Introduction
Фиброз участвует в патогенезе различных хронических прогрессирующих заболеваний, таких как интерстициальный заболевания легких, сердечный фиброз печени , цирроз печени, терминальной почечной недостаточности, системный склероз, и аутоиммунные заболевания 1. Среди интерстициальных заболеваний легких, идиопатический легочный фиброз (IPF) представляет собой хроническое прогрессирующее заболевание, и показывает плохой прогноз. Патологический признак IPF является развитие фибробластической очагов, состоящий из активированных фибробластов и миофибробластов, которые связаны с прогнозом. Истоки таких легочных фибробластов предлагается быть получены из нескольких мезенхимальных клеток, в том числе легочных фибробластов, первоначально резидентных и циркулирующих фиброциты из костного мозга. В последнее время был предложен переход эпителиально-мезенхимальной (ЕМТ), связаны с образованием клеток мезенхимы 2, и внести свой вклад в патогенез фиброзных заболеваний.
Считается, что чемпионат ЕвропыТ играет важную роль в процессе развития плода, заживление ран, а также прогрессирование рака, в том числе опухолевой инвазии и метастазирования 3. После процесса EMT, эпителиальные клетки получают способность мезенхимальных клеток потерей эпителиальных маркеров, таких как Е-кадгерина, и экспрессии маркеров мезенхимальных, таких как виментину и α-актин гладких мышц (SMA) 4,5. Предыдущие исследования показали , доказательства того, что процесс ЕМТ был связан с развитием фиброза тканей в почках 6 и 7 легких. Кроме того, хроническое воспаление способствует болезни фиброзный 8; Кроме того, такие цитокины , как фактор некроза опухоли надсемейства элемента 14 (TNFSF14, свет), фактор некроза опухолей (ФНО), и интерлейкин-1 & beta ; , было показано , что повышение EMT 9-12.
сокращение анализа коллагеновый гель, коллаген на основе сжатия клеток для анализа, в котором фибробласты встроены в типа Iколлагеновый гель трехмерно, является идеалом в пробирке модель для оценки сократительной способности . Сократимость является одной из характерных функций фибробластов и способствует нормальному заживлении ран и фиброза 13. В этом анализе, полагают, что присоединение фибробластов типа коллагена через интегрин-зависимые механизмы, как предполагается производить механические напряжения при определенных условиях, и, следовательно, приводит к сжатию ткани.
Здесь, развитие анализа гель сжатия, как сообщается, адаптированный для оценки приобретения сократительной функции в клетках, прошедших ЕМТ. Этот отчет показывает, что этот модифицированный тест предназначен для оценки сократительной в мезенхимальных клетках, подвергшихся EMT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка и культура легких эпителиальных клеток
- Культура A549 эпителиальные клетки легких человека (прилипший линия клеток) в среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 100 МЕ / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина.
- Удаляют среды для культивирования клеток от культуральной чашки и мыть один раз с 5 - 10 мл фосфатно-буферного раствора (PBS). После промывания, немедленно аспирация PBS.
- Добавить 2 мл трипсин / этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) (0,05%) и инкубируют при температуре 37 ° С и 5% СО 2 в течение 3 мин.
- Собирают обособленные клетки в центрифужные пробирки, содержащие среду для культивирования клеток, центрифугируют пробирки при комнатной температуре в течение 4 мин при 150 × г.
- Ресуспендируют клетки осадок в 2 мл культуральной среды клеток и удалить образец для подсчета клеток. Подсчитайте число клеток с помощью гемоцитометра с трипановым синим красителем, чтобы проверить жизнеспособность клеток.
- Семенной клетки А549 на10 см полистирола пластины с плотностью 0,5 - 1,0 × 10 6 клеток / блюдо с 10 мл среды для геля сжатия анализа. Семенной клеток на 6 - луночные полистироловые планшеты при плотности 0,5 - 1,0 × 10 5 клеток / лунку с 2 мл среды для EMT подтверждения. Инкубируйте клетки при 37 ° С и 5% СО 2 в течение 24 часов.
Процедура 2. EMT
- Добавьте 10 мкл TGF- 1 (5 мкг / мл) и 10 мкл TNF-alpha (10 мкг / мл) к пластине для геля сжатия анализа высевают на этапе 1.6. Добавляют 2 мкл TGF- 1 (5 мкг / мл) и 2 мкл TNF-alpha (10 мкг / мл) к пластине для EMT подтверждения высевают на шаге 1.6. Инкубируют при 37 ° С и 5% СО 2 в течение 48 часов.
3. Подтверждение EMT процедуры с помощью ПЦР и Вестерн-блоттинга
- Подтвердите изменение морфологии (от булыжник-как шпинделем форму) обработанных клеток с использованием фазово-контрастной микроскопии.
Примечание: NormКлетки А549 ал имеют булыжник вид камнеподобное и треугольной формы , которая является характеристикой эпителиальных клеток, но после стимуляции TGF- 1 и TNF-alpha, клетки появляются длинные и шпиндель формы , который похож на мезенхимальные клетки 14,15. - Оценка экспрессии эпителиального маркера, такие как E-кадгерина, и мезенхимальные маркеры, такие как N-кадгерина, виментину и альфа-актин гладких мышц с использованием ПЦР или Вестерн-блоттинга.
- Экстракт тотальной РНК из клеток с использованием набора для экстракции РНК 16 и синтеза кДНК с использованием обратной транскриптазы 17 в соответствии с протоколом производителя.
- Измерьте экспрессию уровней мРНК с использованием системы в реальном масштабе времени PCR 18 и мономерный цианиновый краситель ПЦР - комплект в соответствии с инструкциями производителя. Специфические праймеры для GAPDH (глицеральдегид - 3-фосфат - дегидрогеназа), ACTA2 (альфа-актин-2), CDH1 (кадгерин-1, E-кадгерина), и ВИМ (Виментин), приведены в таблице 1 ,
- Лизировать клетки , используя буфер для лизиса (таблица 2) , содержащий 1% ингибиторов протеаз. Измерить все концентрации образца белка с помощью анализа белка набор 19,20, и применять те же количества белка в полиакриламидном геле.
- Выполнить SDS гель-электрофореза и полусухого переноса белков на PVDF мембрану 21. Инкубируйте мембрану с первичными антителами в блокирующем буфере в течение 1 - 2 ч. После инкубации промыть дважды мембрану с промывочным буфером и инкубировать 1 час мембрану со вторыми антителами.
Примечание: Смотрите таблицу Материалы / Оборудование для антител и разведений, используемых в этих исследованиях. В таблице 2 компонентов блокирующего буфера. - Промойте мембрану с буфером для промывки дважды. Сфотографируйте мембраны с Вестерн - блоттинга комплект обнаружения 22 с использованием холодного CCD камеры 11,23.
- Выполнить SDS гель-электрофореза и полусухого переноса белков на PVDF мембрану 21. Инкубируйте мембрану с первичными антителами в блокирующем буфере в течение 1 - 2 ч. После инкубации промыть дважды мембрану с промывочным буфером и инкубировать 1 час мембрану со вторыми антителами.
4, Гель Сужение анализа для оценки EMT
- Аспирируйте кондиционированной среды из сосуда для культивирования клеток, а также стирать с 5 - 10 мл PBS для удаления мертвых клеток. После промывания, немедленно аспирация PBS.
- Добавляют 2 мл 0,05% трипсина / EDTA и инкубировать при 37 ° С и 5% СО 2 в течение 3 мин.
- Собирают обособленные клетки в центрифужные пробирки, содержащие DMEM, с ингибитором трипсина (1 мг / мл), центрифугу трубках, дополненной при комнатной температуре в течение 4 мин при 150 & bull; g.
- Смешайте тип 1 коллаген гель с дистиллированной водой, и 4 × концентрированные DMEM для регулировки громкости для достижения концентрации коллагена в 1,75 мг / мл, и 1 × концентрация DMEM. Не забудьте сохранить гелевой среды на льду во время этого шага.
Примечание: Для того, чтобы 6 мл гелевой среды, хорошо перемешать 3,5 мл 1 типа коллагена геля (3 мг / мл), 1,5 мл 4 × концентрированного DMEM и 1 мл дистиллированной воды. - Ресуспендируют осадок клеток в 500 мкл PBS и удалить образец для подсчета клеток. подсчитыватьчисло клеток с помощью гемоцитометра с трипановым синим красителем, чтобы проверить жизнеспособность клеток.
- Добавьте гелевой среды , чтобы отрегулировать громкость для достижения плотности клеток 3,0 × 10 5 клеток / лунку (6,0 × 10 5 клеток / мл) и осторожно , но быстро смешать его с помощью пипетки без гелеобразования.
- Разливают 0,5 мл смеси в каждую лунку 24-луночного необработанной пластиной быстро и аккуратно, чтобы сделать аккуратную цилиндрическую форму. Будьте осторожны , чтобы не допустить любые воздушные пузырьки загрязнять гели (Рис . 1А)
Примечание: Носитель гель, содержащий клетки является вязким и может легко гель и форма серповидную форму в скважине. - Инкубируйте планшет в течение 15 минут в кювете инкубаторе при температуре 37 ° С, 5% СО 2 и 95% влажности в гель полностью.
- Отделить гели из пластинки, не нарушая путем перемещения стерилизованного шпателя таким образом, чтобы нарисовать окружность в одном направлении. С помощью шпателя, аккуратно передать гели до 60 мм чашки для культивирования тканейсодержащий 5 мл DMEM / 1% FBS с добавлением или без TGF- 1 (5 нг / мл) и TNF-alpha (10 нг / мл).
- Осторожно потрясите посуду, чтобы обеспечить гели плавающей на носителе. Выдержите в сотовом инкубаторе при температуре 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 и 95% влажности.
5. Измерение размера геля
- Измерьте размер коллагеновый гель после того, как 0, 24, 48, и 72 ч с использованием системы анализа изображений.
- Включите систему гель документации (Рисунок 2A), и поставить посуду в шкаф экранирования света. Затем снять крышку посуды в шкафу.
- Откройте соответствующее программное обеспечение гель анализирующее. Нажмите на кнопку "захвата изображений" в меню-бар, чтобы показать образ гелей в шкафу. Затем нажмите кнопку «захватит» в строке меню , чтобы делать снимки гелей (рис 2В).
- Нажмите на кнопку "обнаружения" в строке меню (Рисунок 2C) и отрегулировать область измерения (желтый круг яп Рис 2С) путем перетаскивания мышью. Затем нажмите кнопку "автоматического обнаружения" в строке меню (см кнопку на рисунке 2D). Программное обеспечение автоматически определяет гели , показывающие Heatmap (рис 2D).
- Нажмите кнопку "OK" , чтобы извлечь контур гелей путем обработки изображений и расчета областей , окруженными контура (рис 2E). После того, как область рассчитывается, расчетная область отображается в отдельном всплывающем окне.
Примечание: Если гели накладываются друг на друга во время формирования изображения, перемещать гели осторожно с помощью стерильной пипетки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Во время EMT, эпителиальные клетки теряют эпителиальные маркеры, такие как E-кадгерина, и получить экспрессию маркеров мезенхимальных, таких как виментин и α-актин гладких мышц 4,5. Инкубация человека A549 легочных эпителиальных клеток с TGF- 1 и TNF-a индуцирует EMT. Появление нормальных клеток А549 являются булыжник камень образную форму и форму треугольника , который является характеристикой эпителиальных клеток (рис 3 , а ), но после того, как стимулировали TGF- 1 и TNF-a, внешний вид изменен на длинной форме веретена , который похож на мезенхимальные клетки (фигура 3В).
Экспрессия эпителиальных и мезенхимальных маркеров оценивали, чтобы подтвердить, что клетки подвергались ЕМТ. Выражение Относительная мРНК рассчитывали с помощью метода ΔΔCt. Индивидуальные данные были нормализованы против глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH), который является ведение домашнего хозяйства гена. A549 клетки , обработанные TGF- 1 и TNF-a в течение 48 ч, значительно пониженную экспрессию CDH1 и значительно повышенную экспрессию VIM и ACTA2 (фиг.4А). Праймеры последовательности, используемые для д-PCR показаны в табл.1. Как показано на фиг.4В, стимуляции TGF- 1 и экспрессии ослабленный Е-кадгерина TNF-alpha, тогда как экспрессия виментину, N-кадгерина и альфа-актин гладких мышц индуцировали.
Анализ гель сжатие проводили для оценки сократимости клеток, которые подверглись ЕМТ. После индукции EMT с TGF- 1 и TNF-alpha, клетки были отлиты в гель коллагена и инкубировали в течение 72 ч в среде, содержащей TGF- 1 и TNF-alpha, или PBS. Как показано на фигуре 5А, гели , содержащие клетки , обработанные с TGF- 1 и ФНО-альфа были меньше , чем контрольные гелей , содержащих клетки , обработанные с PBS. Для кваntify изменением размера геля, гели анализировали с помощью анализатора Лари 0, 24, 48 и 72 ч после обработки. Через 72 ч, размеры гелей , содержащих клетки , обработанные с TGF- 1 и ФНО-альфа были значительно снижены по сравнению с контрольными гелей (рис 5б). Мы также подтвердили, что гели, содержащие клетки, обработанные с TGF- 1 одни были меньше, чем контрольные гели, но были не меньше, чем гели, обработанных TGF- 1 и TNF-alpha (данные не показаны).
Рисунок 1. Дополнительный Рисунок для Создания Гели. Эти изображения показывают гели отлитые в лунки. Носитель гель, содержащий клетки является вязким и может легко гель и форма серповидную форму в скважине. (A) Левое изображение показывает , что гели отлиты правильно, а правое изображение показывает схему "аккуратной цилиндрической формы". (B </ Сильный>) Левое изображение показывает, что гели деформироваться, а правое изображение показывает, что воздушные пузырьки загрязнять гели. (C) гели являются мягкими, так легко повреждается и обычно деформируются как "Pac-Man". Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Шаги для измерения геля размер. (A) Система документации гель состоит из ПК и системы визуализации геля. "Кнопка Image Acquisition" (B), и картина гелей. "Кнопка обнаружения" (C), и окно для настройки область измерения (желтый круг). "Кнопка автоматического обнаружения" (D), а программное обеспечение делает Heatmap гелей от картины к де Tect контур гелей. (E) Программное обеспечение извлекает контур гелей путем обработки изображений, и вычисляет участки , окруженные контуром. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Морфология ЕМТ-индуцированных клеток. A549 эпителии легкого человека , высевали при плотности 1,0 × 10 5 клеток / лунку в 6-луночные планшеты и инкубировали с или без 5 нг / мл TGF- 1 и 10 нг / мл ФНО-α в течение 48 ч, а затем фазовоконтрастном микроскопических изображений. (А) и (В) являются изображения , полученные при х200. Масштабные бары в (А) и (В), 100 мкм. т = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. ЕМТ Стимуляция с TGF- 1 и TNF-alpha. (А) QRT-PCR анализ экспрессии маркера EMT (CDH1, VIM, и ACTA2). (В) Вестерн - блот , показывающий экспрессию Е-кадгерина, N-кадгерина, виментину и альфа актин гладких мышц белков в клетках А549 , стимулированных или без TGF- 1 и TNF-alpha. α-тубулина использовали в качестве внутреннего контроля. Клетки А549 культивировали, как на рисунке 1. N = 3 независимых экспериментов. ** Р <0,01; Столбики ошибок обозначают SEM. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Iles / ftp_upload / 53974 / 53974fig5.jpg "/>
Рисунок 5. Ячейки Проходят EMT Приобретенная сократимости. Клетки А549 высевали при плотности 1,0 × 10 6 клеток / чашку в 10 см чашки и инкубировали с или без 5 нг / мл TGF- 1 и 10 нг / мл TNF-a в течение 48 ч. Клетки затем отливают в 500 мкл среды , содержащей 1,75 мг / мл коллагенового геля , при плотности 3,0 × 10 5 клеток / лунку в 24-луночный планшет. После образования геля, они были добавлены в среде с добавлением или без 5 нг / мл TGF- 1 и 10 нг / мл TNF-a в 60 мм чашках и инкубировали в течение 72 ч с последующей обработки изображений (A). Размеры Гелевые были измерены после того, как 0, 24, 48, и 72 ч с использованием системы анализа изображений. N = 9 независимых экспериментов (B). ** Р <0,01; Столбики ошибок обозначают SEM. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| Джин Имя | Форвард 5 '→ 3' | Обратный 5 '→ 3' | ||
| ACTA2 | GCACCCAGCACCATGAAGA | ACCGATCCAGACAGAGTATTT | ||
| GAPDH | GGTGAAGGTCGGAGTCAACGGA | GAGGGATCTCGCTCCTGGAAGA | ||
| ВИМ | GACAATGCGTCTCTGGCACGTCTT | TTCTTCTGCCTCCTGCAGGTTCTT | ||
| CDH1 | CCCATCAGCTGCCCAGAAAATGAA | CTGTCACCTTCAGCCATCCTGTTT | ||
Таблица 1. Последовательности праймеров. Последовательности праймеров , используемых для QRT-PCR. GAPDH, использовали в качестве внутреннего контроля.
| Лизис буфера: РИПО буфера | |
| 20 мМ Трис-HCl, рН 7,5 | |
| 150 мМ NaCl | |
| 1 мМ ЭДТА | |
| 1% эфира полиоксиэтилена (9) octyiphenyl эфир | |
| 0,1% Na-дезоксихолат | |
| 0,1% ДСН | |
| блокирующего буфера | |
| 1% блокирующий реагент в буфере для промывки | |
| Промывочный буфер: TBST буфер | |
| NaCl | 45 г |
| 1 М Трис рН 7,4 | 50 мл |
| Полиоксиэтилен (20) сорбитан монолаурат | 2,5 мл |
| перегонку воды | добавить в 5 л |
| 5 л |
Таблица 2. Компоненты буферов , используемых. Компоненты лизиса, Блокирующий буфер и промывочный буфер.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол разработан в данном исследовании, включает в себя два этапа. Первый шаг выполняется, чтобы побудить EMT, а второй стадией является анализ гель сжатия. Так как это важно, чтобы подтвердить, что клетки прошли EMT, шаг 2 обеспечивает превосходное дополнение к морфологическим и генных изменений экспрессии. Предыдущие исследования показали , что ЕМТ из клеток A549 индуцировали только 24 TGF- 1; Тем не менее, как мы уже сообщали ранее 10, TNF-α обработка повышает EMT и приобретение маркеров мезенхимальных клеток. Полагают , что механизм TGF-β-опосредованной ЕМТ Smad-зависимый 25. TNF-alpha усиливает TGF- 1-индуцированное EMT, что приводит к усилению контракции геля. Сообщалось , что механизмы TNF & alpha ; для повышения ТФР-β1-индуцированного EMT не только фосфорилирование SMAD2 линкерной области, но и МАРК сигнализации регулирование 26. Таким образом, протокол, разработанный в данном исследовании, включали Стимулвания обоими TGF- 1 и TNF-alpha.
Вложение клеток, прошедших ЕМТ в тип I коллагеновый гель, и плавающие на среде, являются центральными аспектами данного анализа (этап 4). Поскольку гели являются мягкими и легко повреждаются, и имеют различные размеры с каждой стороны, крайняя осторожность требуется при применении гелей для среды и измерения их размеров. Если это трудно осуществить этот шаг, есть альтернативный метод для измерения размеров геля в скважину , не двигая гели в 60 мм блюдо 27,28. Есть несколько распространенных проблем, первая проблема заключается в том, что коллагеновые гели легко желатинирования при комнатной температуре, так что гели часто деформируются, как указано в шаге 4.7. Таким образом, пластина должна быть осторожно встряхивали после заливки гелей в колодцы, чтобы убедиться, что они берут на себя аккуратным цилиндрической формы. Вторая проблема заключается в том, что, если какие-либо пузырьки воздуха вводить гели во время гелеобразования, то размер гелей будет неравномерным. Будьте осторожны, чтобы не допускать воздуха Bubblэс загрязнять гели. Существуют два основных различия между оригинальным методом и этим методом. Первые отличия в том, что конечная концентрация коллагеновых гелей оригинального метода составляет 0,75 мг / мл, но у этого способа составляет 1,75 мг / мл, с тем чтобы гели сжиматься больше, чем они с оригинальным методом. Вторые отличия в том, что оригинальный метод использует безсывороточную среду для геля с плавающей среды, но этот метод использует 1% FBS в геле плавучей среды для того, чтобы сохранить жизнеспособность клеток и поддержания клеток сократимость.
Анализ усадка гель , первоначально разработанный для фибробластов является идеальным в пробирке модель для оценки сократимости клеток , которые вносят вклад в процесс заживления ран и фиброза 13. Прикрепление фибробластов типа 1, коллагена предполагается производить механическую напряженность, что, следовательно, приводит к уменьшению размера коллагеновых гелей. Кроме того, недавно был использован этот анализкак в пробирке модель для изучения сокращения клетки дыхательных путей при воспалительных заболеваниях, в том числе бронхиальной астмы и ХОБЛ 29-31.
Анализ гель сжатия сравнима с другими анализами, такими как миграция клеток анализы, в том, что он не требует особых устройств и демонстрирует высокую количественную воспроизводимость. Тем не менее, есть несколько отчетов , применяющих сократительную анализа гель для оценки EMT 32. В этом исследовании, гели, содержащие клетки, которые прошли ЕМТ значительно уменьшились в размере от 24 до 72 ч после того, как гелеобразование, что указывает на сокращение клеток. Существуют, однако, ограничения этого метода. Во-первых, в этом анализе, изменение размера гелей показывают сумму сократимости всех клеток в геле. Тем не менее, трудно оценить одного сократимость клеток в гелях при применении этого теста. Во-вторых, что клетки А549 представляет собой линию клеток рака, а не нормальные эпителиальные клетки человека. Таким образом, трудно экстраполировать OУр результаты непосредственно к патогенеза легочного фиброза. Тем не менее, клетки А549 широко используются для изучения функции эпителиальных клеток дыхательных путей, и несколько исследований дали доказательства EMT с помощью клеток А549 в качестве модели фиброза легких 33,34.
Таким образом, тип коллагена гели, содержащие мезенхимных клеток, которые подверглись ЕМТ были уменьшены в размерах, что указывает на сокращение этих клеток. Таким образом, анализ сжатия гель следует рассматривать как расширенное в пробирке анализа для оценки приобретения сократительной функции в клетках через процесс ЕМТ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют конфликта интересов раскрывать.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | sigma aldrich | 11965-092 | For A549 medium |
| FBS | GIBCO | 10437 | |
| Transforming Growth Factor-β1, Human, recombinant | Wako Laboratory chemicals | 209-16544 | |
| Recombinant Human TNF-α | R&D systems | 210-TA/CF | |
| E-Cadherin (24E10) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | #3195 | 1:3,000 dilution |
| Vimentin (D21H3) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | #5741 | 1:3,000 dilution |
| Anti-α-Tubulin antibody | sigma aldrich | T9026 | 1:10,000 dilution |
| Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle antibody | sigma aldrich | A5228 | 1:10,000 dilution |
| Anti-N-cadherin antibody | BD Transduction Laboratories | #610920 | 1:1,000 dilution |
| Anti-Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab Sheep (secondary antibody) | GE Healthcare | NA931-100UL | 1:20,000 dilution |
| Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab Donkey (secondary antibody) | GE Healthcare | NA934-100UL | 1:20,000 dilution |
| Blocking reagent | GE Healthcare | RPN418 | 2% in TBS-T |
| 6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid | corning | #353046 | |
| 100 mm Cell culture dish | TPP | #93100 | |
| DMEM, powder | life technologies | 12100-046 | For 4× DMEM |
| Type 1 collagen gel | Nitta gelatin | Cellmatrix type I-A | |
| 24 Well cell culture plate | AGC TECHNO GLASS | 1820-024 | |
| Gel Documentation System | ATTO | AE-6911FXN | Gel imager |
| Gel analyzing software | ATTO | Densitograph, ver. 3.00 | analysing software bundled with AE-6911FXN |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | life technologies | 25300054 | |
| 24 Well Plates, Non-Treated | IWAKI | 1820-024 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | life technologies | 15250-061 | |
| RNA extraction kit | Qiagen | 74106 | |
| Reverse transcriptase | life technologies | 18080044 | |
| Real time PCR system | Stratagene | Mx-3000P | |
| SYBR green PCR kit | Qiagen | 204145 | |
| Protease Inhibitor Cocktail (100x) | life technologies | 78429 | |
| PVDF membrane | ATTO | 2392390 | |
| Protein assay kit | bio-rad | 5000006JA | |
| Polyacrylamide gel | ATTO | 2331810 | |
| Western blotting detection reagent | GE Healthcare | RPN2232 | |
| Cold CCD camera | ATTO | Ez-Capture MG/ST | |
| Trypsin inhibitor | sigma aldrich | T9003-100MG | |
| Polyoxyethylene (20)Sorbitan Monolaurate | Wako Laboratory chemicals | 163-11512 | |
| Polyoxyethylene (9) octyiphenyl ether | Wako Laboratory chemicals | 141-08321 |
References
- Wynn, T. A. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis. The Journal of pathology. 214, 199-214 (2008).
- Hardie, W. D., Glasser, S. W., Hagood, J. S. Emerging concepts in the pathogenesis of lung fibrosis. The American journal of pathology. 175, 3-16 (2009).
- Kovacic, J. C., Mercader, N., Torres, M., Boehm, M., Fuster, V. Epithelial-to-mesenchymal and endothelial-to-mesenchymal transition: from cardiovascular development to disease. Circulation. 125, 1795-1808 (2012).
- Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease. Cell. 139, 871-890 (2009).
- Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. The Journal of clinical investigation. 119, 1420-1428 (2009).
- Forino, M., et al. TGFbeta1 induces epithelial-mesenchymal transition, but not myofibroblast transdifferentiation of human kidney tubular epithelial cells in primary culture. International journal of experimental pathology. 87, 197-208 (2006).
- Yang, S., et al. Participation of miR-200 in pulmonary fibrosis. The American journal of pathology. 180, 484-493 (2012).
- Reynolds, H. Y. Lung inflammation and fibrosis: an alveolar macrophage-centered perspective from the 1970s to 1980s. American journal of respiratory and critical care medicine. 171, 98-102 (2005).
- Camara, J., Jarai, G. Epithelial-mesenchymal transition in primary human bronchial epithelial cells is Smad-dependent and enhanced by fibronectin and TNF-alpha. Fibrogenesis & tissue repair. 3, 2 (2010).
- Kamitani, S., et al. Simultaneous stimulation with TGF-beta1 and TNF-alpha induces epithelial mesenchymal transition in bronchial epithelial cells. International archives of allergy and immunology. 155, 119-128 (2011).
- Mikami, Y., et al. Lymphotoxin beta receptor signaling induces IL-8 production in human bronchial epithelial cells. PloS one. 9, e114791 (2014).
- Yamauchi, Y., et al. Tumor necrosis factor-alpha enhances both epithelial-mesenchymal transition and cell contraction induced in A549 human alveolar epithelial cells by transforming growth factor-beta1. Experimental lung research. 36, 12-24 (2010).
- Grinnell, F. Fibroblasts, myofibroblasts, and wound contraction. The Journal of cell biology. 124, 401-404 (1994).
- Ramos, C., et al. FGF-1 reverts epithelial-mesenchymal transition induced by TGF-{beta}1 through MAPK/ERK kinase pathway . American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 299, L222-L231 (2010).
- Ren, Z. X., Yu, H. B., Li, J. S., Shen, J. L., Du, W. S. Suitable parameter choice on quantitative morphology of A549 cell in epithelial-mesenchymal transition. Bioscience reports. 35, (2015).
- Brinkmann, V., Kinzel, B., Kristofic, C. TCR-independent activation of human CD4+ 45RO- T cells by anti-CD28 plus IL-2: Induction of clonal expansion and priming for a Th2 phenotype. Journal of immunology. 156, 4100-4106 (1996).
- Krug, M. S., Berger, S. L. First-strand cDNA synthesis primed with oligo(dT). Methods in enzymology. 152, 316-325 (1987).
- Morozumi, M., et al. Simultaneous detection of pathogens in clinical samples from patients with community-acquired pneumonia by real-time PCR with pathogen-specific molecular beacon probes. Journal of clinical microbiology. 44, 1440-1446 (2006).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical biochemistry. 150, 76-85 (1985).
- Wiechelman, K. J., Braun, R. D., Fitzpatrick, J. D. Investigation of the bicinchoninic acid protein assay: identification of the groups responsible for color formation. Analytical biochemistry. 175, 231-237 (1988).
- Ursitti, J. A., Mozdzanowski, J., Speicher, D. W., et al. Electroblotting from polyacrylamide gels. Current protocols in protein science. Chapter 10, Unit 10.7 (2001).
- Kricka, L. J., Voyta, J. C., Bronstein, I. Chemiluminescent methods for detecting and quantitating enzyme activity. Methods in enzymology. 305, 370-390 (2000).
- Noguchi, S., et al. An integrative analysis of the tumorigenic role of TAZ in human non-small cell lung cancer. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 20, 4660-4672 (2014).
- Kasai, H., Allen, J. T., Mason, R. M., Kamimura, T., Zhang, Z. TGF-beta1 induces human alveolar epithelial to mesenchymal cell transition (EMT). Respiratory research. 6, 56 (2005).
- Chen, X., et al. Integrin-mediated type II TGF-beta receptor tyrosine dephosphorylation controls SMAD-dependent profibrotic signaling. The Journal of clinical investigation. 124, 3295-3310 (2014).
- Saito, A., et al. An integrated expression profiling reveals target genes of TGF-beta and TNF-alpha possibly mediated by microRNAs in lung cancer cells. PloS one. 8, e56587 (2013).
- Dvashi, Z., et al. Protein phosphatase magnesium dependent 1A governs the wound healing-inflammation-angiogenesis cross talk on injury. The American journal of pathology. 184, 2936-2950 (2014).
- Hallgren, O., et al. Enhanced ROCK1 dependent contractility in fibroblast from chronic obstructive pulmonary disease patients. Journal of translational medicine. 10, 171 (2012).
- Kobayashi, T., et al. Matrix metalloproteinase-9 activates TGF-beta and stimulates fibroblast contraction of collagen gels. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 306, L1006-L1015 (2014).
- Horie, M., et al. Histamine induces human lung fibroblast-mediated collagen gel contraction via histamine H1 receptor. Experimental lung research. 40, 222-236 (2014).
- Kohyama, T., et al. PGD(2) modulates fibroblast-mediated native collagen gel contraction. American journal of respiratory cell and molecular biology. 27, 375-381 (2002).
- Muir, A. B., et al. Esophageal epithelial cells acquire functional characteristics of activated myofibroblasts after undergoing an epithelial to mesenchymal transition. Experimental cell research. 330, 102-110 (2015).
- Zhong, Q., et al. Role of endoplasmic reticulum stress in epithelial-mesenchymal transition of alveolar epithelial cells: effects of misfolded surfactant protein. American journal of respiratory cell and molecular biology. 45, 498-509 (2011).
- Liu, X. Inflammatory cytokines augments TGF-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition in A549 cells by up-regulating TbetaR-I. Cell motility and the cytoskeleton. 65, 935-944 (2008).
