Introduction
Fibrose está envolvida na patogénese de várias doenças progressivas, crónicas, tais como doença intersticial pulmonar, fibrose cardíaca, cirrose hepática, insuficiência renal terminal, esclerose sistémica, doença auto-imune e uma. Entre as doenças pulmonares intersticiais, fibrose pulmonar idiopática (PIF) é uma doença progressiva crónica e mostra mau prognóstico. marco patológico da FPI é o desenvolvimento de focos fibroblásticos consistindo de fibroblastos activados e miofibroblastos que estão associados com o prognóstico. As origens de tais fibroblastos pulmonares são propostos para ser derivadas de várias células mesenquimais, incluindo fibroblastos pulmonares originalmente residentes e fibrócitos que circulam a partir de medula óssea. Recentemente, tem sido proposto transição epitelial-mesenquimal (EMT) para ser associada com a formação de células mesenquimais 2, e para contribuir para a patogénese de doenças fibróticas.
Pensa-se que o EMT desempenha um papel importante no processo de desenvolvimento fetal, a cicatrização de feridas, e progressão do cancro, incluindo a invasão do tumor e metástases 3. Seguindo o processo de EMT, células epiteliais obter a capacidade das células mesenquimais por perda de marcadores epiteliais, tais como E-caderina, e através da expressão de marcadores de mesenquimais, tais como, a vimentina e α-actina de músculo liso (SMA) 4,5. Estudos anteriores demonstraram a evidência de que EMT processo tem sido associada com o desenvolvimento de tecido fibroso no rim e pulmão 6 7. Além disso, a inflamação crónica promove doença fibrótica 8; Além disso, tais citocinas inflamatórias como o factor de necrose tumoral membro da superfamília 14 (TNFSF14; LUZ), -α factor de necrose tumoral (TNF) e interleucina-1β, têm sido mostrados para melhorar EMT 9-12.
ensaio de contracção de gel de colagénio, um ensaio de contracção celular à base de colagénio, em que os fibroblastos são incorporados no tipo Igel de colagénio tridimensional, é um modelo in vitro ideal para a avaliação da contractilidade. Contractilidade é uma das funções características de fibroblastos e contribui para a reparação de feridas normal e fibrose 13. Neste ensaio, pensa-se que a fixação de fibroblastos ao colágeno tipo I através de mecanismos dependentes de integrina é suposto para produzir tensão mecânica sob certas condições, e, consequentemente, levar à contração do tecido.
Aqui, o desenvolvimento do ensaio de contracção de gel é referido como sendo adaptado para avaliar a aquisição da função contráctil nas células que foram submetidos a EMT. Este relatório demonstra que este ensaio modificado é adequado para avaliar a contratilidade em células mesenquimais que foram submetidos a EMT.
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Protocol
1. Preparações e cultivo de células epiteliais do pulmão
- As células epiteliais do pulmão humano A549 (linha de cultura de células aderentes) em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), 100 UI / ml de penicilina, e 100 ug / ml de estreptomicina.
- Remover e descartar o meio de cultura celular a partir de placa de cultura, e lava-se uma vez com 5 - 10 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Após a lavagem, aspirar imediatamente o PBS.
- Adicionar 2 ml de ácido Tripsina / etilenodiaminotetra-acético (EDTA) (0,05%) e incuba-se a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 3 min.
- Recolher as células isoladas em tubos de centrífuga contendo meio de cultura de células, os tubos de centrifugação à TA durante 4 minutos a 150 x g.
- Ressuspender as células sedimentar em 2 ml de meio de cultura celular e remover uma amostra para contagem de células. Contar o número de células utilizando um hemocitómetro com Trypan mancha azul para verificar a viabilidade das células.
- As células A549 semente sobre10 cm placas de poliestireno com uma densidade de 0,5 - 1,0 x 10 6 células / prato com 10 ml de meio para o ensaio de contracção do gel. Semear as células em placas de 6 cavidades de poliestireno com uma densidade de 0,5 - 1,0 x 10 5 células / poço com 2 ml de meio de confirmação EMT. Incubar as células a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 24 horas.
2. EMT Procedimento
- Adicionar 10 ul de TGF-β1 (5 ug / ml) e 10 ul de TNF-α (10 ug / ml) para a placa de ensaio de contracção de gel semeada na etapa 1.6. Adicionar 2 mL de TGF-β1 (5 ug / ml) e 2 ul de TNF-α (10 ug / ml) à placa a confirmação EMT semeadas no passo 1.6. Incubar a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 48 horas.
3. Confirmação de EMT Procedimento por PCR e Western Blotting
- Confirmar alteração na morfologia (a partir de pedra-como remendar a fuso forma) das células tratadas por meio de microscopia de contraste de fase.
Nota: NormaAs células A549 al têm aparência godo tipo pedra e triangulares, que é uma característica das células epiteliais, mas após estimulação com TGF-β1 e TNF-α, as células aparecem longo e em forma de fuso que é semelhante às células mesenquimais 14,15. - Avaliar a expressão de um marcador epitelial, tal como E-caderina, e marcadores de mesenquimais, tais como N-caderina, vimentina, actina de músculo liso-α usando PCR ou transferência de Western.
- Extrair o ARN total a partir das células utilizando o kit de extracção de ARN 16 e sintetizar ADNc, utilizando transcriptase reversa 17 de acordo com o protocolo do fabricante.
- Medir a expressão dos níveis de ARNm utilizando PCR em tempo real do sistema 18 e corante de cianina monomérico Kit de PCR de acordo com as instruções dos fabricantes. Os iniciadores específicos para GAPDH (gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase), ACTA2 (alfa-actina-2), CDH1 (caderina-1; E-caderina), e VIM (vimentina) são mostrados na Tabela 1
- Lisar as células, utilizando um tampão de lise (Tabela 2), contendo 1% de cocktail inibidor de protease. Medir todas as concentrações de proteína de amostra utilizando um kit de ensaio de proteína 19,20, e aplicar as mesmas quantidades de proteína para um gel de poliacrilamida.
- Realizar SDS-gel de electroforese e transferência semi-seco das proteínas para uma membrana de PVDF 21. Incubar a membrana com anticorpos primários em tampão de bloqueio durante 1 - 2 h. Após a incubação, lavar duas vezes a membrana com tampão de lavagem e incubar a membrana 1 h com segundos anticorpos.
Nota: Veja a Tabela de materiais / equipamentos para detecção de anticorpos e diluições utilizadas nestes estudos. Ver Tabela 2 para os componentes do tampão de bloqueio. - Lava-se a membrana com tampão de lavagem por duas vezes. Tire fotos da membrana com o kit de detecção de Western blot 22 usando um CCD frio câmera 11,23.
- Realizar SDS-gel de electroforese e transferência semi-seco das proteínas para uma membrana de PVDF 21. Incubar a membrana com anticorpos primários em tampão de bloqueio durante 1 - 2 h. Após a incubação, lavar duas vezes a membrana com tampão de lavagem e incubar a membrana 1 h com segundos anticorpos.
4. Gel Contração Ensaio de Avaliação EMT
- Aspirar o meio condicionado a partir do recipiente de cultura de células, e lava-se bem com 5 - 10 ml de PBS para remover as células mortas. Após a lavagem, aspirar imediatamente o PBS.
- Adicionar 2 ml de 0,05% de tripsina / EDTA e incubar a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 3 min.
- Recolher as células isoladas em tubos de centrífuga contendo DMEM suplementado com inibidor de tripsina (1 mg / ml), centrifugar os tubos à temperatura ambiente durante 4 minutos a 150 x g.
- Misture tipo gel de colagénio 1 com água destilada, e 4 × DMEM concentrado para ajustar o volume para se atingir uma concentração de colagénio de 1,75 mg / ml, e 1 x concentração de DMEM. Certifique-se de manter o meio de gel em gelo durante esta etapa.
Nota: Para efectuar a 6 ml de meio de gel, misturar bem 3,5 ml de gel de colagénio de tipo 1 (3 mg / ml), 1,5 ml de 4 × DMEM concentrada, e 1 ml de água destilada. - Ressuspender o sedimento celular em 500 ul de PBS e remover uma amostra para contagem de células. Contagemo número de células utilizando um hemocitómetro com corante azul de tripano para verificar a viabilidade das células.
- Adicionar a forma de gel para ajustar os volumes para atingir uma densidade celular de 3,0 x 10 5 células / poço (6,0 x 10 5 células / ml) e cuidadosamente mas rapidamente misturá-lo por pipetagem sem gelificação.
- Pipetar 0,5 mL da mistura em cada cavidade de uma placa de 24 poços não-tratada de forma rápida e cuidadosamente para ter a forma cilíndrica pura. Tenha cuidado para não permitir que as bolhas de ar para contaminar os géis (Figura 1A).
Nota: O meio de gel que contém as células é viscoso e pode facilmente gel e forma forma crescente no poço. - Incubar a placa durante 15 minutos numa incubadora celular a 37 ° C, 5% de CO 2 e 95% de humidade para gelificar completamente.
- Retire a placa de géis sem quebrar, movendo uma espátula esterilizada de forma a tirar uma circunferência numa direcção. Com uma espátula, transferir cuidadosamente os géis para pratos de cultura de tecidos de 60 mmcontendo 5 ml de DMEM / FBS a 1%, com ou sem TGF-β1 (5 ng / ml) e TNF-α (10 ng / ml).
- Agite suavemente os pratos para garantir géis estão flutuando no meio. Incubar numa incubadora celular a 37 ° C, 5% de CO 2 e 95% de humidade.
5. Medição de Gel Tamanho
- Medir o tamanho do gel de colagénio após 0, 24, 48, e 72 h usando um sistema de análise de imagem.
- Ligue o sistema de documentação do gel (Figura 2A), e colocar pratos no armário de blindagem leve. Em seguida, retire a tampa de pratos no armário.
- Abra o software de análise de gel relacionado. Clique no botão "aquisição de imagem" no menu do bar para mostrar a imagem dos géis no gabinete. Em seguida, clique em "adquirir" na barra de menu para tirar fotos dos géis (Figura 2B).
- Clique no botão "detecção" na barra de menu (Figura 2C) e ajustar a região de medição (círculo i amarelon Figura 2C), arrastando o mouse. Em seguida, clique no botão "auto-detectar" na barra de menu (veja o botão na Figura 2D). O software detecta automaticamente os geles que mostram um mapa térmico (Figura 2D).
- Clique em "OK" para extrair o contorno dos géis de processamento de imagem e calcular áreas cercadas pelo contorno (Figura 2E). Depois que a área é calculada, a área calculada é exibida na janela pop-up separada.
Nota: Se os géis sobrepõem uns aos outros durante a imagem, mova géis suavemente com uma ponta de pipeta estéril.
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Representative Results
Durante EMT, células epiteliais perdem marcadores epiteliais, como a E-caderina, e ganhar a expressão de marcadores mesenquimais, como vimentina e músculo α-suave agindo 4,5. A incubação de células epiteliais do pulmão humano A549 com TGF-β1 e TNF-α induz EMT. O aparecimento de células A549 normais são de calçada como forma e forma de triângulo, que é uma característica de células epiteliais (Figura 3A), mas depois estimuladas com TGF-β1 e TNF-α, a aparência alterados para a forma eixo longo que é semelhante ao mesenquimais células (Figura 3B).
A expressão de marcadores epiteliais e mesenquimais foram avaliadas para confirmar que as células foram submetidos a EMT. a expressão de ARNm relativa foi calculada com o método ΔΔCt. Os dados individuais foram normalizados contra a desidrogenase do gliceraldeído-3-fosfato (GAPDH), que é uma arrumação geno. As células A549 tratadas com TGF-β1 e TNF-α durante 48 horas tinham reduzido significativamente a expressão de CDH1 e aumentou significativamente a expressão do VIM e ACTA2 (Figura 4A). As sequências de iniciadores utilizados para Q-PCR estão apresentados na tabela 1. Como mostrado na Figura 4B, a estimulação com TGF-β1 e TNF-α expressão atenuada de E-caderina, enquanto que a expressão de vimentina, N-caderina, e actina de músculo liso-α foi induzida.
O ensaio contração gel foi realizada para avaliar a contratilidade de células que foram submetidos a EMT. Depois de induzir EMT com TGF-β1 e TNF-α, as células foram lançados no gel de colagénio e incubou-se durante 72 horas em meio contendo TGF-β1 e TNF-α, ou PBS. Como mostrado na Figura 5A, os géis contendo células tratadas com TGF-β1 e TNF-α foram menores do que o gel de controlo contendo células tratadas com PBS. para quantify as mudanças no tamanho do gel, os geles foram analisados usando um analisador de gel de 0, 24, 48, e 72 h após o tratamento. Depois de 72 h, os tamanhos de géis contendo células tratadas com TGF-β1 e TNF-α foram significativamente reduzidos em comparação com os geles de controlo (Figura 5B). Nós também confirmou que os géis contendo células tratadas com TGF-β1 sozinho foram menores do que o gel de controlo, mas não foram menores do que os géis tratados com TGF-β1 e TNF-α (dados não mostrados).
Figura 1. Figura Suplementar para fazer Gel. Estas imagens mostram os géis expressos em poços. O meio de gel que contém as células é viscoso e pode facilmente gel e forma forma crescente no poço. (A) A imagem da esquerda mostra que os géis são escalado corretamente, ea imagem da direita mostra o esquema de "forma cilíndrica pura". (B </ Strong>) A imagem da esquerda mostra que os géis deformar, e a imagem direita mostra que as bolhas de ar contaminar os géis. (C) Os géis são suaves, por isso, facilmente danificadas e, geralmente deformar como "Pac-Man". Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Os passos para medir o tamanho Gel. (A) O sistema de documentação de gel consiste em um PC e um sistema de imagem gel. (B) A "imagem de botão aquisição", e uma imagem dos géis. (C) O "botão de detecção", ea janela para ajustar a região de medição (círculo amarelo). O "botão de detecção automática" (D), eo software faz um mapa de calor dos géis de uma imagem para de teger o contorno dos géis. (E) O software extrai o contorno dos géis de processamento de imagem, e calcula áreas cercadas pelo contorno. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. morfologias das células EMT-induzidas. Epitélios do pulmão humano A549 foram plaqueadas a uma densidade de 1,0 x 10 5 células / poço numa placa de 6 poços e incubadas com ou sem 5 ng / ml de TGF-β1 e 10 ng / mL TNF-α durante 48 horas, seguido de contraste de fase de imagem microscópica. (A) e (B) são imagens obtidas sob × 200. As barras de escala em (A) e (B), 100? M. t = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Estimulação EMT com TGF-β1 e TNF-α. (A) análise de qRT-PCR de EMT expressão do marcador (CDH1, VIM e ACTA2). (B) Western blot mostrando a expressão de E-caderina, N-caderina, vimentina, e ácido a actina do músculo liso proteínas em células A549 estimuladas com ou sem TGF-β1 e TNF-α. α-tubulina foi utilizada como controlo interno. As células A549 foram cultivadas como na Figura 1. N = 3 experiências independentes. ** P <0,01; barras de erro representam SEM. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 5. células em EMT Adquirida Contratilidade. As células A549 foram semeadas a uma densidade de 1,0 X 10 6 células / placa em placas de 10 cm e incubadas com ou sem 5 ng / ml de TGF-β1 10 e TNF-α ng / ml durante 48 horas. As células foram então fundido em 500 ul de meio contendo 1,75 mg de gel de colagénio / ml a uma densidade de 3,0 x 10 5 células / poço numa placa de 24 poços. Após a formação do gel, que foram adicionadas ao meio com ou sem 5 ng / ml de TGF-β1 e 10 ml de TNF-α / ng em placas de 60 mm e incubadas durante 72 horas seguido por imagiologia (A). tamanhos de gel foram medidos após 0, 24, 48, e 72 h usando um sistema de análise de imagem. N = 9 experiências independentes (B). ** P <0,01; barras de erro representam SEM. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Nome gene | Adiante 5 '→ 3' | Inverta 5 '→ 3' | ||
| ACTA2 | GCACCCAGCACCATGAAGA | ACCGATCCAGACAGAGTATTT | ||
| GAPDH | GGTGAAGGTCGGAGTCAACGGA | GAGGGATCTCGCTCCTGGAAGA | ||
| VIM | GACAATGCGTCTCTGGCACGTCTT | TTCTTCTGCCTCCTGCAGGTTCTT | ||
| CDH1 | CCCATCAGCTGCCCAGAAAATGAA | CTGTCACCTTCAGCCATCCTGTTT | ||
Tabela 1. Sequências primer. As sequências dos iniciadores utilizados para qRT-PCR. GAPDH foi utilizada como controlo interno.
| Tampão de Lise: tampão RIPA | |
| Tris-HCl pH 7,5 20 | |
| 150 mM de NaCl | |
| 1 mM de EDTA | |
| 1% de polioxietileno (9) éter octyiphenyl | |
| 0,1% Na-desoxicolato | |
| 0,1% de SDS | |
| Tampão de bloqueio | |
| 1% reagente de bloqueio em tampão de lavagem | |
| Tampão de lavagem: tampão TBST | |
| NaCl | 45 g |
| 1 M de Tris pH 7,4 | 50 ml |
| Polioxietileno (20) monolaurato de sorbitano | 2,5 ml |
| destilar água | adicionar 5? L |
| 5 L |
Tabela 2. Os componentes de tampões utilizados. Os componentes de lise tampão de bloqueio, e o tampão de lavagem.
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Discussion
O protocolo desenvolvido neste estudo compreende duas etapas. O primeiro passo é realizado para induzir EMT, enquanto o segundo passo é o ensaio de contracção do gel. Uma vez que é importante para confirmar que as células foram submetidos a EMT, passo 2 proporciona um excelente complemento para as alterações morfológicas e expressão de genes. Estudos anteriores mostraram que as células de EMT A549 foi induzida por apenas 24 TGF-β1; No entanto, como já relatado anteriormente 10, o tratamento TNF-α aumenta EMT ea aquisição de marcadores de células mesenquimais. Pensa-se que os mecanismos de EMT TGF-β-mediada é 25 dependente de Smad. TNFa melhora EMT-TGF-β1 induzida que conduz à melhoria da contracção do gel. Tem sido relatado que os mecanismos de TNFa para o realce de EMT induzida por TGF-β1 não são apenas fosforilação da região ligante Smad2, mas também MAPK sinalização regulação 26. Portanto, o protocolo desenvolvido neste estudo incluiu stimulção por tanto o TGF-β1 e TNF-α.
A incorporação de células que foram submetidos EMT para o colagénio do tipo I de gel, e que flutuam sobre a forma, são aspectos centrais deste ensaio (passo 4). Uma vez que os geles são macios e facilmente danificadas, e ter dimensões diferentes em cada lado, é necessário cuidado extremo quando se aplica os geles para o meio de medição e os seus tamanhos. Se é difícil de realizar este passo, há um método alternativo para medir os tamanhos de gel no poço sem mover os géis em placa de 60 mm 27,28. Há vários problemas comuns, o primeiro problema é que os géis de colagénio facilmente gelificar à TA, de modo que os géis frequentemente deformar como mencionado no passo 4.7. Portanto, a placa deve ser agitada suavemente depois de lançar os géis em poços para se certificar de que eles assumem uma forma cilíndrica pura. O segundo problema é que, se as bolhas de ar entram no gel durante a gelificação, em seguida, o tamanho dos géis será desigual. Tenha cuidado para não permitir que qualquer bubbl arES contaminar os géis. Existem duas diferenças principais entre método original e este método. As primeiras diferenças é que a concentração final de géis de colagénio do método original de 0,75 mg / mL, mas que este método é de 1,75 mg / ml, a fim de permitir que os géis a contrair-se mais do que com o método original. A segunda diferença é que o método original usa meio isento de soro por meio de gel flutuante mas este método utiliza 1% de FBS em meio flutuante em gel, a fim de manter a viabilidade das células e manter a contractilidade celular.
O ensaio de contracção de gel originalmente desenvolvido para fibroblastos é um modelo in vitro ideal na para avaliar a contractilidade de células que contribuem para o processo de cicatrização de feridas e fibrose 13. A ligação de f ibroblastos a um tipo de colagénio é suposto para produzir tensões mecânicas que, consequentemente, leva a uma redução do tamanho dos géis de colagénio. Além disso, este ensaio tem sido utilizada recentementecomo um modelo in vitro para estudar a contracção de células das vias respiratórias em doenças inflamatórias, incluindo a asma brônquica e DPOC 29-31.
O ensaio de contracção de gel é comparável com outros ensaios, tais como ensaios de migração celular, na medida em que não necessita de dispositivos específicos e exibe uma elevada reprodutibilidade quantitativa. No entanto, existem poucos relatos que aplicam o ensaio de contracção gel para avaliar EMT 32. Neste estudo, os geles que contêm células que foram submetidos EMT significativamente diminuído em tamanho de 24 a 72 horas após a gelificação, indicando contracção celular. No entanto, existem limitações para este método. A primeira é que, neste ensaio, a alteração do tamanho dos géis mostram a soma de contractilidade de todas as células nos géis. No entanto, é difícil de avaliar a contractilidade celular única nos géis utilizando este ensaio. A segunda é que as células A549 é uma linha celular de cancro, não células epiteliais humanas normais. Portanto, é difícil para extrapolar our resultados diretamente para a patogênese da fibrose pulmonar. No entanto, as células A549 são amplamente utilizados para estudar as funções das células epiteliais das vias respiratórias, e vários estudos mostraram evidência de EMT usando células A549 como um modelo de fibrose pulmonar 33,34.
Em resumo, o colagénio do tipo I géis contendo células mesenquimais que foram submetidos a EMT foram reduzidos em tamanho, indicando contracção dessas células. Assim, o ensaio de contracção de gel deve ser considerado como um prolongado ensaio in vitro para avaliar a aquisição da função contráctil nas células por meio de processo de TEM.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | sigma aldrich | 11965-092 | For A549 medium |
| FBS | GIBCO | 10437 | |
| Transforming Growth Factor-β1, Human, recombinant | Wako Laboratory chemicals | 209-16544 | |
| Recombinant Human TNF-α | R&D systems | 210-TA/CF | |
| E-Cadherin (24E10) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | #3195 | 1:3,000 dilution |
| Vimentin (D21H3) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | #5741 | 1:3,000 dilution |
| Anti-α-Tubulin antibody | sigma aldrich | T9026 | 1:10,000 dilution |
| Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle antibody | sigma aldrich | A5228 | 1:10,000 dilution |
| Anti-N-cadherin antibody | BD Transduction Laboratories | #610920 | 1:1,000 dilution |
| Anti-Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab Sheep (secondary antibody) | GE Healthcare | NA931-100UL | 1:20,000 dilution |
| Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab Donkey (secondary antibody) | GE Healthcare | NA934-100UL | 1:20,000 dilution |
| Blocking reagent | GE Healthcare | RPN418 | 2% in TBS-T |
| 6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid | corning | #353046 | |
| 100 mm Cell culture dish | TPP | #93100 | |
| DMEM, powder | life technologies | 12100-046 | For 4× DMEM |
| Type 1 collagen gel | Nitta gelatin | Cellmatrix type I-A | |
| 24 Well cell culture plate | AGC TECHNO GLASS | 1820-024 | |
| Gel Documentation System | ATTO | AE-6911FXN | Gel imager |
| Gel analyzing software | ATTO | Densitograph, ver. 3.00 | analysing software bundled with AE-6911FXN |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | life technologies | 25300054 | |
| 24 Well Plates, Non-Treated | IWAKI | 1820-024 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | life technologies | 15250-061 | |
| RNA extraction kit | Qiagen | 74106 | |
| Reverse transcriptase | life technologies | 18080044 | |
| Real time PCR system | Stratagene | Mx-3000P | |
| SYBR green PCR kit | Qiagen | 204145 | |
| Protease Inhibitor Cocktail (100x) | life technologies | 78429 | |
| PVDF membrane | ATTO | 2392390 | |
| Protein assay kit | bio-rad | 5000006JA | |
| Polyacrylamide gel | ATTO | 2331810 | |
| Western blotting detection reagent | GE Healthcare | RPN2232 | |
| Cold CCD camera | ATTO | Ez-Capture MG/ST | |
| Trypsin inhibitor | sigma aldrich | T9003-100MG | |
| Polyoxyethylene (20)Sorbitan Monolaurate | Wako Laboratory chemicals | 163-11512 | |
| Polyoxyethylene (9) octyiphenyl ether | Wako Laboratory chemicals | 141-08321 |
References
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