Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Cycloheximide Chase Analyse av protein degradering i Published: April 18, 2016 doi: 10.3791/53975
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1
1Department of Biology, Ball State University, 2Bioproduct Research & Development, Eli Lilly and Company

Abstract

Regulering av protein overflod er avgjørende for nesten alle cellulære prosessen. Protein overflod reflekterer integrering av satsene for proteinsyntese og proteinnedbrytning. Mange analyser rapportering på protein overflod (for eksempel enkelt tidspunkt western blotting, flowcytometri, fluorescens mikroskopi, eller vekstbaserte reporter analyser) tillater ikke diskriminering av de relative effektene av oversettelse og proteolyse på proteinnivå. Denne artikkelen beskriver anvendelsen av cykloheksimid chase etterfulgt av western-blotting for å analysere spesifikt protein degradering i modellen encellede eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (spirende gjær). I denne prosedyren, blir gjærceller inkubert i nærvær av det translasjonelle inhibitor cykloheksimid. Alikvoter av celler ble oppsamlet umiddelbart etter og på bestemte tidspunkter etter tilsetning av cykloheksimid. Celler blir lysert, og lysatene separeres ved polyakrylamidgel-elektroforese for western blot-analyse av proteiner overflod ved hvert tidspunkt. Den cykloheksimid chase fremgangsmåten tillater visualisering av nedbrytningskinetikken til den stabile tilstand befolkningen i en rekke cellulære proteiner. Fremgangsmåten kan anvendes for å undersøke de genetiske krav og miljømessige påvirkninger på proteinnedbrytingen.

Introduction

Proteiner utfører viktige funksjoner i nesten alle cellulære prosessen. Mange fysiologiske prosesser krever tilstedeværelse av et bestemt protein (eller proteiner) i en definert tidsperiode eller under spesielle omstendigheter. Organismer derfor overvåke og regulere protein overflod å møte cellulære behov 1. For eksempel, cykliner (proteiner som styrer celledeling) er til stede i bestemte faser av cellesyklusen, og tapet av regulerte nivåer cyklin er blitt assosiert med malign tumordannelse to. I tillegg til å regulere proteinnivåer for å dekke celle behov, celler anvende nedbrytende kvalitet kontrollmekanismer for å eliminere misfoldede, usammensatte, eller på annen måte avvikende proteinmolekyler 3. Kontroll av protein overflod innebærer regulering av både makromolekylær syntese (transkripsjon og translasjon) og nedbrytning (RNA forråtnelse og proteolyse). Svekket eller overdreven protein degradering bidrar til flere patologier, Inkludert kreft, cystisk fibrose, nevrodegenerative tilstander, og kardiovaskulære lidelser 4-8. Proteolytiske mekanismer representerer derfor lovende terapeutiske mål for en rekke sykdommer 9-12.

Analyse av proteiner på ett tidspunkt (for eksempel ved western blot 13, flowcytometri 14, eller fluorescens mikroskopi 15) gir et øyeblikksbilde av steady state protein overflod uten å avsløre de relative bidrag fra syntese eller degradering. Tilsvarende vekstbaserte reporter analyser reflektere steady state protein nivåer over en lengre tidsperiode uten å diskriminere mellom påvirkning av syntese og nedbrytning 15-20. Det er mulig å utlede bidraget fra nedbrytende prosesser til steady state proteinnivåer ved å sammenligne overflod før og etter inhibering av bestemte komponenter i den nedbrytende mekanismen (for eksempel ved farmakologisk inaktivere proteasome 21 eller slå ut et gen antatt å være nødvendig for degradering 13). En endring i steady state protein nivåer etter å hemme degraderende trasé gir sterke bevis for bidraget av proteolyse til kontroll av protein overflod 13. Men en slik analyse fremdeles ikke gi informasjon om kinetikken for protein turnover. Cycloheximide chase fulgt av western blotting overvinner disse svakhetene ved å tillate forskere å visualisere protein degradering over tid 22-24. Videre, fordi protein deteksjon følgende cycloheximide jakten er vanligvis utført av western blotting, radioaktive isotoper og lange immunoutfellingsstudier trinnene er ikke nødvendige for cycloheximide jage, i motsetning til mange vanlige puls jage teknikker, som også er utført for å visualisere protein degradering 25.

Cycloheximide ble først identifisert som en forbindelse med anti-sopp riktigbånd produsert av gram-positive bakterien Streptomyces griseus 26,27. Det er en celle-gjennomtrengelig molekyl som spesifikt hemmer eukaryote cytosol (men ikke organellar) oversettelse ved å svekke ribosomalt trans 28-31. I en cycloheximide chase eksperiment, blir cykloheksimid tilsatt til cellene, og porsjoner av celler ble oppsamlet umiddelbart og på bestemte tidspunkter etter tilsetning av forbindelsen 22. Celler blir lysert, og protein overflod ved hvert tidspunkt ble analysert, vanligvis ved western blot. Reduksjoner i protein overflod etter tilsetting av cycloheximide kan trygt tilskrives protein degradering. Et ustabilt protein vil avta i overflod over tid, mens en forholdsvis stabil protein vil oppvise liten endring i overflod.

Mekanismer for selektiv protein degradering har blitt svært konservert gjennom Eukarya. Mye av det som er kjent om proteindegradering ble først lært imodellen encellede eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (spirende gjær) 25,32-36. Studier med gjær er sannsynlig å fortsette å levere nye og viktig innsikt i protein degradering. En metode for cycloheximide jage i gjærceller etterfulgt av western blot analyse av protein overflod er presentert her.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Vekst og hausting av gjærceller

  1. Hvis ikke å analysere nedbrytningskinetikken til en endogen gjær-protein, omdanne ønsket gjærstamme (e) med et plasmid som koder for proteinet av interesse. Pålitelige metoder for gjær transformasjon er tidligere blitt beskrevet 37.
  2. Inokkulere gjær i 5 ml passende medium (for eksempel, selektiv syntetisk definert (SD) medium for plasmid vedlikehold av transformerte celler eller ikke-selektiv gjærekstrakt-pepton-glukose (YPD) medium for ikke-transformerte celler). Inkuber over natten ved 30 ° C, roterer.
    MERK: 30 ° C er den optimale veksttemperatur for typisk villtype-laboratorie-gjærstammer 38. Men fordi noen mutante gjærstammer ikke vokser optimalt ved 30 ° C og en del proteiner gjennomgår temperaturavhengig nedbrytning, de temperaturer som anvendes for gjærcellevekst og cykloheksimid forfølgelse bør bestemmes empirisk 39.
  3. Mål the optisk tetthet ved 600 nm (OD 600) for hver natten kultur.
    MERK: Celler kan være i logaritmisk eller stasjonær vekstfase, men bør ha minimal nådd en tetthet som vil tillate fortynning til en OD 600 = 0,2 i 15 ml ferskt medium.
  4. Fortynn over natt kulturene til en OD 600 verdi på 0,2 i 15 ml friskt medium.
  5. Inkuber gjær ved 30 ° C og rystet inntil cellene når midt-logaritmisk vekstfase (dvs. en OD 600 mellom 0,8 og 1,2).
  6. Under gjærcellevekst, gjør du følgende i forberedelsene til cycloheximide jakten prosedyre:
    1. Satt en varmeblokk som rommer 15 ml koniske rør til 30 ° C for inkubering av celler i nærvær av cykloheksimid. Tilsett vann til brønnene i varmeblokk for å tillate effektiv varmefordeling til kulturer. Tilsett vann til hver brønn slik at et 15 ml konisk rør vil føre til at vannivået stige til, men ikke overflow, leppe av brønn.
    2. Sett en andre varmeblokk som rommer 1,5 ml mikrosentrifugerør til 95 ° C for protein denaturering følgende cellelyse.
    3. Pre-varme ferskt vekstmedium (1,1 ml pr tidspunkt per kultur som skal bli analysert) til 30 ° C.
    4. Tilsett 50 pl 20x Stop mix å forhåndsmerkede mikrosentrifugerør (en tube per tidspunkt per kultur som skal bli analysert). Plasser rørene på is.
      FORSIKTIG: Natriumazid, en ingrediens i 20x Stop Mix, er giftig via oralt inntak eller hudkontakt. Følg produsentens anbefalinger ved tilberedning, lagring og håndtering av natriumazid. Ved utilsiktet eksponering, ta kontakt med HMS-datablad gitt av produsenten.
  7. Når cellene har nådd midt-logaritmisk vekst, samle 2,5 OD 600 enheter av hver kultur pr tidspunkt som skal bli undersøkt (for eksempel 7,5 OD 600 enheter for å analysere proteinet overflod ved tre tidspunkter). Sentrifuger cellene oppsamlet i 15 ml koniske rør på 3,000 xg ved romtemperatur i 2 min.
    MERK: En OD600 enhet er lik mengden av gjær er tilstede i en ml kulturen ved en OD 600 på 1,0. Volumet av kultur (i ml) som er nødvendig for å høste X OD 600 enheter (V) kan bestemmes ved hjelp av følgende ligning: V = X OD 600 enheter / Målt OD600. For eksempel, for å høste 7,5 OD 600 enheter av gjærcellekulturen ved en OD 600 på 1,0, samle 7,5 OD 600 enheter / 1,0 = 7,5 ml gjærkultur.
  8. Resuspender cellepelleten i hver 1 ml 30 ° C (forvarmet) friskt vekstmedium per 2,5 OD 600 enheter av celler (for eksempel 3 ml til 7,5 OD 600 enheter).

2. Cycloheximide Chase

  1. Ekvilibrere gjærcellesuspensjoner ved inkubering i 5 minutter i 30 ° C varmeblokk.
  2. Forbered en timer for å telle opp fra 00:00.
  3. For å begynne cycloheximide jakten, trykk på "Start" på timeren. raskt,men nøye, utføre følgende trinn:
    1. Legg cykloheksimid til en endelig konsentrasjon på 250 ug / ml til den første gjærcellesuspensjonen (for eksempel, tilsett 37,5 ul av 20 mg / ml cykloheksimid lager til 3 ml av cellesuspensjonen), og vortex kort for å blande.
      FORSIKTIG: Cycloheximide er en dermal irriterende og er giftig via oralt inntak. Følg produsentens anbefalinger ved tilberedning, lagring og håndtering cycloheximide. Ved utilsiktet eksponering, ta kontakt med HMS-datablad gitt av produsenten.
    2. Umiddelbart etter tilsetning av sykloheksimid og virvling, overfør 950 pl (~ 2,4 OD 600 enheter) fra gjærcellesuspensjonen med tilsatt cykloheksimid til en forhåndsmerkede mikrosentrifugerør inneholdende 50 ul iskald 20x stopp blanding. Vortex mikrosentrifugerør, og legg på is inntil alle prøvene er samlet.
    3. Returnere den gjærcellesuspensjonen til 30 ° C.
  4. Gjenta trinn 2.3.1 gjennom 2,30,3 for hver av de resterende gjærcellesuspensjoner ved regelmessige tidsintervaller (for eksempel hvert 30 sek, slik at cykloheksimid tilsettes til Prøve # 1 på 00:00, Prøve nr 2 på 00:30, Prøve nr 3 til 1:00 osv.).
  5. På hvert påfølgende tidspunkter, Vortex gjærcellesuspensjoner og overføre 950 mL til merket mikrosentrifugerør inneholder 50 mikroliter pre-kjølt 20x Stop Mix. Vortex og plassere samlet celler på is. Returnere 15 ml koniske rør til 30 ° C varmeblokk.
    1. For eksempel, for oppsamling av celler som 30 min etter tilsetning cykloheksimid (forutsatt at 30-sek intervaller mellom cykloheksimid tillegg til gjærcellesuspensjoner ved begynnelsen av tidsforløpet), Vortex og fjerne 950 pl av cellesuspensjonen fra Prøve nr 1 i 30:00 . Gjenta for Prøve nr 2 på 30:30, og så videre.
      MERK: For å hindre bosetting av gjær, vortex cellesuspensjoner i 15 ml koniske rør ca hvert 5 min i løpet av jakten. Alternativt, gjær cellesuspensjons kan opprettholdes i en kontinuerlig agitering vannbad for varigheten av cykloheksimid chase eksperimentet.
  6. Når alle prøver er samlet, pellet samlet opp cellene ved sentrifugering ved 6500 x g ved romtemperatur i 30 sek. Fjern supernatanten ved pipettering eller aspirasjon. Cellene er nå klar for alkalisk lysering. Alternativt, snap-fryse pelletert celler i flytende nitrogen og oppbevares ved -80 ° C.

3. Post-alkalisk Protein Extraction (Modifisert fra 16,40)

  1. Tilsett 100 ul destillert vann til hver cellepellet. Suspender ved å pipettere opp og ned eller virvling.
  2. Tilsett 100 ul av 0,2 M NaOH til hver prøve. Bland ved å pipettere opp og ned eller virvling.
  3. Inkuber suspenderte cellene ved romtemperatur i 5 min. På dette stadiet, har gjærceller ikke blitt lysert, og proteiner har ikke blitt utgitt 40.
  4. Pellet cellene ved sentrifugering ved 18.000 xg ved værelses hodetperaturen i 30 sek. Fjern supernatanten ved pipettering eller aspirasjon.
  5. For å lysere cellene, tilsett 100 pl Laemmli prøvebuffer til hver cellepellet. Suspender ved å pipettere opp og ned eller virvling.
    MERK: sekvensiell inkubasjon av celler med NaOH og Laemmli-prøvebuffer frigjør proteiner i en form som er kompatibel med natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) under anvendelse av en Tris-glycin-buffer-system.
  6. Inkuber ved 95 ° C i 5 minutter for å full denaturere proteiner.
    MERK: Inkubasjon ved 95 ° C kan ikke være egnet for analyse av proteiner som er tilbøyelige til aggregering (som proteiner med flere transmembrane segmenter). Disse proteinene kan bli uoppløselig når inkubert ved forhøyede temperaturer 41. Således, for analyse av slike proteiner, lysater bør inkuberes ved lavere temperaturer (for eksempel 37 ° C - 70 ° C) i 10 - 30 min, som bestemmes empirisk.
  7. Sentrifuger lysatene på 18.000 xg ved room temperatur i 1 min for å pelletere uoppløselig materiale. Supernatanten (oppløst ekstrahert protein) er klar for separasjon ved hjelp av SDS-PAGE og påfølgende Western blot-analyse. Alternativt, lagre lysates ved -20 ° C.

4. Representative SDS-PAGE og Western blotting Procedure (Tilpasset fra 16)

  1. Belastning proteinmolekylvektstandarder og empirisk bestemt volum av lysatene på en SDS-PAGE-gel.
    MERK: Velg den andel av akrylamid og bis-akrylamid i SDS-PAGE-gel, basert på molekylvekten av proteinet av interesse. Generelt er lavere prosent geler er bedre egnet for å løse høyere molekylvekt proteiner.
  2. Kjør gelen ved 200 V inntil fargestoffet fronten har nådd den nedre kant av gelen.
  3. Overfør proteinene fra gelen til polyvinylidenfluorid (PVDF) membran ved våt overføring ved 20 V i 60-90 minutter ved 4 ° C.
  4. Blokkere membranen ved inkubering i Tris-bufret saltvann (TBS) inneholdende 5% skummet melk, gynge, ved romtemperatur i 1 time eller ved 4 ° C over natten.
    NB: For å forhindre mikrobiell vekst i nærvær av en membran inkubert natten over, er det anbefalt å ta med natriumazid i blokkeringsoppløsningen til en sluttkonsentrasjon på 0,02%.
  5. Inkuber membran med primært antistoff som er spesifikt for proteinet av interesse i TBS med 0,1% Tween-20 (TBS / T) og 1% skummet melk, gynge, ved romtemperatur i 1 time.
  6. Vask membran ved romtemperatur 3 x 5 min med TBS / T, gynge.
  7. Inkuber membran med passende fluorofor-konjugert sekundært antistoff i TBS / T med 1% skummet melk ved romtemperatur i 1 time, gynge.
    MERK: fluoroforer er lysømfintlig. Derfor bør fortynninger av antistoffer konjugert til fluoroforer fremstilles i mørket, og inkubering av membraner i nærvær av antistoffer konjugert til fluoroforer og de ​​etterfølgende vasketrinn bør skje i lystett (f.eks folie-innpakket) containers.
  8. Vask membran ved romtemperatur 3 x 5 min med TBS / T, gynge.
  9. Bilde membran ved hjelp av LI-COR Odyssey CLX og Image Studio programvare (eller tilsvar tenkelig utstyr og programvare), etter produsentens anbefalinger.
  10. Etter å skaffe membran bilde, inkuber membranen med et primært antistoff som er spesifikt for en lasting kontroll protein i TBS / T med 1% skummet melk ved romtemperatur i 1 time, gynge.
  11. Vask membran ved romtemperatur 3 x 5 min med TBS / T, gynge.
  12. Inkuber membran med passende fluorofor-konjugert sekundært antistoff i TBS / T med 1% skummet melk ved romtemperatur i 1 time, gynge.
  13. Vask membran ved romtemperatur 3 x 5 min med TBS / T, gynge.
  14. Bilde membran som i trinn 4.9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å illustrere cycloheximide chase metode, ble stabiliteten av Deg1 -Sec62 (figur 1), en modell gjær endoplasmatisk retikulum (ER) -associated degradering (erad) substrat, analysert 42-44. I erad, kvalitetskontroll ubiquitin ligase enzymer kovalent feste kjeder av lite protein ubiquitin til avvikende proteiner lokalisert til ER membranen. Slike polyubiquitylated proteinene blir deretter fjernet fra ER og forringes av proteasomet, en stor, cytosoliske protease 45. Den Deg1 -Sec62 protein er målrettet for degradering etter at den vedvarende og abnormt engasjerer translocon, en kanal som forenkler protein translokasjon inn i ER lumen eller membran 43. Tilsvarende pattedyr apolipoprotein B, en proteinkomponent i LDL-lipoprotein, vedvarende inngrep med ER translocon og deretter gjennomgår nedbrytning ved hjelp av en beslektet mekanisme når dens leppeid bindingspartnere er fraværende 46-48. Dermed analyser av Deg1 -Sec62 nedbrytning i gjærceller kan gi innsikt i nedbrytning av proteiner som vedvarende eller abnormt engasjerer translocon, foreløpig kalt erad-T (for translocon-forbundet) substrater 43.

Tidligere studier har indikert at de ER-resident ubiquitin ligase Hrd1 funksjoner med ubiquitin-konjugering enzym Ubc7 å katalysere nedbrytning av Deg1 -Sec62 16,42-44. Den trans protein Cue1 forankrer Ubc7 til ER membranen og aktiverer enzymet 49-51. Imidlertid et krav for Cue1 i degraderingen av Deg1 -Sec62 ikke er blitt undersøkt. For å teste hypotesen om at Cue1, som Hrd1 og Ubc7, er nødvendig for effektiv nedbrytning av Deg1 -Sec62, ble villtype og mutant gjærceller uttrykker Deg1 -Sec62 utsatt for cycloheximide jage og western blot analyse (Figur 2A). Den Deg1 -Sec62 protein vandrer på SDS-PAGE som flere arter. Dette er i overensstemmelse med tidligere studier som indikerer omfattende post-translasjonell modifikasjon av proteinet 43,44,52. I villtypegjærceller, Deg1 -Sec62 var lett degradert. Som tidligere observert, tap av enten Hrd1 eller Ubc7 vesentlig stabilisert Deg1 -Sec62 protein 42-44. Som forutsagt, ble Deg1 -Sec62 stabilisert i fravær av Cue1 (i en lignende grad som i fravær av Ubc7), noe som bekrefter en rolle for den Ubc7-veksel protein i erad-T.

Andelen av Deg1 -Sec62 protein gjenværende på hvert tidspunkt ble kvantifisert og plottet i Figur 2B. Vi merker oss at den tilsynelatende frekvensen av forsvinningen av Deg1 -Sec62 i villtype celler kan være en undervurdering av nedbrytingshastigheten av begynnende Deg1 -Sec62(Dvs. proteinet halveringstid, som kan mest direkte bestemmes av puls jage analyse 43). Fordi vill-type gjær aktivt degradere Deg1 -Sec62 protein før cycloheximide tillegg er steady state overflod av Deg1 -Sec62 vesentlig redusert i disse cellene (sammenlignet med celler hvor degradering fall). Dette kan forstås ved å sammenligne overflod av Deg1 -Sec62 i utgangs tidspunkter for hver stamme i figur 2A. Videre kan en hvilken som helst degradering-resistente subpopulasjon av substratet proteinet (for eksempel hvis proteinet akkumuleres i intracellulære bassenger for nedbrytning hindres) kan synes relativt stabil i villtype-celler over tid løpet av eksperimentet.

Figur 1
Figur 1. Modell for Nedbrytning av Deg1 -Sec62 Følgende Aberrant Engasjement av Translocon (A) Skjematisk fremstilling av Deg1 -Sec62 Deg1 -Sec62 består av følgende elementer, i rekkefølge:.. Deg1 (amino-terminale 67 aminosyrer fra gjær transcriptional repressor MATα2), et flagg (F) epitop, 2-transmembranprotein Sec62, og to kopier av Staphylococcus aureus protein A (PRA). (B) ved å følge normal ko-translasjonell innsetting av sine to transmembrane segmenter inn i det endoplasmatiske retikulum (ER) membran, vedvarende forening av Deg1 -Sec62 med translocon utløser unormale, Deg1 -avhengig, post-translasjonell translocon engasjement. En del av den cytosoliske aminoenden abnormt går inn-og sannsynligvis forblir innenfor-det translocon. (C) Ved å følge translocon inngrep, ubiquitylates den Hrd1 ubiquitin ligase Deg1 -Sec62. Hrd1 er assistert av ubiquitin-konjugering enzym Ubc7, som er forankret i ER membranen ved Cue1. Ub, ubiquitin protein monomerer. (D) Ubiquitylated Deg1 -Sec62 er hentet fra ER membranen og degradert av proteasome, lindrende translocon obstruksjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Cycloheximide Chase fulgt av Western blotting Viser at Cue1 er nødvendig for effektiv Deg1 -Sec62 degradering. (A) Gjærceller av de angitte genotypene ble transformert med en gjær centromeric plasmid koding Deg1 -Sec62 (pRS416-P MET25 - Deg1 -Flag-Sec62-2xProtA; AMPR / URA3 43) og utsatt for cycloheximide jage analyse. Proteins fra hvert tidspunkt (ekvivalent med 0,125 OD 600 enheter) ble separert på en 8% SDS-PAGE-gel og påvist ved western blotting med kanin-anti-muse sekundære antistoffer, som direkte binder de C-terminale protein A-epitoper av Deg1 - Sec62 fusjonsprotein. Som et lastekontroll, ble membranen deretter inkubert med antistoffer som er spesifikke til Pgk1. Dette eksperimentet har blitt kopiert tre ganger; representative resultatene er avbildet. (B) Kvantifisering av data i (A) ble utført ved hjelp av bildebehandlingsprogrammer (se tabell for material). Den totale fluorescens intensitet av et område som omfatter den Deg1 -Sec62 proteinet ble bestemt for hver prøve. Bakgrunn fluorescensintensitet for hver prøve ble ekstrapolert fra den gjennomsnittlige fluorescens-intensiteten av bildeelementer i nærheten av Deg1 -Sec62 protein. Denne ekstrapolert bakgrunn fluorescens intensitet ble trukket fra den totale fluorescens intensitet for å gi justerte fluorescerendeence intensiteten for hver prøve. Lignende quantifications for total, bakgrunn, og justerte fluorescensstyrkene ble utført for Pgk1, en laste kontroll protein som overflod ikke varierer i forhold analysert. For å sammenligne overflod av Deg1 -Sec62 protein blant prøvene, ble et forhold mellom de justerte signalintensitetene av Deg1 -Sec62 til Pgk1 bestemt for hver prøve. Den Deg1 -Sec62 / Pgk1-forholdet ble definert som 100% for den første tidspunkt (dvs. umiddelbart etter tilsetning cykloheksimid) for hver stamme som skal analyseres. Mengden av Deg1 -Sec62 resterende ved senere tidspunkter (dvs. de Deg1 -Sec62 / Pgk1 prosenter) ble beregnet som en prosentandel av Deg1 -Sec62 / Pgk1 Andelen ved første tidspunktet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Syntetisk Defined (SD) Minimal Gjær Medium 2% dekstrose, 0,67% gjærnitrogenbase uten aminosyrer, 0,002% adenin, 0,004% uracil, 0,002% arginin, 0,001% histidin, 0,006% isoleucin, 0,006% leucin, 0,004% lysin, 0,001% metionin, 0,006% fenylalanin, 0,005 % treonin, 0,004% tryptofan. For solid (plate) medium, inkluderer 2% agar. 1. Selektivt medium fremstilles ved å utelate passende aminosyre (r) eller nitrogenholdige baser.
2. For enkelhets skyld, kan disse ingrediensene bli opprettholdt som konsentrerte stamløsninger som følger. Aminosyrer kan bli opprettholdt som 100X stamløsning inneholdende alle de ønskede aminosyrer. Gjærnitrogenbase kan opprettholdes på en 20 x stamløsning (13,4%). Dekstrose kan bli opprettholdt i en 40% lagerløsning. Adenin og uracil kan bli opprettholdt som en% stamløsninger i 0,1 M NaOH.
3.Steriliser medium ved autoklave.
Gjærekstrakt-Peptone Druesukker (YPD) Rich Gjær Medium 1% gjærekstrakt, 2% pepton, 2% dekstrose (Valgfritt: 0,002% adenin). For solid (plate) medium, inkluderer 2% agar. 1. For å unngå den langsomme vekst og rød Farge karakteristiske for en bestemt laboratorium gjærstammer i fravær (eller lav overflod) av adenin, kan adenin tilsettes til YPD vekstmedium.
2. For enkelhets skyld kan noen ingredienser opprettholdes som konsentrerte stamløsninger som følger. Dekstrose kan bli opprettholdt i en 40% lagerløsning. Adenin kan opprettholdes som en 1% stamløsning i 0,1 M NaOH.
3. Steril medium ved autoklave.
20x Stop Mix 200 mM natriumazid, 5 mg / ml bovint serumalbumin Natriumazid er giftig via oralt inntak eller hudkontakt. Følg produsentensanbefalinger ved tilberedning, lagring og håndtering av natriumazid. Ved utilsiktet eksponering, ta kontakt med HMS-datablad gitt av produsenten.
20 mg / ml Cycloheximide 1. Forbered i etanol. Oppbevar ved -20 ° C.
2. Cycloheximide er en dermal irriterende og er giftig via oralt inntak. Følg produsentens anbefalinger ved tilberedning, lagring og håndtering cycloheximide. Ved utilsiktet eksponering, ta kontakt med HMS-datablad gitt av produsenten.
0,2 M natriumhydroksid Forbered i vann. Natriumhydroksyd reagerer med glass. Derfor, for langtidslagring, 0,2 M natriumhydroksyd bør opprettholdes i plastbeholdere.
Laemmli-prøvebuffer 2% SDS, 10% glycerol, 5% &# 946; p-merkaptoetanol, 60 mM Tris-HCl pH 6,8, 0,008% bromfenolblått 1. Laemmli-prøvebuffer blir ofte fremstilt ved å fortynne en mer konsentrert (f.eks 5x) lager.
2. Fargestoffet bromfenolblått kan tilsettes til ønsket intensitet. En "klype" (veldig liten mengde tappet fra kanten av en slikkepott) er vanligvis tilstrekkelig.
Laemmli Running Buffer (5x) 125 mM Tris, 960 mM glysin, 0,5% SDS For å forberede en liter 1x Laemmli buffer, fortynne 1: 5 i dH 2 O.
Tris acetat-SDS Transfer Buffer (5x) 125 mM Tris-acetat (pH 8,8), 960 mM glysin, 0,05% SDS For å fremstille 20 liter 1x Tris-acetat-SDS overføringsbuffer, kombiner 4 liter 5 x lager, 4 l metanol og 12 l av dH 2 O.
10x Tris-buffret saltvann (TBS) 500 mM Tris, 1,5 M NaCl; pH ble justert til 7,5 For å forberede en liter 1x TBS fortynnes 1:10 i dH 2 O. 1x TBS kan suppleres med en detergent Tween-20 og pulverisert skummet melk, som er hensiktsmessig.

Tabell 1. Solutions brukt i denne studien.

Strain Name Alias relevant Genotype Referanser
VJY42 MHY501 MATα Chen et al., 1993
HIS3-Δ200
leu2-3,112
ura3-52
lys2-801
trp1-1
gal2
VJY47 YWO55; MHY507 MATα Jungmann et al., 1993; Rubenstein et al., 2012
HIS3-Δ200
leu2-3,112
ura3-52
lys2-801
trp1-1
gal2
ubc7Δ :: LEU2
VJY56 YTX105; MHY1364 MATα Biederer et al., 1997; Ravid et al., 2006
HIS3-Δ200
leu2-3,112
ura3-52
lys2-801
trp1-1
gal2
cue1Δ :: HIS3
VJY172 MHY6199 MATα Denne studien
HIS3-Δ200
leu2-3,112
ura3-52
lys2-801
trp1-1
gal2
hrd1Δ :: kanMX4

Tabell 2. gjærstammer som er brukt i denne studien. Alle stammer er congenic med MHY500 53. VJY42, VJY47, og VJY56 ble beskrevet tidligere 49,53,54. En detaljert belastning generasjon og bekreftelse strategi for VJY172 (forberedt for denne studien) er tilgjengelig på forespørsel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne utredningen, er en metode for å analysere proteinnedbrytningskinetikk presentert. Denne teknikken kan lett anvendes på et utvalg av proteiner nedbrytes av en rekke mekanismer. Det er viktig å merke seg at cycloheximide chase eksperimenter rapportere om nedbrytningskinetikken til den stabile tilstand pool av et gitt protein. Andre teknikker kan brukes til å analysere nedbrytningskinetikken av spesifikke populasjoner av proteiner. For eksempel kan den nedbrytende skjebnen til begynnende polypeptider spores av puls jage analyse 55. I slike forsøk, begynnende proteiner er kort puls-merket (for eksempel med radioaktive aminosyrer). Endringer i overflod av de merkede begynnende proteiner (som kan eller ikke kan gjenspeiler endringer i steady state protein overflod) kan spores over tid.

Cycloheximide chase er egnet til å analysere proteinstabilitet over et relativt kort tidsforløp (dvs. opp til to timer). Over lengre tid courses (dvs. to timer til dager), cycloheximide, en global hemmer av oversettelse, er giftig for cellene, sannsynligvis på grunn av uttømming av ubiquitin 56. Videre analyser av proteinstabilitet over lengre tids kurs er større sannsynlighet for å bli kompromittert ved indirekte effekter av globalt nedsatt proteinsyntese på nedbrytningen av proteinet av interesse (for eksempel nedbrytning av en kortvarig protein som er involvert i nedbrytningen av proteinet av renter). Andre teknikker, slik som puls chase metabolske merkingsforsøk, er derfor bedre egnet for å studere nedbrytning av langlivede proteiner og kan utføres for å bekrefte resultatene oppnådd i cykloheksimid chase eksperimenter.

Tidspunktet for tilsetning av cykloheksimid og samling av celler er en viktig faktor i denne fremgangsmåten. Presisjon er særlig viktig i analysen av meget kortvarige proteiner, som små avvik i tiden som har gått fra cykloheksimid Addisjon til celle høsting kan ha en betydelig innvirkning på tilsynelatende nedbrytningskinetikk. Videre uten en klar plan for gjennomføring av disse tidskritiske trinn, et eksperiment kan raskt tilfaller i kaos og frustrasjon. Av denne grunn anbefales det å legge til cycloheximide til kulturene ved planlagte, regelmessige intervaller. 30-sek intervaller er foreslått i denne protokollen, men tidspunktet kan justeres for å matche komfort og fingerferdighet av etterforsker. Nybegynner etterforskere kan finne det nyttig å skrive en tidsplan for prøveinnsamlings ganger før start av forsøket og å krysse av hver planlagte samlingen som det skjer.

I trinn 1.7 og 1.8 av protokollen som er beskrevet her, er gjærcellekulturer konsentrert under redusert volum av vekstmedium for å lette manipulering ved den etterfølgende cykloheksimid chase prosedyre. Men sentrifugering av gjærceller raskt induserer visse cellulære stressresponser (f.eks signalveier somaktiveres av glukosemangel) 57,58. Etterforskerne er derfor advares mot lengre sentrifugering. Ved analyse av stabiliteten av proteiner som kan være følsomme for sentrifugering, kan forskere ønske å legge til cycloheximide direkte til mid-log fase kultur uten forutgående sentrifugering. I slike tilfeller bør cykloheksimid tilsettes til den samme endelige konsentrasjon (250 ug / ml), og gjærcelleprøver kan høstes ved metoder som ikke krever en innledende sentrifugeringstrinn (f.eks hurtig filtrering) 57. Videre, i trinn 2.3 til 2.5, prøver samlet ved hvert tidspunkt blir overført til en løsning inneholdende natriumazid og plassert på is. Disse forholdene hemmer fortsatt protein degradering for varigheten av jakten. Det bør bemerkes at azid reduserer cellulære konsentrasjonen av ATP 59, for derved å spesifikt inhibere aktiviteten av ATP-avhengige proteaser. Mens redusert temperatur bør enlso redusere den hastighet med hvilken ikke-ATP-avhengige proteolytiske prosesser funksjon, kan forskere studert proteiner nedbrytes av slike mekanismer også velge å knipse-fryse cellepelletene i flytende nitrogen som hver prøve blir høstet.

En prøve protokoll for cellelyse og en representant protokoll for western blotting inkludert i dette manuskriptet har blitt tilpasset fra tidligere rapporter 16,40. I det post-alkaliske lysemetode som beskrives her, forbedrer NaOH forbehandling ekstraksjon av gjærproteiner etter påfølgende tilsetning av Laemmli-prøvebuffer. Mekanismen for denne forbedring finner sted er dårlig karakterisert 40. Imidlertid er polysakkarider slik som de som finnes i gjærcellevegger oppløst i alkali forhold 60. Det er derfor fristende å spekulere at inkubering i nærvær av NaOH sfæroplaster delvis eller helt gjærceller (dvs. fjerner cellevegg-komponenter), hvilket gjør dem mer sensitive til SDS vaskemiddel som er tilstede i Laemmli prøvebuffer. Fordi proteiner er utgitt under sterkt denaturerende betingelser, behøver proteaseinhibitorer ikke inngå i Laemmli prøvebuffer. Den spesifikke fremgangsmåte for cellelysering kan modifiseres etter behov for et gitt eksperiment. For eksempel kan det post-alkaliske lysemetode ikke være egnet for lav-overflod proteiner eller proteiner som er dårlig påvist ved western blot. I slike tilfeller, metoder som inkluderer en trikloreddiksyre nedbør skritt å konsentrere proteinprøver kan være mest hensiktsmessig 61. Dessuten flere viktige hensynet antistoff utvalg, lasting kontroll valg, og alternative metoder for påvisning (f.eks kjemiluminescens western blotting ved hjelp av film eller digitalt bildesystemer) har nylig blitt diskutert 16. Kvantifisering av protein overflod følgende cykloheksimid behandling kan utføres. Mange bildesystemer selges med programvarepakker som letterdenne analysen.

Cycloheximide chase kan implementeres for å analysere nedbryting av en rekke gjær-proteiner, og kan være tilpasset til å studere proteinstabilitet i andre eukaryote celler. Som beskrevet i denne protokollen, cykloheksimid behandling etterfulgt av cellelysering og påvisning av protein overflod av western blot-analyse. Avhengig av programmet, men protein overflod etter cycloheximide behandling kan bli vurdert av en rekke teknikker som passer for forskning mål. For eksempel, hvis protein størrelse ikke er en relevant faktor for analyse, cellelysatene kan bli utsatt for dot blot eller enzym-bundet immunosorbent assay (ELISA) analyse, som rapporterer om protein overflod, men ikke tilsynelatende molekylvekt 62. For proteiner på celleoverflaten (eller indre fluorescens-merket intern proteiner), strømningscytometri kan anvendes for å kvantifisere protein overflod av prøver på forskjellige tidspunkter etter tilsetning cykloheksimid 51. Fluorescence mikros følgende cycloheximide behandling ville gi informasjon om både protein overflod og lokalisering 18. Utvalget av underlag, organismer, og nedstrøms applikasjoner mottagelig til cycloheximide jage gjør teknikken en svært allsidig og informativ måte å studere protein degradering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components
Disposable borosilicate glass tubes Fisher Scientific 14-961-32 Available from a variety of manufacturers
Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180) Dot Scientific 51028068 Available from a variety of manufacturers
New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller) New Brunswick M1053-0450 A tube roller is recommended to maintain overnight  starter cultures of yeast cells in suspension. Alternatively, if a tube roller is unavailable, a platform shaker in a temperature-controlled incubator may be used for overnight starter cultures. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.
New Brunswick TC-7 Roller Drum 120 V 50/60 H New Brunswick M1053-4004 For use with tube roller
SmartSpec Plus Spectrophotometer Bio-Rad 170-2525 Available from a variety of manufacturers
Centrifuge 5430 Eppendorf 5427 000.216  Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 and 50 ml conical tubes
Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 ml Conical Tubes, 6-Place Eppendorf F-35-6-30
15-ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene Sarstedt 62.554.205 Available from a variety of manufacturers
1.5-ml flex-tube, PCR clean, natural microcentrifuge tubes Eppendorf 22364120 Available from a variety of manufacturers
Analog Dri-Bath Heaters Fisher Scientific 1172011AQ It is recomended that two heaters are available (one for incubating cells during cycloheximide treatment and one for boiling lysates to denature proteins). Alternatively, 30 °C water bath may be used for incubation of cells in the presence of cycloheximide. Boiling water bath with hot plate may altertnatively be used to denature proteins.
Heating block for 12 x 15 ml conical tubes Fisher Scientific 11-473-70 For use with Dri-Bath Heater during incubation of cells in the presence of cycloheximide.
Heating block for 20 x 1.5 ml conical tubes Fisher Scientific 11-718-9Q For use with Dri-Bath Heater to boil lysates for protein denaturation.
SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane Will vary by lab and application
Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software) Li-Cor 9140-01 Will vary by lab and application
EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes Fisher Scientific IPFL00010 Will vary by lab and application
Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8)) Life Technologies 459250 Will vary by lab and application
Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H + L)) Life Technologies A-21065 Will vary by lab and application

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jankowska, E., Stoj, J., Karpowicz, P., Osmulski, P. A., Gaczynska, M. The proteasome in health and disease. Cur Pharm Des. 19 (6), 1010-1028 (2013).
  2. Nakayama, K. I., Nakayama, K. Ubiquitin ligases: cell-cycle control and cancer. Nat Rev Cancer. 6 (5), 369-381 (2006).
  3. Amm, I., Sommer, T., Wolf, D. H. Protein quality control and elimination of protein waste: the role of the ubiquitin-proteasome system. Biochim Biophys Acta. 1843 (1), 182-196 (2014).
  4. Goldberg, A. L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426 (6968), 895-899 (2003).
  5. Guerriero, C. J., Brodsky, J. L. The delicate balance between secreted protein folding and endoplasmic reticulum-associated degradation in human physiology. Physiol Rev. 92 (2), 537-576 (2012).
  6. Pagan, J., Seto, T., Pagano, M., Cittadini, A. Role of the ubiquitin proteasome system in the heart. Circ Res. 112 (7), 1046-1058 (2013).
  7. Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443 (7113), 780-786 (2006).
  8. Turnbull, E. L., Rosser, M. F., Cyr, D. M. The role of the UPS in cystic fibrosis. BMC Biochem. 8 Suppl 1, S11 (2007).
  9. Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nat Rev Drug Discov. 10 (1), 29-46 (2011).
  10. Kar, G., Keskin, O., Fraternali, F., Gursoy, A. Emerging role of the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Curr Pharm Des. 19 (18), 3175-3189 (2013).
  11. Paul, S. Dysfunction of the ubiquitin-proteasome system in multiple disease conditions: therapeutic approaches. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 30 (11-12), 1172-1184 (2008).
  12. Shen, M., Schmitt, S., Buac, D., Dou, Q. P. Targeting the ubiquitin-proteasome system for cancer therapy. Expert Opin Ther Targets. 17 (9), 1091-1108 (2013).
  13. Crowder, J. J., et al. Rkr1/Ltn1 Ubiquitin Ligase-Mediated Degradation of Translationally Stalled Endoplasmic Reticulum Proteins. J Biol Chem. 290 (30), 18454-18466 (2015).
  14. Gardner, R. G., et al. Endoplasmic reticulum degradation requires lumen to cytosol signaling. Transmembrane control of Hrd1p by Hrd3p. J Cell Biol. 151 (1), 69-82 (2000).
  15. Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery. J Biol Chem. 283 (47), 32302-32316 (2008).
  16. Watts, S. G., Crowder, J. J., Coffey, S. Z., Rubenstein, E. M. Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae. J Vis Exp. (96), e52428 (2015).
  17. Cohen, I., Geffen, Y., Ravid, G., Ravid, T. Reporter-based growth assay for systematic analysis of protein degradation. J Vis Exp. (93), e52021 (2014).
  18. Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways. EMBO J. 25 (3), 533-543 (2006).
  19. Kohlmann, S., Schafer, A., Wolf, D. H. Ubiquitin ligase Hul5 is required for fragment-specific substrate degradation in endoplasmic reticulum-associated degradation. J Biol Chem. 283 (24), 16374-16383 (2008).
  20. Medicherla, B., Kostova, Z., Schaefer, A., Wolf, D. H. A genomic screen identifies Dsk2p and Rad23p as essential components of ER-associated degradation. EMBO Rep. 5 (7), 692-697 (2004).
  21. Habeck, G., Ebner, F. A., Shimada-Kreft, H., Kreft, S. G. The yeast ERAD-C ubiquitin ligase Doa10 recognizes an intramembrane degron. J Cell Biol. 209 (2), 261-273 (2015).
  22. Tran, J. R., Brodsky, J. L. Assays to measure ER-associated degradation in yeast. Methods Mol Biol. 832, 505-518 (2012).
  23. Kao, S. H., et al. GSK3beta controls epithelial-mesenchymal transition and tumor metastasis by CHIP-mediated degradation of Slug. Oncogene. 33 (24), 3172-3182 (2014).
  24. Hampton, R. Y., Rine, J. Regulated degradation of HMG-CoA reductase, an integral membrane protein of the endoplasmic reticulum, in yeast. J Cell Biol. 125 (2), 299-312 (1994).
  25. Hochstrasser, M., Varshavsky, A. In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast alpha 2 repressor. Cell. 61 (4), 697-708 (1990).
  26. Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nat Chem Biol. 6 (3), 209-217 (2010).
  27. Whiffen, A. J., Bohonos, N., Emerson, R. L. The Production of an Antifungal Antibiotic by Streptomyces griseus. J Bacteriol. 52 (5), 610-611 (1946).
  28. Obrig, T. G., Culp, W. J., McKeehan, W. L., Hardesty, B. The mechanism by which cycloheximide and related glutarimide antibiotics inhibit peptide synthesis on reticulocyte ribosomes. J Biol Chem. 246 (1), 174-181 (1971).
  29. Ennis, H. L., Lubin, M. Cycloheximide: Aspects of Inhibition of Protein Synthesis in Mammalian Cells. Science. 146 (3650), 1474-1476 (1964).
  30. Kerridge, D. The effect of actidione and other antifungal agents on nucleic acid and protein synthesis in Saccharomyces carlsbergensis. J Gen Microbiol. 19 (3), 497-506 (1958).
  31. Chakrabarti, S., Dube, D. K., Roy, S. C. Effects of emetine and cycloheximide on mitochondrial protein synthesis in different systems. Biochem J. 128 (2), 461-462 (1972).
  32. Seufert, W., Jentsch, S. In vivo function of the proteasome in the ubiquitin pathway. EMBO J. 11 (8), 3077-3080 (1992).
  33. Varshavsky, A. Discovery of the biology of the ubiquitin system. JAMA. 311 (19), 1969-1970 (2014).
  34. Heinemeyer, W., Kleinschmidt, J. A., Saidowsky, J., Escher, C., Wolf, D. H. Proteinase yscE, the yeast proteasome/multicatalytic-multifunctional proteinase: mutants unravel its function in stress induced proteolysis and uncover its necessity for cell survival. EMBO J. 10 (3), 555-562 (1991).
  35. Sommer, T., Jentsch, S. A protein translocation defect linked to ubiquitin conjugation at the endoplasmic reticulum. Nature. 365 (6442), 176-179 (1993).
  36. Hiller, M. M., Finger, A., Schweiger, M., Wolf, D. H. ER degradation of a misfolded luminal protein by the cytosolic ubiquitin-proteasome pathway. Science. 273 (5282), 1725-1728 (1996).
  37. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protoc. 2 (1), 31-34 (2007).
  38. Bergman, L. W. Growth and maintenance of yeast. Methods Mol Biol. 177, 9-14 (2001).
  39. Biederer, T., Volkwein, C., Sommer, T. Degradation of subunits of the Sec61p complex, an integral component of the ER membrane, by the ubiquitin-proteasome pathway. EMBO J. 15 (9), 2069-2076 (1996).
  40. Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).
  41. Sharma, M., Benharouga, M., Hu, W., Lukacs, G. L. Conformational and temperature-sensitive stability defects of the delta F508 cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in post-endoplasmic reticulum compartments. J Biol Chem. 276 (12), 8942-8950 (2001).
  42. Mayer, T. U., Braun, T., Jentsch, S. Role of the proteasome in membrane extraction of a short-lived ER-transmembrane protein. EMBO J. 17 (12), 3251-3257 (1998).
  43. Rubenstein, E. M., Kreft, S. G., Greenblatt, W., Swanson, R., Hochstrasser, M. Aberrant substrate engagement of the ER translocon triggers degradation by the Hrd1 ubiquitin ligase. J Cell Biol. 197 (6), 761-773 (2012).
  44. Scott, D. C., Schekman, R. Role of Sec61p in the ER-associated degradation of short-lived transmembrane proteins. J Cell Biol. 181 (7), 1095-1105 (2008).
  45. Thibault, G., Ng, D. T. The endoplasmic reticulum-associated degradation pathways of budding yeast. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (12), (2012).
  46. Fisher, E. A., et al. The degradation of apolipoprotein B100 is mediated by the ubiquitin-proteasome pathway and involves heat shock protein 70. J Biol Chem. 272 (33), 20427-20434 (1997).
  47. Pariyarath, R., et al. Co-translational interactions of apoprotein B with the ribosome and translocon during lipoprotein assembly or targeting to the proteasome. J Biol Chem. 276 (1), 541-550 (2001).
  48. Yeung, S. J., Chen, S. H., Chan, L. Ubiquitin-proteasome pathway mediates intracellular degradation of apolipoprotein. B. Biochemistry. 35 (43), 13843-13848 (1996).
  49. Biederer, T., Volkwein, C., Sommer, T. Role of Cue1p in ubiquitination and degradation at the ER surface. Science. 278 (5344), 1806-1809 (1997).
  50. Metzger, M. B., et al. A structurally unique E2-binding domain activates ubiquitination by the ERAD E2, Ubc7p, through multiple mechanisms. Mol Cell. 50 (4), 516-527 (2013).
  51. Bazirgan, O. A., Hampton, R. Y. Cue1p is an activator of Ubc7p E2 activity in vitro and in vivo. J Biol Chem. 283 (19), 12797-12810 (2008).
  52. Kim, I., et al. The Png1-Rad23 complex regulates glycoprotein turnover. J Cell Biol. 172 (2), 211-219 (2006).
  53. Chen, P., Johnson, P., Sommer, T., Jentsch, S., Hochstrasser, M. Multiple ubiquitin-conjugating enzymes participate in the in vivo degradation of the yeast MAT alpha 2 repressor. Cell. 74 (2), 357-369 (1993).
  54. Jungmann, J., Reins, H. A., Schobert, C., Jentsch, S. Resistance to cadmium mediated by ubiquitin-dependent proteolysis. Nature. 361 (6410), 369-371 (1993).
  55. Tansey, W. P. Pulse-chase assay for measuring protein stability in yeast. Cold Spring Harb Protoc. , (2007).
  56. Hanna, J., Leggett, D. S., Finley, D. Ubiquitin depletion as a key mediator of toxicity by translational inhibitors. Mol Cell Biol. 23 (24), 9251-9261 (2003).
  57. Wilson, W. A., Hawley, S. A., Hardie, D. G. Glucose repression/derepression in budding yeast: SNF1 protein kinase is activated by phosphorylation under derepressing conditions, and this correlates with a high AMP:ATP ratio. Curr Biol. 6 (11), 1426-1434 (1996).
  58. Ashe, M. P., De Long, S. K., Sachs, A. B. Glucose depletion rapidly inhibits translation initiation in yeast. Mol Biol Cell. 11 (3), 833-848 (2000).
  59. Grant, C. M., MacIver, F. H., Dawes, I. W. Mitochondrial function is required for resistance to oxidative stress in the yeast Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett. 410 (2-3), 219-222 (1997).
  60. Javmen, A., et al. beta-Glucan from Saccharomyces cerevisiae Induces IFN-gamma Production In Vivo in BALB/c Mice. In Vivo. 29 (3), 359-363 (2015).
  61. Link, A. J., LaBaer, J. Trichloroacetic acid (TCA) precipitation of proteins. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (8), 993-994 (2011).
  62. Hornbeck, P. V. Enzyme-Linked Immunosorbent Assays. Curr Protoc Immunol. 110, 2.1.1-2.1.23 (2015).

Tags

Biokjemi , Spirende gjær mutanter endoplasmatisk retikulum-assosiert degradering protein degradering cycloheximide jage translocon ubiquitin-proteasome system
Cycloheximide Chase Analyse av protein degradering i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Buchanan, B. W., Lloyd, M. E.,… More

Buchanan, B. W., Lloyd, M. E., Engle, S. M., Rubenstein, E. M. Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (110), e53975, doi:10.3791/53975 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter