-Green, P. Molluscs as multidisciplinary models in environment toxicology. Mar. Pollut. Bull. 50 (4), 369-373 (2005).
- Liu, M. M., Davey, J. W., Jackson, D. J., Blaxter, M. L., Davison, A. A conserved set of maternal genes? Insights from a molluscan transcriptome. Int. J. Dev. Biol. 58 (6-8), 501-511 (2014).
- Hohagen, J., Herlitze, I., Jackson, D. J. An optimised whole mount in situ. hybridisation protocol for the mollusc Lymnaea stagnalis. BMC Dev. Biol. 15 (1), 19 (2015).
- Raven, C. P. The development of the egg of Limnaea stagnalis. L. from oviposition till first cleavage. Arch. Neth. J. Zool. 1 (4), 91-121 (1946).
- Raven, C. P. The development of the egg of Limnaea Stagnalis. L. from the first cleavage till the troghophore stage, with special reference to its' chemical embryology. Arch. Neth. J. Zool. 1 (4), 353-434 (1946).
- Raven, C. P. Morphogenesis in Limnaea stagnalis. and its disturbance by lithium. J. Exp. Zool. 121 (1), 1-77 (1952).
- Raven, C. P. The nature and origin of the cortical morphogenetic field in Limnaea. Dev. Biol. 7, 130-143 (1963).
- Morrill, J. B., Blair, C. A., Larsen, W. J. Regulative development in the pulmonate gastropod, Lymnaea palustris., as determined by blastomere deletion experiments. J Exp Zool. 183 (1), (1973).
- Van Den Biggelaar, J. A. M. Timing of the phases of the cell cycle during the period of asynchronous division up to the 49-cell stage in Lymnaea. J. Emb. Exp. Morph. 26 (3), 367-391 (1971).
- Verdonk, N. H. Gene expression in early development of Lymnaea stagnalis. Dev. Biol. 35 (1), 29 (1973).
- Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and Detection of Rna-Dna Hybrid Molecules in Cytological Preparations. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 63 (2), 378-383 (1969).
- Iijima, M., Takeuchi, T., Sarashina, I., Endo, K. Expression patterns of engrailed and dpp in the gastropod Lymnaea stagnalis. Dev Genes Evol. 218 (5), 237-251 (2008).
- Shimizu, K., Sarashina, I., Kagi, H., Endo, K. Possible functions of Dpp in gastropod shell formation and shell coiling. Dev Genes Evol. 221 (2), 59-68 (2011).
- Koop, D., Richards, G. S., Wanninger, A., Gunter, H. M., Degnan, B. M. D. The role of MAPK signaling in patterning and establishing axial symmetry in the gastropod Haliotis asinina. Dev. Biol. 311 (1), 200-212 (2007).
- Lartillot, N., Lespinet, O., Vervoort, M., Adoutte, A. Expression pattern of Brachyury in the mollusc Patella vulgata suggests a conserved role in the establishment of the AP axis in Bilateria. Development. 129 (6), 1411-1421 (2002).
- Jackson, D. J., Wörheide, G., Degnan, B. M. Dynamic expression of ancient and novel molluscan shell genes during ecological transitions. BMC Evol. Biol. 7 (1), 160 (2007).
- Jackson, D. J., Meyer, N. P., Seaver, E., Pang, K., McDougall, C., et al. Developmental expression of COE. across the Metazoa supports a conserved role in neuronal cell-type specification and mesodermal development. Dev Genes Evol. 220, 221-234 (2010).
- Perry, K. J., Lyons, D. C., Truchado-Garcia, M., Fischer, A. H. L., Helfrich, L. W., et al. Deployment of regulatory genes during gastrulation and germ layer specification in a model spiralian mollusc. Dev. Dyn. , (2015).
- Iijima, M., Takeuchi, T., Sarashina, I., Endo, K. Expression patterns of engrailed and dpp in the gastropod Lymnaea stagnalis. Dev Genes Evol. 218 (5), 237-251 (2008).
- Shimizu, K., Iijima, M., Setiamarga, D. H. E., Sarashina, I., Kudoh, T., et al. Left-right asymmetric expression of dpp in the mantle of gastropods correlates with asymmetric shell coiling. EvoDevo. 4 (1), 15 (2013).
- Christodoulou, F., Raible, F., Tomer, R., Simakov, O., Trachana, K., et al. Ancient animal microRNAs and the evolution of tissue identity. Nature. 463, (2010).
- Koga, M., Kudoh, T., Hamada, Y., Watanabe, M., Kageura, H. A new triple staining method for double in situ hybridization in combination with cell lineage tracing in whole-mount Xenopus embryos. Dev Growth Differ. 49 (8), 635-645 (2007).
- Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems. BMC Dev. Biol. 11 (1), 43 (2011).
- Davison, A., Frend, H. T., Moray, C., Wheatley, H., Searle, L. J., Eichhorn, M. P. Mating behaviour in Lymnaea stagnalis. pond snails is a maternally inherited, lateralized trait. Biol. Lett. 5 (1), 20-22 (2009).
- Kuroda, R., Endo, B., Abe, M., Shimizu, M. Chiral blastomere arrangement dictates zygotic left-right asymmetry pathway in snails. Nature. 462 (7274), 790-794 (2009).
- Shibazaki, Y., Shimizu, M., Kuroda, R. Body handedness is directed by genetically determined cytoskeletal dynamics in the early embryo. Curr. Biol. 14 (16), 1462-1467 (2004).
- Lu, T. Z., Feng, Z. P. A sodium leak current regulates pacemaker activity of adult central pattern generator neurons in Lymnaea stagnalis. PLoS One. 6 (4), e18745 (2011).
- Dawson, T. F., Boone, A. N., Senatore, A., Piticaru, J., Thiyagalingam, S., et al. Gene Splicing of an Invertebrate Beta Subunit (LCav-beta) in the N-Terminal and HOOK Domains and Its Regulation of LCav1 and LCav2 Calcium Channels. PLoS ONE. 9 (4), e92941 (2014).
- Smith, S. A., Wilson, N. G., Goetz, F. E., Feehery, C., Andrade, S. C. S., et al. Resolving the evolutionary relationships of molluscs with phylogenomic tools. Nature. 480 (7377), 364-367 (2011).
- Gregory, T. R., Nicol, J. A., Tamm, H., Kullman, B., Kullman, K., et al. Eukaryotic genome size databases. Nuc. Acids. Res. 35 (Database issue), D332-D338 (2007).
