Introduction
纤维化参与多种慢性进行性疾病，如间质性肺疾病，心脏纤维化，肝硬化，终端肾功能衰竭，系统性硬化，和自身免疫性疾病1的发病机制。间间质性肺疾病，特发性肺纤维化（IPF）是一种慢性进行性疾病，并显示预后差。 IPF的病理特点是成纤维细胞灶组成了与预后有关激活成纤维细胞和肌的发展。提出这样的肺成纤维细胞的起源是从几个间充质细胞，包括原驻地肺成纤维细胞和骨髓循环纤维细胞衍生的。最近，上皮-间质转化（EMT）已经提出了用间充质细胞2的形成相关联，并且有助于纤维化疾病的发病机制。
它被认为是电磁ŧ在胚胎发育过程中的重要作用，伤口愈合和癌症的进展，包括肿瘤侵袭和转移3。以下EMT的过程中，上皮细胞的上皮标记物，如E-钙粘蛋白的损失获得间充质细胞的能力，以及由间充质标志物，如波形蛋白和α平滑肌肌动蛋白（SMA）4,5的表达。以往的研究表明，EMT过程已与组织纤维化的发展在肾脏6和肺7被相关联的证据。此外，慢性炎症促进纤维化疾病8;此外，如炎性细胞因子如肿瘤坏死因子超家族成员14（TNFSF14; LIGHT），肿瘤坏死因子（TNF）-α和白细胞介素1β，已显示出提高的EMT 9-12。
胶原凝胶收缩试验，其中成纤维细胞嵌入型我一个基于胶原的细胞收缩测定胶原凝胶三维， 在体外模型收缩的评价理想。收缩是成纤维细胞的特征功能之一，并有助于正常的伤口修复和纤维化13。在该测定中，可以认为，成纤维细胞附着于I型通过整合素依赖性机制胶原被认为在一定条件下，以产生机械张力，并因此导致组织收缩。
这里，凝胶收缩测定的发展报告可以适于评估在经历EMT的细胞中采集收缩功能。这份报告表明，这种改进法是适用于评估在经历了EMT间质细胞收缩。
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Protocol
1.准备肺上皮细胞的培养和
- 培养A549人肺上皮细胞（贴壁细胞系）中的Dulbecco改进的Eagle培养基（DMEM），补充有10％胎牛血清（FBS），100IU / ml青霉素，和100μg/ ml链霉素。
- 卸下并丢弃从培养皿的细胞培养基，并用5洗一次 - 10毫升磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。清洗后，立即吸出PBS。
- 加2ml胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA）（0.05％），在37℃下孵育，5％CO 2的3分钟。
- 收集脱离的细胞在含有细胞培养基，离心在RT管在150×g下4分钟离心管中。
- 悬浮细胞在2毫升细胞培养基的沉淀并除去对细胞计数的样品。算使用台盼蓝染色血球以检查细胞存活力细胞的数目。
- 种子A549细胞上10厘米聚苯乙烯板在0.5的密度- 1.0×10 6细胞/皿含10毫升凝胶收缩测定培养基的。种子上6孔聚苯乙烯板的细胞以0.5的密度- 1.0×10 5个细胞/孔用2ml为EMT确认培养基。孵育细胞在37℃和5％CO 2的24小时。
2. EMT过程
- 添加TGF-β1（5微克/毫升）的10微升和10微升的TNF-α（10微克/毫升），以在步骤1.6接种的板凝胶收缩试验。添加TGF-β1（5微克/毫升）的2微升和2μl的TNF-α（10微克/毫升）至板在步骤1.6接种EMT确认。在37℃和5％CO 2的48小时。
3.确认EMT过程的PCR和免疫印迹
- 确认形态变化（由鹅卵石状，以纺锤形）用相差显微镜处理的细胞中。
注：规范人A549细胞有鹅卵石状和三角形的外观是上皮细胞的特征，但与TGF-β1和肿瘤坏死因子α刺激后，细胞出现长和梭形是类似于间充质细胞14,15。 - 评估上皮标记物，如E-钙粘蛋白的表达，和间充质标记物如N-钙粘蛋白，波形蛋白和α平滑肌肌动蛋白使用PCR或印迹。
- 使用RNA提取试剂盒16中的细胞中提取总RNA，并使用根据制造商的协议逆转录17合成cDNA。
- 测量使用实时PCR系统18，并根据制造商的说明单体花青染料PCR试 剂盒的mRNA水平的表达。对于GAPDH特异性引物（甘油醛-3-磷酸脱氢酶），ACTA2（的α-肌动蛋白2），CDH1（钙粘蛋白-1; E-钙粘蛋白），和VIM（波形蛋白）示于表1中
- 裂解用裂解缓冲液（ 表2）含有1％蛋白酶抑制剂混合物溶液中的细胞。测量使用蛋白测定试剂盒19,20的所有样品的蛋白浓度，并应用相同量的蛋白质，以聚丙烯酰胺凝胶。
- 执行SDS凝胶电泳和蛋白质的半干转移到PVDF膜21。 2小时 - 在1封闭缓冲液孵育初级抗体的膜。温育后，用洗涤缓冲液洗两次膜孵育与第二抗体在膜1小时。
注：请参阅材料/设备表在这些研究中使用的抗体和稀释。 见表2为封闭缓冲液的组分。 - 两次洗涤用洗涤缓冲液的膜。就拿膜的照片与使用冷CCD相机11,23蛋白质印迹检测试剂盒22。
- 执行SDS凝胶电泳和蛋白质的半干转移到PVDF膜21。 2小时 - 在1封闭缓冲液孵育初级抗体的膜。温育后，用洗涤缓冲液洗两次膜孵育与第二抗体在膜1小时。
4。凝胶收缩试验评定EMT
- 吸从细胞培养容器中的条件培养基，并用5洗井 - 10mL的PBS，以去除死细胞。清洗后，立即吸出PBS。
- 加2ml的0.05％胰蛋白酶/ EDTA中，并在37℃反应和5％的CO 2 3分钟。
- 收集脱离的细胞在含有DMEM补充有蛋白酶抑制剂（1毫克/毫升），离心管在室温下在150×g下4分钟离心管中。
- 混合型胶原凝胶用蒸馏水，和4×浓缩的DMEM以调节体积以达到1.75毫克/毫升的胶原浓度，和1×DMEM的浓度。一定要保持冰凝胶培养基在这一步。
注意：为了让6毫升凝胶培养基中，拌匀3.5毫升1型胶原凝胶（3毫克/毫升），1.5毫升4×浓的DMEM和1 ml蒸馏水。 - 悬浮于500μlPBS中的细胞沉淀并除去对细胞计数的样品。计数使用血球用锥虫蓝染色的细胞的数目来检查细胞存活力。
- 添加凝胶介质来调整卷来实现/孔3.0×10 5个细胞的细胞密度（6.0×10 5个细胞/ ml），轻轻地但很快没有凝胶化，通过移液混合。
- 分配将0.5ml混合物成24孔未处理的板的每个孔迅速并小心地使整齐圆筒形。要小心，不要让任何气泡污染凝胶（ 图1A）。
注意：含有细胞的凝胶介质是粘性的，并且可以很容易地在井胶凝并形成月牙形状。 - 在37℃下孵育在细胞培养箱15分钟的盘，5％CO 2和95％的湿度完全胶凝。
- 分离从板凝胶而不通过的方式移动的无菌刮刀在一个方向上绘制的圆周断裂。用刮刀轻轻转移凝胶至60mm组织培养皿含有5毫升含或不含TGF-β1（5毫微克/毫升）和TNF-α（10毫微克/毫升）的DMEM / 1％FBS的。
- 轻轻摇动菜，以确保凝胶漂浮在介质上。在37℃，5％CO 2和95％湿度下孵育在细胞培养箱中。
5.凝胶尺寸的测量
- 后使用图象分析系统0，24，48，和72小时测量胶原蛋白凝胶的尺寸。
- 打开凝胶文档系统（ 图2A），并把餐具放入光屏蔽柜。然后起飞的内阁菜盖子。
- 打开相关的凝胶分析软件。单击菜单栏中的“图像采集按钮”，显示在机柜凝胶的形象。然后，点击“获取”，在菜单栏取凝胶（ 图2B）的照片。
- 单击菜单栏（ 图2C）中的“检测键”，调整测量区域（黄圈我Q 图2C）通过拖动鼠标。然后，单击菜单栏中的“自动检测按钮”（ 见图2D按钮）。该软件会自动检测出热图（ 图2D）凝胶。
- 点击“确定”，以提取图像处理凝胶的轮廓和计算的轮廓（ 图2E）所包围的区域。的区域被计算后，将计算出的区域被显示在单独的弹出窗口。
注意：如果凝胶成像期间彼此重叠，轻轻用无菌移液管尖移到凝胶。
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Representative Results
EMT期间，上皮细胞失去上皮标记，如E-钙粘蛋白，并获得间充质标志物，如波形蛋白和α平滑肌肌动蛋白4,5的表达。与TGF-β1和肿瘤坏死因子αA549人肺上皮细胞的温育诱导EMT。正常A549细胞的外观是鹅卵石状的形状，三角形形状是上皮细胞（ 图3A）的特性，但是刺激的TGF-β1和TNF-α后，外观改变为长纺锤形是类似于间充质细胞（ 图3B）。
的上皮细胞和间质标记物的表达进行评价，确认细胞发生EMT。相对mRNA的表达与ΔΔCT法计算。个人数据被归一针对甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH），它是一个内务克烯。与TGF-β1和肿瘤坏死因子α48小时处理的A549细胞已显著减少CDH1的表达和显著增加VIM和ACTA2（ 图4A）的表达。用于Q-PCR的引物序列示于表1。如在图4B中 ，刺激TGF-β1和肿瘤坏死因子α减毒E-钙粘蛋白的表达示出，而波形蛋白，N-钙粘蛋白，α平滑肌肌动蛋白的表达诱导。
进行凝胶收缩试验，以评估经历EMT的细胞的收缩性。诱导与TGF-β1和肿瘤坏死因子αEMT后，将细胞浇铸成胶原蛋白凝胶并孵育含有TGF-β1和TNF-α，或PBS 72小时中的介质。 如图5A所示，含有TGF-β1和TNF-α处理的细胞中的凝胶比含有用PBS处理的细胞控制凝胶小。要QUAntify在凝胶大小的变化，凝胶使用凝胶分析器0，24，48，和处理后72小时进行分析。 72小时后，含有TGF-β1和肿瘤坏死因子α处理的细胞凝胶的尺寸均显著减少与对照相比的凝胶（ 图5B）。我们还证实，含有TGF-β1处理的细胞的凝胶单独比对照凝胶小，但为（数据未显示）比TGF-β1和肿瘤坏死因子α处理的凝胶不小。
图1.补充图的制作凝胶。这些图像显示抛入井中的凝胶。含有细胞的凝胶介质是粘性的，并且可以容易胶凝并在井形式月牙形。 （A）左边的图像显示，该凝胶被正确铸造，右边的图片显示“整洁的圆筒形”的模式。 （B </强>）左边的图像显示，该凝胶变形，并且右图像显示，气泡污染凝胶。 （C）的凝胶是软的，这样容易损坏，变形，通常像“吃豆人”， 请点击此处查看该图的放大版本。
图2中的步骤测量的凝胶尺寸（A）的凝胶文档系统包括PC和凝胶成像系统。 （B）中的“图像获取按钮”，和凝胶的照片。 （C）中的“检测键”，和用于调整测量区域（黄色圆圈）的窗口。 （D）的“自动检测键”，并且该软件使得凝胶的热图从一个图象到脱 TECT凝胶的轮廓。 （E）该软件通过提取图像处理凝胶的轮廓，并计算出轮廓包围的地区。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3. EMT诱导细胞形貌。A549人肺上皮细胞以1.0×10 5个细胞/孔的密度在一个6孔板中铺板并有或没有5纳克/ ml的TGF-β1和10ng / ml的温育TNF-α为48小时，接着通过相差显微成像。 （A）和（B）是下×200所获得的图像。在（A）的比例尺和（B），100微米。 T =“_空白”>点击此处查看该图的放大版本。
图4. EMT刺激与TGF-β1和肿瘤坏死因子α。 （A）EMT标志物的表达（CDH1，VIM和 ACTA2）的定量RT-PCR分析。 （B）中示出E-钙粘蛋白，N-钙粘蛋白，波形蛋白的表达Western印迹，和α平滑肌肌动蛋白在有或无TGF-β1和TNF-α刺激的A549细胞的蛋白质。 α微管蛋白用作内部对照。 A549细胞分别为在图1中，N = 3次独立实验中培养。 ** P <0.01;误差棒代表SEM。 请点击此处查看该图的放大版本。
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图5.细胞发生EMT获得收缩 。在10 cm的培养皿1.0×10 6个细胞/皿的密度铺板并有或没有5纳克/ ml的TGF-β1和10ng / ml的TNF-α的48小时培养A549细胞。然后将细胞在24孔板铸造成500微升含有1.75毫克/毫升的胶原凝胶培养基以3.0×10 5个细胞/孔的密度。后的凝胶形成，它们被添加到培养基有或没有5纳克/ ml的TGF-β1和10ng / ml的60毫米培养皿中TNF-α和培养72小时，随后通过成像（A）中。凝胶尺寸被后使用图像分析系统0，24，48，和72小时进行测定。 N = 9个独立的实验（B）中。 ** P <0.01;误差棒代表SEM。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 基因名称 | 前进5'→3' | 扭转5'→3' | ||
| ACTA2 | GCACCCAGCACCATGAAGA | ACCGATCCAGACAGAGTATTT | ||
| GAPDH | GGTGAAGGTCGGAGTCAACGGA | GAGGGATCTCGCTCCTGGAAGA | ||
| VIM | GACAATGCGTCTCTGGCACGTCTT | TTCTTCTGCCTCCTGCAGGTTCTT | ||
| CDH1 | CCCATCAGCTGCCCAGAAAATGAA | CTGTCACCTTCAGCCATCCTGTTT | ||
表1引物序列。用于定量RT-PCR引物序列。 GAPDH用作内部对照。
| 裂解液：RIPA缓冲液 | |
| 的20mM的Tris-HCl pH为7.5 | |
| 150毫米氯化钠 | |
| 1毫摩尔EDTA | |
| 1％聚氧乙烯（9）醚octyiphenyl | |
| 0.1％的钠脱氧胆酸 | |
| 0.1％SDS中 | |
| 封闭液 | |
| 在洗涤缓冲液的1％封闭试剂 | |
| 洗涤液：TBST缓冲液 | |
| 氯化钠 | 45克 |
| 的1M Tris pH 7.4的 | 50毫升 |
| 聚氧乙烯（20）脱水山梨醇单月桂酸 | 2.5毫升 |
| 水蒸馏 | 加入5升 |
| 5升 |
表2缓冲器的使用的组分。裂解的组分，封闭缓冲液和洗涤缓冲液。
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Discussion
在这项研究中开发的协议包括两个步骤。进行第一步骤以诱导EMT的，而第二个步骤是在凝胶收缩试验。因为它确认细胞发生EMT是很重要的，第2步提供了一个极好的补充，形态学和基因表达的变化。以往的研究表明，A549细胞的EMT诱导仅24，TGF-β1;然而，正如我们以前10日报道，TNF-α处理增强EMT和收购的间充质细胞标志物。它被认为是TGF-β介导EMT的机制是SMAD依赖性25。 TNFα增强了TGF-β1诱导的EMT，导致增强凝胶收缩。已经报道了TNFα的用于增强TGF-β1诱导的EMT的机制不仅Smad2的接头区的磷酸化，但也MAPK信号调节26。因此，在该研究开发的协议包括stimul由两个TGF-β1和TNF-α的通货膨胀。
该行的EMT到I型胶原凝胶的类型，和浮动在介质上的细胞的嵌入，是该测定（步骤4）的中央的方面。由于凝胶是软的，容易损坏，并且在每侧有不同的尺寸，施加凝胶时向培养基中并测量它们的尺寸格外小心是必需的。如果难以进行这种步骤中，是测量井的凝胶尺寸而不凝胶移入60mm培养皿27,28的替代方法。有几个共同的问题，第一个问题是，胶原凝胶容易凝胶化在RT，所以凝胶如在步骤4.7中提到经常变形。因此，该板块一定要轻轻地铸造成凝胶井，以确保他们采取一个整洁的圆柱状后动摇。第二个问题是，如果任何气泡凝胶化期间输入的凝胶，然后将凝胶的大小将是不均匀的。要小心，不要让任何空气bubbl下载到污染凝胶。有原始的方法，这方法之间有两个主要差异。第一差别是该原始方法的胶原凝胶的最终浓度为0.75毫克/毫升，但是，该方法的是1.75毫克/毫升，以使凝胶收缩超过他们做的原始方法。第二差异是，原来的方法使用凝胶浮动平台无血清培养基，但这种方法中，以保持细胞生存力和维持细胞收缩使用1％FBS中的凝胶的浮动平台。
最初为成纤维细胞开发的凝胶收缩试验是在体外模型用于评估有助于伤口愈合和纤维化13的过程的细胞的收缩性的理想。成纤维细胞的1型胶原的连接应该是产生机械张力该因而导致在胶原凝胶的尺寸的减小。此外，该测定中，最近已经使用作为研究的炎性疾病，包括支气管哮喘和COPD 29-31气道细胞的收缩的体外模型。
凝胶收缩试验是可比其他测定法，诸如细胞迁移测定的，因为它不需要特定设备和显示出高的定量重复性。但是，也有施加凝胶收缩试验用于评估EMT 32报道很少。在这项研究中，包含该行的EMT的细胞凝胶显著在大小减小24到72小时的凝胶化后，指示细胞收缩。然而有这种方法的局限性。第一个是，在该测定中，凝胶的尺寸变化显示在凝胶所有细胞的收缩力的总和。然而，这是难以评价在使用该测定的凝胶单细胞收缩。第二个是，A549细胞是癌症细胞系，而不是正常的人上皮细胞。因此，它是难以推断ö乌尔结果直接肺纤维化的发病机制。然而，A549细胞被广泛用于研究呼吸道上皮细胞的功能，并且一些研究通过使用A549细胞肺纤维化33,34的模型得到的EMT的证据。
总之，I型胶原蛋白包含经历EMT的大小减少了，指示这些细胞的收缩间充质细胞的凝胶。因此，凝胶收缩试验应被视为一个扩展体外测定中通过EMT过程中的细胞，以评估采集收缩功能。
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Disclosures
作者有没有利益冲突披露。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | sigma aldrich | 11965-092 | For A549 medium |
| FBS | GIBCO | 10437 | |
| Transforming Growth Factor-β1, Human, recombinant | Wako Laboratory chemicals | 209-16544 | |
| Recombinant Human TNF-α | R&D systems | 210-TA/CF | |
| E-Cadherin (24E10) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | #3195 | 1:3,000 dilution |
| Vimentin (D21H3) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | #5741 | 1:3,000 dilution |
| Anti-α-Tubulin antibody | sigma aldrich | T9026 | 1:10,000 dilution |
| Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle antibody | sigma aldrich | A5228 | 1:10,000 dilution |
| Anti-N-cadherin antibody | BD Transduction Laboratories | #610920 | 1:1,000 dilution |
| Anti-Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab Sheep (secondary antibody) | GE Healthcare | NA931-100UL | 1:20,000 dilution |
| Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab Donkey (secondary antibody) | GE Healthcare | NA934-100UL | 1:20,000 dilution |
| Blocking reagent | GE Healthcare | RPN418 | 2% in TBS-T |
| 6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid | corning | #353046 | |
| 100 mm Cell culture dish | TPP | #93100 | |
| DMEM, powder | life technologies | 12100-046 | For 4× DMEM |
| Type 1 collagen gel | Nitta gelatin | Cellmatrix type I-A | |
| 24 Well cell culture plate | AGC TECHNO GLASS | 1820-024 | |
| Gel Documentation System | ATTO | AE-6911FXN | Gel imager |
| Gel analyzing software | ATTO | Densitograph, ver. 3.00 | analysing software bundled with AE-6911FXN |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | life technologies | 25300054 | |
| 24 Well Plates, Non-Treated | IWAKI | 1820-024 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | life technologies | 15250-061 | |
| RNA extraction kit | Qiagen | 74106 | |
| Reverse transcriptase | life technologies | 18080044 | |
| Real time PCR system | Stratagene | Mx-3000P | |
| SYBR green PCR kit | Qiagen | 204145 | |
| Protease Inhibitor Cocktail (100x) | life technologies | 78429 | |
| PVDF membrane | ATTO | 2392390 | |
| Protein assay kit | bio-rad | 5000006JA | |
| Polyacrylamide gel | ATTO | 2331810 | |
| Western blotting detection reagent | GE Healthcare | RPN2232 | |
| Cold CCD camera | ATTO | Ez-Capture MG/ST | |
| Trypsin inhibitor | sigma aldrich | T9003-100MG | |
| Polyoxyethylene (20)Sorbitan Monolaurate | Wako Laboratory chemicals | 163-11512 | |
| Polyoxyethylene (9) octyiphenyl ether | Wako Laboratory chemicals | 141-08321 |
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